專利名稱：一種阿特拉津人工完全抗原的合成方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種阿特拉津人工完全抗原的合成方法，屬于生物化工技術(shù)領(lǐng)域，用于制備特異識別化學(xué)農(nóng)藥阿特拉津的高效抗體與研制可以快速檢測阿特拉津殘留的免疫速測試劑盒。
背景技術(shù)：
除草劑阿特拉津(Atrazine，AT)又名莠去津，全稱為2_氯_4_乙胺_6_異丙胺_1， 3，5-三嗪，分子量為215. 69，純品為無色無嗅結(jié)晶，熔點為175 177°C，28°C時在水中的溶解度為28mg/L，27°C時在甲醇中的溶解度為1800mg/L，在氯仿中的溶解度為52mg/mL。阿特拉津自1952年由瑞士 Ciki-Geigy開發(fā)生產(chǎn)以來，作為在擇性內(nèi)吸傳導(dǎo)型苗前、苗后除草劑，在世界各國得到了大面積使用，主要用于玉米、高粱、甘蔗、果樹、林地等旱田，可防除一年生禾本科雜草和闊葉雜草，對某些多年生雜草也有一定的抑制作用；阿特拉津具有一定殘留毒性，在水中達(dá)到一定濃度時，能抑制多種藻類的光合作用及生長，并且使魚體內(nèi)的 Ca2+、Mg 2+等無機離子濃度顯著下降，導(dǎo)致其重要的生理功能發(fā)生紊亂，對生物體的內(nèi)分泌系統(tǒng)產(chǎn)生干擾作用，引起一系列病癥。當(dāng)在水中的濃度達(dá)到3 μ g/L時，可致使小鼠的染色體受損，能夠殺死水底節(jié)肢動物。阿特拉津可經(jīng)口、皮膚及其它裸露部位進(jìn)入人體血液循環(huán)，嚴(yán)重時可引起腹痛、腹瀉、嘔吐等中毒癥狀。在低濃度長期暴露下，會影響人體的內(nèi)分泌系統(tǒng)及生殖系統(tǒng)，對人體有潛在的致癌作用，甚至引發(fā)癌癥，美國環(huán)境保護(hù)局規(guī)定阿特拉津在水中的最高允許濃度為3 μ g/L,歐盟規(guī)定飲用水中阿特拉津含量不得超過0. 1 μ g/L,我國國家環(huán)保部規(guī)定地表水(1-2類)中阿特拉津的最高允許濃度為3 μ g/L，阿特拉津引起的嚴(yán)重污染環(huán)境的問題已引起了人們的廣泛關(guān)注。因此，建立阿特拉津殘留的檢測方法具有十分迫切和必要的現(xiàn)實意義。阿特拉津及其降解產(chǎn)物準(zhǔn)確分析的常用方法有C18小柱固相萃取、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用或高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用測定以及傳感器檢測等。GC的檢測器通常是ECD或NPD， HPLC采用紫外或可見光檢測器進(jìn)行檢測。這些檢測方法均需要昂貴的儀器設(shè)備及專業(yè)的操作人員，不適合于現(xiàn)場的快速檢測。免疫學(xué)方法檢測阿特拉津所具備的快速、簡便、靈敏、便攜等優(yōu)點使其適合于現(xiàn)場的快速檢測，而免疫學(xué)檢測方法的基礎(chǔ)是相應(yīng)的高特異性、高親和力的抗體，而阿特拉津作為小分子半抗原，本身不具備免疫原性，因此，半抗原的結(jié)構(gòu)改造和全抗原合成是建立免疫速測技術(shù)的關(guān)鍵和難點之一。

發(fā)明內(nèi)容
針對農(nóng)藥阿特拉津無免疫原性不能直接用于免疫制備針對阿特拉津的特異抗體， 而阿特拉津分子不能與蛋白質(zhì)(如牛血清白蛋白等)直接偶聯(lián)，本發(fā)明的目的就是提供一種阿特拉津半抗原的改造方法，并由此合成阿特拉津人工完全抗原，經(jīng)動物免疫后可以生產(chǎn)出特異識別阿特拉津的抗體。阿特拉津人工完全抗原的合成工藝包括
(1)羧基化阿特拉津的合成與鑒定利用三巰基丙酸取代阿特拉津上的氯原子，反應(yīng)方程為
權(quán)利要求
1.一種阿特拉津人工完全抗原的合成方法，其特征在于以阿特拉津原藥為半抗原，對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行羧基化改造，利用DCC及NHS將羧基化的阿特拉津與載體蛋白BSA進(jìn)行偶聯(lián)，經(jīng)紫外光譜鑒定及SDS-PAGE鑒定成功合成了阿特拉津人工完全抗原。
