專利名稱：用于增加蛋白質(zhì)產(chǎn)生的芽孢桿菌屬菌株的制作方法
用于增加蛋白質(zhì)產(chǎn)生的芽孢桿菌屬菌株相關(guān)申請的交互參照本申請要求2009年6月11日遞交的美國臨時申請?zhí)?1/186321的權(quán)益，其在此處全文引用作為參考。本發(fā)明提供已經(jīng)受到基因操作以具有增強(qiáng)的目的蛋白產(chǎn)生能力的宿主細(xì)胞。特別地，本發(fā)明涉及具有至少一個失活Phr和/或rap基因的修飾的芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞。修飾的芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞的增強(qiáng)的目的蛋白產(chǎn)生在過量表達(dá)YmaH的修飾芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞中進(jìn)一步增加。也提供用于在修飾的宿主細(xì)胞中產(chǎn)生目的蛋白的方法。
背景技術(shù)：
外源多肽的表達(dá)和重組產(chǎn)生是一項廣泛使用的技術(shù)。眾所周知細(xì)胞可以用編碼外
源目的多肽的核酸轉(zhuǎn)化用于表達(dá)和產(chǎn)生大量想要的多肽。在一些應(yīng)用中，所述方法用來產(chǎn)生比由起源生物天然產(chǎn)生量要高的多肽。實際上，外源核酸序列的表達(dá)以及內(nèi)源序列的過量表達(dá)已經(jīng)廣泛地用于現(xiàn)代生物技術(shù)中。盡管實施了用于增加蛋白酶產(chǎn)量的多種方法，包括篩選超高產(chǎn)菌株、克隆和過量表達(dá)蛋白酶、改善補料分批發(fā)酵和恒化器發(fā)酵和優(yōu)化發(fā)酵技術(shù)，但是仍需要用于增強(qiáng)蛋白酶產(chǎn)生的其它手段。發(fā)明概述本發(fā)明提供已經(jīng)受到基因操作以具有增強(qiáng)的目的蛋白產(chǎn)生能力的宿主細(xì)胞。特別地，本發(fā)明涉及具有至少一個失活Phr和/或rap基因的修飾的芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞。修飾的芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞的增強(qiáng)的目的蛋白產(chǎn)生在過量表達(dá)YmaH的修飾芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞中進(jìn)一步增加。也提供用于在修飾的宿主細(xì)胞中產(chǎn)生目的蛋白的方法。在一個實施方案中，本發(fā)明提供包含基因組和重組核酸的修飾的芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞，用于以比未修飾的前體宿主細(xì)胞所產(chǎn)生水平高的水平產(chǎn)生目的蛋白，其中所述基因組包含具有至少一個失活Phr基因的rap操縱子。該目的蛋白是酶并且優(yōu)選地是蛋白酶(例如，枯草蛋白酶)。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供包含基因組和重組核酸的修飾的芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞，用于以比未修飾的前體宿主細(xì)胞所產(chǎn)生水平高的水平產(chǎn)生目的蛋白，其中所述基因組包含具有至少一個失活Phr基因的rap操縱子。該重組核酸包含與編碼目的蛋白的多核苷酸序列有效連接的啟動子。優(yōu)選地，該啟動子是野生型或突變aprE啟動子。該目的蛋白是酶并且優(yōu)選地是蛋白酶(例如，枯草蛋白酶)。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供包含基因組和重組核酸的修飾的芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞，用于以比未修飾的前體宿主細(xì)胞所產(chǎn)生水平高的水平產(chǎn)生目的蛋白，其中所述基因組包含具有至少一個失活phr基因和失活rap基因的rap操縱子。優(yōu)選地,失活的rap基因是rapA基因。該目的蛋白是酶并且優(yōu)選地是蛋白酶(例如，枯草蛋白酶)。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供包含基因組和重組核酸的修飾的芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞，用于以比未修飾的前體宿主細(xì)胞所產(chǎn)生水平高的水平產(chǎn)生目的蛋白，其中所述基因組包含具有至少一個失活phr基因和失活rap基因(例如，rapA基因)的rap操縱子。該重組核酸包含與編碼目的蛋白的多核苷酸序列有效連接的啟動子。優(yōu)選地，該啟動子是野生型或突變aprE啟動子。該目的蛋白是酶并且優(yōu)選地是蛋白酶(例如，枯草蛋白酶)。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供包含基因組和重組核酸的修飾的芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞，用于以比未修飾的前體宿主細(xì)胞所產(chǎn)生水平高的水平產(chǎn)生目的蛋白，其中所述基因組包含具有至少一個失活phr基因的rap操縱子。至少一個失活的phr基因選自phrA、phrE、phrC、phrF、phrG、phrl和phrK。在一些實施方案中，失活的phr基因是失活的phrA基因，而在其他實施方案中，失活的Phr基因是phrE基因。該目的蛋白是酶并且優(yōu)選地是蛋白酶(例如，枯草蛋白酶)。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供包含基因組和重組核酸的修飾的芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞，用于以比未修飾的前體宿主細(xì)胞所產(chǎn)生水平高的水平產(chǎn)生目的蛋白，其中所述基因組包含具有至少一個失活phr基因的rap操縱子。至少一個失活的phr基因選自phrA、phrE、phrC、phrF、phrG、phrl和phrK。在一些實施方案中，失活的phr基因是失活的phrA基因，而在其他實施方案中，失活的Phr基因是phrE基因。該重組核酸包含與編碼目的蛋
白的多核苷酸序列有效連接的啟動子。優(yōu)選地，該啟動子是野生型或突變aprE啟動子。該目的蛋白是酶并且優(yōu)選地是蛋白酶(例如，枯草蛋白酶)。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供包含基因組和重組核酸的修飾的芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞，用于以比未修飾的前體宿主細(xì)胞所產(chǎn)生水平高的水平產(chǎn)生目的蛋白，其中所述基因組包含具有至少一個失活Phr基因和失活rap基因的rap操縱子。優(yōu)選地，失活的rap基因是rapA基因，并且至少一個失活的phr基因選自phrA、phrE、phrC、phrF、phrG、phrl和phrK。在一些實施方案中，失活的phr基因是失活的phrA基因，而在其他實施方案中，失活的Phr基因是phrE基因。該目的蛋白是酶并且優(yōu)選地是蛋白酶(例如，枯草蛋白酶)。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供包含基因組和重組核酸的修飾的芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞，用于以比未修飾的前體宿主細(xì)胞所產(chǎn)生水平高的水平產(chǎn)生目的蛋白，其中所述基因組包含具有至少一個失活phr基因和失活rap基因(例如，rapA基因)的rap操縱子。該重組核酸包含與編碼目的蛋白的多核苷酸序列有效連接的啟動子。優(yōu)選地，該啟動子是野生型或突變aprE啟動子。至少一個失活的phr基因選自phrA、phrE、phrC、phrF、phrG、phrl和phrK。優(yōu)選地,失活的phr基因是失活的phrA或phrE基因。該目的蛋白是酶并且優(yōu)選地是蛋白酶(例如，枯草蛋白酶)。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供包含基因組和重組核酸的修飾的芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞，用于以比未修飾的前體宿主細(xì)胞所產(chǎn)生水平高的水平產(chǎn)生目的蛋白，其中所述基因組包含具有失活的PhrA基因和失活的phrE基因的rap操縱子。該目的蛋白是酶并且優(yōu)選地是蛋白酶(例如，枯草蛋白酶)。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供包含基因組和重組核酸的修飾的芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞，用于以比未修飾的前體宿主細(xì)胞所產(chǎn)生水平高的水平產(chǎn)生目的蛋白，其中所述基因組包含具有失活的PhrA基因和失活的phrE基因的rap操縱子。該重組核酸包含與編碼目的蛋白的多核苷酸序列有效連接的啟動子。優(yōu)選地，該啟動子是野生型或突變aprE啟動子。該目的蛋白是酶并且優(yōu)選地是蛋白酶(例如，枯草蛋白酶)。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供包含基因組和重組核酸的修飾的芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞，用于以比未修飾的前體宿主細(xì)胞所產(chǎn)生水平高的水平產(chǎn)生目的蛋白，其中所述基因組包含具有失活的phrA基因、失活的phrE基因、失活rapA基因的rap操縱子。該目的蛋白是酶并且優(yōu)選地是蛋白酶(例如，枯草蛋白酶)。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供包含基因組和重組核酸的修飾的芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞，用于以比未修飾的前體宿主細(xì)胞所產(chǎn)生水平高的水平產(chǎn)生目的蛋白，其中所述基因組包含具有失活的phrA基因、失活的phrE基因、失活rapA基因的rap操縱子。該重組核酸包含與編碼目的蛋白的多核苷酸序列有效連接的啟動子。優(yōu)選地，該啟動子是野生型或突變aprE啟動子。該目的蛋白是酶并且優(yōu)選地是蛋白酶(例如，枯草蛋白酶)。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供過量表達(dá)YmaH和包含基因組和重組核酸的修飾的芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞，用于以比未修飾的前體宿主細(xì)胞所產(chǎn)生水平高的水平產(chǎn)生目的蛋白，其中所述基因組包含具有至少一個失活Phr基因的rap操縱子。該目的蛋白是酶并且優(yōu)選地是蛋白酶(例如，枯草蛋白酶)。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供過量表達(dá)YmaH和包含基因組和重組核酸的修飾的芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞，用于以比未修飾的前體宿主細(xì)胞所產(chǎn)生水平高的水平產(chǎn)生目的蛋白，其中所述基因組包含具有至少一個失活Phr基因的rap操縱子。該重組核酸包含與編碼目的蛋白的多核苷酸序列有效連接的啟動子。優(yōu)選地，該啟動子是野生型或突變aprE啟動子。該目的蛋白是酶并且優(yōu)選地是蛋白酶(例如，枯草蛋白酶)。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供過量表達(dá)YmaH和包含基因組和重組核酸的修飾的芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞，用于以比未修飾的前體宿主細(xì)胞所產(chǎn)生水平高的水平產(chǎn)生目的蛋白，其中所述基因組包含具有至少一個失活Phr基因和失活rap基因的rap操縱子。優(yōu)選地，失活的rap基因是rapA基因。該目的蛋白是酶并且優(yōu)選地是蛋白酶(例如，枯草蛋白酶)。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供過量表達(dá)YmaH和包含基因組和重組核酸的修飾的芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞，用于以比未修飾的前體宿主細(xì)胞所產(chǎn)生水平高的水平產(chǎn)生目的蛋白，其中所述基因組包含具有至少一個失活Phr基因和失活rap基因(例如，rapA基因)的rap操縱子。該重組核酸包含與編碼目的蛋白的多核苷酸序列有效連接的啟動子。優(yōu)選地，該啟動子是野生型或突變aprE啟動子。該目的蛋白是酶并且優(yōu)選地是蛋白酶(例如，枯草蛋白酶)。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供過量表達(dá)YmaH和包含基因組和重組核酸的修飾的芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞，用于以比未修飾的前體宿主細(xì)胞所產(chǎn)生水平高的水平產(chǎn)生目的蛋白，其中所述基因組包含具有至少一個失活Phr基因的rap操縱子。至少一個失活的phr基因選自phrA、phrE、phrC、phrF、phrG、phrl和phrK。在一些實施方案中，失活的phr基因是失活的PhrA基因，而在其他實施方案中，失活的phr基因是phrE基因。該目的蛋白是酶并且優(yōu)選地是蛋白酶(例如，枯草蛋白酶)。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供過量表達(dá)YmaH和包含基因組和重組核酸的修飾的芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞，用于以比未修飾的前體宿主細(xì)胞所產(chǎn)生水平高的水平產(chǎn)生目的蛋白，其中所述基因組包含具有至少一個失活Phr基因的rap操縱子。至少一個失活的phr基因選自phrA、phrE、phrC、phrF、phrG、phrl和phrK。在一些實施方案中，失活的phr基因是失活的PhrA基因，而在其他實施方案中，失活的phr基因是phrE基因。該重組核酸包含與編碼目的蛋白的多核苷酸序列有效連接的啟動子。優(yōu)選地，該啟動子是野生型或突變aprE啟動子。該目的蛋白是酶并且優(yōu)選地是蛋白酶(例如，枯草蛋白酶)。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供過量表達(dá)YmaH和包含基因組和重組核酸的修飾的芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞，用于以比未修飾的前體宿主細(xì)胞所產(chǎn)生水平高的水平產(chǎn)生目的蛋白，其中所述基因組包含具有至少一個失活Phr基因和失活rap基因的rap操縱子。優(yōu)選地，失活的rap基因是rapA基因，并且至少一個失活的phr基因選自phrA、phrE、phrC、phrF、phrG、phr I和phrK。在一些實施方案中，失活的phr基因是失活的phrA基因，而在其他實施方案中，失活的Phr基因是phrE基因。該目的蛋白是酶并且優(yōu)選地是蛋白酶(例如，枯草蛋白酶)。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供過量表達(dá)YmaH和包含基因組和重組核酸的修飾的芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞，用于以比未修飾的前體宿主細(xì)胞所產(chǎn)生水平高的水平產(chǎn)生目的蛋白，其中所述基因組包含具有至少一個失活Phr基因和失活rap基因(例如，rapA基因)
