專利名稱：李壞死環(huán)斑病毒外殼蛋白基因表達(dá)方法及抗血清和試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用畢赤酵母表達(dá)李壞死環(huán)斑病毒外殼蛋白基因的方法，本發(fā)明還涉及一種采用該表達(dá)外殼蛋白基因制備的抗血清；本發(fā)明還涉及一種李壞死環(huán)斑病毒ELISA檢測試劑盒。
背景技術(shù)：
李壞死環(huán)斑病毒(Plum necrosis ringspot virus, PNRSV)是我國最新頒布的進(jìn)境植物的檢疫性病原物，是核果類果樹危險(xiǎn)性最大的病毒之一，果樹一旦受其侵染，會造成未成熟果實(shí)大量脫落、產(chǎn)量嚴(yán)重下降，并且使果實(shí)品質(zhì)大幅度下降。且該病毒傳播速度快，在短時(shí)間內(nèi)即可能給整個(gè)國家的果樹業(yè)發(fā)展帶來災(zāi)難性損失。目前中國僅有局部地區(qū)有該病毒發(fā)生的報(bào)道。由于我國奉行改革開放的國策，同他國種質(zhì)資源交流越來越頻繁，為了防止該病毒隨著種子、苗木等繁殖材料的引進(jìn)而進(jìn)入我國，以保護(hù)我國農(nóng)業(yè)的健康和可持續(xù)發(fā)展，必須加強(qiáng)對該病毒的檢驗(yàn)檢疫。酶聯(lián)免疫吸附分析法(ELISA)是目前靈敏較高、比較穩(wěn)定且通量較高的一種成熟的檢測方法，是口岸植物種苗病毒的常規(guī)檢測和對多個(gè)樣品的快速檢測的首選方法。但由于該病毒在果樹體內(nèi)含量非常低，繁殖困難，因此要大量提純該病毒并制備高效價(jià)的抗血清就變得十分困難，而且本病毒目前在我國屬于檢疫性病毒之列，不宜為各個(gè)檢測部門提供該病毒作為陽性對照，這樣就在很大程度上限制了對該病毒進(jìn)行血清學(xué)檢測
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足之處，提供一種用畢赤酵母表達(dá)李壞死環(huán)斑病毒外殼蛋白基因的方法；本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種采用該表達(dá)基因制備的抗血清；本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種李壞死環(huán)斑病毒ELISA檢測試劑盒。為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用以下方案一種李壞死環(huán)斑病毒外殼蛋白基因表達(dá)方法，其特征在于包括以下步驟A、從PNRSV感病材料中提取李壞死環(huán)斑病毒的RNA ；B、采用RT-PCR擴(kuò)增的方法克隆李屬壞死環(huán)斑病毒的外殼蛋白基因；將得到的殼蛋白基因連接到PGEM-T載體上，得到pGEM-T-PNRSV重組載體，并以序列分析確定該病毒外殼蛋白基因的序列正確性；C、構(gòu)建PNRSV外殼蛋白基因真核表達(dá)載體；D、轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115菌株,誘導(dǎo)畢赤酵母表達(dá)外殼蛋白；Ej Western-blot檢測表達(dá)蛋白大小的正確性。如上所述的一種李壞死環(huán)斑病毒外殼蛋白基因表達(dá)方法，其特征在于步驟A中提取李壞死環(huán)斑病毒的RNA具體包括以下步驟(I)取PNRSV感病材料的幼嫩組織若干，液氮研磨，分裝成< IOOmg小份至預(yù)冷Ε· P管，取IOOmg樣品加入ImlTriZOL抽提；(2) 12000rpm, 2-8°C 離心 IOmin ；(3)吸取上清液，轉(zhuǎn)移至新的1. 5mlE. P管中，15_30°C放置5min ；(4)加 O. 2ml 氯仿，充分抽提 8min，15_30°C放置 2_3min ；(5) I^OOOrpmJ-SO 離心 15min ；(6)吸取上清液，轉(zhuǎn)移至新的1. 5mlE. P.管中，加O. 5ml異丙醇，15_30°C放置IOmin ；(7) I^OOOrpmJ-SO離心 IOmin ；(8)棄去上清液，得膠體狀RNA，加1-1. 5ml75%乙醇，渦旋混勻(9) 7500rpm、2-8°C離心5min，棄去上清液，留下膠體狀RNA ；(10)干燥 5-10min ；(11)溶于 Rnase. free 水中，槍頭打勻，55_60°C溫浴 IOmin ；(12)5% Agarose膠檢測，測定濃度并調(diào)至2_3μ g/μ L，_70°C儲存?zhèn)溆谩Ｈ缟纤龅囊环N李壞死環(huán)斑病毒外殼蛋白基因表達(dá)方法，其特征在于步驟B具體方法包括

a、RT-PCR擴(kuò)增目的基因⑴引物上游引物PNRSV-F 5 ' -GTGGATCCTACGTAATGGTTTGCCGAATTTG-3 '，其中 GGATCC為BamHI酶切位點(diǎn)，TAC GTA為SnaB I酶切位點(diǎn)；下游引物PNRSV-R 5 ' -GGAAGCTTGCGGCCGCGATCTCAAGCAGGTC-3 '，其中 AAGCTT為Hind III酶切位點(diǎn)，GCGGCCGC為Not I酶切位點(diǎn)；在引物兩端即5，及3，分別加上了 SnaB I及NotI酶切位點(diǎn)引物；(2)擴(kuò)增體系模板RNA I μ L ；5 μ mol/L上游引物I μ L ；5μ mol/L 下游引物 IyL;擴(kuò)增酶混合液 I μ L ；2 X buffer 12. 5μ L ；RNase-freeddH20至總體積25 μ L ;(3)擴(kuò)增過程50°C 30min, 94。。3min, 94°C lmin, 60°C 30s, 72°C lmin, 72°C IOmin,4°C ;其中 94°C lmin,60°C 30s, 2°C lmin,72°C IOmin 循環(huán) 35 次；b、基因克隆及序列測序(I)PNRSV CP 產(chǎn)物的回收取擴(kuò)增產(chǎn)物在I % TBE瓊脂糖凝膠上電泳，電泳完畢，切下目的條帶，采用PCR產(chǎn)物回收試劑盒回收；(2)重組質(zhì)粒的構(gòu)建采用pGEM-T載體進(jìn)行TA克隆，構(gòu)建重組質(zhì)粒，具體步驟為電泳確定回收產(chǎn)物的純度和濃度；向PCR管中依次加入約4 μ L回收產(chǎn)物，I μ LpGEM-T載體，5 μ L連接液，補(bǔ)充ddH20至總體積10 μ L ;16°C下反應(yīng)過夜；(3)感受態(tài)細(xì)胞制備于LB培養(yǎng)基平板上活化DH5 α菌株，并挑取單菌落接種于5mlLB液體培養(yǎng)基中，37°C下?lián)u動培養(yǎng)過夜，形成種子菌液；取此5ml菌液，于IOOml LB液體培養(yǎng)基，37°C搖動培養(yǎng)2 2. 5hr,至OD600 = O. 6 O. 8時(shí)，吸取1. 5ml菌液于1. 5ml離心管中，冰浴5min,4°C下4000g離心lOmin，棄上清液，重復(fù)吸取菌液一次，沉淀用滅菌濾紙吸盡殘液，加入300 μ L冰預(yù)冷的100mmol/L CaCl2重懸浮菌體,冰浴30min,4°C下4000g離心IOmin,收集沉淀,力口入100 μ L冰預(yù)冷的100mmol/L CaCl2重新懸浮細(xì)菌沉淀，即為感受態(tài)細(xì)胞，于4°C冰箱中放置12 24hr備用；或加入70 μ L冰預(yù)冷的100mmol/LCaCl2和30 μ L50%甘油于_70°C保存?zhèn)溆茫?4)重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化及篩選從_70°C冰箱中取出感受態(tài)細(xì)胞，置于冰上解凍，在超凈工作臺上，取10 μ L連接產(chǎn)物于100 μ L感受態(tài)細(xì)胞中，輕彈管壁混勻，冰浴30min，將離心管置于42°C水浴中熱激90sec,迅速將離心管冰浴3 5min。每管中加入800 μ LLB液體培養(yǎng)基(不含抗生素)，37°C下?lián)u動培養(yǎng)90min，以利于細(xì)菌的復(fù)蘇和質(zhì)粒編碼抗性基因的表達(dá)；采用抗生素和α -互補(bǔ)法篩選重組質(zhì)粒；取100ml LB固體培養(yǎng)基加熱融化，待冷卻至60°C以下時(shí)，加入100 μ LAmp，混勻后分倒4個(gè)培養(yǎng)皿；凝固后，每皿取4 μ LIPTG，200mg/ml水溶液過濾除菌及40 μ LX-gal混勻后均勻涂布平板；待液體被吸收后取200 μ I轉(zhuǎn)化后的菌液均勻涂于上述LB平板上，正向放置30min待液體被吸收，37°C下倒置培養(yǎng)16 24hr ;挑取直徑約為I 2mm大小的白色菌落于5ml LB液體培養(yǎng)基中，37°C下?lián)u動培養(yǎng)12 16hr，標(biāo)記后取0. 