2.如權(quán)利要求1所述阿特拉津人工完全抗原的合成方法其特征在于對阿特拉津進(jìn)行羧基化改造，羧基化改造的工藝為組裝回流裝置于加熱磁力攪拌器上，邊加熱邊攪拌；向反應(yīng)瓶O50mL)中加入50mL無水乙醇，稱取1. 03g阿特拉津(純度97% )加入無水乙醇中，攪拌混勻；反應(yīng)瓶中加入2. Og Κ0Η，通氮氣除氧30min后加入0. 5g 3-巰基丙酸；氮氣保護(hù)下，加熱回流池后，補加3-巰基丙酸0. 5g，TLC (薄層層析色譜)檢測反應(yīng)是否完全，反應(yīng)完全后停止加熱，室溫攪拌反應(yīng)過夜；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇，加入NaHC03溶液(5% ) 25mL溶解產(chǎn)物，用3 X IOmL CHCl3萃取，棄有機相，收集水相，用HCl(6mol/mL)調(diào)節(jié)水相pH值至1 2，反應(yīng)液變?yōu)槿闋钜?，?3X20mL乙酸乙酯對乳狀液進(jìn)行萃取，將乙酸乙酯萃取液加入無水硫酸鈉室溫干燥過夜，抽濾并旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，得到的固體即為羧基化的阿特拉津粗品，用乙酸乙酯重結(jié)晶純化粗品產(chǎn)物， 傅立葉紅外光譜鑒定改造后的羧基，質(zhì)譜法確定羧基化阿特拉津的大體結(jié)構(gòu)以及分子量的大小。
3.如權(quán)利要求1所屬阿特拉津人工完全抗原的合成方法，其特征包括利用DCC及NHS 將羧基化的阿特拉津與載體蛋白進(jìn)行偶聯(lián)，合成工藝為準(zhǔn)確稱取羧基化阿特拉津0. 057g溶于ImL的無水DMF中，溶解后加入0. 023g的NHS 和0. 0453g的DCC,室溫攪拌反應(yīng)3. 5h，然后4000r/min離心IOmin,棄沉淀，收集上清液； 稱取BSA 0. 34 g溶于20mL純水中，向蛋白溶液中緩慢加入4. 2mL的DMF并劇烈攪拌使其充分溶解后加入收集的上清液中，4°C環(huán)境下緩慢攪拌Mh ；將反應(yīng)液置于透析袋中，于透析液PBS (0. Olmol/L、pH7. 2)中透析3天，透析過程中有沉淀析出，用0. lmol/L的NaOH堿化透析液，待沉淀溶解后再將透析液的PH值調(diào)回7. 0左右。SDS-PAGE與紫外分光光度法計算出AT與載體蛋白偶聯(lián)結(jié)果。
4.如權(quán)利要求3所述，載體蛋白可以是牛血清白蛋白(BSA)、卵清白蛋白(OVA)、人血清白蛋白(HAS)或者匙孔藍(lán)蛋白(KLH)等。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種阿特拉津人工完全抗原的合成方法，屬于生物化工技術(shù)領(lǐng)域，本發(fā)明將阿特拉津的結(jié)構(gòu)進(jìn)行羧基化改造，利用DCC及NHS將羧基化的阿特拉津與載體蛋白BSA進(jìn)行偶聯(lián)，經(jīng)紫外光譜鑒定及SDS-PAGE鑒定成功合成了阿特拉津人工完全抗原，制備方法簡單有效，成本低廉，合成阿特拉津人工完全抗原可以應(yīng)用于制備特異識別化學(xué)農(nóng)藥阿特拉津的高效抗體與研制快速檢測阿特拉津殘留的免疫速測試劑盒，為以后該物質(zhì)的檢測與研究提供了方便的途徑。
文檔編號C07K14/765GK102372774SQ20101025583
公開日2012年3月14日 申請日期2010年8月18日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月18日
發(fā)明者寧保安, 柳明, 王彩紅, 王紅勇, 高志賢 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院衛(wèi)生學(xué)環(huán)境醫(yī)學(xué)研究所