的rap操縱子。該重組核酸包含與編碼目的蛋白的多核苷酸序列有效連接的啟動子。優(yōu)選地，該啟動子是野生型或突變aprE啟動子。至少一個失活的phr基因選自phrA、phrE、phrC、phrF、phrG、phrI和phrK。優(yōu)選地,失活的phr基因是失活的phrA或phrE基因。該目的蛋白是酶并且優(yōu)選地是蛋白酶(例如，枯草蛋白酶)。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供過量表達(dá)YmaH和包含基因組和重組核酸的修飾的芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞，用于以比未修飾的前體宿主細(xì)胞所產(chǎn)生水平高的水平產(chǎn)生目的蛋白，其中所述基因組包含具有失活的PhrA基因和失活的phrE基因的rap操縱子。該目的蛋白是酶并且優(yōu)選地是蛋白酶(例如，枯草蛋白酶)。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供過量表達(dá)YmaH和包含基因組和重組核酸的修飾的芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞，用于以比未修飾的前體宿主細(xì)胞所產(chǎn)生水平高的水平產(chǎn)生目的蛋白，其中所述基因組包含具有失活的PhrA基因和失活的phrE基因的rap操縱子。該重組核酸包含與編碼目的蛋白的多核苷酸序列有效連接的啟動子。優(yōu)選地，該啟動子是野生型或突變aprE啟動子。該目的蛋白是酶并且優(yōu)選地是蛋白酶(例如，枯草蛋白酶)。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供過量表達(dá)YmaH和包含基因組和重組核酸的修飾的芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞，用于以比未修飾的前體宿主細(xì)胞所產(chǎn)生水平高的水平產(chǎn)生目的蛋白，其中所述基因組包含具有失活的PhrA基因、失活的phrE基因、失活rapA基因的rap操縱子。該目的蛋白是酶并且優(yōu)選地是蛋白酶(例如，枯草蛋白酶)。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供過量表達(dá)YmaH和包含基因組和重組核酸的修飾的芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞，用于以比未修飾的前體宿主細(xì)胞所產(chǎn)生水平高的水平產(chǎn)生目的蛋白，其中所述基因組包含具有失活的PhrA基因、失活的phrE基因、失活rapA基因的rap操縱子。該重組核酸包含與編碼目的蛋白的多核苷酸序列有效連接的啟動子。優(yōu)選地，該啟動子是野生型或突變aprE啟動子。該目的蛋白是酶并且優(yōu)選地是蛋白酶(例如，枯草蛋白酶)。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供用于在宿主細(xì)胞中產(chǎn)生目的蛋白的方法，該方法包括將失活性DNA構(gòu)建體導(dǎo)入前體芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞以產(chǎn)生修飾的芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞，其中所述的失活性DNA構(gòu)建體包含導(dǎo)致至少一個固有phr和/或rap基因失活的失活性多核苷酸；并且在合適的條件下培育所述的修飾宿主細(xì)胞，其中與目的蛋白在所述前體宿主細(xì)胞中的產(chǎn)生相比時，所述目的蛋白的產(chǎn)生在所述修飾的宿主細(xì)胞中更大。在一些實施方案中，該方法還包括回收此目的蛋白。該目的蛋白是酶并且優(yōu)選地是蛋白酶(例如，枯草蛋白酶)。在一些實施方案中，宿主細(xì)胞包含在選自degU、degQ、degS、sco4、spoIIE、degQ和degR的至少一個基因中的突變。優(yōu)選地，該宿主細(xì)胞包含deg(Hy)32突變。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供用于在宿主細(xì)胞中產(chǎn)生目的蛋白的方法，該方法包括將失活性DNA構(gòu)建體導(dǎo)入前體芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞以產(chǎn)生修飾的芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞，其中所述的失活性DNA構(gòu)建體包含導(dǎo)致至少一個固有phr和/或rap基因失活的失活性多核苷酸；并且在合適的條件下培育所述的修飾宿主細(xì)胞，其中與目的蛋白在所述前體宿主細(xì)胞中的產(chǎn)生相比時，所述目的蛋白的產(chǎn)生在所述修飾的宿主細(xì)胞中更大。被失活的至少一個固有phr基因選自phrA、phrE、phrC、phrF、phrG、phr I和phrK。在一些實施方案中，失活的Phr基因是失活的phrA基因，而在其他實施方案中，失活的phr基因是phrE基因。該目的蛋白是酶并且優(yōu)選地是蛋白酶(例如，枯草蛋白酶)。在一些實施方案中，該方法還包括回收此目的蛋白。該目的蛋白是酶并且優(yōu)選地是蛋白酶(例如，枯草蛋白酶)。在一些實施方案中，宿主細(xì)胞包含在選自degU、degQ、degS、sco4、spoIIE、degQ和degR的至少一個基因中的突變。優(yōu)選地，該宿主細(xì)胞包含deg(Hy)32突變。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供用于在宿主細(xì)胞中產(chǎn)生目的蛋白的方法，該方法包括將失活性DNA構(gòu)建體導(dǎo)入前體芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞以產(chǎn)生修飾的芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞，其中所述的失活性DNA構(gòu)建體包含導(dǎo)致固有的phrA和phrE基因和/或rap基因失活的失活性多核苷酸；并且在合適的條件下培育所述的修飾宿主細(xì)胞，其中與目的蛋白在所述前體宿主細(xì)胞中的產(chǎn)生相比時，所述目的蛋白的產(chǎn)生在所述修飾的宿主細(xì)胞中更大。在一些實施方案中，該方法還包括回收此目的蛋白。該目的蛋白是酶并且優(yōu)選地是蛋白酶(例如，枯草蛋白酶)。在一些實施方案中，宿主細(xì)胞包含在選自degU、degQ、degS、sco4、spoIIE、degQ和degR的至少一個基因中的突變。優(yōu)選地，該宿主細(xì)胞包含deg (Hy) 32突變。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供用于在宿主細(xì)胞中產(chǎn)生目的蛋白的方法，該方法包括將失活性DNA構(gòu)建體導(dǎo)入前體芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞以產(chǎn)生修飾的芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞，其中所述的失活性DNA構(gòu)建體包含導(dǎo)致固有的phrA和rap基因失活的失活性多核苷酸；并且在合適的條件下培育所述的修飾宿主細(xì)胞，其中與目的蛋白在所述前體宿主細(xì)胞中的產(chǎn)生相比時，所述目的蛋白的產(chǎn)生在所述修飾的宿主細(xì)胞中更大。在一些實施方案中，該方法還包括回收此目的蛋白。該目的蛋白是酶并且優(yōu)選地是蛋白酶(例如，枯草蛋白酶)。在一些實施方案中，宿主細(xì)胞包含在選自degU、degQ、degS、sC04、spoIIE、degQ和degR的至少一個基因中的突變。優(yōu)選地，該宿主細(xì)胞包含deg (Hy) 32突變。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供用于在宿主細(xì)胞中產(chǎn)生目的蛋白的方法，該方法包括將失活性DNA構(gòu)建體導(dǎo)入過量表達(dá)YmaH的前體芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞以產(chǎn)生修飾的芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞，其中所述的失活性DNA構(gòu)建體包含導(dǎo)致至少一個固有phr和/或rap基因失活的失活性多核苷酸；并且在合適的條件下培育所述的修飾宿主細(xì)胞，其中與目的蛋白在所述前體宿主細(xì)胞中的產(chǎn)生相比時，所述目的蛋白的產(chǎn)生在所述修飾的宿主細(xì)胞中更大。在一些實施方案中，該方法還包括回收此目的蛋白。該目的蛋白是酶并且優(yōu)選地是蛋白酶(例如，枯草蛋白酶)。在一些實施方案中，宿主細(xì)胞包含在選自degU、degQ、degS、sco4,spoIIE,degQ和degR的至少一個基因中的突變。優(yōu)選地，該宿主細(xì)胞包含deg (Hy) 32突變。通過將包含與編碼YmaH蛋白的多核苷酸有效連接的SigH啟動子的SigH構(gòu)建體(例如，SEQ ID NO 23)導(dǎo)入前體宿主細(xì)胞或修飾的宿主細(xì)胞中實現(xiàn)YmaH的過量表達(dá)。備選地，通過將包含與編碼YmaH的多核苷酸有效連接的SigA啟動子的SigA構(gòu)建體(例如，SEQ IDNOS 26和31)導(dǎo)入前體宿主細(xì)胞或修飾的宿主細(xì)胞中實現(xiàn)YmaH的過量表達(dá)。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供用于在宿主細(xì)胞中產(chǎn)生目的蛋白的方法，該方法包括將失活性DNA構(gòu)建體導(dǎo)入過量表達(dá)YmaH的前體芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞以產(chǎn)生修飾的芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞，其中所述的失活性DNA構(gòu)建體包含導(dǎo)致至少一個固有phr和/或rap基因失活的失活性多核苷酸；并且在合適的條件下培育所述的修飾宿主細(xì)胞，其中與目的蛋白在所述前體宿主細(xì)胞中的產(chǎn)生相比時，所述目的蛋白的產(chǎn)生在所述修飾的宿主細(xì)胞中更大。被失活的至少一個固有phr基因選自phrA、phrE、phrC、phrF、phrG、phr I和phrK。在一些實施方案中，失活的Phr基因是失活的phrA基因，而在其他實施方案中，失活的phr基因是PhrE基因。該目的蛋白是酶并且優(yōu)選地是蛋白酶(例如，枯草蛋白酶)。在一些實施方案中，該方法還包括回收此目的蛋白。該目的蛋白是酶并且優(yōu)選地是蛋白酶(例如，枯草蛋白酶)。在一些實施方案中，宿主細(xì)胞包含在選自degU、degQ、degS、sco4、spoIIE、degQ和degR的至少一個基因中的突變。優(yōu)選地，該宿主細(xì)胞包含deg (Hy) 32突變。通過
將包含與編碼YmaH蛋白的多核苷酸有效連接的SigH啟動子的SigH構(gòu)建體(例如，SEQ IDNO 23)導(dǎo)入前體宿主細(xì)胞或修飾的宿主細(xì)胞中實現(xiàn)YmaH的過量表達(dá)。備選地，通過將包含與編碼YmaH的多核苷酸有效連接的SigA啟動子的SigA構(gòu)建體(例如，SEQ ID NOS 26和31)導(dǎo)入前體宿主細(xì)胞或修飾的宿主細(xì)胞中實現(xiàn)YmaH的過量表達(dá)。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供用于在宿主細(xì)胞中產(chǎn)生目的蛋白的方法，該方法包括將失活性DNA構(gòu)建體導(dǎo)入過量表達(dá)YmaH的前體芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞以產(chǎn)生修飾的芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞，其中所述的失活性DNA構(gòu)建體包含導(dǎo)致固有的phrA和phrE基因和/或rap基因失活的失活性多核苷酸；并且在合適的條件下培育所述的修飾宿主細(xì)胞，其中與目的蛋白在所述前體宿主細(xì)胞中的產(chǎn)生相比時，所述目的蛋白的產(chǎn)生在所述修飾的宿主細(xì)胞中更大。在一些實施方案中，該方法還包括回收此目的蛋白。該目的蛋白是酶并且優(yōu)選地是蛋白酶(例如，枯草蛋白酶)。在一些實施方案中，宿主細(xì)胞包含在選自degU、degQ、degS、sco4、spoIIE、degQ和degR的至少一個基因中的突變。優(yōu)選地,該宿主細(xì)胞包含deg (Hy) 32突變。通過將包含與編碼YmaH蛋白的多核苷酸有效連接的SigH啟動子的SigH構(gòu)建體(例如，SEQ ID NO 23)導(dǎo)入前體宿主細(xì)胞或修飾的宿主細(xì)胞中實現(xiàn)YmaH的過量表達(dá)。備選地，通過將包含與編碼YmaH的多核苷酸有效連接的SigA啟動子的SigA構(gòu)建體(例如，SEQ ID N0S:26和31)導(dǎo)入前體宿主細(xì)胞或修飾的宿主細(xì)胞中實現(xiàn)YmaH的過量表達(dá)。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供用于在宿主細(xì)胞中產(chǎn)生目的蛋白的方法，該方法包括將失活性DNA構(gòu)建體導(dǎo)入過量表達(dá)YmaH的前體芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞以產(chǎn)生修飾的芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞，其中所述的失活性DNA構(gòu)建體包含導(dǎo)致固有的phrA和rap基因失活的失活性多核苷酸；并且在合適的條件下培育所述的修飾宿主細(xì)胞，其中與目的蛋白在所述前體宿主細(xì)胞中的產(chǎn)生相比時，所述目的蛋白的產(chǎn)生在所述修飾的宿主細(xì)胞中更大。在一些實施方案中，該方法還包括回收此目的蛋白。該目的蛋白是酶并且優(yōu)選地是蛋白酶(例如，枯草蛋白酶)。在一些實施方案中，宿主細(xì)胞包含在選自degU、degQ、degS、sco4、spoIIE,degQ和degR的至少一個基因中的突變。優(yōu)選地，該宿主細(xì)胞包含deg (Hy) 32突變。通過將包含與編碼YmaH蛋白的多核苷酸有效連接的SigH啟動子的SigH構(gòu)建體(例如，SEQID NO 23)導(dǎo)入前體宿主細(xì)胞或修飾的宿主細(xì)胞中實現(xiàn)YmaH的過量表達(dá)。備選地，通過將包含與編碼YmaH的多核苷酸有效連接的SigA啟動子的SigA構(gòu)建體(例如，SEQ ID NOS 26和31)導(dǎo)入前體宿主細(xì)胞或修飾的宿主細(xì)胞中實現(xiàn)YmaH蛋白的過量表達(dá)。所述實施方案的芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞是嗜堿芽孢桿菌(Bacillusalkalophilus)、解淀粉芽抱桿菌(Bacillus amyloliquefaciens) > 短芽抱桿菌(Bacillus brevis)、環(huán)狀芽抱桿菌(Bacillus circulans)、克勞氏芽抱桿菌(Bacillusclausii)、凝固芽抱桿菌(Bacillus coagulans)、堅強(qiáng)芽抱桿菌(Bacillus firmus)、燦爛芽孢桿菌(Bacillus lautus)、遲緩芽孢桿菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)、巨大芽抱桿菌(Bacillus megaterium)、短小芽抱桿菌(Bacillus pumilus)、嗜熱脂肪芽抱桿菌(Bacillus stearothermophilus)、枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis)或蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)細(xì)胞。優(yōu)選地,所述實施方案的芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞是枯草芽孢桿菌宿主細(xì)胞。在本文提供的每個本發(fā)明實施