7ml與0. 3ml 50%的滅菌甘油混勻后，置_80°C下保存?zhèn)溆茫溆嗑河糜谥亟M質(zhì)粒抽提及 鑒定；(5)重組質(zhì)粒的抽提經(jīng)抗生素及α -互補(bǔ)法篩選得到的待檢菌落培養(yǎng)物于4°C冰箱內(nèi)預(yù)冷5 lOmin，采用堿裂解法抽提質(zhì)粒DNA ;具體步驟如下離心管標(biāo)號，取含重組質(zhì)粒的菌體液1. 5ml至離心管中，4°C、12000g、離心lmin，棄上清，重復(fù)加菌體液一次，離心后將管倒置于吸水紙上，待流盡余液后加入150 μ L溶液I，劇烈振蕩，使菌體懸浮，室溫放置5 lOmin，加入250 μ L溶液II，顛倒離心管數(shù)次，溫和混勻，室溫放置5min，加入180 μ L溶液III，蓋緊離心管，溫和顛倒離心管數(shù)次，使沉淀混勻，冰浴6 7min，4°C、12000g離心lOmin，上清夜移入干凈的離心管中，分別加入1/2體積的氯仿/異戊醇、Tris飽和苯酚，混勻，4°C、12000g離心5min，取上清，氯仿/異戊醇再抽提一次；上清水相移入干凈離心管中，加入1/10體積NaAc，2倍體積無水乙醇，混勻后，-20°C冰箱中20min或過夜，4°C、12000g離心lOmin，棄上清，將管口打開倒置于吸水紙上，吸干余液，70%, 100%乙醇各洗一次，室溫下風(fēng)干，加入20 μ LTE，_20°C冰箱中備用；(6)重組質(zhì)粒的鑒定①、特異引物PCR鑒定利用特異引物對待檢重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系程序參數(shù)同上，PCR產(chǎn)物在1% TBE瓊脂糖凝膠上電泳鑒定，凡含有目的擴(kuò)增片段的克隆，進(jìn)一步進(jìn)行酶切鑒定；②、重組質(zhì)粒酶切鑒定經(jīng)PCR鑒定陽性的重組質(zhì)粒，以下列體系進(jìn)行雙酶切10 X HBufferl. 5 μ L，BamHlO. 5 μ L, HindIIIO. 5 μ L，待檢質(zhì)粒 4 μ L，加 ddH20 至總體積 15 μ L，37°C下反應(yīng)過夜，取10 μ L反應(yīng)液電泳檢測酶切結(jié)果；③、重組質(zhì)粒序列測定經(jīng)上述PCR及酶切鑒定為陽性的克隆，擴(kuò)繁菌體，抽提并純化質(zhì)粒后，利用通用測序引物對重組質(zhì)粒進(jìn)行序列測定。如上所述的一種李壞死環(huán)斑病毒外殼蛋白基因表達(dá)方法，其特征在于步驟C的具體做法用PCR擴(kuò)增出PAP基因，然后回收該基因片段后用SnaB I和Not I雙酶切，再與用同樣雙酶切的載體PPIC9K相連接構(gòu)建成表達(dá)載體PPIC9K-P，將pPIC9K_P轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109后經(jīng)篩選培養(yǎng)基篩選，堿法提取其重組質(zhì)粒，然后用酶切及PCR進(jìn)行鑒定；用PCR和質(zhì)粒酶切鑒定方法篩選出的陽性重組子后，再進(jìn)行DNA測序，以驗(yàn)證閱讀框的正確性。如上所述的一種李壞死環(huán)斑病毒外殼蛋白基因表達(dá)方法，其特征在于步驟D的具體做法序列分析驗(yàn)證后，再用酶BglII將表達(dá)載體PPIC9K-P線性化，然后通過電轉(zhuǎn)移方法將其導(dǎo)入酵母GS115菌株的感受態(tài)細(xì)胞；(I)制備酵母感受態(tài)細(xì)胞酵母菌株P(guān).pastoris GS115 于 500ml YPD 中 30°C培養(yǎng)至 A 600 =1. 5，1500g離心收集菌體，先后用500ml、250ml預(yù)冷的無菌水洗菌體，離心去上清夜，用20ml預(yù)冷的Imol/L山梨醇懸浮菌體,離心后菌體再用O. 5ml預(yù)冷的山梨醇懸浮后備用；(2)制備轉(zhuǎn)化DNA :質(zhì)粒DNA的提取采用堿裂解法，然后將提取的DNA用BglII酶切，使之分成二個(gè)片段，其中之一是含有酵母表達(dá)盒的DNA區(qū)段，將其用低熔點(diǎn)瓊脂糖電泳后回收；(3)酵母細(xì)胞的轉(zhuǎn)化取上述步驟制備的 I 5μ gDNA加到40μ I山梨醇懸浮的酵母細(xì)胞中，冰浴5min，然后用電擊儀電擊，參數(shù)為0. 8kV、11.5yF;電擊結(jié)束后立即加入O. 5ml預(yù)冷的lmol/L山梨醇，取200μ I于固體RDB轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基為RDB : 18. 6%山梨醇、2%葡萄糖、1. 34% ΥΝΒ、
0.00004%生物素、各O. 005%谷氨酸、甲硫氨酸、賴氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、2%瓊脂糖，上涂板，30°C培養(yǎng)直至轉(zhuǎn)化子出現(xiàn)；用牙簽挑取轉(zhuǎn)化子對應(yīng)點(diǎn)種到MM :1. 34% YNB,O. 00004%生物素、O. 5%甲醇、1. 5%瓊脂糖，平板和MD :1. 34% YNB,O. 00004%生物素、2%葡萄糖、
1.5%瓊脂糖上，30°C培養(yǎng)2d，在MD上生長正常而在MM上生長不正常或不生長的轉(zhuǎn)化子即為陽性克?。?4) PNRSV CP基因在酵母中的誘導(dǎo)表達(dá)具體操作按Invitrogen 公司 Pichia Expression Kit 程序進(jìn)行。如上所述的一種李壞死環(huán)斑病毒外殼蛋白基因表達(dá)方法，其特征在于步驟E的具體做法(I)表達(dá)蛋白分子量的測定取Iml酵母發(fā)酵液，13000rpm離心15分鐘，取上清10 μ I進(jìn)行SDS-PAGE，電泳后
用考馬斯亮蘭染色；(2)表達(dá)蛋白 Western-blot 檢測SDS-PAGE電泳后將表達(dá)蛋白電轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，然后用PNRSV抗血清作為一抗與硝酸纖維素膜上的蛋白進(jìn)行免疫反應(yīng)，之后再用第二抗血清即堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗兔抗血清對表達(dá)蛋白進(jìn)行特異性鑒定，以未用甲醇誘導(dǎo)的酵母培養(yǎng)液作為陰性對照。本發(fā)明一種抗血清，其特征在于其制備方法包括以下步驟根據(jù)預(yù)表達(dá)結(jié)果，選取高效表達(dá)的畢赤酵母GSl 15菌株，大量誘導(dǎo)表達(dá)，經(jīng)SDS-PAGE和考馬斯亮藍(lán)染色分析，切膠條帶用生理鹽水適當(dāng)稀釋后，加入等體積福氏不完全佐劑乳化；蛋白液體lmg/mL直接與福氏不完全佐劑進(jìn)行乳化；免疫大白兔采用肌肉注射結(jié)合皮下注射的方式，第一次免疫之后，分別于第21天、第35天和第49天加強(qiáng)免疫3次；最后一次注射免疫后7天開始少量靜脈采血測定效價(jià)，根據(jù)效價(jià)情況分次大量取血；制備的抗血清加入O. 02%的疊氮化鈉，-200C保存?？寡逍r(jià)及特異性測定將抗血清進(jìn)行一系列稀釋后，用間接ELISA方法測定抗血清的效價(jià)和特異性。(I).用包被液將抗原稀釋成2ug/mL，IOOul/孔加到96孔可拆酶標(biāo)板中，4°C過夜。
