專利名稱:以免疫活性肽為載體的分支多肽及其衍生物與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及一種以免疫活性肽為載體的分支多肽及其衍生物與應(yīng)用,特別是涉及一種具有流感病毒免疫原性的分支多肽。
背景技術(shù):
RNA病毒的高變異能力對生產(chǎn)針對這類病毒感染的疫苗是極大的挑戰(zhàn),這些病毒主要包括流感病毒、HIV和HCV等。由不同型別流感病毒引起的流感大流行時刻威脅著全球,而現(xiàn)有流感疫苗的保護(hù)效果受到疫苗毒株與實(shí)際流行株的匹配程度的制約。所以為了研制對甲型流感病毒各種亞型或突變株都有效的通用疫苗,人們將目光投向了流感病毒較為保守的核蛋白(NP)和基質(zhì)蛋白 2(M2) (GS Jimenez, R Planchon, Q Wei,HumVaccin, 3(5) :157-64,2007 ;M Schotsaert, M De Filette, W Fiers, Expert RevVaccines,8(4) 499-508,2009)。抗病毒疫苗的保護(hù)效果除了與針對的病毒蛋白有關(guān),還與疫苗的類型有關(guān)。合成肽疫苗,尤其是篩選病毒的抗原表位并采用人工合成方法制成的表位肽疫苗具有很多優(yōu)點(diǎn)可避免不利于免疫應(yīng)答的表位而選擇有利于免疫應(yīng)答的表位,在保持抗原特異性的基礎(chǔ)上誘導(dǎo)免疫應(yīng)答;可用化學(xué)合成的方法制備,研發(fā)時間短、工藝簡單并且制備過程安全, 獲得病毒抗原序列信息后可很快完成制備過程,因此適宜應(yīng)對新發(fā)、突發(fā)傳染病。但抗原表位多是短肽,分子量小,抗原性和免疫原性都很弱,必須進(jìn)行加工改造才能發(fā)揮疫苗的作用。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種分支多肽及其衍生物與應(yīng)用,目的之一是提供一種免疫原性高的分支多肽。本發(fā)明所提供的分支多肽自氨基端到羧基端的結(jié)構(gòu)式為(AAn)4-(Lys)2-Lys-Thr-Lys-Pr0-Arg,上述分支多肽的羧基端序列 Thr-Lys-Pro-Arg為免疫活性肽Tuftsin。所述AAn為甲型流感病毒的基質(zhì)蛋白2胞外區(qū)。 將上述分支多肽命名為分支狀(iCe)4-TuftSin。其中,所述甲型流感病毒的基質(zhì)蛋白2胞外區(qū)自氨基端到羧基端的序列為Ser-Leu-Leu-Thr-Glu-Val-Glu-Thr-Pro-Ile-Arg-Asn-Glu-Trp-Gly-Cys-Arg-C ys-Asn—Asp-Ser—Ser—Asp??稍谒龅姆种Ф嚯牡陌被醾?cè)鏈基團(tuán)上、氨基端或羧基端進(jìn)行羥基化、羧基化、 羰基化、甲基化、乙?;?、磷酸化、酯化或糖基化,得到所述分支多肽衍生物。所述的分支多肽可以與酸或堿反應(yīng)形成藥學(xué)上可接受的鹽類化合物。對本發(fā)明的分支多肽可進(jìn)行等同變化獲得如下的分支多肽(Ser-Leu-Leu-Thr-Glu-Val-Glu-Thr-Pro-Ile-Arg-Asn-Glu-Trp-Gly-Cys-Arg-Cys-Asn-Asp-Ser-Ser-Asp) 8_ (Lys) 4_ (Lys) 2-Lys-Thr-Lys-Pro-Arg ;