方案中，本發(fā)明提供分離的宿主細(xì)胞以及培養(yǎng)的細(xì)胞。本發(fā)明提供包含rap操縱子的宿主細(xì)胞，其中所述的rap操縱子包含至少一個失活的Phr和/或至少一個失活的rap基因。在一些實施方案中，該宿主細(xì)胞過量表達(dá)YmaH。在一些其他實施方案中，該宿主細(xì)胞還包含重組核酸。仍在一些其他實施方案中，該宿主細(xì)胞還包含編碼目的蛋白的多核苷酸序列。在一些額外的實施方案中，該重組核酸包含與編碼目的蛋白的多核苷酸序列有效連接的啟動子。在一些其他實施方案中，該啟動子是野生型或突變aprE啟動子。在一些額外的實施方案中，該宿主細(xì)胞是芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞。仍在一些其他實施方案中，該芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞是枯草芽孢桿菌。在一些額外的實施方案中，該宿主細(xì)胞以比不包含至少一個失活Phr和/或rap基因的宿主細(xì)胞所產(chǎn)生水平高的水平產(chǎn)生目的蛋白。在一些其他實施方案中，目的蛋白是酶。在一些額外的實施方案中，該酶是蛋白酶。仍在一些額外的實施方案中，至少一個失活的rap基因是rapA基因。在一些其他實施方案中，至少一個失活的phr基因選自phrA、phrE、phr C、phrF、phrG、phr I和phrK。在一些實施方案中，至少一個失活的phr基因是phrA,而在一些備選實施方案中，至少一個失活的Phr基因是phrE。在一些其他實施方案中，該宿主細(xì)胞包含至少一個失活的phr基因和至少一個失活的rap基因。在一些其他實施方案中，失活的rap基因是rapA基因。仍在一些其他實施方案中，存在至少一個失活的rap基因(例如，rapA)和至少一個選自phrA、phrE、phr C、phrF、phrG、phr I和phrK的失活phr基因。在一些實施方案中，至少一個失活的phr基因是phrA,而在一些備選實施方案中，至少一個失活的phr基因是phrE。仍在一些其他實施方案中，該宿主細(xì)胞包含失活的PhrA基因、失活的phrE基因、失活的rapA基因和編碼目的蛋白的重組核酸。在一些實施方案中，目的蛋白是酶。仍在一些其他實施方案中，該酶是蛋白酶。在一些實施方案中，該宿主細(xì)胞是芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞。在一些其他實施方案中，芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞是嗜堿芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、短芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、克勞氏芽孢桿菌、凝固芽孢桿菌、堅強(qiáng)芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌或蘇云金芽孢桿菌細(xì)胞。在一些額外的實施方案中，芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞是枯草芽孢桿菌宿主細(xì)胞。本發(fā)明也提供用于產(chǎn)生至少一種目的蛋白的方法，其包括提供前體宿主細(xì)胞和包含使至少一個固有Phr和/或rap基因失活的失活性多核苷酸的失活性核苷酸構(gòu)建體；將所述的失活性核苷酸構(gòu)建體導(dǎo)入所述前體宿主細(xì)胞以產(chǎn)生修飾的宿主細(xì)胞；并且在用于產(chǎn)生至少一種目的蛋白的合適條件下培育所述的修飾宿主細(xì)胞。在本發(fā)明方法的一些實施方案中，該目的蛋白由前體宿主細(xì)胞中存在的重組核酸編碼。在本發(fā)明方法的一些實施方案中，該目的蛋白由修飾的宿主細(xì)胞中存在的重組核酸編碼。在本發(fā)明方法的一些實施方案中，該目的蛋白由前體宿主細(xì)胞和/或修飾的宿主細(xì)胞中存在的重組核酸編碼。在本發(fā)明方法的一些實施方案中，該重組核酸包含與編碼此目的蛋白的多核苷酸序列有效連接的啟動子。在本發(fā)明方法的一些額外實施方案中，該目的蛋白是野生型目的蛋白。仍在本發(fā)明方法的一些額外實施方案中，前體宿主細(xì)胞天然地產(chǎn)生此目的蛋白。在本發(fā)明方法的一些其他實施方案中，修飾的宿主細(xì)胞的目的蛋白產(chǎn)生大于前體宿主細(xì)胞的目的蛋白產(chǎn)生。在本發(fā)明方法的一些實施方案中，所述方法還包括回收目的蛋白的步驟。在本發(fā)明方法的一些實施方案中，目的蛋白是酶。在本發(fā)明方法的一些其他實施方案中，該酶是蛋白酶。仍在本發(fā)明方法的一些其他實施方案中，修飾的宿主細(xì)胞包含在選自degU、degQ、degS、sco4、Sp0IIE、degQ和degR的至少一個基因中的突變。在本發(fā)明方法的一些實施方案中，宿主細(xì)胞包含deg (Hy) 32突變。在本發(fā)明方法的一些其他實施方案中，被失活的所述至少一個固
有phr基因選自phrA、phrE、phr C、phrF、phrG、phr I和phrK。仍在本發(fā)明方法的一些其他實施方案中，失活性多核苷酸使固有PhrA和phrE基因和/或rap基因失活。在本發(fā)明方法的一些實施方案中，至少一個固有的phr基因是phrA,而在一些備選實施方案中，至少一個固有的Phr基因是phrE。仍在本發(fā)明方法的一些額外實施方案中，固有的rap基因失活。在本發(fā)明方法的一些其他實施方案中，固有的rap基因是rapA。在本發(fā)明方法的一些額外實施方案中，前體宿主細(xì)胞或修飾的宿主細(xì)胞過量表達(dá)YmaH。在本發(fā)明方法的一些實施方案中，通過將SigH構(gòu)建體導(dǎo)入前體宿主細(xì)胞或修飾的宿主細(xì)胞中實現(xiàn)YmaH的過量表達(dá)。在本發(fā)明方法的一些其他實施方案中，SigH構(gòu)建體包含SEQ ID NO: 23，其包含與編碼YmaH蛋白的多核苷酸有效連接的SigH啟動子。在本發(fā)明方法的一些實施方案中，通過將SigA構(gòu)建體導(dǎo)入前體宿主細(xì)胞或所述修飾的宿主細(xì)胞中實現(xiàn)YmaH的過量表達(dá)。在本發(fā)明方法的一些其他實施方案中，SigA構(gòu)建體包含SEQ ID NO 26和/或31，其包含與編碼YmaH的多核苷酸有效連接的SigA啟動子。在本發(fā)明方法的一些實施方案中，該宿主細(xì)胞是芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞。在本發(fā)明方法的一些其他實施方案中，芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞是嗜堿芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、短芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、克勞氏芽孢桿菌、凝固芽孢桿菌、堅強(qiáng)芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌或蘇云金芽孢桿菌細(xì)胞。在本發(fā)明方法的一些額外實施方案中，芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞是枯草芽孢桿菌細(xì)胞。附圖簡述與附圖一起閱讀時，最佳地理解以下詳細(xì)描述的某些方面。應(yīng)當(dāng)強(qiáng)調(diào)根據(jù)常規(guī)習(xí)慣，附圖的各種特征不是合乎比例的。相反，為清晰起見，任意地放大或縮小多種特征的尺度。附圖中包括以下各圖圖I說明枯草芽孢桿菌rap操縱子中phr和rap基因的排列。圖2示意地說明用來缺失枯草芽孢桿菌中phr基因的失活盒共有的特征。圖 3 顯不 AprE 蛋白酶在包含 phrA、phrE、phrC、phrF、phrG、phr I 和 phrK 缺失的修飾的枯草芽孢桿菌菌株中的產(chǎn)生。圖4是顯示在對照枯草芽孢桿菌親代菌株BG2942 (菱形)中和在分別含有phrA和phrE基因缺失的修飾枯草芽孢桿菌菌株CB2-1 (正方形)和CB2-2 (三角形)中AprE產(chǎn)生的圖。圖5是顯示在親代枯草芽孢桿菌菌株CF471 (菱形)中和在分別含有phrE和phrA基因缺失的修飾枯草芽孢桿菌菌株CB3-48(正方形)和CB3-47(三角形)中蛋白酶FNA產(chǎn)生的圖。圖6是顯示缺失phrA和phrE基因聯(lián)合影響枯草芽孢桿菌中蛋白酶產(chǎn)生的圖。圖7說明用于產(chǎn)生多核苷酸構(gòu)建體的引物的位置，其中所述的多核苷酸構(gòu)建體用來在枯草芽孢桿菌中過量表達(dá)YmaH。分圖B-E顯示了用來產(chǎn)生構(gòu)建體SigH(分圖B)和SigA構(gòu)建體SigAl (分圖C)、SigA2(分圖D)和SigA3(分圖E)的引物相對于枯草芽孢桿
菌miaA操縱子的芽孢桿菌染色體序列(枯草芽孢桿菌菌株168的第1865428-1867019堿基對；NCBI登錄號NC000964)的位置，所述的芽孢桿菌染色體序列在分圖A中說明。引物對P4-P5和P6-P7是融合引物，它們在其5’端包含與直接擴(kuò)增序列同源的堿基對“尾部”，并且是彼此互補的。融合引物的互補尾部允許擴(kuò)增的Sigma A啟動子DNA融合至擴(kuò)增的YmaH編碼DNA以獲得含有與YmaH編碼序列毗鄰的Sigma A啟動子序列的嵌合性多核苷酸，同時缺失大部分或全部的miaA編碼序列。圖8顯示枯草芽孢桿菌基因組的一部分的多核苷酸序列，其中所述的部分包含定義SigA啟動子至YmaH蛋白編碼性序列末端的序列(SEQ ID NO :101)。將該序列圖示于圖7，分圖A中。將編碼miaA蛋白的序列的起點標(biāo)出并且完整的miaA編碼序列以粗體字母顯示；將編碼YmaH蛋白的序列的起點標(biāo)出并且完整的ymaH編碼序列以加下劃線的粗體字母
顯不O圖9 顯不質(zhì)粒 pBS19_ymaH sigH 的圖。圖IO(A-B)分圖A顯示由芽孢桿菌屬對照宿主細(xì)胞(42pBS)和由過量表達(dá)ymaH的枯草芽孢桿菌宿主細(xì)胞(42SigAl和42SigH)所產(chǎn)生枯草蛋白酶的蛋白酶解活性的示意圖。分圖B顯示由芽孢桿菌屬對照宿主細(xì)胞(42pBS)和由過量表達(dá)ymaH的枯草芽孢桿菌宿主細(xì)胞(41SigH)產(chǎn)生的枯草蛋白酶活性。將蛋白酶解活性度量為因水解和釋放對硝基苯胺所致405nm處的吸光度增加。酶促活性的水平是表明過量表達(dá)ymaH對芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞產(chǎn)生枯草蛋白酶的影響。

圖11顯示枯草芽孢桿菌對照宿主細(xì)胞42pBS19和過量表達(dá)ymaH的芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞42SigH和42SigAl產(chǎn)生枯草蛋白酶的水平。圖12是顯示phr缺失和YamH過量表達(dá)(使用多拷貝質(zhì)粒pBS19_ymaH sigH)對AprE表達(dá)產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)的圖。過量表達(dá)YmaH的影響在名為YmaH的枯草芽孢桿菌菌株(正方形)中并在分別含有PhrA和phrE基因缺失的修飾菌株CB2-11(三角形)和CB2_12(交叉形)中顯示，并且與對照菌株42pBS19中的AprE產(chǎn)生比較。圖13示意地說明用來缺失rapA基因的DNA構(gòu)建體。圖14顯示由枯草芽孢桿菌對照宿主細(xì)胞CF471 (實心菱形)、包含失活的phrA基因的修飾枯草芽孢桿菌細(xì)胞CB3-47 (實心正方形)和包含失活rapA基因和失活phrA基因的修飾枯草芽孢桿菌細(xì)胞JS1121 (空心三角形)產(chǎn)生枯草蛋白酶FNA的水平。
圖15 (A-B)顯示缺失phrH基因(實心正方形，分圖A)或rapH基因(實心正方形，分圖B)基因?qū)莶菅挎邨U菌產(chǎn)生AprE的影響。發(fā)明描述本發(fā)明提供已經(jīng)受到基因操作以具有增強(qiáng)的目的蛋白產(chǎn)生能力的宿主細(xì)胞。特別地，本發(fā)明涉及具有至少一個失活Phr和/或rap基因的修飾的芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞。修飾的芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞的增強(qiáng)的目的蛋白產(chǎn)生在過量表達(dá)YmaH的修飾芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞中進(jìn)一步增加。也提供用于在修飾的宿主細(xì)胞中產(chǎn)生目的蛋白的方法。雖然在本文中描述的是示例性絲氨酸蛋白酶(例如，F(xiàn)NA和AprE)，但本發(fā)明的組合物和方法不限于絲氨酸蛋白酶。實際上，本發(fā)明用于改善多個類型的酶以及蛋白酶(例如淀粉酶、纖維素酶、氧化酶、氧化還原酶、角質(zhì)酶、甘露聚糖酶、果膠酶、淀粉酶、脂肪酶等)的產(chǎn)生。實際上，不意圖使本發(fā)明限于任何具體的酶和酶類型。除非另外說明，本發(fā)明的實施涉及在分子生物學(xué)、微生物學(xué)、蛋白質(zhì)純化、蛋白質(zhì)工程、蛋白質(zhì)與DNA測序和重組DNA中常用的常規(guī)技術(shù)，它們處于本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍內(nèi)。此類技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的并且在眾多的標(biāo)準(zhǔn)教材和參考書中描述。本文此前和以下提到的全部專利、專利申請、文章和出版物因而通過引用的方式明確地并入本文作為參考。除非本文另外定義，本文中所用的全部技術(shù)術(shù)語及科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員通常理解的相同意義。包含本文中所包括術(shù)語的多部科學(xué)字典是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知和可獲得的。雖然與本文所述的那些方法和材料相似或等效的任意方法和材料可以用于實施或檢驗本發(fā)明中，然而描述了一些優(yōu)選的方法和材料。因而，通過參考作為一個整體的本說明書而更充分地描述下文立即定義的術(shù)語。應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明不限于所述的具體方法學(xué)、方案和試劑，因為這些內(nèi)容可以根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員使用它們的具體情況而變化。如本文中所用，單數(shù)術(shù)語“一個”、“一種”和“該”包括復(fù)數(shù)稱謂，除非上下文另外清楚地說明并非如此。除非另外說明，分別地，核酸從左至右以5'至3'方向書寫，并且氨基酸序列從左至由以氨基至羧基方向書寫。本文中所提到的全部專利、專利申請和其他出版物，包括這些參考文獻(xiàn)內(nèi)所公開的全部序列，通過引用方式以相同程度并入本文，如同專門且個別地說明通過引用方式并入每份單獨的出版物、專利或?qū)＠暾?。將所提到的全部文獻(xiàn)在有關(guān)的部分通過引用的方式并入本文。然而，對任意文獻(xiàn)的引用不得解釋為承認(rèn)該文獻(xiàn)相對于本文發(fā)明是現(xiàn)有技術(shù)。數(shù)字范圍包括定義該范圍的數(shù)字在內(nèi)。意圖在本說明書通篇范圍內(nèi)給出的每個最大數(shù)字界限包括每個較小的數(shù)字界限，如同在本文中明確地寫出此類較小的數(shù)字界限。在本說明書通篇范圍內(nèi)給出的每個最小數(shù)字界限將包括每個較高的數(shù)字界限，如同在本文中明確地寫出此類較高的數(shù)字界限。在本說明書通篇范圍內(nèi)給出的每個數(shù)字范圍將包括屬于這種較寬泛數(shù)字范圍內(nèi)的每個較窄的數(shù)字界限，如同在本文中明確地寫出此類較窄的數(shù)字界限。本文中所提供的標(biāo)題題目不限制可能通過參考作為一個整體的本說明書來實現(xiàn)的本發(fā)明的多個方面或?qū)嵤┓桨?。因此，如上文所示，通過參考作為一個整體的本說明書來更充分地定義下文立即定義的術(shù)語。定義