(2). PBS-T洗三次于吸水紙上拍干，加200ul/孔I % BSA, 37°C恒溫箱2小時(shí)。(3).取抗血清按照1: 1000,1 2000,1 4000,1 8000，I ; 16000，I 32000,1 64000,1 128000作梯度稀釋，每個(gè)樣品不小于200ul。(4).取出37°C恒溫箱里的抗原板，PBS-T洗三次于吸水紙上拍干，加步驟3中稀釋好的抗血清樣品IOOul/孔，每個(gè)稀釋度加并排兩個(gè)孔。(5).取陰性血清1: 1000稀釋按順序加到抗血清最小濃度樣品后作為陰性對照。置37°C恒溫箱I小時(shí)。(也要重復(fù)2次)(6). PBS-T洗三次于吸水紙上拍干，羊抗兔酶標(biāo)(辣根過氧化物酶)二抗按照使用說明稀釋好，IOOul/孔加到酶標(biāo)板中，置37°C恒溫箱I小時(shí)。(7). PBS-T洗五次于吸水紙上拍干，TMB顯色液IOOul/孔加到酶標(biāo)板中，置37°C恒溫箱10分鐘。酶標(biāo)儀450nm測OD值并打印結(jié)果。(8).通常將2. 5倍陰性對照OD值看作陽性，根據(jù)結(jié)果判斷樣品滴度。(9).選擇最適合的工作濃度，分別與TMV、PVX、PVY等病毒進(jìn)行免疫反應(yīng)，以測試該血清的特異性。本發(fā)明一種試劑盒，其特征在于該試劑盒內(nèi)包括1). PNRSV抗體；2).酶標(biāo)抗體堿性磷酸酯酶標(biāo)記；3).底物對硝基苯磷酸鈉(P NPP) ；4). PNRSV陽性對照；5). PNRSV陰性對照。

本發(fā)明中材料、主要試劑、儀器和溶液等1、PNRSV感病材料由西班牙國家生物技術(shù)中心分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供，于_80°C超低溫冰箱中保存。2、主要試劑=Trizol試劑、Taq酶、M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶，T4連接酶及甲醇、山梨醇、酵母氮堿等均購自廣州普博生物技術(shù)公司；限制性內(nèi)切酶均購自大連寶生物公司；pPIC9K載體、畢赤酵母GS115菌株購自Invitrogen公司。3、主要儀器BIOTEK酶聯(lián)檢測儀、日本梯度PCR儀、Labofuge400R型冷凍高速離心，高速臺式離心機(jī)、DYY-7型轉(zhuǎn)移電泳儀，Pharmacia EPS601型電泳儀；法國UVP凝膠成像系統(tǒng)；日本Shimadzu公司UV-120-02型可見-紫外分光光度計(jì)；HARRIS超低溫冰三洋牌、法國吉爾森牌移液器；單人型超凈工作臺；人工氣候箱LRH-250-GS，隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱PYX-DHS，HZQ-C空氣浴振蕩器，電熱恒溫水浴鍋DK-S22等等。4、主要溶液的配制:⑴PBS緩沖液每IOOOmL中，含2. 2gNa2HP04. 12Η20、0· 2gKH2PO4,8. Og NaCl、0· 2g KCl、0· 2g NaN3,調(diào)節(jié) pH 至 7. 3 ; (2) PBST 每 IOOOmL PBS 中力口O. 5mL Tween-20。(3)摩擦接種緩沖液=PBS中加入I %的銅試劑。(4)0.1 % DEPC水溶液IOOOmL水中加入ImLDEPC后，37°C下處理24hr，高壓滅菌，封閉保存。(5) RNA提取緩沖液4mol/L異硫氰酸胍，25mmol/L朽1檬酸鈉,0. 5%十二燒基肌氨酸納(w/v),0. lmol/L巰基乙醇，2mol/LNaAc，水飽和酚(ρΗ3· 5)。(6) 10XMOPS 0. 2mol/L MOPS (pH7. O), IOmmol/L EDTA (pH8. 0),80mmol/L NaAc。(7) LB 培養(yǎng)基胰蛋白胨(Tryptone) 10g/L，酵母浸出液(Yeast Extract) 5g/L,氯化鈉(NaCl) lOg/L, pH 7. 0 7. 2,固體培養(yǎng)基加1. 5% (w/v)瓊脂粉。(8)質(zhì)粒抽提緩沖液溶液1:50mmol/L葡萄糖，25mmol/L Tris-HCl (pH8. O)，IOmmol/L EDTA(pH8. 0)，分裝后高壓滅菌，于 4°C下保存;溶液 I1:0. 2mol/L NaOH, I % SDS (w/v),4mol/L NaOH和20% (w/v) SDS貯存液現(xiàn)配現(xiàn)用；溶液II1:在60mL 5mol/L的乙酸鉀溶液中加入11. 5mL冰乙酸和28. 5mL水，配成濃度為3mol/L(pH5. 3)，乙酸鉀濃度為5mol/L的溶液。(9)10% (w/v) SDS溶液(IOOmL) SDS 10g，加入ddH20至終體積100mL。室溫保存(使用前確保SDS沒有沉淀)。(10)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)的相關(guān)試劑A.抗原包被緩沖液(0.05mol/L pH 9. 6 碳酸鹽緩沖液):每 IOOOmL 中含1. 59g Na2CO3, 2. 93gNaHC03,0. 2gNaN3，調(diào)節(jié) pH值至 9· 6 ；Β.洗滌緩沖液(0. 02mol/L ρΗ7· 3PBST 緩沖液):取 8· Og NaCl，0. 2gKCl，2· 9g Na2HPO4,0. 2gKH2P04,0. 5mL 吐溫-20 (Tween-20)，蒸餾水定容至 lOOOmL，調(diào)節(jié) pH至7. 3 ；C.1gG稀釋緩沖液(O. 02mol/L PBST牛血清白蛋白緩沖液)0.1g牛血清白蛋白(BSA)溶于IOOmL洗滌液中；D.磷酸鹽-檸檬酸鹽緩沖液(pH5. 0) 0. 2mol/L Na2HP0425. 7mL,0. lmol/L檸檬酸液24. 3mL，加蒸餾水定容至IOOmL ；E.底物溶液(OPD-H2O2):該溶液現(xiàn)用現(xiàn)配，取磷酸鹽-檸檬酸緩沖液IOOmL^ 40mg(隨溫度升高可調(diào)整至16mg)鄰苯二胺(OPD)，避光充分溶解后，加入0. 15mL (隨溫度升高可調(diào)整至0. 07mL)30%的H2O2 ；F.終止液2mol/LH2S04。(11)氨芐青霉素(Amp):用雙蒸水溶解，稀釋至貯存濃度100mg/mL，過濾除菌后置-20°C備用；(12)氯仿 異戊醇(24 I):取氯仿48mL、異戊醇2mL，充分混勻后，棕色瓶中保存。(13)TE :含 10mmol/LTris-Cl，lmmol/L EDTA，調(diào) pH 值至 8· O ; (14) EB 母液(lOmg/mL):稱取IOmg EB溶解于ImL蒸餾水中，避光保存，工作濃度為0. 5 μ g/mL。(15)5XTBE母液稱取 54g Tris base，27. 5g 硼酸，0. 5mol/LEDTA(PH 8. 0) 20mL，雙蒸水定容至 1000mL。稀釋10倍為0.5 X TBE工作液。本發(fā)明技術(shù)方案1.提取李壞死環(huán)斑病毒的總核酸；2.以總核酸為模板，用Oligo (dT)為引物，反轉(zhuǎn)錄成cDNA第一鏈；3.設(shè)計(jì)李壞死環(huán)斑病毒外殼蛋白基因的特異性引物，以cDNA第一鏈為模板，PCR擴(kuò)增外殼蛋白基因；4.將外殼蛋白基因克隆到pGEM-T載體上，然后進(jìn)行序列測定，以確證基因序列的正確性；5.從pGEM-T載體上將外殼蛋白基因切下，克隆到真核表達(dá)載體PPIC9K上，轉(zhuǎn)化畢赤酵母GSl 15菌株，然后誘導(dǎo)畢赤酵母表達(dá)外殼蛋白；6.用Western-blot檢測表達(dá)蛋白大小的正確性；7.大量表達(dá)外殼蛋白，然后進(jìn)行回收,免疫家兔；8.抽取免疫家兔體內(nèi)血，檢測其是否產(chǎn)生抗血清及其特異性；9.測定抗血清的效價(jià)，制備酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，并在實(shí)際檢測工作中加以檢驗(yàn)。本發(fā)明融合了現(xiàn)代分子生物學(xué)、分子病毒學(xué)及免疫學(xué)等理論和技術(shù)，避開了傳統(tǒng)的生產(chǎn)抗原和抗體的方法，采用分子生物學(xué)方法，利用真核生物的繁殖來大量表達(dá)該病毒的外殼蛋白，該表達(dá)蛋白即可以為血清學(xué)檢測提供陽性對照，又能夠用來作為抗原生產(chǎn)抗血清，提供給檢測部門尤其是檢疫部門的檢測使用。同時(shí)由于已經(jīng)將該病毒的外殼蛋白基因克隆在表達(dá)載體上，因此可以源源不斷地生產(chǎn)出外殼蛋白作為陽性對照之用，同時(shí)避免了直接用該病毒或被該病毒侵染的寄主植物存在病毒逃逸的危險(xiǎn)，從而充分保證了檢測工作中抗血清的供應(yīng)以及生物安全性問題。