(Ser-Leu-Leu-Thr-Glu-Val-Glu-Thr-Pro-Ile-Arg-Asn-Glu-Trp-Gly-Cys-Arg-Cys-Asn-Asp-Ser-Ser-Asp) 2~Ly s-Thr-Ly s-Pro-Arg ο本發(fā)明的另一個目的是提供所述分支多肽及其衍生物的應(yīng)用。所述分支多肽及其衍生物可制備成流感疫苗。所述的流感疫苗,其活性物質(zhì)為所述的分支多肽或所述分支多肽的衍生物。所述流感疫苗中還含有佐劑,佐劑能夠增強(qiáng)對疫苗組分抗原特異性免疫應(yīng)答或改變免疫反應(yīng)。佐劑可以選用多種,如Al (OH)3佐劑。上述流感疫苗為甲型流感病毒疫苗。所述甲型流感病毒包括Hmi流感病毒、H2N2流感病毒、H3N2流感病毒、H5W流感病毒、H7N7流感病毒和H9N2流感病毒等。本發(fā)明的分支多肽能與M2多克隆抗體特異性結(jié)合,能與巨噬細(xì)胞特異結(jié)合,提高了抗原呈遞細(xì)胞的工作效率。本發(fā)明的分支多肽制備的疫苗誘導(dǎo)動物的免疫應(yīng)答效率高,并能保護(hù)動物免受病毒感染。本發(fā)明的具體實(shí)施方式
由以下實(shí)施例及其附圖詳細(xì)給出。
圖1為分支狀(iCe)4-TuftSin結(jié)構(gòu)示意圖。圖2為分支狀(iCe)4_Tuftsin HPLC分析結(jié)果。圖3為分支狀(Mk) 4-Tuftsin質(zhì)譜分析結(jié)果。圖4為分支狀(Mk)4-Tuftsin SDS-PAGE分析結(jié)果,圖中1代表分支狀 (M2e) 4-Tuftsin ;2 代表分支狀(M2e)4-G40圖5為分支狀(Mk) 4-Tuftsin Western-blot檢測結(jié)果,圖中1為分支狀 (M2e) 4-Tuftsin ;2 為分支狀(M2e)4-G40圖6為ELISA檢測免疫小鼠血清中Mk抗體效價。圖7為ELISpot檢測免疫小鼠脾細(xì)胞的結(jié)果。圖8為流感病毒攻擊后不同免疫組小鼠存活率。圖9為分支狀(iCe)8_Tuftsin結(jié)構(gòu)示意圖.圖10為ELISA檢測分支狀(Mk) 8-Tuftsin抗原性結(jié)果。圖11為FITC標(biāo)記分支狀(iCe)8_Tuftsin與巨噬細(xì)胞結(jié)合結(jié)果0OOX)。圖12為實(shí)施例2ELISA檢測小鼠血清Mk抗體效價。圖13為實(shí)施例2ELISpot實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖14為實(shí)施例2小鼠肺病毒載量的檢測結(jié)果。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例11)合成分支狀多肽使用多肽合成儀,采取固相合成法合成圖1所示的四分支多肽(Mk)4-Tuftsin, 該分支狀多肽從N端到C端的結(jié)構(gòu)式為(Ser-Leu-Leu-Thr-Glu-Val-Glu-Thr-Pro-Ile-Arg-Asn-Glu-Trp-Gly-Cys-Arg-Cys-Asn-Asp-Ser-Ser-Asp) 4- (Lys) 2-Lys-Thr-LyS-Pro-Arg0對上述合成的分支狀多肽進(jìn)行高效液相和質(zhì)譜分析,以及SDS-聚丙烯酰氨凝膠電泳和ffestern-blot分析。圖2至圖5所示結(jié)果表明,多肽合成儀合成的多肽為我們所設(shè)計的分支狀多肽,將其命名為分支狀(M&)4-TUftSin,其分子量為11312Da。2)分支狀多肽的抗原性鑒定采用ELISA的方法測定分支狀(Mk) 4-Tuftsin與M2多克隆抗體特異性識別和結(jié)合的能力,具體方法如下將濃度0. 0625 μ g、0. 125 μ g、0. 25 μ g、0. 5 μ g 禾口 1 μ g 的分支狀(M2e) 4-Tuftsin 分別包被到ELISA板的孔內(nèi),以大腸桿菌表達(dá)的重組禽流感病毒M2蛋白作為陽性對照。以小鼠抗M2多克隆抗體作為一抗,二抗為堿性磷酸酶標(biāo)記羊抗小鼠免疫球蛋白IgG抗體。ELISA結(jié)果顯示示,分支狀(Mk) 4-Tuftsin能與抗M2多克隆抗體特異性識別和結(jié)合,當(dāng)分支狀(Mk) 4-Tuftsin包被量在0. 0625 μ g/孔至0. 25 μ g/孔范圍時,吸光度值與其成正比;而分支狀(Mk) 4-Tuftsin量在0. 