如本文中所用，“修飾的宿主細(xì)胞”是含有至少一個失活的phr和/或rap基因的重組宿主細(xì)胞。修飾的宿主細(xì)胞衍生自前體宿主細(xì)胞，該前體宿主細(xì)胞可以是野生型或包含未失活的Phr基因的重組前體宿主細(xì)胞。如本文中所用，“重組宿主細(xì)胞”指已經(jīng)通過導(dǎo)入至少一個重組/異源核酸被修飾的細(xì)胞。因而，例如，重組宿主細(xì)胞表達(dá)在該細(xì)胞的親代形式內(nèi)不以相同形式存在的基因或表達(dá)否則因人為故意干預(yù)而異常表達(dá)、不足表達(dá)或根本不表達(dá)的天然基因。如本文中所用，“前體宿主細(xì)胞”在本文中與“親代宿主細(xì)胞”互換地使用，以表示被遺傳改變以產(chǎn)生修飾的宿主細(xì)胞的宿主細(xì)胞。如本文中所用，術(shù)語“重組多核苷酸”和“重組多肽”分別指宿主細(xì)胞中不天然存在的多核苷酸和多肽。重組多核苷酸或多肽分子可以含有兩個或多個以非天然存在形式連接在一起的天然存在序列?！爸亟M”、“重組(recombining) ”或產(chǎn)生“重組的”或“重組”核酸一般是兩個或多個核酸片段的裝配物，其中所述裝配物產(chǎn)生嵌合基因。如本文中所用，“重組體”在談及細(xì)胞使用時意指已經(jīng)通過導(dǎo)入異源核酸序列被修飾的細(xì)胞或意指從如此修飾的細(xì)胞衍生的細(xì)胞。因而，例如，重組細(xì)胞表達(dá)不以該細(xì)胞的天然(非重組)形式中的相同形式存在的基因或表達(dá)否則因人為故意干預(yù)而異常表達(dá)、不足表達(dá)或根本不表達(dá)的天然基因。如本文中所用，“類似序列”是一級生物學(xué)序列，如氨基酸序列或DNA序列的核苷酸，其中蛋白質(zhì)或所編碼蛋白質(zhì)的功能與賦予本文中提到的Phr、Rap和YmaH蛋白的功能基本上相同。額外地，類似的蛋白質(zhì)與本文中提到的Phr、Rap和YmaH蛋白的變體的序列具有至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%序列同一性。類似序列通過已知的序列比對方法確定。通常使用的比對方法是BLAST，不過如上文及下文所示，也存在用于比對序列的其他方法。一個有用算法的實例是PILEUP。使用累進(jìn)配對比對法，PILEUP從一組相關(guān)的序列中產(chǎn)生多重序列比對結(jié)果。它也可以繪制進(jìn)化樹，其中所述進(jìn)化樹顯示用來產(chǎn)生該比對結(jié)果的聚類關(guān)系。PILEUP使用Feng和Doolittle累進(jìn)比對法(Feng和Doolittle，J. Mol. Evol. ,35 =351-360 [1987])的簡化形式。該方法類似于Higgins和 Sharp 描述的方法(Higgins 和 Sharp, CABIOS 5 :151-153 [1989])。有用的 PILEUP 參數(shù)包括默認(rèn)空位權(quán)重3. 00、默認(rèn)空位長度權(quán)重0. 10和加權(quán)末端空位。另一個有用算法的實例是由 Altschul 等人(Altschul 等人,J. Mol. Biol. 215 :403-410, [1990] JPKarlin 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA90 :5873-5787[1993])描述的 BLAST 算法。一個特別有用的BLAST 程序是 WU-BLAST-2 程序(見，Altschul 等人，Meth. Enzymol.，266 :460-480 [1996])。WU-BLAST-2使用幾個檢索參數(shù)，其中大部分設(shè)置成默認(rèn)值。用以下值設(shè)置可調(diào)整參數(shù)重疊覆蓋區(qū)=1，重疊分?jǐn)?shù)=O. 125，字閾值(T) = 11。HSP S和HSP S2參數(shù)是動態(tài)值并且由程序自身根據(jù)特定序列的組成和特定數(shù)據(jù)庫的組成建立，其中針對所述的特定數(shù)據(jù)庫檢索目的序列。然而，可以調(diào)整所述值以提高靈敏度。％氨基酸序列同一性值由匹配的相同殘基數(shù)除以比對區(qū)域中“較長”序列的殘基總數(shù)來確定?！拜^長的”序列是比對區(qū)域中具有最多實際殘基的序列(忽略由WU-Blast-2導(dǎo)入以使比對評分最大化的空位)。在重疊覆蓋區(qū)和重疊分?jǐn)?shù)分別設(shè)置成I和O. 125的情況下，優(yōu)選的方法使用設(shè)置成默認(rèn)參數(shù)的WU-BLAST-2的BLASTN模塊。
如本文中所用，“序列同一性百分?jǐn)?shù)) ”或“百分?jǐn)?shù)同源性”在談及多核苷酸或多肽序列使用時定義為候選序列中與起始序列(即目的序列)的核苷酸或氨基酸殘基相同的核苷酸或氨基酸殘基的百分?jǐn)?shù)。通過本領(lǐng)域已知的方法比對所述序列并且確定同一性，通過直接比較分子之間的序列信息確定多核苷酸序列或多肽序列共有的同一性百分?jǐn)?shù)。在一些實施方案中，比對包括將空位導(dǎo)入待比對的序列中。此外，對于比候選多核苷酸或多肽序列含有更多或更少核苷酸或氨基酸的序列，應(yīng)當(dāng)理解同源性百分?jǐn)?shù)將以相對于核苷酸或氨基酸總數(shù)的同源核苷酸或氨基酸的數(shù)目為基礎(chǔ)來測定。如本文中所用，“同源性”指序列相似性或同一性，優(yōu)選同一性。這種同源性使用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)(見例如，Smith和 Waterman, Adv. Appl. Math. ,2 :482 [1981] ；Needleman 和 ffunsch, J. Mol. Biol. ,48 443 [1970] ;Pearson 和 Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85 :2444 [1988];程序如威斯康辛 Genetics 軟件包(Genetics Computer Group, Madison, WI)中的 GAP、BESTFIT、FASTA和 TFASTA 和 Devereux 等人，NucI. Acid Res. , 12 :387-395 [1984])來確定。如本文中所用，術(shù)語“異源”指通常彼此無聯(lián)系的元件。例如，如果某宿主細(xì)胞產(chǎn)生一種異源蛋白質(zhì)，則該蛋白質(zhì)是通常不由該宿主細(xì)胞產(chǎn)生的蛋白質(zhì)。同樣地，與異源編碼
序列有效連接的啟動子是與不是野生型序列的編碼序列有效連接的啟動子。如本文中所用，“目的蛋白”或“目的多肽”指由宿主細(xì)胞表達(dá)/產(chǎn)生的蛋白質(zhì)。通常而言，目的蛋白是具有商業(yè)意義的想要的蛋白質(zhì)。目的蛋白可以相對于該宿主為同源或異源的。在一些實施方案中，目的蛋白是分泌的多肽，特別是酶，包括但不限于淀粉水解酶、蛋白質(zhì)水解酶、纖維素水解酶、氧化還原酶和植物細(xì)胞壁降解酶。在又一些實施方案中，這些酶包括但不限于淀粉酶、蛋白酶、木聚糖酶、脂肪酶、漆酶、酚氧化酶、氧化酶、角質(zhì)酶、纖維素酶、半纖維素酶、酯酶、過氧化物酶、過氧化氫酶、葡萄糖氧化酶、植酸酶、果膠酶、葡糖苷酶、異構(gòu)酶、轉(zhuǎn)移酶、半乳糖苷酶和殼多糖酶。仍在又一些實施方案中，表達(dá)的多肽是激素、細(xì)胞因子、生長因子、受體、疫苗、抗體等。盡管不意圖使本發(fā)明限于任何具體蛋白質(zhì)/多肽，在一些最優(yōu)選的實施方案中，表達(dá)的目的蛋白是蛋白酶。如本文中所用，術(shù)語“蛋白酶”和“蛋白酶解活性”指這樣的蛋白質(zhì)或肽，其顯示水解肽或具有肽鍵的底物的能力。存在許多用于測量蛋白酶解活性的熟知方法(Kalisz, “Microbial Proteinases”，在Fiechter (編著)，Advances in BiochemicalEngineering/Biotechnology, [1988])。例如，蛋白酶解活性可以通過比較測定法確定,其中所述的比較測定法分析相應(yīng)蛋白酶水解商品底物的能力。在分析蛋白酶或蛋白酶解活性中有用的示例性底物包括但不限于二甲基酪蛋白(Sigma C-9801)、牛膠原蛋白(SigmaC-9879)、牛彈性蛋白(Sigma E-1625)和牛角蛋白(ICN Biomedical 9021111)。使用這些底物的比色測定法是本領(lǐng)域熟知的(見例如WO 99/34011和美國專利號6，376，450，這兩份專利均通過引用的方式并入本文)。pNA測定法(見例如Del Mar等人,Anal. Biochem.,99316-320[1979])也用于確定在梯度洗脫期間所收集的級分的活性酶濃度。該測定法測量當(dāng)酶水解可溶性合成底物琥珀酰-丙氨酸-丙氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸-對硝基苯胺(sAAPF-pNA)時釋放對硝基苯胺的速率。在分光光度計上于410nm處測量從水解反應(yīng)中產(chǎn)生黃顏色的速率并且該速率與活性酶濃度成正比。此外，280nm處的吸光度量值可以用來確定總蛋白濃度?；钚悦?總蛋白比產(chǎn)生該酶純度。如本文中所用，術(shù)語“枯草蛋白酶”指屬于通過活性部位處絲氨酸殘基對肽鍵發(fā)動親核攻擊的絲氨酸蛋白酶類的蛋白酶(絲氨酸內(nèi)肽酶)?？莶莸鞍酌敢源蟮牧繌脑S多芽孢桿菌屬物種中分泌。例如，F(xiàn)NA，其為含有Y217L置換的枯草蛋白酶BPN’，是從解淀粉芽孢桿菌獲得的枯草蛋白酶，并且AprE是從枯草芽孢桿菌獲得的枯草蛋白酶。如本文中所用，基因的“缺失”指完整編碼序列的缺失、編碼序列的部分的缺失或包括側(cè)翼區(qū)的編碼序列的缺失。所述缺失可以是部分的，只要染色體中剩下的序列引起想要的該基因生物學(xué)功能喪失。編碼序列的側(cè)翼區(qū)可以在5’和3’端包括約Ibp至約500bp。側(cè)翼區(qū)可以大于500bp，但是將優(yōu)選地不包括該區(qū)域內(nèi)根據(jù)本發(fā)明可以失活或缺失的其他基因。最終結(jié)果是缺失的基因有效地失去功能。簡而言之，“缺失”定義為核苷酸或氨基酸序列的變化，其中一個或多個核苷酸或氨基酸殘基已經(jīng)分別移去(即，不存在)。因而，“缺失突變體”具有比相應(yīng)親代宿主細(xì)胞少的核苷酸或氨基酸。在一些實施方案中，Phr基因的缺失提供增強(qiáng)的目的蛋白(例如，蛋白酶)表達(dá)。在一些實施方案中，缺失一個或多個選自由phrA、phrC、phrE、phrF、phr I和phrK組成的組中的基因提供了增強(qiáng)蛋白酶產(chǎn)生的改良菌株。如本文中所用，“相應(yīng)的未修飾芽孢桿菌屬菌株”或“親代”或“前體”芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞是從中失活固有染色體區(qū)(例如，PhrA和/或phrE基因)并且從中衍生變異/重組菌株的源頭宿主菌株。如果一種多肽在某重組宿主細(xì)胞中以比它在前體細(xì)胞中表達(dá)高的水平表達(dá)，則該多肽在此重組宿主細(xì)胞中“過量表達(dá)”。如本文中所用，術(shù)語“同源”在談及多核苷酸或蛋白質(zhì)使用時指天然存在于宿主細(xì)胞中的多核苷酸或蛋白質(zhì)。如本文中所用，術(shù)語“多肽”指由肽鍵連接的氨基酸組成的化合物。如本文中所用術(shù)語“蛋白質(zhì)”可以同義于術(shù)語“多肽”或可以另外地指兩個或多個多肽的復(fù)合物。因而，術(shù)語“蛋白質(zhì)”、“肽”和“多肽”互換地使用。如本文中所用，術(shù)語“嵌合多肽”和“融合多肽”互換地用來指包含可以源自或可以不源自相同蛋白質(zhì)的至少兩個分開的且不同區(qū)域的蛋白質(zhì)。例如，與目的蛋白連接的下述信號肽稱作嵌合多肽或嵌合蛋白，其中所述的信號肽正常不與目的蛋白接合。如本文中所用，“信號序列”是存在于蛋白質(zhì)氨基端部分的氨基酸序列，其促進(jìn)成熟形式的該蛋白質(zhì)分泌于細(xì)胞外部。信號序列的定義是功能性定義。成熟形式的胞外蛋白缺少信號序列，所述信號序列在分泌過程期間被切除。“前序列(prosequence) ”是在信號序列與成熟蛋白酶之間對該蛋白酶分泌為必需的氨基酸序列。該前序列的切除產(chǎn)生成熟的活性蛋白酶。術(shù)語“信號序列”或“信號肽”指可以參與成熟或前體形式的蛋白質(zhì)分泌的任意核苷酸序列和/或氨基酸序列。信號序列的這種定義是一種功能性定義，其意圖包括由該蛋白質(zhì)基因的氨基端部分編碼的參與實現(xiàn)該蛋白質(zhì)分泌的全部那些氨基酸序列。它們往往但并非普遍地與蛋白質(zhì)的氨基端部分或與前體蛋白的N端部分結(jié)合。信號序列可以是內(nèi)源或外源的。信號序列可以是通常與該蛋白質(zhì)(例如，蛋白酶)接合的那種信號序列，或可以來自編碼另一種分泌性蛋白的基因。一個示例性外源信號序列包含來自枯草芽孢桿菌枯草蛋白酶信號序列的頭7個氨基酸殘基，其中這七個氨基酸殘基與來自遲緩芽孢桿菌(ATCC21536)的枯草蛋白酶的信號序列的剩余部分融合。
術(shù)語“aprE啟動子”在本文中指天然驅(qū)動枯草蛋白酶在枯草芽孢桿菌中表達(dá)的多核苷酸啟動子序列(Ferrari等人，J Bacteriol. 170 :289-295[1988])。在aprE啟動子的語境下，“aprE啟動子”在本文中指野生型aprE啟動子和其突變體。在一些實施方案中，aprE啟動子包括對該啟動子的DegU、ScoC、AbrB和任何其他調(diào)節(jié)物所產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用為必需的核苷酸序列物和/或aprE轉(zhuǎn)錄前導(dǎo)序列(Hambraeus等人，Microbiology 148 1795-1803 [2002])。在一些備選的實施方案中，aprE啟動子不包括對DegU、ScoC、AbrB和其他調(diào)節(jié)物所產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用為必需的全部核苷酸序列，和/或不包括aprE轉(zhuǎn)錄前導(dǎo)序列。如本文中所用，“失活的基因”是基因組的基因座，其中所述的基因座在其失活之前能夠產(chǎn)生蛋白質(zhì)(即，能夠轉(zhuǎn)錄成可以翻譯以產(chǎn)生全長多肽的RNA)。當(dāng)編碼多肽的基因不轉(zhuǎn)錄且不翻譯成具有生物學(xué)活性(在酶的情況下，所述生物學(xué)活性例如是催化活性)的全長蛋白時，該基因失活。某基因可以因改變其轉(zhuǎn)錄過程所要求的序列，例如因改變RNA加工過程(例如，添加聚腺苷酸尾)所要求的序列、因改變翻譯過程所要求的序列或因改變所編碼多肽的氨基酸序列(例如，因核苷酸置換等)失活。失活基因的實例包括但不限于缺