圖1為PNRSV重組質(zhì)粒PCR鑒定結(jié)果圖；圖2為真核分泌型表達(dá)載體PPIC9K-PNRSV的構(gòu)建示意圖；圖3真核表達(dá)載體pPIC9K_PNRSV PCR及雙酶切鑒定結(jié)果圖；圖4為酵母表達(dá)蛋白SDS-PAGE分析結(jié)果圖；圖5表達(dá)蛋白Western-blotting特異性檢測結(jié)果圖；圖6回收PNRSVCP蛋白的SDS-PAGE分析結(jié)果圖。其中圖1中2、3、5、6號轉(zhuǎn)化子有PNRSV CP基因片段插入?！癕”表示IOObp ladderDNA Marker. “一”指示為PNRSV CP片段(675bp)。圖3中1.分子量對照，2.雙酶切，3. PCR鑒定。圖4中LMarker(Ku) : 15，20，31，43，66. 2 ;2.表達(dá)蛋白，3.陰性對照；圖5中1:甲醇誘導(dǎo)的表達(dá)產(chǎn)物；2 :陰性對照;圖6中1:M :蛋白質(zhì)分子量對照(150kDa, IOOkDa, 75kDa,50kDa，31kDa，20kDa，15kDa)2 :E1_E8 :誘導(dǎo)表達(dá)蛋白產(chǎn)物
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施方式
對本發(fā)明做進(jìn)一步描述實(shí)施例1
1、病毒樣品的保存及鑒定保存主要采用二種方法，-是選取癥狀典型葉片標(biāo)本速凍干燥后，保存于_80°C冰箱中；二是抽提病株總DNA和RNA并保存于-80°C冰箱中。鑒定采集的樣品先采用血清學(xué)方法，主要是ELISA進(jìn)行檢測，根據(jù)血清學(xué)檢測結(jié)果，再用現(xiàn)代分子生物學(xué)方法如PCR檢測法進(jìn)行確證。2、PNRSV的血清學(xué)檢測方法采用間接ELISA方法進(jìn)行，步驟如下(I)取待測樣品O. lg，用研杵搗碎，加入ImL的抗原包被緩沖液，轉(zhuǎn)入1. 5mL離心管中，2700g離心，取上清液體；(2)加入200 μ L上清液體到酶聯(lián)板樣品孔中以包被抗原，37°C下，孵育2hr ；
(3)倒掉包被液，用PBST洗板3次，每次3min ； (4)加入PNRSV特異性IgG,每孔150uL,37°C，溫育2hr ； (5)倒掉此溶液，洗板同前；(6)加入酶標(biāo)羊抗兔IgG，每孔100 μ L(工作濃度1: 3000)，37 °C下溫育2hr ； (7)倒掉此溶液，洗板同前；⑶加入底物溶液TMB，每孔100 μ 1，室溫30min后，每孔加50 μ L 2mol/L的H2SO4終止反應(yīng)；(9)酶標(biāo)儀測定OD450nm,觀測記錄顯色情況，重復(fù)三次。注做ELISA檢測時(shí)，每個(gè)樣品至少重復(fù)2次，并需要設(shè)置陽性對照、陰性對照以及空白對照；而且顯色時(shí)間不可過長。3、總RNA提取方法(I)幼嫩組織若干,液氮研磨，分裝成< IOOmg小份至預(yù)冷E. P.管，IOOmg樣品加入ImL TriZOL抽提幾分鐘(顛倒混勻)；(2) 12000rpm, 2-8°C 離心 IOmin ；(3)吸取上清(含RNA)，轉(zhuǎn)移至新的1. 5mLE. P.管中，15_30°C放置5min(此前可于-70°C放置I月再抽提)；(4)加 O. 2mL(l/5XV01. TriZOL)氯仿，充分抽提 8min，15_30°C放置 2_3min ；(5) 12000rpm、2-8°C離心15min(形成上層無色水相、中間相和下層有機(jī)相、中間相和有機(jī)相可用于DNA和蛋白質(zhì)抽提)；(6)吸取上清，轉(zhuǎn)移至新的1. 5mL E. P.管中，加O. 5mL (1/2 X V01. TriZOL)異丙醇，15-30°C放置 IOmin ；(7) I^OOOrpmJ-SO離心 IOmin ；(8)小心棄去上清，得膠體狀RNA，加l_1.5mL( >= I X VOl. TriZOL) 75%乙醇，渦旋混勻(在75%乙醇中，RNA沉淀可于2-8°C放置二周、_70°C放置I年)；(9) 7500rpm、2_8°C離心5min,棄去上清，留下膠體狀RNA ；(10)干燥5-10min (過干會使RNA難以溶解)；(11)溶于 RNase. free 水中，槍頭打勻，55-6CTC溫浴 IOmin ;(12)5% Agarose膠檢測，測定濃度并調(diào)至2-31^/μ L。_70°C儲存?zhèn)溆谩?、RT-PCR擴(kuò)增目的基因(I)引物設(shè)計(jì)合成根據(jù)已測定的PNRSV CP基因保守序列設(shè)計(jì)，上游引物PNRSV_F 5' -GTGGATCCTACGTA ATGGTTTGCCGAATTTG-3',其中 GGATCC 為 BamHI 酶切位點(diǎn)，TAC GTA為SnaB I酶切位點(diǎn)；下游引物PNRSV-R :5' -GGAAGCTT GCGGCCGCGATCTCAAGCAGGTC-3',其中 AAGCTT為Hind III酶切位點(diǎn)，GCGGCCGC為Not I酶切位點(diǎn)；在引物兩端即5’及3’分別加上了SnaB I及Not I酶切位點(diǎn)引物；引物由北京奧科生物公司合成。(2)擴(kuò)增參數(shù)體系采用大連寶生物公司的試劑盒PrimeScript One-Step Ver. 2. O進(jìn)行一步法RT-PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物4°C保存，取5 μ L在I %的瓊脂糖凝膠上電泳，檢查PCR結(jié)果。(2)擴(kuò)增體系:模板RNA I μ L ；5 μ mol/L上游引物I μ L ；5 μ mol/L下游引物I μ L ；擴(kuò)增酶混合液 I μ L ；2 Xbuffer 12. 5 μ L ；RNase-free ddH20 至總體積 25 μ L ；(3)擴(kuò)增過程50°C 30min,94°C 3min,94°C lmin，60°C 30s，72°C lmin，72°C IOmin,4°C ;其中 94°C lmin,60°C 30s, 2°C lmin,72°C IOmin 循環(huán) 35 次；5、基因克隆及序列測序(I)PNRSV CP 產(chǎn)物的回收取擴(kuò)增產(chǎn)物在1% TBE瓊脂糖凝膠上電泳，電泳完畢，切下目的條帶，采用PCR產(chǎn)物回收試劑盒回收。具體步驟參照試劑盒說明取一1. 5mL離心管在電子天平上稱重，切下體積盡可能小的凝膠塊至離心管中，稱重，按每IOOmg膠加入300 μ L Buffer DE_A,懸浮混勻后于75°C水浴加熱，每隔2 3min混合一次，直至凝膠塊完全融化，按Buffer DE-A體積的50%加入Buffer DE-B,混合均勻，DNA-prep柱置于2mL離心管中，并將上述混合液移入DNA-prep柱中，3600g離心lmin,棄濾液，將DNA-prep柱置回到原2mL離心管中，加入500 μ LBuffer ffl, 3600g離心lmin,棄濾液，將DNA-prep柱置回到原2mL離心管中，加入700 μ L已加無水乙醇的Buffer W2，3600g離心lmin，以同樣的方法再用700 μ L Buffer W2洗漆一次，將DNA-prep柱置于1. 5mL離心管中，12000g離心lmin,將DNA-prep柱置于另一干凈1. 5mL離心管中，在silica膜中央加入25 30 μ L 65°C預(yù)熱的Eluent或去離子水，室溫靜置lmin，12000g離心lmin，洗脫DNA，_20°C保存?zhèn)溆谩?2)重組質(zhì)粒的構(gòu)建采用pGEM-T載體進(jìn)行TA克隆，構(gòu)建重組質(zhì)粒。連接反應(yīng)方法按生產(chǎn)商推薦的方法進(jìn)行，具體步驟為電泳確定回收產(chǎn)物的純度和濃度；向PCR管中依次加入約4 μ L回收產(chǎn)物，I μ LpGEM-T載體，5 μ L連接液，補(bǔ)充ddH20至總體積10 μ L ;16°C下反應(yīng)過夜。(3)感受態(tài)細(xì)胞制備感受態(tài)大腸桿菌的制備參考Sambrook等(1989)的氯化鈣法。具體步驟為于LB培養(yǎng)基平板上活化DH5 α菌株，并挑取單菌落接種于5mL LB液體培養(yǎng)基中，37°C下?lián)u動培養(yǎng)過夜(約12 16hr)，形成種子菌液。取此5mL菌液，于IOOmLLB液體培養(yǎng)基，37°C搖動培養(yǎng)2 2. 5hr，至OD600 = O. 6 O. 8左右時(shí)，吸取1. 5mL菌液于1. 