25 μ g/孔至1 μ g/孔時,吸光度值達(dá)到平臺期。說明分支狀(M&)4-TUftSin具有甲型流感病毒M2抗原活性。3)分支狀多肽與巨噬細(xì)胞結(jié)合試驗(yàn)使用多肽合成儀,采取固相合成法合成對照分支肽(Mk) 4-G4,用四個甘氨酸取代了 Tuftsin。分支肽(M2e)4-G4 從 N 端到 C 端的結(jié)構(gòu)式為(Ser-Leu-Leu-Thr-Glu-Val-Glu-Th r-Pro-IIe-Arg-Asn-Glu-Trp-Gly-Cys-Arg-Cys-Asn-Asp-Ser-Ser-Asp) 4- (Lys) 2-Lys-Gly -Gly-Gly-Gly0測定熒光素FITC標(biāo)記的分支狀(iCe)4-TuftSin與巨噬細(xì)胞結(jié)合的能力,以熒光素FITC標(biāo)記的分支肽(Mk) 4-G4作為對照,具體方法如下取BALB/c小鼠腹腔巨噬細(xì)胞,在96孔板1640培養(yǎng)液中37°C 5% CO2培養(yǎng)7h,每孔2 X 106/1個腹腔巨噬細(xì)胞,棄去上層懸浮細(xì)胞,再將貼壁的巨噬細(xì)胞置4°C培養(yǎng)40分鐘。將上述96孔板分成兩組,每組48孔。其中一組每孔加入FITC標(biāo)記的分支狀(]\Ce) 4-Tuftsin,分支狀(]\Ce) 4-Tuftsin 的終濃度為0.5ymol/L;另一組每孔加入FITC標(biāo)記的分支肽(Mk)4-G4,分支狀 (M2e) 4-G4的終濃度為0. 5 μ mol/L,混勻,4°C培養(yǎng)20分鐘。然后用1640培養(yǎng)液分別洗滌細(xì)胞2次,將洗滌后的細(xì)胞置于奧林巴斯1X-51FL熒光顯微鏡下觀察。熒光顯微鏡下觀察結(jié)果為,F(xiàn)ITC標(biāo)記的分支狀(Mk) 4-Tuftsin與小鼠腹腔巨噬細(xì)胞共同孵育后在紫外光下的圖像,可觀察到細(xì)胞表面有綠色熒光,說明FITC標(biāo)記的分支狀(iCe) 4-Tuftsin能與巨噬細(xì)胞表面Tuftsin受體結(jié)合;FITC標(biāo)記的分支肽(iCe)4_G4與小鼠腹腔巨噬細(xì)胞共同孵育在紫外光下的圖像,細(xì)胞表面未見綠色熒光,說明對照分支肽 (M2e)4-G4不能與巨噬細(xì)胞結(jié)合。上述的實(shí)驗(yàn)說明分支狀(Mk) 4-Tuftsin能與巨噬細(xì)胞結(jié)合,證實(shí)了 Tuftsin的活性。4)用分支狀多肽免疫小鼠將6周齡雌性BALB/c小鼠隨機(jī)分為四組PBS組、ICe單體組、(M2e) 4-Tuftsin組和(M2e)4-G4組,每組16只BALB/c小鼠。PBS組為在小鼠兩條后腿內(nèi)側(cè)肌肉各注射10 μ 1的PBS與Al (OH) 3佐劑的混合物, PBS與Al (OH) 3佐劑的混合物中PBS與Al (OH) 3佐劑的體積比為1 1。M2e單體組為在小鼠兩條后腿內(nèi)側(cè)肌肉各注射10 μ 1的Mk單體與Al (OH) 3佐劑混合制備的流感疫苗,流感疫苗中M2e單體的濃度為5ug/10ul。每只小鼠的M2e單體注射總量為IOug/Ko(M2e) 4-Tuftsin組為在小鼠兩條后腿內(nèi)側(cè)肌肉各注射10 μ 1的分支狀 (M2e) 4-Tuftsin與Al (OH) 3佐劑混合制備的流感疫苗,流感疫苗中分支狀(Mk) 4-Tuftsin 的濃度為5ug/10ul。每只小鼠的分支狀(MkM-Tuftsin注射總量為10 μ g/只。(M2e)4-G4組為在小鼠兩條后腿內(nèi)側(cè)肌肉各注射10 μ 1的分支肽(Mk) 4-G4與 Al (OH) 3佐劑的混合物,分支肽(Mk) 4-G4與Al (OH) 3佐劑的混合物中分支肽(Mk) 4-G4的濃度為5ug/10ul。每只小鼠的分支肽(Mk)4-G4注射總量為IOyg/只。各組小鼠均免疫兩次,每次免疫間隔兩周。