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      一種檸檬黃完全抗原的合成方法

      文檔序號:3563391閱讀:321來源:國知局
      專利名稱:一種檸檬黃完全抗原的合成方法
      技術(shù)領(lǐng)域
      一種檸檬黃的通用人工抗原的合成方法,屬于生物化工技術(shù)領(lǐng)域。
      背景技術(shù)
      檸檬黃色素(Tar)是目前我國批準(zhǔn)使用的六種食用合成色素之一,其分子結(jié) 構(gòu)為偶氮化合物,在體內(nèi)代謝的產(chǎn)物為對人體具有潛在危害的一芳香類化合物。 因此,我國對在食品中的檸檬黃色素有嚴(yán)格限制。凡是肉類及其加工品,魚類 及其加工品等都不能使用人工合成色素,即使在適用的品種和范圍內(nèi),使用劑 量也有嚴(yán)格規(guī)定,決不允許過量使用。但實際上,我國食品中普遍存在檸檬黃 色素的超標(biāo)、超范圍使用現(xiàn)象屢禁不止。如果人們長期或一次性大量食用擰檬 黃含量超標(biāo)的食品,可能會引起過敏、腹瀉等癥狀,當(dāng)攝入量過大,超過肝臟 負(fù)荷時會在體內(nèi)蓄積,對腎臟、肝臟產(chǎn)生一定傷害。目前,檢測檸檬黃含量采 取的方法是薄層分析及分光光度法,近年來,我國科研工作者在檸檬黃檢測方 面做了大量的工作,但都主要集中在理化檢測方面,這些方法不僅需要昂貴的 儀器設(shè)備,專業(yè)的操作人員,對檢材的要求也比較高,并且需要進(jìn)一步的樣本 前處理才能進(jìn)行,這己經(jīng)不能達(dá)到現(xiàn)代檢測對快速、方便、準(zhǔn)確的要求。近年 來,國內(nèi)外已經(jīng)開展了對色素類免疫分析方法的研究,但國內(nèi)外尚沒有針對擰 檬黃的酶聯(lián)免疫檢測的報道,為了彌補(bǔ)這一空白,有必要制備檸檬黃完全抗原。

      發(fā)明內(nèi)容
      本發(fā)明的目的是提供一種擰檬黃完全抗原的合成方法。所制備的產(chǎn)品用于 檸檬黃的免疫分析方法研究。為今后人們的研究提供了必需的人工抗原。
      本發(fā)明的技術(shù)方案 一種檸檬黃完全抗原的合成方法,以擰檬黃為半抗原, 用混合酸酐法將其與載體蛋白BSA偶聯(lián),用分光光度法測定偶聯(lián)物的偶聯(lián)比; 步驟為
      (1)檸檬黃完全抗原的合成
      配制A液取53.4mg (O.lmmol)檸檬黃溶于2mL 二甲亞砜(DMSO)中, 冰浴10min,加入51pL三正丁胺,冰浴10min,加入87^L氯甲酸異丁酯,4°C 下,攪拌孵育lh,為A液,4t:保存?zhèn)溆茫?br> 配制B液130mg (0.002 mmol)牛血清蛋白BSA溶于2mL 0.01 mol/LpH 7.4PBS緩沖液,為B液,4"C保存?zhèn)溆茫?br> 冰浴條件下把A液逐滴滴加入B液中,邊加邊搖,于4。C下孵育4h,即得擰 檬黃完全抗原混合液;透析袋前處理取10cm的透析袋,于沸水中煮沸5min,再用60。C的去離 子水沖洗3min,保存在4'C去離子水中備用。
      透析將檸檬黃完全抗原混合液移入透析袋中,用2X2L的0.01 mol/L的 pH 7.4的磷酸鹽緩沖溶液和2X2L的去離子水透析3天,最后使用凍干法將透 析袋中的液體制成粉末,即得到檸檬黃完全抗原;
      (2)檸檬黃完全抗原的鑒定檸檬黃完全抗原采用分光光度法鑒定其偶 聯(lián)結(jié)果,利用牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)液得到標(biāo)準(zhǔn)曲線,從曲線上比對得到抗原溶液的 蛋白濃度,計算摩爾吸光系數(shù)e,再測定檸檬黃完全抗原的偶聯(lián)比。