5mL離心管中，冰浴5min，4°C下4000g離心lOmin，棄上清液，重復(fù)吸取菌液一次，沉淀用滅菌濾紙吸盡殘液，加入300 μ L冰預(yù)冷的lOOmmol/L CaCl2重懸浮菌體，冰浴30min，4°C下4000g離心IOmin,收集沉淀,加入100 μ L冰預(yù)冷的100mmol/L CaCl2重新懸浮細(xì)菌沉淀，即為感受態(tài)細(xì)胞，于4°C冰箱中放置12 24hr備用；或加入70 μ L冰預(yù)冷的IOOmmol/L CaCl2和30yL50%甘油于一 70°C保存?zhèn)溆谩?4)重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化及篩選從_70°C冰箱中取出感受態(tài)細(xì)胞，置于冰上解凍，在超凈工作臺上，取10 μ L連接產(chǎn)物于100 μ L感受態(tài)細(xì)胞中，輕彈管壁混勻，冰浴30min，將離心管置于42°C水浴中熱激90sec,迅速將離心管冰浴3 5min。每管中加入800 μ L LB液體培養(yǎng)基(不含抗生素)，37°C下?lián)u動培養(yǎng)90min，以利于細(xì)菌的復(fù)蘇和質(zhì)粒編碼抗性基因的表達(dá)。米用抗生素和α -互補(bǔ)法(Sambrook, et al. , 1989)篩選重組質(zhì)粒。取IOOmL LB固體培養(yǎng)基加熱融化，待冷卻至60°C以下時(shí)，加入100 μ LAmp,混勻后分倒4個(gè)培養(yǎng)皿；凝固后，每皿取4 μ LIPTG (200mg/mL水溶液過濾除菌)及40 μ LX-gal混勻后均勻涂布平板；待液體被吸收后取200 μ L轉(zhuǎn)化后的菌液均勻涂于上述LB平板上，正向放置30min待液體被吸收，37°C下倒置培養(yǎng)16 24hr。挑取直徑約為I 2mm大小的白色菌落于5mL LB液體培養(yǎng)基中(含100 μ g/mLAmp) 37°C下?lián)u動培養(yǎng)12 16hr,標(biāo)記后取0. 7mL與0. 3mL 50%(v/v)的滅菌甘油混勻后， 置-80°C下保存?zhèn)溆茫溆嗑河糜谥亟M質(zhì)粒抽提及鑒定。(5)重組質(zhì)粒的抽提經(jīng)抗生素及α -互補(bǔ)法篩選得到的待檢菌落培養(yǎng)物于4°C冰箱內(nèi)預(yù)冷5 lOmin，采用堿裂解法抽提質(zhì)粒DNA (Sambrook, et al. , 1989)。具體步驟如下離心管標(biāo)號,取含重組質(zhì)粒的菌體液1. 5mL至離心管中，4°C、12000g、離心lmin，棄上清，重復(fù)加菌體液一次，離心后將管倒置于吸水紙上，待流盡余液后加入150 μ L溶液I，劇烈振蕩，使菌體懸浮，室溫放置5 IOminJPA 250 μ L溶液II，顛倒離心管數(shù)次，溫和混勻，室溫放置5min，力口入180 μ L溶液III，蓋緊離心管，溫和顛倒離心管數(shù)次，使沉淀混勻，冰浴6 7min，4°C、12000g離心lOmin，上清夜移入干凈的離心管中，分別加入1/2體積的氯仿/異戊醇、Tris飽和苯酚，混勻，4°C、12000g離心5min，取上清，氯仿/異戊醇再抽提一次。上清水相移入干凈離心管中，加入1/10體積NaAc，2倍體積無水乙醇，混勻后，-20°C冰箱中20min或過夜，40C、12000g離心lOmin，棄上清，將管口打開倒置于吸水紙上，吸干余液，70%、100 %乙醇各洗一次，室溫下風(fēng)干，加入20 μ L TE，_20°C冰箱中備用。(6)重組質(zhì)粒的鑒定A、特異引物PCR鑒定利用特異引物對待檢重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系程序參數(shù)同上，PCR產(chǎn)物在1% TBE瓊脂糖凝膠上電泳鑒定。凡含有目的擴(kuò)增片段的克隆，進(jìn)一步進(jìn)行酶切鑒定。
B、重組質(zhì)粒酶切鑒定經(jīng)PCR鑒定陽性的重組質(zhì)粒，以下列體系進(jìn)行雙酶切10 X HBufferl. 5 μ L，BamHlO. 5μ L(14U/y L)，HindII 10. 5 μ L(14U/μ L)，待檢質(zhì)粒 4 μ L(約 400ng)，力口 ddH20 至總體積15yL，37°C下反應(yīng)過夜，取10 μ L反應(yīng)液電泳檢測酶切結(jié)果。C、重組質(zhì)粒序列測定經(jīng)上述PCR及酶切鑒定為陽性的克隆，擴(kuò)繁菌體，抽提并純化質(zhì)粒后，利用通用測序引物對重組質(zhì)粒進(jìn)行序列測定，由寶生物工程(大連)有限公司進(jìn)行DNA序列測定。6、PNRSV CP基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建用PCR擴(kuò)增出PAP基因，然后回收該基因片段后用SnaB I和Not I雙酶切，再與用同樣雙酶切的載體PPIC9K相連接構(gòu)建成表達(dá)載體PPIC9K-P，將pPIC9K_P轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109后經(jīng)篩選培養(yǎng)基篩選，堿法提取其重組質(zhì)粒，然后用酶切及PCR進(jìn)行鑒定。用PCR和質(zhì)粒酶切鑒定方法篩選出的陽性重組子后，再送到寶生物工程(大連)有限公司進(jìn)行DNA測序，以驗(yàn)證閱讀框的正確性。7、表達(dá)載體的序列分析及GS115的轉(zhuǎn)化序列分析驗(yàn)證后， 再用酶BglII將表達(dá)載體PPIC9K-P線性化，然后通過電轉(zhuǎn)移方法將其導(dǎo)入酵母GS115菌株的感受態(tài)細(xì)胞。具體操作程序如下7.1酵母感受態(tài)細(xì)胞的制備酵母菌株P(guān).pastoris GS115于500mlYPD (I %酵母提取物、2%蛋白胨、2%葡萄糖)中30°C培養(yǎng)至A600 =1. 5，1500g離心收集菌體，先后用500ml、250ml預(yù)冷的無菌水洗菌體，離心去上清夜，用20ml預(yù)冷的lmol/L山梨醇懸浮菌體，離心后菌體再用O. 5ml預(yù)冷的山梨醇懸浮后備用。7. 2轉(zhuǎn)化DNA的制備質(zhì)粒DNA的提取采用堿裂解法，然后將提取的DNA用BglII酶切，使之分成二個(gè)片段，其中之一是含有酵母表達(dá)盒的DNA區(qū)段，將其用低熔點(diǎn)瓊脂糖電泳后回收。8、酵母細(xì)胞的轉(zhuǎn)化取步驟2. 2. 7. 2制備的I 5yg DNA加到40 μ I山梨醇懸浮的酵母細(xì)胞中，冰浴5min，然后用電擊儀電擊，參數(shù)為0.81 ν、11.5μΡ。電擊結(jié)束后立即加入O. 5ml預(yù)冷的lmol/L山梨醇，取200 μ I于固體RDB轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基為RDB : (18. 6 %山梨醇、2 %葡萄糖、1. 34% YNB,O. 00004%生物素、各O. 005%谷氨酸、甲硫氨酸、賴氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、2%瓊脂糖)上涂板，30°C培養(yǎng)直至轉(zhuǎn)化子出現(xiàn)。用牙簽挑取轉(zhuǎn)化子對應(yīng)點(diǎn)種到MM(1. 34%YNB,O. 00004% 生物素、O. 5% 甲醇、1. 5% 瓊脂糖)平板和 MD (1. 34% YNB,O. 00004% 生物素、2%葡萄糖、1. 5%瓊脂糖)上，30°C培養(yǎng)2d，在MD上生長正常而在MM上生長不正常或不生長的轉(zhuǎn)化子即為陽性克隆。9、PNRSV CP基因在酵母中的誘導(dǎo)表達(dá)具體操作按Invitrogen 公司 Pichia Expression Kit 程序進(jìn)行。10、表達(dá)蛋白分子量的測定取Iml酵母發(fā)酵液，13000rpm離心15分鐘，取上清10 μ I進(jìn)行SDS-PAGE，電泳后用考馬斯亮蘭染色。11、表達(dá)蛋白 Western-blot 檢測SDS-PAGE電泳后將表達(dá)蛋白電轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜(NC)上，然后用PNRSV抗血清作為一抗與NC膜上的蛋白進(jìn)行免疫反應(yīng)，之后再用第二抗血清即堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗兔抗血清對表達(dá)蛋白進(jìn)行特異性鑒定，以未用甲醇誘導(dǎo)的酵母培養(yǎng)液作為陰性對照。