A)每次免疫后的第14天分別從小鼠眼眶后靜脈采血,分別離心取血清,-20°C保存,用于血清中抗似e抗體滴度檢測。采用ELISA方法檢測不同免疫組小鼠每次免疫后第14天血清中抗M2e抗體滴度。ELISA結(jié)果如圖6所示,第一次免疫后第14天(圖6中以第一次免疫后表示) M2e單體組、分支狀(iCe) 4-Tuftsin組和分支肽(Mk) 4-G4組的血清中抗體效價分別為 3、860和180 ;第二次免疫后第14天(圖6中以第二次免疫后表示單體組、分支狀 (iCe) 4-Tuftsin組和分支肽(iCe) 4-G4組的血清中抗體效價分別為4J4800和11940 ;PBS 組兩次免疫后的抗體效價均為零。上述的結(jié)果說明,M2e單體組、分支狀(iCe)4-Tuftsin組和分支肽(iCe)4_G4組都能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生抗Mk抗體,分支狀(Mk) 4-Tuftsin組和分支肽(iCe) 4-G4組與Mk單體組的抗體滴度相比都有顯著性差異(P < 0. 05)。而分支狀(MkM-Tuftsin組比分支狀 (M2e)4-G4組誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗Mk抗體水平更高,它們之間抗體滴度相比也有顯著性差異(P < 0. 05)。B)第二次免疫后12天,每組各取4只小鼠處死取脾臟,分離脾淋巴細(xì)胞,用于 ELISP0T 試驗(yàn)。采用ELISP0T方法檢測用Mk多肽刺激脾淋巴細(xì)胞后能分泌IFN-Y的細(xì)胞數(shù)量, 間接反映免疫后小鼠Thl細(xì)胞的特異性反應(yīng)功能。ELISP0T 使用 BD 公司 ELISP0T 試劑盒。ELISP0T檢測結(jié)果如圖7所示,PBS組小鼠脾淋巴細(xì)胞中平均每1 X IO6細(xì)胞產(chǎn)生6 個斑點(diǎn),ICe單體組小鼠脾淋巴細(xì)胞中平均每IX IO6細(xì)胞產(chǎn)生46個斑點(diǎn),(Mk) 4-Tuftsin 組小鼠脾淋巴細(xì)胞中平均每IX IO6細(xì)胞產(chǎn)生2M個斑點(diǎn),(Mk) 4-G4組小鼠脾淋巴細(xì)胞中平均每IX IO6細(xì)胞產(chǎn)生156個斑點(diǎn)。上述結(jié)果說明分支狀(Mk) 4-Tuftsin、(Mk) 4_G4和單體Mk均能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生特異性細(xì)胞免疫,分支狀Mk組產(chǎn)生的斑點(diǎn)數(shù)目與單體Mk組產(chǎn)生的斑點(diǎn)數(shù)目有顯著性差異(P < 0. 05),而對照分支肽(Mk) 4-G4誘導(dǎo)產(chǎn)生斑點(diǎn)數(shù)目要明顯低于含Tuftsin的分支肽免疫組。
C)第二次免疫后14天,用流感病毒PR8株攻擊每組剩余的小鼠,流感病毒攻擊方法如下用CO2吸入法將小鼠麻醉,然后迅速在其兩側(cè)鼻孔滴入10個LD5tl的流感病毒PR8 株病毒液,使其充分吸入。攻毒后第5天,每組各取2只小鼠處死取肺,稱重,制備肺組織懸液,連續(xù)稀釋后接種MDCK細(xì)胞,測定流感病毒滴度(TCID5tl)。肺病毒載量測定結(jié)果顯示,PBS組IgTCID5tl為 7. 21,]\Ce 單體組 Ig TCID5。為 6. 32,(]\Ce) 4-Tuftsin 組 Ig TCID5。為 5. 63,(]\Ce) 4-G4 組 Ig TCID50為5. 9,這個結(jié)果說明病毒在三個M2e免疫組小鼠體內(nèi)的復(fù)制受到有效的抑制,而含 Tuftsin的分支肽免疫組小鼠肺病毒載量最低,與PBS組相比具有顯著性差異(P < 0. 05)。攻毒后每日觀察各組小鼠的存活情況,至攻毒后14天統(tǒng)計存活率,攻毒M小時內(nèi)死亡的小鼠視為意外死亡。