失的基因、含有缺失區(qū)的基因、含有重排區(qū)的基因、具有失活性點突變或移碼的基因和含有插入的基因。某基因也可以因改變或缺失操縱子中毗鄰基因的序列失活。此外，某基因也可以使用反義法或取消該基因表達(dá)的任何其他方法來失活。如本文中所用，術(shù)語“核酸”包括DNA、RNA (無論為單鏈或雙鏈)，并且包括化學(xué)修飾的DNA或RNA。術(shù)語“核酸”和“多核苷酸”在本文互換地使用。術(shù)語“失活”包括阻止一種或多種phr基因(phrA、phr C、phrE、phrF、phr I和phrK)功能性表達(dá)的任何方法，其中所述的基因或基因產(chǎn)物(即，編碼的Phr蛋白)不能夠產(chǎn)生它的已知功能。失活借助任何合適的手段發(fā)生，所述的手段包括在核酸基因序列中缺失、置換(例如，突變)、中斷和/或插入。在一些實施方案中，改變/重組的芽孢桿菌屬菌株包含一個或多個基因的失活，其中所述的失活優(yōu)選地導(dǎo)致穩(wěn)定和不可逆的失活。在一些實施方案中，通過缺失實現(xiàn)失活。在一些優(yōu)選的實施方案中，通過同源重組缺失基因。例如，在phrA是待缺失基因時的一些實施方案中，使用包含外來序列(incoming sequence)的失活性DNA構(gòu)建體，其中所述的外來序列具有在每一側(cè)分布有同源盒的選擇標(biāo)記。該同源盒包含與染色體PhrA基因的核酸側(cè)翼區(qū)同源的核苷酸序列。失活性DNA構(gòu)建體與芽孢桿菌屬宿主染色體的同源序列對齊并且PhrA基因在一個雙交換事件中從宿主染色體切下。在某些實施方案中，改變/重組的細(xì)胞是包含兩個失活基因(例如，phrA和phrE)的芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞。在其他實施方案中，芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞包含3個失活基因、4個失活基因、5個失活基因、6個失活基因或更多個失活基因。因而，不意圖使失活基因的數(shù)目限于任何具體的基因數(shù)。在一些實施方案中，失活的基因是彼此連續(xù)的，而在其他實施方案中，它們位于芽孢桿菌染色體的分立區(qū)域內(nèi)。在一些實施方案中，失活的染色體基因具有某些條件下的必需功能，但是該基因?qū)τ趯嶒炇覘l件下芽孢桿菌屬菌株活力不是必需的。優(yōu)選的實驗室條件包括但不限于條件，如在適于微生物生長的發(fā)酵罐、搖瓶、平板培養(yǎng)基等中生長。如本文中所用，術(shù)語“失活性DNA構(gòu)建體”、“失活性多核苷酸”和“缺失盒”互換地用來指DNA構(gòu)建體，其包含可以插入某基因以干擾該基因功能的無功能序列。在一些實施方案中，失活性DNA構(gòu)建體包含編碼選擇標(biāo)記的序列。失活性DNA構(gòu)建體也可以包括兩個同源盒。如本文中所用，術(shù)語“表達(dá)盒”和“表達(dá)載體”指重組或合成地產(chǎn)生的核酸構(gòu)建體，其具有一系列允許特定核酸在靶細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的指定核酸元件。重組表達(dá)盒可以摻入質(zhì)粒、染色體、線粒體DNA、質(zhì)體DNA、病毒或核酸片段。一般而言，表達(dá)載體的重組表達(dá)盒部分包括待轉(zhuǎn)錄的核酸序列和啟動子，以及其他序列。在優(yōu)選的實施方案中，表達(dá)載體具有將異源DNA片段摻入宿主細(xì)胞中和表達(dá)的能力。眾多原核和真核表達(dá)載體是市售的。適宜表達(dá)載體的選擇處于本領(lǐng)域技術(shù)人員的知識范圍內(nèi)。術(shù)語“表達(dá)盒”在本文中與“DNA構(gòu)建體”及其語法等同物互換地使用。合適表達(dá)載體的選擇處于本領(lǐng)域技術(shù)人員的知識范圍內(nèi)。如本文中所用，術(shù)語“DNA構(gòu)建體”和“轉(zhuǎn)化性DNA”互換地用來指將序列導(dǎo)入宿主細(xì)胞或生物中所使用的DNA。該DNA可以通過PCR或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任意其他合適技術(shù)在體外(in vitro)產(chǎn)生。在特別優(yōu)選的實施方案中,DNA構(gòu)建體包含目的序列(例如，作為外來序列)。在一些實施方案中，該序列與額外元件如調(diào)控元件(例如，啟動子等)
有效連接。該DNA構(gòu)建體還可以包含選擇標(biāo)記。它還可以包含側(cè)翼分布有同源盒的外來序列。在又一個實施方案中，轉(zhuǎn)化性DNA包含添加至末端的其他非同源序列(例如，填充序列或側(cè)翼序列)。在一些實施方案中，外來序列的末端被閉合，從而這種轉(zhuǎn)化性DNA形成閉合環(huán)。所述轉(zhuǎn)化性序列可以是野生型、突變或修飾的。在一些實施方案中，該DNA構(gòu)建體包含與宿主細(xì)胞染色體同源的序列。在其他實施方案中，該DNA構(gòu)建體包含非同源序列。一旦在體外裝配出DNA構(gòu)建體，則它可以用來1)將異源序列插入宿主細(xì)胞的預(yù)期靶序列中；和/或2)誘變宿主細(xì)胞染色體的區(qū)域(即，用異源序列替換內(nèi)源序列)，3)缺失靶基因；和/或?qū)?fù)制型質(zhì)粒導(dǎo)入宿主中。如本文中所用，術(shù)語“異源DNA序列”指不天然存在于宿主細(xì)胞中的DNA序列。在一些實施方案中，異源DNA序列是由不同基因的部分(包括調(diào)節(jié)元件)組成的嵌合DNA序列。如本文中所用，術(shù)語“異源蛋白”指不天然存在于宿主細(xì)胞中的蛋白質(zhì)或多肽(即，它由異源序列編碼)。如本文中所用，“同源蛋白”指細(xì)胞中固有或天然存在的蛋白質(zhì)或多肽。術(shù)語“YmaH蛋白”與“Hfq蛋白”互換地使用并且指增強(qiáng)目的蛋白表達(dá)的蛋白質(zhì)。在YmaH的語境中，“ YmaH蛋白”在本文中指野生型YmaH蛋白及其變體，包括直向同源物。如本文中所用，術(shù)語“載體”指設(shè)計旨在將核酸導(dǎo)入一種或多種宿主細(xì)胞的多核苷酸。在優(yōu)選的實施方案中，載體在不同的宿主細(xì)胞中自主復(fù)制。本術(shù)語意圖包括但不限于克隆載體、表達(dá)載體、穿梭載體、質(zhì)粒、曬菌體顆粒、盒(cassettes)等。如本文中所用的“表達(dá)載體”指包含與合適的調(diào)控序列有效連接的蛋白質(zhì)編碼區(qū)的DNA構(gòu)建體，其中所述的合適調(diào)控序列能夠?qū)崿F(xiàn)該蛋白質(zhì)在合適宿主細(xì)胞中的表達(dá)。在一些實施方案中，此類調(diào)控序列包括實現(xiàn)轉(zhuǎn)錄的啟動子、控制轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生mRNA的任選操縱基因序列、編碼mRNA中合適核糖體結(jié)合位點的序列、和增強(qiáng)子、以及控制轉(zhuǎn)錄和翻譯終止的序列。如本文中所用，術(shù)語“啟動子”指啟動下游核酸轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)序列。如本文中所用，術(shù)語“有效連接”指元件的排列，其中所述的排列使得所述元件功能地聯(lián)系。例如，如果某啟動子控制某編碼序列的轉(zhuǎn)錄，則該啟動子與此序列有效連接。如本文中所用，術(shù)語“衍生”包括術(shù)語“源自”、“獲得”、“從......可獲得”和
“從......分離”。如本文中所用，“非致病性”生物是對人和/或其他動物無致病性的生物。如本文中所用的術(shù)語“回收的”、“分離的”和“分開的”指從與其天然結(jié)合的至少一種組分中取出的蛋白質(zhì)、細(xì)胞、核酸或氨基酸。如本文中將某核酸序列導(dǎo)入細(xì)胞的情況下所用，術(shù)語“導(dǎo)入”指任何適于將此核酸序列轉(zhuǎn)移至該細(xì)胞中的方法。用于導(dǎo)入的此類方法包括但不限于原生質(zhì)體融合法、轉(zhuǎn)染法、轉(zhuǎn)化法、接合法和轉(zhuǎn)導(dǎo)法(見例如，F(xiàn)errari等人,“Genetics, ”在Hardwood等人(編著)，Bacillus. Plenum Publishing Corp.,第 57-72 頁[1989]中)。如本文中所用，術(shù)語“轉(zhuǎn)化的”和“穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的”指這樣的細(xì)胞，其具有非天然(異源)多核苷酸序列整合入其基因組中或作為維持至少兩個世代的附加體質(zhì)粒。如本文中所用，術(shù)語“表達(dá)”指多肽基于基因的核酸序列被產(chǎn)生的過程。該過程包括轉(zhuǎn)錄和翻譯。如本文中所用，術(shù)語“編碼選擇標(biāo)記的核苷酸序列”指這樣的核苷酸序列，它能夠在宿主細(xì)胞中表達(dá)并且其中該選擇標(biāo)記的表達(dá)賦予含有所表達(dá)基因的細(xì)胞在相應(yīng)選擇劑存在下或缺少必需養(yǎng)分時生長的能力。如本文中所用，術(shù)語“選擇標(biāo)記“和“選擇性標(biāo)記”指能夠在宿主細(xì)胞中表達(dá)的核酸(例如基因)，所述核酸允許容易地選擇含有載體的那些宿主。此類選擇標(biāo)記的例子包括但不限于抗微生物劑。因而，術(shù)語“選擇標(biāo)記”指這樣的基因，它們提供了宿主細(xì)胞已經(jīng)攝取外來目的DNA或一些其他反應(yīng)已經(jīng)發(fā)生的指示。一般而言，選擇標(biāo)記是這樣的基因，它們賦予宿主細(xì)胞抗微生物劑抗性或代謝優(yōu)勢以使得含有外源DNA的細(xì)胞與轉(zhuǎn)化期間沒有接受任何外源序列的細(xì)胞區(qū)別。“原住性選擇標(biāo)記”是位于待轉(zhuǎn)化微生物的染色體上的選擇標(biāo)記。原住性選擇標(biāo)記編碼與轉(zhuǎn)化DNA構(gòu)建體上的選擇標(biāo)記不同的基因。選擇標(biāo)記是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。如上文所示，優(yōu)選地，該標(biāo)記是抗微生物劑抗性標(biāo)記(例如ampK ；phleoE ；specE ；kanE ；eryE ；tetE ；cmpE 和 neoR(見例如，Guerot-Fleury, Gene, 167 :335-337,1995 ；Palmeros 等人，Gene 247 :255_264，2000 和 Trieu-Cuot 等人，Gene，23 :331-341，1983)。根據(jù)本發(fā)明有用的其他標(biāo)記包括但不限于營養(yǎng)缺陷型標(biāo)記如色氨酸；和檢測標(biāo)記，如β-半乳糖苷酶。如本文中所用，“培養(yǎng)”指在合適的條件下在液態(tài)或固態(tài)培養(yǎng)基中培育微生物細(xì)胞群體。在一些實施方案中，培養(yǎng)指外源目的蛋白或其他所希望終產(chǎn)物的發(fā)酵性重組產(chǎn)生(一般在容器或反應(yīng)器中)。如本文中所用，術(shù)語“產(chǎn)生”在談及目的蛋白使用時包括轉(zhuǎn)錄和翻譯的過程，并且根據(jù)需要，包括分泌和成熟過程，這產(chǎn)生活性形式的蛋白質(zhì)。對于分泌至胞外培養(yǎng)基中的蛋白質(zhì)(例如，蛋白酶)，將蛋白質(zhì)產(chǎn)生的水平評估為分泌至胞外培養(yǎng)基中的活性蛋白質(zhì)的量。如本文中所用，“芽孢桿菌屬物種(Bacillus sp.) ”指“芽孢桿菌屬”內(nèi)部的全部物種，它們是分類為芽孢桿菌綱(Bacilli)、芽孢桿菌目(Bacillale)、芽孢桿菌科(Bacillaceae)成員的革蘭氏陽性細(xì)菌。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所致，“芽孢桿菌屬”包括“芽孢桿菌屬”內(nèi)的全部物種，包括但不限于嗜堿芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、短芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、克勞氏芽孢桿菌、凝固芽孢桿菌、堅強(qiáng)芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌或蘇云金芽孢桿菌細(xì)胞。認(rèn)識到芽孢桿菌屬仍在進(jìn)行分類學(xué)重新編排。因而，意圖該屬包括已經(jīng)重新劃分的物種，包括但不限于此類生物，如嗜熱脂肪芽孢桿菌，它現(xiàn)在名叫“嗜熱脂肪土芽孢桿菌(Geobacillus stearothermophilus)”。在氧存在下產(chǎn)生抗性內(nèi)生孢子被視為芽孢桿菌屬的限定性特征，盡管這個特征也適用于新近命名的脂環(huán)酸芽孢桿菌屬(Alicyclobacillus)、雙芽孢桿菌屬(Amphibacillus)、硫胺素芽孢桿菌屬(Aneurinibacillus)、厭氧芽孢桿菌屬(Anoxybacillus)、短芽孢桿菌屬(Brevibacillus)、Filobacillus、薄壁芽抱桿菌屬(Gracilibacillus)、喜鹽芽抱桿菌 Halobacillus)、類芽抱桿菌屬(Paenibacillus)、需鹽芽抱桿菌屬(Salibacillus)、耐熱芽孢桿菌屬(Thermobacillus)、解脲芽孢桿菌屬(Ureibacillus)和枝芽孢桿菌屬(Virgibacillus)。其他術(shù)語的定義可以在本說明書通篇范圍內(nèi)顯而易見。在更詳細(xì)地描述示例性實施方案之前，應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明不限于所述的具體實施方案，因為這類實施方案當(dāng)然可以變動。還應(yīng)當(dāng)理解本文中所用的術(shù)語其目的僅在于描述具體實施方案，并且不意圖是限制性的。在更詳細(xì)地描述示例性實施方案之前，應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明不限于所述的具體實施方案，因為這類實施方案當(dāng)然可以變動。還應(yīng)當(dāng)理解本文中所用的術(shù)語其目的僅在于描述具體實施方案，并且不意圖是限制性的。修飾的宿主細(xì)胞芽孢桿菌屬細(xì)胞利用雙組分信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)(每種系統(tǒng)含有傳感器激酶和應(yīng)答調(diào)節(jié)物)來感知和應(yīng)對多種類型的胞外刺激。已知的雙組分信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)參與多種過程，如感受態(tài)發(fā)育(Dubnau, Microbiological Reviews 199 155, 395-424)、蛋白質(zhì)分泌(Kunst,Research in Microbiology 1994 145,393-402 ；Darmon, Journal of Bacteriology 2002184, 5661-5671),妝抗生素和殺菌素的合成(Marahiel Molecular Microbiology 1993 7,631-636 ；Stein, Molecular Microbiology 2002 44,403-416)和芽抱形成(Grossman,Annual Reviews Genetics 1995 29,477-508)。這些調(diào)節(jié)系統(tǒng)受胞內(nèi)應(yīng)答調(diào)節(jié)物天冬氨酰磷酸酶(Rap)及其對抗性磷酸酶調(diào)節(jié)物(Phr)控制。Rap使應(yīng)答調(diào)節(jié)物去磷酸化,這改變基因表達(dá)，因而產(chǎn)生細(xì)胞應(yīng)答。Phr肽充當(dāng)細(xì)胞密度信號傳導(dǎo)分子并且抑制Rap磷酸酶(Perego, Procedings of the National Acadamy of Science USA 1997 94,8612-8617 ；Perego, M. Trends in Microbiology 1998 6，366-370 ;Perego，Cell 199479,1047-1055)。Rap磷酸酶留在細(xì)胞質(zhì)，而Phr肽含有氨基端信號肽并且作為前肽輸出，最可能經(jīng) Sec 途徑輸出(Perego, Molecular Microbiology 1996 19,1151-1170 ；Tjalsma.Microbiological and Molecular Biology Reviews 2000 64,515-547)。另外，胞外加工產(chǎn)生有活性的Phr五肽。通過培養(yǎng)的細(xì)胞借助寡肽通透酶(Opp)系統(tǒng)再輸入后，Phr肽特異性抑制其關(guān)聯(lián)物Rap磷酸酶的活性(Solomon, Genes and Development 1996 10,2014-2024 ；Perego, Procedings of the National Acadamy of Science USA 1997 94，8612-8617 ；Perego, Trends in Microbiology 1998 6，366-370)。