本發(fā)明表達(dá)產(chǎn)物的純化及抗血清制備根據(jù)預(yù)表達(dá)結(jié)果，選取高效表達(dá)菌株，大量誘導(dǎo)表達(dá)，經(jīng)SDS-PAGE和考馬斯亮藍(lán)染色分析，切膠條帶用生理鹽水適當(dāng)稀釋后，加入等體積福氏不完全佐劑乳化；蛋白液體(lmg/mL)直接與福氏不完全佐劑進(jìn)行乳化。免疫大白兔采用肌肉注射結(jié)合皮下注射的方式，第一次免疫之后，分別于第21天、第35天和第49天加強(qiáng)免疫3次。最后一次注射免疫后7天開始少量靜脈采血測定效價(jià)，根據(jù)效價(jià)情況分次大量取血。制備的抗血清加入O. 02%的疊氮化鈉，_20°C保存?？寡逍r(jià)及特異性測定將抗血清進(jìn)行一系列稀釋后，用間接ELISA方法測定抗血清的效價(jià)和特異性。(I).用包被液將抗原稀釋成2ug/mL，IOOul/孔加到96孔可拆酶標(biāo)板中，4°C過夜。(2). PBS-T洗三次于吸水紙上拍干，加200ul/孔1% BSA，37°C恒溫箱2小時(shí)。(3).取抗血清按照1: 1000，I 2000，I 4000，I 8000，I 16000，I 32000，I 64000，I 128000作梯度稀釋，每個(gè)樣品不小于200ul。(4).取出37°C恒溫箱里的抗原板，PBS-T洗三次于吸水紙上拍干，加步驟3中稀釋好的抗血清樣品IOOul/孔，每個(gè)稀釋度加并排兩個(gè)孔。(5).取陰性血清1: 1000稀釋按順序加到抗血清最小濃度樣品后作為陰性對照。置37°C恒溫箱I小時(shí)。(也要重復(fù)2次)(6). PBS-T洗三次于吸水紙上拍干，羊抗兔酶標(biāo)(辣根過氧化物酶)二抗按照使用說明稀釋好，IOOul/孔加到酶標(biāo)板中，置37°C恒溫箱I小時(shí)。
(7). PBS-T洗五次于吸水紙上拍干，TMB顯色液IOOul/孔加到酶標(biāo)板中，置37°C恒溫箱10分鐘。酶標(biāo)儀450nm測OD值并打印結(jié)果。(8).通常將2. 5倍陰性對照OD值看作陽性，根據(jù)結(jié)果判斷樣品滴度。(9).選擇最適合的工作濃度，分別與TMV、PVX、PVY等病毒進(jìn)行免疫反應(yīng)，以測試該血清的特異性。為了進(jìn)一步驗(yàn)證本發(fā)明技術(shù)方案，作了一下測試和鑒定及分析1、提取植物總RNA以及含CP基因片段的克隆以帶病葉片總RNA為模板，經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到長度約675bp的DNA目的片段。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化后克隆到pGEM -T載體上，經(jīng)藍(lán)白斑篩選和酶切鑒定，對所獲得的陽性克隆進(jìn)行序列測定，確定了擴(kuò)增產(chǎn)物的核苷酸序列，其中包含675bp的PNRSV CP序列，與GenBank報(bào)道的CP序列一致。2、含CP基因重組載體的酶切鑒定應(yīng)用特異性引物PPV-F和PPV-R所獲得的CP基因PCR產(chǎn)物經(jīng)雙酶切后，連接到同樣用BamHl和HindIII雙酶切的可隆載體上，組建成重組載體。經(jīng)Colony PCR擴(kuò)增，陽性克隆可以得到675bp大小的條帶，抽提質(zhì)粒經(jīng)BamHl和HindIII雙酶切證明篩選出的陽性重組子正確，見圖1。3、表達(dá)載體pPIC9K-PNRSV的鑒定表達(dá)載體 pPIC9K-PNRSV的構(gòu)建策略如圖2.對表達(dá)載體pPIC9K_PNRSV分別用PCR及SnaB I/Not I雙酶切鑒定及PCR擴(kuò)增，結(jié)果表明PNRSV CP基因已經(jīng)克隆于表達(dá)載體PPIC9K上，如圖3 :對表達(dá)載體進(jìn)行序列分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CP插入方向及位置完全正確，可以進(jìn)行下一步誘導(dǎo)表達(dá)。4、PNRSV CP基因的誘導(dǎo)表達(dá)及表達(dá)蛋白的SDS-PAGE分析
帶有表達(dá)載體的GSl 15在28°C條件下，在BMMY培養(yǎng)基(I %酵母提取物，2%蛋白腺，IOOmM 憐酸鐘，pH 6. O,1. 34%酵母氣喊(yeast nitrogen base, YNB), O. 00004 生物素，I %甲醇)連續(xù)培養(yǎng)96小時(shí)后，取培養(yǎng)基上清經(jīng)SDS-PAGE電泳分析，發(fā)現(xiàn)在泳道中有一條非常明顯的蛋白帶，大小約為25Ku，而在陰性對照中幾乎看不到任何蛋白帶，如圖4，經(jīng)測定其蛋白表達(dá)量約為50-60 μ g/ml上清。5、表達(dá)蛋白的鑒定經(jīng)Western-blotting分析發(fā)現(xiàn)表達(dá)蛋白帶能夠與PNRSV兔抗血清發(fā)生特異性的免疫反應(yīng)，如圖5，說明PNRSV CP基因在酵母中得到了正確表達(dá)。6、表達(dá)產(chǎn)物的純化大量誘導(dǎo)的菌液經(jīng)SDS-PAGE電泳染色后，切下25ku的表達(dá)蛋白條帶作為直接免疫源，見圖6。7、抗血清的制備和效價(jià)及特異性測定將切下得到的CP蛋白免疫大白兔，獲得了 PNRSV特異性抗血清。經(jīng)過ELISA測定其抗血清效價(jià)為3. 2 X 104，正在制備酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，并在實(shí)際檢測工作中加以檢驗(yàn)。根據(jù)目前市場價(jià)格，制備出的40mL抗血清經(jīng)濟(jì)價(jià)值超過一億元，可檢測樣品1000多萬份，經(jīng)ELISA檢測驗(yàn)證，該抗血清均與PVX、PVY、TMV及健康的桃樹、李樹和櫻桃葉片等李樹植物沒有血清學(xué)反應(yīng)。根據(jù)目前市場價(jià)格，制備出的40mL抗血清經(jīng)濟(jì)價(jià)值超過一億元，可檢測樣品1000多萬份。本發(fā)明李壞死環(huán)斑病毒(PNRSV)ELISA檢測試劑盒，1、試劑盒內(nèi)容包括I). PNRSV抗體；2).酶標(biāo)抗體堿性磷酸酯酶標(biāo)記；3).底物對硝基苯磷酸鈉(pNPP) ；4) · PNRSV 陽性對照；5) · PNRSV 陰性對照。本發(fā)明試劑盒的用途及檢測數(shù)主要檢測李屬植株中的PNRSV，用于100個(gè)酶聯(lián)板孔的檢測。2、采用本發(fā)明試劑盒的檢測方法I).樣品制備將待測樣品和健康對照樣品按1: 10 (重量體積)加入包被緩沖液，用研缽研磨成漿，2000r/min離心10分鐘，上清即為制備好的檢測樣品。陰性對照、陽性對照作相應(yīng)的處理；2).加樣加入制備好的檢測樣品、陰性對照、陽性對照，IOOyL/孔，加蓋，4°C冰箱孵育過夜，然后用PBST洗滌3次，每次3分鐘；3).加抗體用酶標(biāo)抗體緩沖液將PNRSV抗體按工作濃度稀釋，加入酶聯(lián)板的孔中，100 μ L/孔，加蓋，37°C孵育2小時(shí)，清空孔中溶液，PBST洗滌3次，每次3分鐘；4).加酶標(biāo)抗體用酶標(biāo)抗體緩沖液將抗體按要求倍數(shù)稀釋，加至酶聯(lián)板中，100 μ L/孔，加蓋，37°C孵育4小時(shí)，然后用PBST洗滌3次，每次3分鐘；5).加底物將底物P NPP加入到底物緩沖液中使終濃度為lmg/mL (現(xiàn)配現(xiàn)用)，按100 μ L/孔，加入到酶聯(lián)板中，室溫孵育；6).讀數(shù)在不同的時(shí)間內(nèi)如30分鐘、I小時(shí)內(nèi)，用酶聯(lián)儀在405nm處讀OD值。3.數(shù)據(jù)處理及結(jié)果判斷 I).對照孔的OD4tl5值(緩沖液孔、陰性對照及陽性對照孔)，應(yīng)該在質(zhì)量控制范圍內(nèi)。即緩沖液孔和陰性對照孔的OD4tl5值< O. 15。當(dāng)陰性對照孔的OD4tl5值< O. 05時(shí)，按O. 05計(jì)算；陽性對照OD4tl5值/陰性對照OD4tl5值> 5-10 ;孔的重復(fù)性基本一致。