小鼠存活狀況統(tǒng)計結(jié)果如圖8所示,接種PBS的小鼠攻毒后有9只死亡,接種Mk 單體的小鼠有7只死亡,接種分支狀(Mk) 4-Tuftsin的小鼠只有2只死亡,接種(Mk) 4-G4 的小鼠除1只意外死亡外,另有5只死亡,說明這兩種分支肽免疫對小鼠均具有保護(hù)作用, 而含Tuftsin的分支肽免疫組的保護(hù)效果最好。實(shí)施例21)合成分支狀多肽使用多肽合成儀,采取固相合成法合成圖9所示的八分支多肽(Mk)S-Tuftsin, 該分支狀多肽從N端到C端的結(jié)構(gòu)式為(Ser-Leu-Leu-Thr-Glu-Val-Glu-Thr-Pro-Ile-Ar g-Asn-Glu-Trp-Gly-Cy s-Arg-Cy s-Asn-Asp-Ser-Ser-Asp) 8- (Lys) 4- (Lys) 2-Lys-Thr-Lys-Pro—Arg。對上述合成的分支狀多肽進(jìn)行高效液相色譜和質(zhì)譜分析。分析結(jié)果表明,多肽合成儀合成的多肽為我們所設(shè)計的分支狀多肽,將其命名為分支狀0\Ce)8-Tuftsin,其分子量為22251Da。2)分支狀多肽的抗原性鑒定采用ELISA的方法測定分支狀(Mk) 8-Tuftsin與M2多克隆抗體特異性識別和結(jié)合的能力,具體方法如下將濃度0. 0625 μ g、0. 125 μ g、0. 25 μ g、0. 5 μ g 禾口 1 μ g 的分支狀(M2e) 8-Tuftsin 分別包被到ELISA板的孔內(nèi),以大腸桿菌表達(dá)的重組禽流感病毒M2蛋白作為陽性對照。以小鼠抗M2多克隆抗體作為一抗,二抗為堿性磷酸酶標(biāo)記羊抗小鼠免疫球蛋白IgG抗體。ELISA結(jié)果如圖10所示,分支狀(Mk) 8-Tuftsin能與抗M2多克隆抗體特異性識別和結(jié)合,當(dāng)分支狀(M2e) 8-Tuftsin包被量在0. 0625 μ g/孔至0. 25 μ g/孔范圍時,吸光度值與其成正比,而分支狀(Mk) 8-Tuftsin量在0. 25 μ g/孔至1 μ g/孔時,吸光度值達(dá)到平臺期。說明分支狀(Mk)S-Tuftsin具有甲型流感病毒M2抗原活性。3)分支狀多肽與巨噬細(xì)胞結(jié)合試驗(yàn)使用多肽合成儀,采取固相合成法合成對照分支肽(Mk) 8-G4,用四個甘氨酸取代了 Tuftsin。分支肽(M2e)8-G4 從 N 端到 C 端的結(jié)構(gòu)式為(Ser-Leu-Leu-Thr-Glu-Val-Glu-Th r-Pro-IIe-Arg-Asn-Glu-Trp-Gly-Cys-Arg-Cys-Asn-Asp-Ser-Ser-Asp) 8- (Lys) 4- (Lys) 2-Lys-Gly-Gly-Gly-Gly0
測定熒光素FITC標(biāo)記的分支狀(Mk)S-Tuftsin巨噬細(xì)胞結(jié)合的能力,以熒光素 FITC標(biāo)記的分支肽(Mk) 8-G4作為對照,具體方法如下取BALB/c小鼠腹腔巨噬細(xì)胞,在96孔板1640培養(yǎng)液中37°C 5% CO2培養(yǎng)幾,每孔 2XlOVml個腹腔巨噬細(xì)胞,棄去上層懸浮細(xì)胞,再將貼壁的巨噬細(xì)胞置4°C培養(yǎng)40分鐘。將上述96孔板分成兩組,每組48孔。其中一組每孔加入FITC標(biāo)記的分支狀(iCe)8_Tuftsin,分支狀(iCe) 8-Tuftsin 的終濃度為0.5ymol/L;另一組每孔加入FITC標(biāo)記的分支肽(Mk)8-G4,分支狀 (M2e) 8-G4的終濃度為0. 5 μ mol/L,混勻,4°C培養(yǎng)20分鐘。然后用1640培養(yǎng)液分別洗滌細(xì)胞2次,將洗滌后的細(xì)胞置于奧林巴斯1X-51FL熒光顯微鏡下觀察。