Phr 肽充當(dāng)細(xì)胞密度傳感蛋白(quorum sensors)，因為它們啟動應(yīng)答于細(xì)胞密度變化的細(xì)胞反應(yīng)。Rap蛋白和抑制Rap蛋白的Phr肽在單一操縱子上編碼?？莶菅挎邨U菌基因組中有8個rap操縱子和3個其他rap編碼基因，其中所述操縱子與之關(guān)聯(lián)的phr基因轉(zhuǎn)錄(Kunst, Nature 1997390, 249-256)。Pottathil (Front Biosci. 2003 8 :d32_45)和 Perego (Peptides 2001 22:1541-7)中綜述了枯草芽孢桿菌rap/phr信號傳導(dǎo)系統(tǒng)。本發(fā)明提供了經(jīng)修飾的芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞，其是已經(jīng)受到基因操作以具有增強(qiáng)的目的蛋白產(chǎn)生能力的宿主細(xì)胞。特別地，本發(fā)明涉及含有基因組的修飾芽孢桿菌屬細(xì)胞，其中所述基因組包含至少一個包含失活Phr基因的rap操縱子。在一些實施方案中，修飾的芽孢桿菌屬細(xì)胞含有基因組，該基因組包含至少一個包含失活Phr基因和失活rap基因的rap操縱子。與未修飾的前體芽孢桿菌細(xì)胞產(chǎn)生相同的蛋白質(zhì)相比時,phr和/或rap基因的失活增強(qiáng)了修飾的芽孢桿菌細(xì)胞產(chǎn)生目的蛋白。因而，修飾的芽孢桿菌細(xì)胞包含至少一個失活的Phr和/或rap基因和編碼目的蛋白的多核苷酸。在一些實施方案中，編碼目的蛋白的多核苷酸是野生型多核苷酸。在其他實施方案中，編碼目的蛋白的多核苷酸是重組多核苷酸。幾種芽孢桿菌rap操縱子的DNA序列和由所述操縱子編碼的Rap和Phr蛋白已經(jīng)測定并且提交至NCBI Genbank數(shù)據(jù)庫中。在某些實施方案中，在主題細(xì)胞中修飾過的芽孢桿菌rap操縱子a)可以與提交至NCBI Genbank數(shù)據(jù)庫中的rap操縱子序列具有至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約97%或至少約98%序列同一性的序列山)可以在嚴(yán)格條件下與提交至NCBIGenbank數(shù)據(jù)庫中的rap操縱子序列雜交；或c)可以編碼多肽，所述多肽與提交至NCBI Genbank數(shù)據(jù)庫中的Rap或Phr序列具有至少約70%序列同一‘注(例如，至少約80%、至少約90%、至少約93%、至少約95%、至少約97%或至少約98%序列同一'丨生)。NCBI Genbank數(shù)據(jù)庫中提交的示例性phr蛋白和核苷酸序列包括以Genbank登錄號NC_000964. 2 ；GID :50812173 (枯草芽孢桿菌)、Genbank登錄號 NC_009848. I ；GID : 157690798 (短小芽孢桿菌)、Genbank 登錄號 NC_006270. 3 ；GID 163119169(地衣芽孢桿菌)和Genbank登錄號NC_005957. I ；GID 49476684 (蘇云金芽孢桿菌)注釋的那些，以及其他的Phr蛋白和核苷酸序列。Rap蛋白可以鑒定為含有所謂的三十四肽重復(fù)序列結(jié)構(gòu)域(tetratricopeptide),為pfam結(jié)構(gòu)域,其通常含有34個氨基酸并且含有以下的氨基酸序列[WLF] -X (2) - [LIM] - [GAS] -X (2) - [YLF] -X (8) - [ASE] -X (3) - [FYL] -X (2) - [ASL] -X (4) - [PKE]。上文的Genbank登錄項通過弓I用的方式完整并入本文，包括其中的核酸和蛋白質(zhì)序列和對那些序列以及本專利申請的最早申請日的注釋。在一些實施方案中，熟知的枯草芽孢桿菌菌株168用于本發(fā)明中。實際上,該菌株的基因組已經(jīng)充分表征(見，Kunst等人，Nature 390 :249-256 [1997];和Henner等人，Microbiol. Rev.，44 :57-82 [1980])。該基因組包含一條4215kb染色體。盡管本文中所用的坐標(biāo)指168菌株，但是本發(fā)明包括來自非枯草芽孢桿菌168的芽孢桿菌屬菌株中的類似序列。在一個實施方案中，修飾的芽孢桿菌屬細(xì)胞包含單個失活的phr基因(例如，含有一個無活性phrA基因的rapA操縱子、含有一個無活性phrC基因的rapC操縱子、含有一個無活性phrE基因的rapE操縱子、含有一個無活性phrF基因的rapF操縱子、含有一個無活性phrl基因的rapl操縱子或含有一個無活性phrK基因的rapK操縱子)。
在一個實施方案中，修飾的芽孢桿菌屬細(xì)胞包含失活的phrA基因(例如，含有無活性phrA基因的rapA操縱子)。在一些實施方案中，失活因缺失編碼PhrA蛋白的完整內(nèi)源性DNA序列所致。在一些實施方案中，使用失活性DNA缺失構(gòu)建體SEQ ID NO: 17缺失枯草芽孢桿菌PhrA基因的完整內(nèi)源性DNA序列。在枯草芽孢桿菌168中，編碼phrA蛋白 MKSKWMSGLL LVAVGFSFTQ VMVHAGETAN TEGKTFHIAA RNQT ;SEQ ID NO 42 (Swiss-Prot Q00829)的 DNA 序列是 Atgaaatctaaatggatgtcaggtttgttgctcgttgcggtcgggttcagctttactcaggtgatggttcatgcaggtgaaacagcaaacacagaagggaaaacatttcatattgcggcacgcaatcaaaca ；SEQ ID NO 41(NP_389126) 0備選地，phrA基因的失活因缺失phrA基因片段而阻止PhrA蛋白的功能性表達(dá)。PhrA基因位于枯草芽孢桿菌168染色體(登錄號NC_000964)約1316305-1316439bp處。根據(jù)一個實施方案,通過插入中斷phrA基因的選擇標(biāo)記失活phrA基因。在另一個實施方案中，修飾的芽孢桿菌屬細(xì)胞包含失活的phrE基因(例如，含有無活性PhrE基因的rapE操縱子)。在一些實施方案中，失活因缺失編碼PhrE蛋白的完整內(nèi)源性DNA序列所致。在一些實施方案中，使用失活性DNA缺失構(gòu)建體SEQ ID NO :18缺失枯草芽孢桿菌phrE基因的完整內(nèi)源性DNA序列。在枯草芽孢桿菌168中，編碼PhrE蛋白MKSKLFISLSAVLIGLAFFG SMYNGEMKEA SRNVTLAPTH EFLV ;SEQ ID NO 44 (Swiss-Prot :032025)的 DNA序列是 atgaaatctaaattgtttatcagtttatccgccgttttaattggacttgcctttttcggatctatgtataatggcgaaatgaaggaagcatcccggaatgtaactctcgcacctactcatgaattccttgtt ；SEQ ID NO 43(NP_390461)。備選地，phrE基因的失活因缺失phrE基因片段而阻止PhrE蛋白的功能性表達(dá)。phrE基因位于枯草芽孢桿菌168染色體(登錄號NC_000964)約2659557_2659691bp處。根據(jù)一個實施方案，通過插入中斷PhrE基因的選擇標(biāo)記而失活phrE基因。又在其他實施方案中，使用SEQ ID NOS :17和18中分別所述的phrA和phrE缺失構(gòu)建體從枯草芽孢桿菌染色體中缺失PhrA和phrE基因。在一些其他實施方案中，修飾的芽孢桿菌屬細(xì)胞包含至少兩個失活的phr基因(例如，兩個rap操縱子，各自含有失活的phr基因)、至少三個失活的phr基因(例如，三個rap操縱子,各自含有失活的phr基因)、至少四個失活的phr基因(例如，四個rap操縱子，各自含有失活的Phr基因)、至少五個失活的phr基因(例如，五個rap操縱子，各自含有失活的Phr基因)、至少六個失活的phr基因(例如，六個rap操縱子，各自含有失活的Phr基因)、至少七個失活的phr基因(例如，七個rap操縱子，各自含有失活的phr基因)或至少八個失活的phr基因(例如,八個rap操縱子,各自含有失活的phr基因)。在一個示例性實施方案中，主題宿主細(xì)胞可以含有a)含無活性phrA基因的rapA操縱子和b)含無活性phrE基因的rapE操縱子。在一些實施方案中，失活因缺失分別編碼PhrA蛋白和PhrE蛋白的完整內(nèi)源性DNA序列所致。備選地，phrA和phrE基因的失活因缺失phrA和phrE基因片段而阻止PhrA蛋白和PhrE蛋白的功能性表達(dá)。因而，在一些實施方案中，從該染色體中缺失phrA基因的節(jié)段和缺失phrE基因的節(jié)段。類似地，phrA和phrE基因的失活因缺失編碼PhrA的完整內(nèi)源性DNA序列和缺失編碼PhrE蛋白片段的DNA序列所致。備選地，phrA和phrE基因的失活因缺失編碼PhrE的完整內(nèi)源性DNA序列和缺失編碼PhrA蛋白片段的DNA序列所致。phr基因(例如phrA和/或phrE)的片段包含范圍約I %至約99 %的編碼PhrA和/或phrE蛋白的固有染色體區(qū)。在其他實施方案中，片段包含范圍約5%至約95%的所述固有染色體區(qū)。還在額外的實施方案中，片段包含至少約99%、約98%、約 97%、約 96%、約 95%、約 94%、約 93%、約 92%、約 90%、約 88%、約 85%、約 80%、約75%、約70%、約65%、約50%、約40%、約30%、約25%、約20%和約10%的所述固有染色體區(qū)。在一些實施方案中，通過因同源重組所致的缺失實現(xiàn)phrA和/或phrE基因的失活。例如，在phr是待缺失基因時的一些實施方案中，使用包含選擇標(biāo)記的失活性DNA構(gòu)建體，其中所述的選擇標(biāo)記在每一側(cè)分布有同源盒。該同源盒包含與染色體Phr基因的核酸側(cè)翼區(qū)同源的核苷酸序列。該DNA構(gòu)建體與芽孢桿菌屬宿主染色體的同源序列對齊并且Phr基因在雙交換事件中從宿主染色體切下。失活性DNA構(gòu)建體在體外裝配出來，隨后直接克隆該構(gòu)建至感受態(tài)芽孢桿菌屬宿主中，從而該DNA構(gòu)建體整合入芽孢桿菌染色體。例如，PCR融合和/或連接法可以用來在體外裝配DNA構(gòu)建體。在一些實施方案中，該DNA構(gòu)
建體是非質(zhì)粒構(gòu)建體，而在其他實施方案中，它摻入載體(例如，質(zhì)粒)中。在其他實施方案中，失活性DNA構(gòu)建體包含基因序列片段和在5'和3'末端側(cè)翼分布有選擇標(biāo)記。在一些實施方案中，當(dāng)包含選擇標(biāo)記和基因、基因片段或其同源序列的DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化入宿主細(xì)胞時，選擇標(biāo)記的位置使得該基因無法履行其預(yù)期功能。在一些實施方案中，失活性DNA構(gòu)建體包含位于該基因的啟動子區(qū)內(nèi)的選擇標(biāo)記。在其他實施方案中，失活性DNA構(gòu)建體包含位于該基因的啟動子區(qū)3’處的選擇標(biāo)記。還在其他實施方案中，失活性DNA構(gòu)建體包含位于該基因編碼區(qū)內(nèi)的選擇標(biāo)記。在又一些實施方案中，失活性DNA構(gòu)建體包含在兩端側(cè)翼分布有同源盒的選擇標(biāo)記。仍在又一些實施方案中，失活性DNA構(gòu)建體包括中斷編碼序列轉(zhuǎn)錄和/或翻譯的序列。還在額外的實施方案中，失活性DNA構(gòu)建體包括在該構(gòu)建體上游和下游末端處工程化設(shè)計的限制性位點。在另一個實施方案中，通過插入以單個交換事件中斷phrA和/或phrE基因的選擇標(biāo)記來失活PhrA和/或phrE基因。在一些實施方案中，該選擇標(biāo)記位于基因編碼序列內(nèi)部或位于質(zhì)粒上的與該基因分開的部分上。該載體整合入芽孢桿菌染色體，并且該基因因載體插在編碼序列中而失活。用于失活phr基因的其他合適手段包括導(dǎo)入產(chǎn)生氨基酸置換和截短的突變，這伴隨Phr蛋白生物學(xué)活性的相應(yīng)喪失。在一些實施方案中，修飾的芽孢桿菌屬細(xì)胞包含一個或多個Phr基因的失活，其中所述的失活優(yōu)選地導(dǎo)致穩(wěn)定和不可逆的失活。使基因突變的方法是本領(lǐng)域熟知的并且包括但是不限于位點定向突變法、隨機(jī)突變生成法和空位-雙鏈體(gapped-duplex)法(見例如，美國專利號 4, 760, 025 ；Moring 等人，Biotech. 2 646 [1984];和 Kramer 等人，Nucleic Acids Res.，12 :9441 [1984])。無論失活性DNA構(gòu)建體是摻入載體還是在質(zhì)粒DNA不存在的情況下使用，該構(gòu)建體均用來轉(zhuǎn)化微生物。構(gòu)思了用于轉(zhuǎn)化的任何合適方法將隨本發(fā)明使用。在一些實施方案中，至少一個拷貝的失活性DNA構(gòu)建體整合入宿主芽孢桿菌染色體。在一些實施方案中，本發(fā)明的一個或多個失活性DNA構(gòu)建體用來轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。例如，一個失活性DNA構(gòu)建體可以用來失活PhrA基因并且另一個構(gòu)建體可以用來失活phrE基因。當(dāng)然，本發(fā)明構(gòu)思和提供了額外的組合。在一些實施方案中，phrA和/或phrE基因在已經(jīng)缺失一個或多個編碼內(nèi)源性蛋白酶的基因的前體重組枯草芽孢桿菌菌株中缺失。在一些實施方案中，該芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞包含兩個或多個失活的蛋白酶基因。在一些實施方案中，該芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞含有兩個失活的蛋白酶基因(見例如，美國專利5，387，521)而在其他實施方案中，該芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞含有5個失活的蛋白酶基因nprE、aprE、epr, ispA和bpr基因(見例如，US20050202535)。由于完整枯草芽孢桿菌基因組的序列是公開可獲得的并且被注釋(見例如，Moszer, FEBS Lett. ,430 :28_36[1998])，已經(jīng)鑒定并詳細(xì)綜述了枯草芽孢桿菌的蛋白酶(見例如，He等人，Res. Microbiol.，142 :797-803[1991])。此外，用于芽孢桿菌屬細(xì)胞的基因破壞方法是本領(lǐng)域通常熟知的(見例如，Lee等人，Appl. Environ.Microbiol. ,66 :476-480 [2000] ；Ye 等人，Proc. Internatl. Symp. Rec. Adv. Bioindustry,Seoul, Korea The Korean Society for Applied Microbiology,第 160-169 頁[1996]；Wu 等人，J. Bacteriol.，173 :4952-4958 [1991]；和 Sloma 等人，J. Bacteriol.，173 6889-6895 [1991])。因而，此類菌株的構(gòu)建體完全處于本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍內(nèi)。如上文所示，在一些實施方案中，修飾的芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞包含失活的phr基因和失活的rap基因。在一個實施方案中，修飾的芽孢桿菌屬細(xì)胞包含了含有失活phr基因