      偶聯(lián)比測定是估算偶聯(lián)物中被偶聯(lián)的兩種分子的比率(偶聯(lián)比率)的方 法,雖然測定方法種類很多,但都是依據(jù)檢測偶聯(lián)物中被偶聯(lián)的兩種分子含量 (或相對含量)的原理建立起來的。分光光度法是利用物質(zhì)對光的吸收與其濃 度呈比例關(guān)系的原理分別測定被偶聯(lián)的兩種分子濃度.在大分子與小分子偶聯(lián) 物中,兩種分子均有各自不同的紫外掃描光譜,并表現(xiàn)出光譜圖迭加的性質(zhì)。
      摩爾吸光系數(shù)s:配制檸檬黃濃度為O, 10, 20, 30嗎'mL'1的0.01M的PBS 溶液,通過紫外掃描可知擰檬黃的最大吸收波長為427nm,在427nm處測吸光 值,每個濃度做平行樣.摩爾吸光系數(shù)計算為^吸光值/摩爾濃度。
      偶聯(lián)物蛋白濃度測定配制濃度為0, 10, 20, 40, 60, 80, 100嗎'mL" 的牛血清蛋白溶液1.5mL,加入5mL考馬斯亮藍(lán)染色液,立即混勻,30'C水浴 溫?zé)?分鐘,每個濃度做平行樣.在595nm處測吸光值,繪制蛋白濃度與吸光 值的關(guān)系曲線。將抗原溶液按一定比例稀釋,在595nm處測定抗原溶液的吸光 值,從曲線上得到抗原溶液的相應(yīng)的蛋白濃度。
      偶聯(lián)比測定配制150嗎.mL"牛血清蛋白的20。/。乙醇溶液,將偶聯(lián)產(chǎn)物人 工抗原用20%乙醇稀釋到150嗎.ml/1,在427nm處測吸光值,以20%乙醇為空 白,測出牛血清蛋白溶液的吸光值為Al,偶聯(lián)產(chǎn)物的吸光值為A2,則偶聯(lián)比 率r為Z = [" -J2)/s]/(l50x1 (r3/66200)。
      其中s為摩爾吸光系數(shù)(L'mor1), 66200為牛血清蛋白的分子量,150xl0—3 為牛血清蛋白濃度(^mL-1^
      本發(fā)明的有益效果本發(fā)明合成了檸檬黃完全抗原,合成步驟簡潔,有效, 完全可用于免疫分析中,為以后人們的研究提供了方便的途徑,可以滿足國內(nèi) 對其研究的需要。


      圖l檸檬黃完全抗原制備前后的紫外掃描圖。 具體實施方法 實施例1 (1)檸檬黃完全抗原的制備
      4配制A液取擰檬黃53.4mg (O.lmmol)溶于2mL DMSO中,冰浴10min,
      加入51mL三正丁肢,冰浴10min,加入87pL的氯甲酸異丁酯,4。C下,攪拌孵 育lh,為A液。
      配制B液130mg (0.002 mmol)牛血清蛋白BSA溶于2mL 0.01 mol/LPBS 緩沖液,為B液。把A液逐滴滴加入B液中,邊加邊搖,于4'C下孵育4h,即 得檸檬黃完全抗原混合液。
      透析袋前處理取10cm的透析袋,于沸水中煮沸5min,再用60'C的去離 子水沖洗3min,保存在4t去離子水中備用。
      透析將檸檬黃完全抗原混合液移入透析袋中,用2X2L的0.01M的PBS 溶液和2X2L的去離子水透析3天。最后使用凍干法將透析袋中的液體制成粉 末,即得到檸檬黃完全抗原。
      (2)檸檬黃完全抗原的鑒定
      摩爾吸光系數(shù)s:配制擰檬黃濃度為O, 10, 20, 30 ng'ml/1的0.01M的PBS 溶液,通過紫外掃描可知檸檬黃的最大吸收波長為427nm,在427nm處測吸光 值,每個濃度做平行樣.摩爾吸光系數(shù)計算為^吸光值/摩爾濃度。本實驗計 算得£=25649.76 L'mor1。