2).在滿足了上述質(zhì)量要求后，結(jié)果原則上可判斷如下樣品OD4tl5值/陰性對照OD405值明顯> 2，判為陽性；樣品OD4tl5值/陰性對照OD4tl5值在閾值附近，判為可疑樣品，需重新做一次，或用其他方法加以驗(yàn)證；樣品OD4tl5值/陰性對照OD4tl5值明顯< 2，判為陰性；若滿足不了上述質(zhì)量要求，則不能進(jìn)行結(jié)果判斷。4.緩沖液的配制I).包被緩沖液(pH9. 6) =Na2CO3L 59g ；NaHC032. 93g ；NaN30. 2g ;溶于蒸餾水，調(diào) pH值至9. 6，蒸餾水定容至1000mL，4°C儲存。2). PBST緩沖液(洗滌緩沖液)在IOOOmL蒸餾水中加入8. Og NaCl,1. 15g Na2HPO4,0. 2g KH2PO4,0. 2g KCl，0.5mL Tween-20，調(diào) pH 值至7. 4。3).酶標(biāo)抗體緩沖液向IOOOmLPBST加入2. Og BSA(牛血清白蛋白)或脫脂奶粉，20. OgPVP (MW24, 000-40，000)，O. 2g NaN3,調(diào) pH 值至 7. 4，4°C儲存。4).底物緩沖液在800mL 蒸 餾水中加入0.1g MgCl2 ；0. 2g NaN3 ；97mL 二乙醇胺；用 HCl 調(diào) pH 值至9. 8，蒸餾水定溶至1000mL，4°C儲存。
權(quán)利要求
1.一種李壞死環(huán)斑病毒外殼蛋白基因表達(dá)方法，其特征在于包括以下步驟 A、從PNRSV感病材料中提取李壞死環(huán)斑病毒的RNA； B、采用RT-PCR擴(kuò)增的方法克隆李屬壞死環(huán)斑病毒的外殼蛋白基因；將得到的殼蛋白基因連接到PGEM-T載體上，得到pGEM-T-PNRSV重組載體，并以序列分析確定該病毒外殼蛋白基因的序列正確性； C、構(gòu)建PNRSV外殼蛋白基因真核表達(dá)載體； D、轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115菌株,誘導(dǎo)畢赤酵母表達(dá)外殼蛋白； E、用Western-blot檢測表達(dá)蛋白大小的正確性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種李壞死環(huán)斑病毒外殼蛋白基因表達(dá)方法，其特征在于步驟A中提取李壞死環(huán)斑病毒的RNA具體包括以下步驟 (1)取PNRSV感病材料的幼嫩組織若干，液氮研磨，分裝成<IOOmg小份至預(yù)冷E. P管，取IOOmg樣品加入ImlTriZOL抽提；(2)12000rpm，2-8°C 離心 IOmin ； (3)吸取上清液，轉(zhuǎn)移至新的1.5mlE. P管中，15-30°C放置5min ； (4)加0. 2ml 氯仿，充分抽提 8min，15_30°C放置 2_3min ；(5)I^OOOrpmJ-ST^ 離心 15min ； (6)吸取上清液，轉(zhuǎn)移至新的1.5mlE. P.管中，加0. 5ml異丙醇，15_30°C放置IOmin ；(7)I^OOOrpmJ-ST^ 離心 IOmin ； (8)棄去上清液，得膠體狀RNAJP1-1.5ml75%乙醇，渦旋混勻 (9)7500rpm、2-8°C離心5min，棄去上清液，留下膠體狀RNA ；(10)干燥5-10min ； (11)溶于Rnase.free水中，槍頭打勻，55_60°C溫浴IOmin ； (12)5%Agarose膠檢測，測定濃度并調(diào)至2_3ii g/y L，_70°C儲存?zhèn)溆谩?br> 3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種李壞死環(huán)斑病毒外殼蛋白基因表達(dá)方法，其特征在于步驟B具體方法包括 a、RT-PCR擴(kuò)增目的基因 (1)引物 上游引物PNRSV-F 5 ' -GTGGATCCTACGTAATGGTTTGCCGAATTTG-3 '，其中 GGATCC 為BamHI酶切位點(diǎn)，TAC GTA為SnaB I酶切位點(diǎn)； 下游引物PNRSV-R :5' -GGAAGCTTGCGGCCGCGATCTCAAGCAGGTC-3 ',其中 AAGCTT 為Hind III酶切位點(diǎn)，GCGGCCGC為Not I酶切位點(diǎn)； 在引物兩端即5’及3’分別加上了 SnaB I及Not I酶切位點(diǎn)引物； (2)擴(kuò)增體系模板RNAI H L·5umol/L上游引物I UL ·5y mol/L下游弓I物I PL 擴(kuò)增酶混合液I P L ·2X buffer12.5叫 RNase-free ddH20至總體積 25 y L (3)擴(kuò)增過程·50 0C 30min，94 °C 3min，94 °C lmin，60 °C 30s, 72 °C lmin，72 °C 10min，4 °C ;其中·94°C lmin,60°C 30s, 2°C lmin,72°C IOmin 循環(huán) 35 次； b、基因克隆及序列測序 (1)PNRSVCP產(chǎn)物的回收 取擴(kuò)增產(chǎn)物在I % TBE瓊脂糖凝膠上電泳，電泳完畢，切下目的條帶，采用PCR產(chǎn)物回收試劑盒回收； (2)重組質(zhì)粒的構(gòu)建 采用pGEM-T載體進(jìn)行TA克隆，構(gòu)建重組質(zhì)粒，具體步驟為電泳確定回收產(chǎn)物的純度和濃度；向PCR管中依次加入約4 ii L回收產(chǎn)物，I u LpGEM-T載體，5 u L連接液，補(bǔ)充ddH20至總體積IOii L ;16°C下反應(yīng)過夜； (3)感受態(tài)細(xì)胞制備 于LB培養(yǎng)基平板上活化DH5 a菌株，并挑取單菌落接種子5mlLB液體培養(yǎng)基中，37°C下?lián)u動培養(yǎng)過夜，形成種子菌液；取此5ml菌液，于100ml LB液體培養(yǎng)基，37°C搖動培養(yǎng)·2 2. 5hr,至0D600 = 0. 6 0. 8時(shí),吸取1. 5ml菌液于1. 5ml離心管中，冰浴5min, 4°C下·4000g離心lOmin，棄上清液，重復(fù)吸取菌液一次，沉淀用滅菌濾紙吸盡殘液，加入300 u L冰預(yù)冷的100mmol/L CaCl2重懸浮菌體,冰浴30min,4°C下4000g離心IOmin,收集沉淀,加入·100 u L冰預(yù)冷的100mmol/L CaCl2重新懸浮細(xì)菌沉淀，即為感受態(tài)細(xì)胞，于4°C冰箱中放置·12 24hr備用；或加入70 ii L冰預(yù)冷的IOOmmo I/L CaCl2和30 u L50%甘油于_70°C保存?zhèn)溆茫? (4)重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化及篩選 從_70°C冰箱中取出感受態(tài)細(xì)胞，置于冰上解凍，在超凈工作臺上，取10 ii L連接產(chǎn)物于100 ii L感受態(tài)細(xì)胞中，輕彈管壁混勻，冰浴30min，將離心管置于42°C水浴中熱激90sec，迅速將離心管冰浴3 5min。每管中加入800 u LLB液體培養(yǎng)基(不含抗生素)，37°C下?lián)u動培養(yǎng)90min，以利于細(xì)菌的復(fù)蘇和質(zhì)粒編碼抗性基因的表達(dá)； 采用抗生素和a -互補(bǔ)法篩選重組質(zhì)粒；取100ml LB固體培養(yǎng)基加熱融化，待冷卻至·60°C以下時(shí)，加入IOOii LAmp，混勻后分倒4個(gè)培養(yǎng)皿；凝固后，每皿取4 y LIPTG，200mg/ml水溶液過濾除菌及40 u LX-gal混勻后均勻涂布平板；待液體被吸收后取200 U I轉(zhuǎn)化后的菌液均勻涂于上述LB平板上，正向放置30min待液體被吸收，37°C下倒置培養(yǎng)16 24hr ；挑取直徑約為I 2mm大小的白色菌落于5ml LB液體培養(yǎng)基中，37°C下?lián)u動培養(yǎng)12 ·16hr，標(biāo)記后取0.7ml與0.3ml 50%的滅菌甘油混勻后，置_80°C下保存?zhèn)溆?，其余菌液用于重組質(zhì)粒抽提及鑒定； (5)重組質(zhì)粒的抽提 經(jīng)抗生素及a -互補(bǔ)法篩選得到的待檢菌落培養(yǎng)物于4°C冰箱內(nèi)預(yù)冷5 lOmin，采用堿裂解法抽提質(zhì)粒DNA ;具體步驟如下離心管標(biāo)號，取含重組質(zhì)粒的菌體液1. 