和失活rap基因的單個rap操縱子(例如，含有無活性phrA基因和失活rapA基因的rapA操縱子、含有無活性phrC基因和失活rapC基因的rapC操縱子、含有無活性phrE基因和失活rapE基因的rapE操縱子、含有無活性phrF基因和失活rapF基因的rapF操縱子、含有無活性PhrI基因和失活rapl基因的rapl操縱子或者含有無活性phrK基因和失活rapK基因的rapK操縱子)。在其他實施方案中，修飾的芽孢桿菌細(xì)胞含有至少兩個這樣的rap操縱子，每一操縱子含有失活的Phr基因和失活的rap基因。在一些實施方案中，失活因缺失分別編碼Phr蛋白和Rap蛋白的完整內(nèi)源性DNA序列所致。在一些實施方案中，使用失活性DNA缺失構(gòu)建體SEQ ID NO :17缺失枯草芽孢桿菌phrA基因的完整內(nèi)源性DNA序列。在枯草芽孢桿菌168中，編碼PhrA蛋白MKSKWMSGLLLVAVGFSFTQ VMVHAGETAN TEGKTFHIAA RNQT ;SEQ ID NO 42 (Swiss-Prot Q00829)的 DNA序列是 atgaaatctaaatggatgtcaggtttgttgctcgttgcggtcgggttcagctttactcaggtgatggttcatgcaggtgaaacagcaaacacagaagggaaaacatttcatattgcggcacgcaatcaaaca ；SEQ ID NO 41 (NP—389126)。備選地，phrA基因的失活因缺失phrA基因片段來阻止PhrA蛋白的功能性表達(dá)。phrA基因位于枯草芽孢桿菌168染色體(登錄號NC_000964)約1316305_1316439bp處。根據(jù)一個實施方案，通過插入中斷phrA基因的選擇標(biāo)記失活phrA基因。備選地，phrA基因的失活因通過導(dǎo)入在rapA基因中包含終止子序列的選擇標(biāo)記，因而阻止rapA和PhrA蛋白功能性表達(dá)來失活rapA基因所致。根據(jù)一個實施方案，通過插入中斷rapA基因的選擇標(biāo)記來失活rapA基因。在一個實施方案中，使用失活性DNA缺失構(gòu)建體SEQ ID NO :52缺失枯草芽孢桿菌rapA基因的內(nèi)源性DNA序列。在枯草芽孢桿菌168中，編碼rapA蛋白MRMKQTIPSSYVGLKINEWYTHIRQFHVAEAERVKLEVEREIEDMEEDQDLLLYYSLMEFRHRVMLDYIKPFGEDTSQLEFSELLEDIEGNQYKLTGLLEYYFNFFRGMYEFKQKMFVSAMMYYKRAEKNLALVSDDIEKAEFAFKMAEIFYNLKQTYVSMSYAVQALETYQMYETYTVRRIQCEFVIAGNYDDMQYPERALPHLELALDLAKKEGNPRLISSALYNLGNCYEKMGELQKAAEYFGKSVSICKSEKFDNLPHSIYSLTQVLYKQKNDAEAQKKYREGLEIARQYSDELFVELFQFLHALYGKNIDTESVSHTFQFLEEHMLYPYIEELAHDAAQFYIENGQPEKALSFYEKMVHAQKQIQRGDCLYEI ；SEQ ID NO 54(Swiss-Prot Q00828)的 DNA 序列是 ttgaggatgaagcagacgattccgtcctcttatgtcgggcttaaaattaatgaatggtatactcatatccggcagttccacgtcgctgaagccgaacgggtcaagctcgaagtagaaagagaaattgaggatatggaagaagaccaagatttgctgctgtattattctttaatggagttcaggcaccgtgtcatgctggattacattaagccttttggagaggacacgtcgcagctagagttttcagaattgttagaagacatcgaagggaatcagtacaagctgacagggcttctcgaatattactttaatttttttcgaggaatgtatgaatttaagcagaagatgtttgtcagtgccatgatgtattataaacgggcagaaaagaatcttgccctcgtctcggatgatattgagaaagcagagtttgcttttaaaatggctgagattttttacaatttaaaacaaacctatgtttcgatgagctacgccgttcaggcattagaaacataccaaatgtatgaaacgtacaccgtccgcagaatccaatgtgaattcgttattgcaggtaattatgatgatatgcagtatccagaaagagcattgccccacttagaactggctttagatcttgcaaagaaagaaggcaatccccgcctgatcagttctgccctatataatctcggaaactgctatgagaaaatgggtgaactgcaaaaggcagccgaatactttgggaaatctgtttctatttgcaagtcggaaaagttcgataatcttccgcattctatctactctttaacacaagttctgtataaacaaaaaaatgacgccgaagcgcaaaaaaagtatcgtgaaggattggaaatcgcccgtcaatacagtgatgaattatttgtggagctttttcaatttttacatgcgttatacggaaaaaacattgacacagaatcagtctcacacacctttcaatttcttgaa
gaacatatgctgtatccttatattgaagagctggcgcatgatgctgcccaattctatatagaaaacggacagcccgaaaaagcactttcattttatgagaaaatggtgcacgcacaaaaacaaatccagagaggagattgtttatatgaaatc ；SEQ ID NO 53(NP_389125)。在某些實施方案中，修飾的芽孢桿菌屬細(xì)胞包含了含有無活性phr基因的rap操縱子，所述細(xì)胞可以包含有活性或無活性的rap基因。如果rap基因是有活性的，它可以具有野生型序列(例如，可以相對于該細(xì)胞為內(nèi)源性)或可以被修飾，從而它功能地等同于相同物種的野生型蛋白。在一些實施方案中，修飾的芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞包含失活的rap基因。在一個實施方案中，修飾的芽孢桿菌屬細(xì)胞包含了含有失活rap基因的單個rap操縱子(例如，含有無活性的失活rapA基因的rapA操縱子、含有無活性的失活rapB基因的rapB操縱子、含有失活rapC基因的rapC操縱子、含有失活rapD基因的rapD操縱子、含有失活rapE基因的rapE操縱子、含有失活rapF基因的rapF操縱子、含有失活rapG基因的rapG操縱子、含有失活rapl基因的rapl操縱子、含有失活rapj基因的rapj操縱子、含有失活rapK基因的rapK操縱子)。在其他實施方案中，修飾的芽孢桿菌細(xì)胞含有至少兩個這樣的rap操縱子，每一操縱子含有失活的rap基因。在一些實施方案中，失活因缺失編碼Rap蛋白的完整內(nèi)源性DNA序列所致。修飾的芽孢桿菌屬細(xì)胞衍生自屬于芽孢桿菌屬菌株的前體宿主細(xì)胞，包括嗜堿芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、短芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、克勞氏芽孢桿菌、凝固芽孢桿菌、堅強(qiáng)芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌或蘇云金芽孢桿菌菌株。在一些實施方案中，修飾的芽孢桿菌屬細(xì)胞衍生自嗜堿性芽孢桿菌屬細(xì)胞。眾多嗜堿性芽孢桿菌物種是已知的(見例如，美國專利號 5, 217, 878 ;和 Aunstrup 等人，Proc IV IFS Ferment. Technol. Today,299-305 [1972])。在一些具體的實施方案中，芽孢桿菌屬前體宿主細(xì)胞是工業(yè)用芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞。工業(yè)用芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞的實例包括不限于地衣芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌宿主細(xì)胞。在額外的實施方案中，芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞選自由遲緩芽孢桿菌、短芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、嗜堿芽孢桿菌、凝固芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌、克勞氏芽孢桿菌和巨大芽孢桿菌以及如上文所討論的芽孢桿菌屬內(nèi)部其他生物組成的組。在一些特別優(yōu)選的實施方案中，使用枯草芽孢桿菌。例如，美國專利號5，264，366和4，760，025 (RE 34，606)描述用于本發(fā)明中的多個芽孢桿菌屬宿主菌株，不過也構(gòu)思了其他合適的菌株(例如，工業(yè)用菌株)用于本發(fā)明中。工業(yè)用菌株可以是芽孢桿菌屬物種的非重組菌株、天然存在菌株的突變體或重組菌株。優(yōu)選地，宿主菌株是其中編碼目的多肽的重組多核苷酸已經(jīng)導(dǎo)入該宿主中的重組宿主菌株。在一些實施方案中，目的多肽是酶(例如，蛋白酶)。又一個優(yōu)選的宿主菌株是枯草芽孢桿菌宿主菌株，并且特別地是重組枯草芽孢桿菌宿主菌株。眾多枯草芽孢桿菌菌株是已知的，包括但不限于 1A6 (ATCC39085), 168 (1A01)、SB19、W23、Ts85、B637、PB1753 至 PB1758、PB3360、JH642、1A243(ATCC 39，087)、ATCC 21332、ATCC 6051、MI113、DE100 (ATCC 39，094)、GX4931、PBT 110 和 PEP 211 菌株(見例如，Hoch 等人，Genetics、73 215-228[1973];美國專利號 4，450，235 ;美國專利號 4，302，544 ;和 EP 0134048)。枯草芽孢桿菌作為表達(dá)宿主的用途還由Palva等人和其他人(見，Palva等人，Gene 19:81-87 [1982];還見，F(xiàn)ahnestock 和 Fischer，J. Bacteriol.，165 :796-804 [1986] JPWang
等人，Gene 69 :39_47[1988])描述。產(chǎn)生工業(yè)用蛋白酶的芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞提供特別優(yōu)選的宿主細(xì)胞。在一些優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明中這些宿主細(xì)胞的使用增強(qiáng)了蛋白酶產(chǎn)生。一般而言，兩種常見類型的蛋白酶由芽孢桿菌屬物種分泌，即中性(或“金屬蛋白酶”)和堿性(或“絲氨酸”)蛋白酶。絲氨酸蛋白酶是在活性部位催化存在的必需絲氨酸殘基的肽鍵水解的酶。絲氨酸蛋白酶具有25,000至30,000范圍的分子量(見，Priest, Bacteriol. Rev.，41 :711-753[1977])?？莶莸鞍酌甘怯杀景l(fā)明的經(jīng)修飾芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞產(chǎn)生的優(yōu)選絲氨酸蛋白酶。已經(jīng)鑒定并測序種類多樣的芽孢桿菌枯草蛋白酶，例如，GG36、枯草蛋白酶168、枯草蛋白酶BPN'、枯草蛋白酶Carlsberg、枯草蛋白酶DY、枯草蛋白酶147和枯草蛋白酶 309 (見例如，EP 414279B ；W0 89/06279 ;和 Stahl 等人，J. Bacteriol.，159 811-818[1984])。在本發(fā)明的一些實施方案中，芽孢桿菌屬宿主菌株產(chǎn)生突變體(例如，變體)蛋白酶。眾多的參考文獻(xiàn)提供變體蛋白酶和參比物的實例(見例如，WO 99/20770 ；W099/20726 ；W0 99/20769 ；W0 89/06279 ；RE 34，606 ;美國專利號 4，914，031 ;美國專利號4，980，288 ;美國專利號5，208，158 ;美國專利號5,310,675 ;美國專利號5，336,611 ；美國專利號5，399，283 ;美國專利號5，441，882 ;美國專利號5，482，849 ;美國專利號5，631，217 ;美國專利號5，665，587 ;美國專利號5，700, 676 ;美國專利號5，741,694 ;美國專利號5，858，757 ;美國專利號5，880，080 ;美國專利號6，197，567 ;和美國專利號6，218，165)。在另一個實施方案中，優(yōu)選的芽孢桿菌宿主是在以下基因degU、degS、degR和degQ至少一者中包括突變或缺失的芽孢桿菌。優(yōu)選地，該突變位于degU基因中，并且更優(yōu)選地，該突變是 degU (Hy) 32 (見例如，Msadek 等人，J. Bacteriol.，172 =824-834 [1990]；和Olmos等人，Mol. Gen. Genet.，253 :562-567 [1997])。在一個實施方案中，該宿主細(xì)胞是攜帶degU32 (Hy)突變的枯草芽孢桿菌宿主細(xì)胞。在又一個實施方案中，芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞包含在scoC4中的突變或缺失(見例如，Caldwell等人，J. Bacteriol.，183 7329-7340 [2001]) ;spoIIE 中的突變或缺失(見例如，Arigoni 等人，Mol. Microbiol.，31 1407-1415 [1999]) ；opp操縱子的oppA或其他基因中的突變或缺失(見例如，Perego等人，Mol. Microbiol.，5 :173-185 [1991])。實際上，構(gòu)思了 opp操縱子中的任何突變將用于本發(fā)明的經(jīng)修飾芽孢桿菌屬細(xì)胞的一些實施方案中，其中所述的任何突變造成與oppA基因中的突變相同的表型。在一些實施方案中，這些突變單獨地存在，而在其他實施方案中，存在突變的組合。在一些實施方案中，本發(fā)明的經(jīng)修飾芽孢桿菌屬細(xì)胞衍生自已經(jīng)包括對一個或多個上文所提及基因的突變的芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞。在備選實施方案中，進(jìn)一步工程化本發(fā)明的經(jīng)修飾芽孢桿菌屬細(xì)胞以包括對一個或多個上文所提及基因的突變。目的蛋白本發(fā)明提供了修飾的芽孢桿菌屬細(xì)胞，它們用來以比未修飾的前體宿主細(xì)胞所產(chǎn)生水平高的水平產(chǎn)生目的蛋白。通常而言，目的蛋白是具有商業(yè)意義的想要的蛋白質(zhì)。目的蛋白可以相對于該宿主為同源或異源的。在一些實施方案中，目的蛋白是分泌的多肽，特別是酶，包括但不限于淀粉水解酶、蛋白質(zhì)水解酶、纖維素水解酶、氧化還原酶和植物細(xì)胞