      偶聯(lián)物蛋白濃度測定配制濃度為0, 10, 20, 40, 60, 80, 100嗎'mL" 的牛血清蛋白溶液1.5mL,加入5mL考馬斯亮藍(lán)染色液,立即混勻,30。C水浴 溫?zé)?分鐘,每個濃度做平行樣.在595nm處測吸光值,繪制蛋白濃度與吸光 值的關(guān)系曲線。將抗原溶液按一定比例稀釋,在595nm處測定抗原溶液的吸光 值,從曲線上得到抗原溶液的相應(yīng)的蛋白濃度。本實驗計算得抗原溶液的蛋白 濃度為3.35mg'mL"。
      偶聯(lián)比測定配制150^mL"牛血清蛋白的20。/。乙醇溶液,將偶聯(lián)產(chǎn)物用 20%乙醇稀釋到150嗎.ml/1,在427nm處測吸光值,以20%乙醇為空白,測出 牛血清蛋白溶液的吸光值為Al,偶聯(lián)產(chǎn)物的吸光值為A2,則偶聯(lián)比率r為 ,-[(4-4)/s]/(150x1(TV66200),本實驗計算得r&18 。
      其中s為摩爾吸光系數(shù)(Lmor1), 66200為牛血清蛋白的分子量,150xl(T3 為牛血清蛋白濃度(吸ml/1)。
      權(quán)利要求
      1、一種檸檬黃完全抗原的合成方法,其特征是以檸檬黃為半抗原,用混合酸酐法將其與載體蛋白BSA偶聯(lián),用分光光度法測定偶聯(lián)物的偶聯(lián)比;步驟為(1)檸檬黃完全抗原的合成配制A液取53.4mg檸檬黃溶于2mL DMSO中,冰浴10min,加入51μL三正丁胺,冰浴10min,加入87μL氯甲酸異丁酯,4℃下,攪拌孵育1h,為A液,4℃保存?zhèn)溆?;配制B液130mg牛血清蛋白BSA溶于2mL 0.01mol/L pH 7.4PBS緩沖液,為B液,4℃保存?zhèn)溆?;冰浴條件下把A液逐滴滴加入B液中,邊加邊搖,于4℃下孵育4h,即得檸檬黃完全抗原混合液;透析袋前處理取10cm的透析袋,于沸水中煮沸5min,再用60℃的去離子水沖洗3min,保存在4℃去離子水中備用。透析將檸檬黃完全抗原混合液移入透析袋中,用2×2L的0.01mol/L的pH 7.4的磷酸鹽緩沖溶液和2×2L的去離子水透析3天,最后使用凍干法將透析袋中的液體制成粉末,即得到檸檬黃完全抗原;(2)檸檬黃完全抗原的鑒定檸檬黃完全抗原采用分光光度法鑒定其偶聯(lián)結(jié)果,利用牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)液得到標(biāo)準(zhǔn)曲線,從曲線上比對得到抗原溶液的蛋白濃度,計算摩爾吸光系數(shù)ε,再測定檸檬黃完全抗原的偶聯(lián)比。
      全文摘要
      一種檸檬黃完全抗原的合成方法,屬于生物化工技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明以檸檬黃為半抗原,用混合酸酐法將其與載體蛋白BSA偶聯(lián),用分光光度法測定偶聯(lián)物的偶聯(lián)比。本發(fā)明成功合成了檸檬黃的人工抗原,合成步驟簡潔,有效,完全可用于免疫分析中,為以后人們的研究提供了必需的人工抗原,可以滿足國內(nèi)對檸檬黃研究的需要。
      文檔編號C07K1/00GK101585875SQ20091003172
      公開日2009年11月25日 申請日期2009年6月20日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月20日
      發(fā)明者宋珊珊, 菲 林, 胥傳來 申請人:江南大學(xué)
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