熒光顯微鏡下觀察結(jié)果如圖11所示圖IlA為FITC標(biāo)記的分支狀(Mk)S-Tuftsin 與小鼠腹腔巨噬細(xì)胞共同孵育后可見光下的圖像;圖IlB為FITC標(biāo)記的分支狀 (Mk)S-Tuftsin與小鼠腹腔巨噬細(xì)胞共同孵育后在紫外光下的圖像,可觀察到細(xì)胞表面有綠色熒光,圖IlA和圖IlB的結(jié)果說明FITC標(biāo)記的分支狀(Mk)S-Tuftsin能與巨噬細(xì)胞表面Tuftsin受體結(jié)合;圖IlC為FITC標(biāo)記的分支肽(Mk) 8-G4與小鼠腹腔巨噬細(xì)胞共同孵育可見光下的圖像;圖IlD為FITC標(biāo)記的分支肽(Mk)8-G4與小鼠腹腔巨噬細(xì)胞共同孵育在紫外光下的圖像,細(xì)胞表面未見綠色熒光,圖IlC和圖IlD的結(jié)果說明分支肽(Mk)8-G4 不能與巨噬細(xì)胞結(jié)合。上述的實(shí)驗(yàn)說明分支狀(iCe)8-TuftSin能與巨噬細(xì)胞結(jié)合,證實(shí)了 Tuftsin的活性。4)用分支狀多肽免疫小鼠將6周齡雌性BALB/c小鼠隨機(jī)分為三組PBS組、(iCe) 8-Tuftsin組和(iCe) 8_G4 組,每組20只BALB/c小鼠。PBS組為在小鼠兩條后腿內(nèi)側(cè)皮下各注射30 μ 1的PBS與不完全福氏佐劑的混合物,PBS與不完全福氏佐劑的混合物中PBS與不完全福氏佐劑的體積比為1 1。(M2e) 8-Tuftsin組為在小鼠兩條后腿內(nèi)側(cè)皮下各注射30 μ 1的分支狀(Mk)S-Tuftsin與不完全福氏佐劑混合制備的流感疫苗,流感疫苗中分支狀 (M2e)8-Tuftsin的濃度為5ug/30ul。每只小鼠的分支狀(M2e)8-Tuftsin注射總量為 IOyg/只。(M2e) 8_G4組為在小鼠兩條后腿內(nèi)側(cè)皮下各注射30 μ 1的分支肽(Mk) 8_G4 與不完全福氏佐劑的混合物,分支肽(Mk)8-G4與不完全福氏佐劑的混合物中分支肽 (M2e)8-G4的濃度為5ug/30ul。每只小鼠的分支肽(Mk) 8-G4注射總量為10 μ g/只。各組小鼠均免疫三次,每次免疫間隔三周。A)每次免疫后的第14天分別從小鼠眼眶后靜脈采血,分別離心取血清,-20°C保存,用于血清中抗似e抗體滴度檢測。采用ELISA方法檢測不同免疫組小鼠每次免疫后第14天血清中抗Mk抗體滴度。ELISA結(jié)果如圖12所示,第一次免疫后第14天(圖12中以第一次免疫后表示) 分支狀(iCe) 8-Tuftsin組和分支肽(Mk) 8-G4組的血清中抗體效價分別為1056和39 ;第二次免疫后第14天(圖12中以第二次免疫后表示)分支狀(Mk) 8-Tuftsin組和分支肽
8(Mk) 8-G4組的血清中抗體效價分別為9370和252 ;第三次免疫后第14天(圖12中以第三次免疫后表示)分支狀(iCe)8-TuftSin組和分支肽(iCe)8-G4組的血清中抗體效價分別為14703和696 ;PBS三次免疫后的抗體效價均為零。上述的結(jié)果說明,分支狀(Mk)S-Tuftsin和分支肽(Mk) 8-G4都能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生抗Mk抗體,分支狀(Mk) 8-Tuftsin組和分支狀(Mk) 8-G4組與PBS組的抗體滴度相比都有顯著性差異(P < 0. 05)。而分支狀(Mk) 8-Tuftsin組比分支狀(Mk) 8-G4組誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗Mk抗體水平更高,它們之間抗體滴度相比也有顯著性差異(P < 0. 05)。B)第三次免疫后12天,每組各取5只小鼠處死取脾臟,分離脾淋巴細(xì)胞,用于 ELISP0T 試驗(yàn)。采用ELISP0T方法檢測Mk特異性刺激產(chǎn)生IFN-Y的細(xì)胞數(shù)量間接反映免疫后小鼠Thl細(xì)胞的特異性反應(yīng)功能。