5ml至離心管中，4°C、12000g、離心lmin，棄上清，重復(fù)加菌體液一次，離心后將管倒置于吸水紙上，待流盡余液后加入150 u L溶液I，劇烈振蕩，使菌體懸浮，室溫放置5 lOmin，加入250 y L溶液II，顛倒離心管數(shù)次，溫和混勻，室溫放置5min，加入180 ii L溶液III，蓋緊離心管，溫和顛倒離心管數(shù)次，使沉淀混勻，冰浴6 7min，4°C、12000g離心lOmin，上清夜移入干凈的離心管中，分別加入1/2體積的氯仿/異戍醇、Tris飽和苯酹,混勻，4°C、12000g離心5min,取上清,氯仿/異戊醇再抽提一次；上清水相移入干凈離心管中，加入1/10體積NaAc，2倍體積無水乙醇，混勻后，_20°C冰箱中20min或過夜，4°C、12000g離心lOmin，棄上清，將管口打開倒置于吸水紙上，吸干余液，70%, 100%乙醇各洗一次，室溫下風(fēng)干，加入20 u LTE,-20°C冰箱中備用； (6)重組質(zhì)粒的鑒定 ①、特異引物PCR鑒定 利用特異引物對待檢重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系程序參數(shù)同上，PCR產(chǎn)物在1%TBE瓊脂糖凝膠上電泳鑒定，凡含有目的擴(kuò)增片段的克隆，進(jìn)一步進(jìn)行酶切鑒定； ②、重組質(zhì)粒酶切鑒定 經(jīng)PCR鑒定陽性的重組質(zhì)粒，以下列體系進(jìn)行雙酶切10XHBufferl. 5 u L,BamHlO. 5 u L, HindIIIO. 5 y L，待檢質(zhì)粒 4 y L，加 ddH20 至總體積 15 y L，37°C下反應(yīng)過夜，取10 ii L反應(yīng)液電泳檢測酶切結(jié)果； ③、重組質(zhì)粒序列測定 經(jīng)上述PCR及酶切鑒定為陽性的克隆，擴(kuò)繁菌體，抽提并純化質(zhì)粒后，利用通用測序引物對重組質(zhì)粒進(jìn)行序列測定。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種李壞死環(huán)斑病毒外殼蛋白基因表達(dá)方法，其特征在于步驟C的具體做法 用PCR擴(kuò)增出PAP基因，然后回收該基因片段后用SnaB I和Not I雙酶切，再與用同樣雙酶切的載體PPIC9K相連接構(gòu)建成表達(dá)載體pPIC9K-P，將pPIC9K-P轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109后經(jīng)篩選培養(yǎng)基篩選，堿法提取其重組質(zhì)粒，然后用酶切及PCR進(jìn)行鑒定；用PCR和質(zhì)粒酶切鑒定方法篩選出的陽性重組子后，再進(jìn)行DNA測序，以驗(yàn)證閱讀框的正確性。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種李壞死環(huán)斑病毒外殼蛋白基因表達(dá)方法，其特征在于步驟D的具體做法 序列分析驗(yàn)證后，再用酶BglII將表達(dá)載體pPIC9K-P線性化，然后通過電轉(zhuǎn)移方法將其導(dǎo)入酵母GS115菌株的感受態(tài)細(xì)胞； (1)制備酵母感受態(tài)細(xì)胞 酵母菌株 P. pastoris GS 115 于 500ml YPD 中 30°C培養(yǎng)至 A 600 =1. 5，1500g 離心收集菌體，先后用500ml、250ml預(yù)冷的無菌水洗菌體，離心去上清夜，用20ml預(yù)冷的Imol/L山梨醇懸浮菌體,離心后菌體再用0. 5ml預(yù)冷的山梨醇懸浮后備用； (2)制備轉(zhuǎn)化DNA:質(zhì)粒DNA的提取采用堿裂解法，然后將提取的DNA用Bgl II酶切，使之分成二個(gè)片段，其中之一是含有酵母表達(dá)盒的DNA區(qū)段，將其用低熔點(diǎn)瓊脂糖電泳后回收； (3)酵母細(xì)胞的轉(zhuǎn)化 取上述步驟制備的I 5μ gDNA加到40 μ I山梨醇懸浮的酵母細(xì)胞中，冰浴5min，然后用電擊儀電擊，參數(shù)為0. 8kV、11.5yF;電擊結(jié)束后立即加入O. 5ml預(yù)冷的lmol/L山梨醇，取200 μ I于固體RDB轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基為RDB : 18. 6 %山梨醇、2 %葡萄糖、1. 34% ΥΝΒ、·0.00004%生物素、各O. 005%谷氨酸、甲硫氨酸、賴氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、2%瓊脂糖，上涂板，30°C培養(yǎng)直至轉(zhuǎn)化子出現(xiàn)；用牙簽挑取轉(zhuǎn)化子對應(yīng)點(diǎn)種到麗1. 34% YNB,O. 00004%生物素、O. 5%甲醇、1. 5%瓊脂糖，平板和MD 1. 34% YNB,O. 00004%生物素、2 %葡萄糖、·1.5%瓊脂糖上，30°C培養(yǎng)2d，在MD上生長正常而在MM上生長不正?；虿簧L的轉(zhuǎn)化子即為陽性克?。? (4)PNRSV CP基因在酵母中的誘導(dǎo)表達(dá) 具體操作按Invitrogen公司Pichia Expression Kit程序進(jìn)行。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種李壞死環(huán)斑病毒外殼蛋白基因表達(dá)方法，其特征在于步驟E的具體做法 (1)表達(dá)蛋白分子量的測定 取Iml酵母發(fā)酵液，13000rpm離心15分鐘，取上清10 μ I進(jìn)行SDS-PAGE，電泳后用考馬斯亮蘭染色； (2)表達(dá)蛋白Western-blot檢測 SDS-PAGE電泳后將表達(dá)蛋白電轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，然后用PNRSV抗血清作為一抗與硝酸纖維素膜上的蛋白進(jìn)行免疫反應(yīng)，之后再用第二抗血清即堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗兔抗血清對表達(dá)蛋白進(jìn)行特異性鑒定，以未用甲醇誘導(dǎo)的酵母培養(yǎng)液作為陰性對照。
7.—種抗血清，其特征在于其制備方法包括以下步驟根據(jù)預(yù)表達(dá)結(jié)果，選取高效表達(dá)的畢赤酵母GSl 15菌株，大量誘導(dǎo)表達(dá)，經(jīng)SDS-PAGE和考馬斯亮藍(lán)染色分析，切膠條帶用生理鹽水適當(dāng)稀釋后，加入等體積福氏不完全佐劑乳化；蛋白液體lmg/mL直接與福氏不完全佐劑進(jìn)行乳化；免疫大白兔采用肌肉注射結(jié)合皮下注射的方式，第一次免疫之后，分別于第21天、第35天和第49天加強(qiáng)免疫3次；最后一次注射免疫后7天開始少量靜脈采血測定效價(jià)，根據(jù)效價(jià)情況分次大量取血；制備的抗血清加入O. 02%的疊氮化鈉，_20°C保存。
8.一種試劑盒，其特征在于該試劑盒內(nèi)包括1).PNRSV 抗體 2).酶標(biāo)抗體堿性磷酸酯酶標(biāo)記 3).底物對硝基苯磷酸鈉(pNPP) 4)· PNRSV陽性對照 5).PNRSV陰性對照。
全文摘要
本發(fā)明公開了李壞死環(huán)斑病毒外殼蛋白基因表達(dá)方法及抗血清和試劑盒，該表達(dá)方法從PNRSV感病材料中提取李壞死環(huán)斑病毒的RNA；采用RT-PCR擴(kuò)增的方法克隆李屬壞死環(huán)斑病毒的外殼蛋白基因；將得到的殼蛋白基因連接到pGEM-T載體上，得到pGEM-T-PNRSV重組載體，并以序列分析確定該病毒外殼蛋白基因的序列正確性；構(gòu)建PNRSV外殼蛋白基因真核表達(dá)載體；轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115菌株，誘導(dǎo)畢赤酵母表達(dá)外殼蛋白；用Western-blot檢測表達(dá)蛋白大小的正確性。本發(fā)明的目的提供一種用畢赤酵母表達(dá)李壞死環(huán)斑病毒外殼蛋白基因的方法；另一目的是提供一種抗血清；另一目的是提供一種李壞死環(huán)斑病毒ELISA檢測試劑盒。
文檔編號C07K16/10GK103045635SQ20121024585
公開日2013年4月17日 申請日期2012年7月12日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月12日
發(fā)明者陳定虎, 劉恭源, 楊雷亮, 王勇, 劉軍 申請人:陳定虎