ELISP0T 方法使用 Quick Spot 人 IFN-Y ELISPOT 預(yù)包被試劑盒。ELISP0T方法檢測結(jié)果如圖13所示,PBS組小鼠脾淋巴細(xì)胞中平均每5X IO5細(xì)胞產(chǎn)生12個斑點(diǎn),(M2e) 8-Tuftsin組小鼠脾淋巴細(xì)胞中平均每5 X IO5細(xì)胞產(chǎn)生124個斑點(diǎn), (M2e)8-G4組小鼠脾淋巴細(xì)胞中平均每5 X IO5細(xì)胞產(chǎn)生30個斑點(diǎn)。說明分支狀(Mk) 8-Tuftsin能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生細(xì)胞免疫,產(chǎn)生的斑點(diǎn)數(shù)目與PBS誘導(dǎo)產(chǎn)生的斑點(diǎn)數(shù)目有顯著性差異(P <0.05),而對照分支肽(Mk) 8-G4誘導(dǎo)產(chǎn)生斑點(diǎn)數(shù)目要明顯低于含Tuftsin的分支肽。C)第三次免疫后14天,用流感病毒PR8株攻擊每組剩余的小鼠,流感病毒PR8攻擊方法如下用C02吸入法將小鼠麻醉,然后迅速在其兩側(cè)鼻孔各滴入25 μ 1 5倍TCID5tl 流感病毒PR8病毒液,使其充分吸入。攻毒后第5天,每組各取5只小鼠處死取肺,稱重,制備肺組織懸液,連續(xù)稀釋后接種MDCK細(xì)胞,測定TCID5Q。肺病毒載量測定結(jié)果如圖14所示,PBS組Ig TCID50為6. 53,(M2e)8-Tuftsin組 Ig TCID5tl為5. 53,(iCe)8-G4組Ig TCID5tl為5. 89,這個結(jié)果表明含Tuftsin的分支肽免疫組小鼠肺病毒載量最低,與PBS組相比具有顯著性差異(P < 0. 05),說明病毒在這組小鼠體內(nèi)的復(fù)制受到有效的抑制。攻毒后每日觀察每組10只小鼠的存活率,至攻毒后14天統(tǒng)計存活率,攻毒M小時內(nèi)死亡的小鼠視為意外死亡。小鼠存活狀況統(tǒng)計結(jié)果顯示,接種PBS的小鼠攻毒后第7天和第8天各有1只死亡,接種對照分支肽(Mk) 8-G4的小鼠在第8天有1只死亡,而接種分支狀(Mk)S-Tuftsin 的小鼠未出現(xiàn)死亡,說明這兩種分支肽免疫對小鼠具有保護(hù)作用。本發(fā)明的另外的實(shí)施例還提出一種分支多肽衍生物,是在分支狀(MkM-Tuftsin 和分支狀(Mk)S-Tuftsin的氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)上、氨基端或羧基端進(jìn)行羥基化、羧基化、羰基化、甲基化、乙?;?、磷酸化、酯化或糖基化所得到的衍生物。本發(fā)明的其他實(shí)施例還提出分支狀(iCe)4-TuftSin和分支狀(Mk) 8-Tuftsin藥學(xué)上可接受的鹽,這些鹽通過以分支狀(iCe)4-TuftSin和分支狀(Mk) 8-Tuftsin為原料結(jié)合現(xiàn)有技術(shù)的制備方法既可以得到。本發(fā)明提出的分支狀(iCe)4-TuftSin和分支狀(iCe) 8-Tuftsin可以用于制備疫苗,特別是制備甲型流感病毒疫苗,更進(jìn)一步的,所述甲型流感病毒為Hmi流感病毒、H2N2流感病毒、H3N2流感病毒、H5N1流感病毒、H7N7流感病毒或H9N2流感病毒。
本發(fā)明還提出一種疫苗,是以分支狀(iCe)4-TuftSin或分支狀(Mk)8-Tuftsin 作為活性組分。所述疫苗為甲型流感病毒疫苗,更進(jìn)一步的,所述甲型流感病毒疫苗為Hmi 流感病毒疫苗、H2N2流感病毒疫苗、H3N2流感病毒疫苗、H5N1流感病毒疫苗、H7N7流感病毒疫苗或H9N2流感病毒疫苗。
權(quán)利要求
1.一種分支多肽,其特征在于所述分支多肽自氨基端到羧基端的結(jié)構(gòu)式如下;(AAn) 8- (Lys) 4- (Lys) 2-Lys-Thr-Lys-Pro-Arg ;或(AAn) 4- (Lys) 2-Lys-Thr-Lys-Pro-Arg ;所述AAn為甲型流感病毒的基質(zhì)蛋白2胞外區(qū),上述分支多肽的羧基端序列 Thr-Lys-Pro-Arg 為免疫活性肽 Tuftsin。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分支多肽,其特征在于所述甲型流感病毒的基質(zhì)蛋白2胞外區(qū)自氨基端到羧基端的的序列如下Ser-Leu-Leu-Thr-Glu-Val-Glu-Thr-Pro-Ile-Arg-Asn-Glu-Trp-Gly-Cys-Arg-Cys-A sn—Asp-Ser—Ser—Asp。
3.一種分支多肽衍生物,是在權(quán)利要求1或2所述的分支多肽的氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)上、氨基端或羧基端進(jìn)行羥基化、羧基化、羰基化、甲基化、乙?;?、磷酸化、酯化或糖基化所得到的衍生物。
4.一種分支多肽衍生物,是權(quán)利要求1或2所述的分支多肽的藥學(xué)上可接受的鹽。
5.權(quán)利要求1至4中任一所述的分支多肽在制備疫苗中的應(yīng)用。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用,其特征在于所述疫苗為甲型流感病毒疫苗。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6任一項所述的應(yīng)用,其特征在于所述甲型流感病毒為Hmi流感病毒、H2N2流感病毒、H3N2流感病毒、H5N1流感病毒、H7N7流感病毒或H9N2流感病毒。
8.一種疫苗,其活性物質(zhì)為權(quán)利要求1至4中任一所述的分支多肽。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的疫苗,其特征在于所述疫苗為甲型流感病毒疫苗。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的疫苗,其特征在于所述甲型流感病毒為Hmi流感病毒、 H2N2流感病毒、H3N2流感病毒、H5N1流感病毒、H7N7流感病毒或H9N2流感病毒。
全文摘要
本發(fā)明是關(guān)于一種以免疫活性肽為載體的分支多肽及其衍生物與應(yīng)用。該分支多肽自氨基端到羧基端的結(jié)構(gòu)式為(AAN)4-(Lys)2-Lys-Thr-Lys-Pro-Arg;AAN為甲型流感病毒的基質(zhì)蛋白2胞外區(qū),羧基端序列Thr-Lys-Pro-Arg為免疫活性肽Tuftsin。甲型流感病毒的基質(zhì)蛋白2胞外區(qū)自氨基端到羧基端的序列為Ser-Leu-Leu-Thr-Glu-Val-Glu-Thr-Pro-Ile-Arg-Asn-Glu-Trp-Gly-Cys-Arg-Cys-Asn-Asp-Ser-Ser-Asp。本發(fā)明的分支多肽可制備成流感疫苗。本發(fā)明的分支多肽能與M2多克隆抗體特異性結(jié)合,能與巨噬細(xì)胞特異結(jié)合,促進(jìn)抗原呈遞細(xì)胞的處理。本發(fā)明的分支多肽制備的疫苗誘導(dǎo)動物免疫應(yīng)答效率高,并能保護(hù)動物免受病毒感染。
文檔編號C07K19/00GK102153654SQ20101061733
公開日2011年8月17日 申請日期2010年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月31日
發(fā)明者劉曉宇, 姚立紅, 張智清, 徐一, 郭建強(qiáng), 陳愛珺, 韓蘇 申請人:中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所, 元森泰生物科技(天津)有限公司