壁降解酶。在又一些實施方案中，這些酶包括但不限于淀粉酶、蛋白酶、木聚糖酶、脂肪酶、漆酶、酚氧化酶、氧化酶、角質(zhì)酶、纖維素酶、半纖維素酶、酯酶、過氧化物酶、過氧化氫酶、葡萄糖氧化酶、植酸酶、果膠酶、葡糖苷酶、異構(gòu)酶、轉(zhuǎn)移酶、半乳糖苷酶和殼多糖酶。仍在又一些實施方案中，表達(dá)的多肽是激素、細(xì)胞因子、生長因子、受體、疫苗、抗體等。雖然不意圖使本發(fā)明限于任何具體蛋白質(zhì)/多肽，但在一些最優(yōu)選的實施方案中，表達(dá)的目的蛋白是蛋白酶。如上文指出，在某些實施方案中，宿主細(xì)胞含有重組表達(dá)盒，其包含編碼目的蛋白的多核苷酸序列(即，用于產(chǎn)生對該宿主細(xì)胞而言并非天然的蛋白質(zhì)的表達(dá)盒)。在一些實施方案中，該宿主細(xì)胞包含了含有表達(dá)盒(即，啟動子、編碼目的蛋白的多核苷酸和轉(zhuǎn)錄終止子)的重組核酸，其中該表達(dá)盒足以通過芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞產(chǎn)生蛋白質(zhì)。在一些實施方案中，重組核酸整合入宿主細(xì)胞的基因組中，而在其他實施方案中，該重組核酸存在于從基因組自主復(fù)制的載體中。在一些實施方案中，編碼目的蛋白的多核苷酸是進(jìn)行了密碼子優(yōu)化的，用于該蛋白質(zhì)在芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞中的表達(dá)。雖然任何啟動子可以用于主題表達(dá)盒中，但受rap/phr系統(tǒng)調(diào)節(jié)的啟動子(例如,aprE和nprE啟動子)可以用于一些實施方案中。在一個實施方案中，目的蛋白可以例如是酶(例如，所謂的“工業(yè)用酶”)或具有治療活性的蛋白質(zhì)如抗體。在一個具體實施方案中，目的蛋白是枯草蛋白酶，其中術(shù)語“枯草蛋白酶”指S8肽酶家族的絲氨酸內(nèi)肽酶。根據(jù)IUMBM酶命名法，枯草蛋白酶蛋白質(zhì)具有描述為EC 3. 4. 21. 62 (以前稱為EC 3. 4. 4. 16)的活性。示例性枯草蛋白酶蛋白的活性通常在 Philipp 等人，(Mol. Cell. Biochem. 1983 51 :5-32)，Siezen(Protein Sci. , 19976 501-523) ；Bryan(Biochim. Biophys. Acta, 20001543 :203-222) ；Maurer,2004 Curr. Op,Biotechnol. , 2004 15:330-334)；和 Gupta, Appl. Microbiol. Biotechnol. ,2002 59:15-32)中描述。在一些實施方案中，枯草蛋白酶具有在野生型基因組中發(fā)現(xiàn)的氨基酸序列(即，該枯草蛋白酶是天然存在的枯草蛋白酶)，而在其他實施方案中，該枯草蛋白酶是天然存在枯草蛋白酶的變體。在一些實施方案中，變體枯草蛋白酶包含與野生型基因組所編碼的枯草蛋白酶至少約80%、至少約90%、至少約95%或至少約98%同一的氨基酸序列。示例性枯草蛋白酶包括但不限于ALCANASE (Novozymes)、FNA (Genencor)、SAVINASE (Novozymes) PURAFECT (Genencor)、KAP (Kao)、EVERLASE (Novozymes)、PURAFECT OxP (Genencor)、FN4 (Genencor)、BLAP S (Henkel)、BLAPX (Henkel)、ESPERASE (Novozymes)、KANNASE (Novozymes)和 PROPERASE (Genencor)。還在額外的實施方案中，枯草蛋白酶包括但不限于枯草蛋白酶BPN’、枯草蛋白酶Carlsberg、枯草蛋白酶DY、枯草蛋白酶147或枯草蛋白酶309(見例如，W089/06279 ;和Stahl等人，J. Bacteriol.，159 :811_818[1984])。用于本發(fā)明中的額外枯草蛋白酶和其他蛋白酶包括但不限于在 W099/20770 ;W0 99/20726 ；W0 99/20769 ；W0 89/06279 ；RE 34，606;美國專利號4，914，031 ;美國專利號4，980，288 ;美國專利號5，208，158 ;美國專利號5，310，675 ；美國專利號5，336,611 ;美國專利號5，399，283 ;美國專利號5，441，882 ;美國專利號5，482，849 ;美國專利號5，631，217 ;美國專利號5，665，587 ;美國專利號5，700，676 ；美國專利號5，741,694 ;美國專利號5，858，757 ;美國專利號5，880，080 ;美國專利號
6，197，567 ;和美國專利號6，218，165中描述的那些酶。在一些實施方案中，目的蛋白在宿主細(xì)胞中的表達(dá)受aprE基因的aprE啟動子驅(qū)動，從其天然轉(zhuǎn)錄枯草芽孢桿菌枯草蛋白酶。aprE基因由sigma Α(σΑ)因子轉(zhuǎn)錄并且其表達(dá)高度地受幾種調(diào)節(jié)物控制，如DegU/DegS, AbrB, Hpr和SinR(Valle和Ferrari (1989)在Smith I, Slepecky RA, Setlow P(編著)原核生物發(fā)育的調(diào)節(jié)(Regulation ofProcaryotic Development).美國微生物學(xué)會(American Society for Microbiology),Washington, DC 第 131-146 頁)，并且已經(jīng)鑒定了 aprE Sigma A 啟動子 tgggtcttgacaaatattattccatctattacaataaattcacaga(SEQ ID NO 38 ；US 20030148461 ;Helman 等人，1995,Nucleic Acid Research,第24卷,第2351-2360頁)。在一些實施方案中，該宿主細(xì)胞包含作為野生型 aprE 啟動子 tgggtctactaaaatattattccatctattacaataaattcacaga(SEQ ID NO 39 ;美國專利申請公開號20030148461)的aprE啟動子。在其他實施方案中，宿主細(xì)胞目的蛋白的表達(dá)受枯草芽孢桿菌aprE啟動子的突變體驅(qū)動。在一些實施方案中，本發(fā)明提供芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞，其含有與編碼目的蛋白的多核苷酸序列有效連接的突變體aprE啟動子。因而，本發(fā)明包括從突變體aprE啟動子表達(dá)目的蛋白的宿主細(xì)胞。突變體aprE啟動子的實例是具有以下序列的突變體aprE啟動子tgggtc ttgaca aatattattccatctat tacaat aaattcacaga(SEQ ID NO 40),該啟動子在美國專利申請公開號20030148461中描述。本文中所提到的任一種目的蛋白(例如，芽孢桿菌枯草蛋白酶)可以從aprE啟動子轉(zhuǎn)錄。在一些實施方案中，本發(fā)明提供能夠從aprE啟動子表達(dá)目的蛋白的修飾的芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞。在一些實施方案中，修飾的宿主細(xì)胞是受aprE啟動子驅(qū)動能夠表達(dá)蛋白酶的修飾的枯草芽孢桿菌宿主細(xì)胞。在一些實施方案中，該aprE啟動子包括aprE啟動子調(diào)節(jié)元件和/或aprE轉(zhuǎn)錄前導(dǎo)序列，而在其他實施方案中，該aprE啟動子不包括aprE啟動子調(diào)節(jié)元件和/或aprE轉(zhuǎn)錄前導(dǎo)序列。除aprE啟動子之外，本發(fā)明還包括用于通過宿主細(xì)胞表達(dá)目的蛋白的組合物和方法，其中所述表達(dá)受適于驅(qū)動目的基因轉(zhuǎn)錄的任何啟動子驅(qū)動，只要該啟動子包含aprE基因的轉(zhuǎn)錄前導(dǎo)序列。用于芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞中的其他合適啟動子和終止子是已知的，并且包括npr (中性蛋白酶；即NprE啟動子)、amy ( α -淀粉酶)和α -內(nèi)酰胺酶基因以及枯草芽孢桿菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、地衣芽孢桿菌α-淀粉酶基因(amyL)、嗜熱脂肪芽胞桿菌生麥芽糖淀粉酶基因(amyM)、解淀粉芽孢桿菌α -淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢桿菌青霉素酶基因(PenP)、枯草芽孢桿菌xylA和xylB基因的啟動子和終止子、在WO93/10249，WO 98/07846和WO 99/43835中所述的啟動子和終止子。在其他實施方案中，修飾的宿主細(xì)胞可以例如產(chǎn)生這樣的目的蛋白，其是重組糖酶，如起液化和糖化作用的α-淀粉酶、堿性α-淀粉酶、α-淀粉酶、纖維素酶；糊精酶、α -葡糖苷酶、α -半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、半纖維素酶、戊聚糖酶、木聚糖酶、轉(zhuǎn)化酶、乳糖酶、柚苷酶、果膠酶或支鏈淀粉酶；蛋白酶如酸性蛋白酶、堿性蛋白酶、菠蘿蛋白酶、無花果蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、肽酶、粗制凝乳酶、腎素、凝乳酶、嗜熱菌蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶或胰蛋白酶；脂肪酶或酯酶，如甘油酯酶、磷脂酶、前胃酯酶、磷酸酶、植酸酶、酰胺酶、亞氨?；?iminoaeylase)、谷氨酰胺酶、溶菌酶或青霉素?；?；異構(gòu)酶如葡萄糖異構(gòu)酶；氧化還原酶(例如，氨基酸氧化酶)、過氧化氫酶、氯過氧化物酶、葡萄糖氧化酶、羥類固醇脫氫酶或過氧化物酶；裂解酶如乙酰乳酸脫羧酶、天冬氨酸脫羧
酶、延胡索酸酶或組氨酸酶；轉(zhuǎn)移酶如環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶；或連接酶。在具體的實施方案中，該蛋白質(zhì)可以是氨肽酶、羧肽酶、殼多糖酶、角質(zhì)酶、脫氧核糖核酸酶、α-半乳糖苷酶、β -半乳糖苷酶、β -葡糖苷酶、漆酶、甘露糖苷酶、齒斑葡聚糖酶(mutanase)、果膠分解酶、多酚氧化酶、核酸酶或轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶。在具體實施方案中，該蛋白質(zhì)可以是治療性蛋白?？梢允褂弥黝}細(xì)胞產(chǎn)生的合適治療性靶蛋白的實例包括紅細(xì)胞生成素、細(xì)胞因子如干擾素-α、干擾素、干擾素-Y、干擾素-ο和粒細(xì)胞-CSF、GM-CSF、凝血因子如因子VIII、因子IX和人蛋白C、抗凝血酶III、凝血酶、可溶性IgE受體α -鏈、IgG, IgG片段、IgG融合物、IgM, IgA,白細(xì)胞介素、尿激酶、類糜乳蛋白酶和尿胰蛋白酶再用抑制蛋白(urea trypsin resume inhibitor)、IGF-結(jié)合蛋白、表皮生長因子、生長激素釋放因子、膜聯(lián)V融合蛋白、制管張素(angiostatin)、血管內(nèi)皮生長因子-2、髓樣先祖抑制因子-I (myeloid progenitor inhibitory factor-1)、護(hù)骨蛋白、α -I-抗胰蛋白酶、α -甲胎蛋白、DNA酶II、人纖溶酶原的Kringle 3、葡糖腦苷脂酶、TNF結(jié)合蛋白I、卵泡刺激素、細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4-Ig、跨膜激活物和鈣調(diào)節(jié)物和親環(huán)蛋白配體、可溶性TNF受體Fe融合物、胰高血糖素樣蛋白I和IL-2受體激動劑。也可以制備單克隆抗體。在某些實施方案中，可以工程化所述細(xì)胞，從而由該細(xì)胞產(chǎn)生的蛋白質(zhì)可以從細(xì)胞分泌至培養(yǎng)基中。從而，該細(xì)胞還可以進(jìn)一步含有編碼融合多肽的重組核酸，其中所述的融合多肽含有信號序列、蛋白酶剪切位點和此蛋白質(zhì)。在一些實施方案中，信號序列可以是與待表達(dá)多肽天然連接的一種信號序列。該信號序列可以是能夠指導(dǎo)融合蛋白進(jìn)入芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞分泌途徑的任意氨基酸序列。在某些情況下，可以使用的信號序列包括從野生型芽孢桿菌屬細(xì)胞分泌的蛋白質(zhì)的信號序列。此類信號序列包括由α-淀粉酶基因、蛋白酶基因(例如，aprE或枯草蛋白酶Ε)或β _內(nèi)酰胺酶基因編碼的信號序列。示例性信號序列包括但不限于來自任意合適芽孢桿菌屬物種的α-淀粉酶基因、枯草蛋白酶基因、內(nèi)酰胺酶基因、中性蛋白酶基因(例如，nprT、nprS、nprM)或prsA基因編碼的信號序列，其中所述的芽孢桿菌屬物種包括但不限于嗜堿芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、短芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、克勞氏芽孢桿菌、凝固芽孢桿菌、堅強(qiáng)芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌或蘇云金芽孢桿菌。在一個實施方案中，信號序列由枯草芽孢桿菌aprE基因編碼(如Appl. Microbiol. Biotechnol. 2003 62 :369-73 中所描述)。其他信號序列由 Simonen 和Palva(Microbiological Reviews 1993 57:109-137)及其他參考文獻(xiàn)描述。本發(fā)明也提供通過培養(yǎng)能夠產(chǎn)生目的蛋白的修飾細(xì)胞并且在表達(dá)該目的蛋白的合適生長條件下培育該細(xì)胞，用于在修飾的芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞中產(chǎn)生目的蛋白的方法，其中所述修飾的芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞包含至少一個失活的Phr基因(例如，失活的phrA和/或PhrE基因)或失活的phr和失活的rap基因。所述方法提供任一種上文所述目的蛋白的產(chǎn)生。在優(yōu)選的實施方案中，由本發(fā)明方法產(chǎn)生的目的蛋白是蛋白酶(例如，枯草蛋白酶)。修飾的芽孢桿菌屬細(xì)胞的目的蛋白產(chǎn)生大于從相應(yīng)的未修飾前體宿主細(xì)胞獲得的目的蛋白產(chǎn)生。在一些實施方案中，在修飾的細(xì)胞中如下文所述通過過量表達(dá)ymaH進(jìn)行一步增強(qiáng)修飾的芽孢桿菌屬細(xì)胞的改善水平的蛋白酶產(chǎn)生。過量表達(dá)YmaH的修飾的芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞在上文所述的實施方案中，包含至少一個失活phr基因和/或失活rap基因的修飾的芽孢桿菌屬細(xì)胞具有以比未修飾的前體細(xì)胞所達(dá)到水平高的水平產(chǎn)生目的蛋白的增強(qiáng)能力。在下文所述的又一些實施方案中，通過改變修飾的細(xì)胞以過量表達(dá)RNA結(jié)合蛋白ymaH進(jìn)一步增加修飾的芽孢桿菌屬細(xì)胞的增強(qiáng)的目的蛋白產(chǎn)生水平。因而，在一個實施方案中，本發(fā)明提供了經(jīng)修飾的芽孢桿菌屬細(xì)胞，其包含至少一個失活的Phr基因(例如，失活的PhrA和/或phrE基因)、編碼目的蛋白(例如，蛋白酶)的多核苷酸和編碼YmaH蛋白的異源多核苷酸。在另一個實施方案中，修飾的芽孢桿菌屬細(xì)胞包含至少一個失活的Phr基因(例如，失活的PhrA和/或phrE基因)和/或失活的rap基因、編碼目的蛋白(例如，蛋白酶)的多核苷酸和編碼YmaH蛋白的異源多核苷酸。在一些實施方案中，修飾的芽孢桿菌屬細(xì)胞包含多核苷酸表達(dá)構(gòu)建體，其包含與編碼YmaH蛋白的多核苷酸序列有效連接的YmaH啟動子?？莶菅挎邨U菌YmaH，也稱作HFQ_BACSU,是RNA-結(jié)合蛋白，是RNA-結(jié)合蛋白Hfq家族的成員(Sauter等人，Nucleic AcidRes31 :4091-4098, [2003])。YmaH蛋白在枯草芽孢桿菌中由作為大腸桿菌hfq基因的直向同源物的 ymaH 基因編碼(Silvaggi 等人，J Bacteriol. 187(19) =6641-6650, [2005])。YmaH是一種作為原核生物中多效RNA代謝調(diào)節(jié)物發(fā)揮作用的豐富和遍在性RNA-結(jié)合蛋白，并且是穩(wěn)定某些轉(zhuǎn)錄物和降解其他轉(zhuǎn)錄物所需要的。YmaH偏好地與未定形的A/U豐富RNA序列結(jié)合并且在序列和結(jié)構(gòu)方面均與真核Sm蛋白相似。還已知YmaH結(jié)合調(diào)節(jié)RNA轉(zhuǎn)錄物的穩(wěn)定性或翻譯效率的叫做核糖調(diào)節(jié)物的小RNA分子。來自枯草芽孢桿菌的天然存在YmaH蛋白是一種73個氨基酸的蛋白質(zhì)MKPINIQDQFLNQIRKENTYVTVFLLNGFQLRGQVKGFDNFTVLLESEGKQQLIYKHAISTFAPQKNVQLELE(Swiss-Prot P3756 ；SEQ ID NO :45)，其由219 (包括終止子在內(nèi)的222)個堿基對的多核苷酸(EMBL—級登錄號 Z99113 ；SEQ ID NO :46)編碼。因而，在一些實施方案中，本發(fā)明的經(jīng)修飾芽孢桿菌屬細(xì)胞還包含編碼ymaH的異源多核苷酸序列。在一個實施方案中，YmaH蛋白由野生型枯草芽孢桿菌菌株168的基因組中找得到的天然存在性多核苷酸序列編碼(SEQ ID N0:45)。在一些實施方案中，本發(fā)明的經(jīng)修飾芽孢桿菌屬細(xì)胞包含編碼天然存在性ymaH的變體的異源多核苷酸序列。變體YamH蛋白包括從野生型蛋白通過在該天然蛋白中一個或多個位點處缺失(即，截短)、添加或置換一個或多個氨基酸所衍生的蛋白質(zhì)。用于此類缺失、添加和置換的方法通常是本領(lǐng)域已知的。例如，所述多肽的氨基酸序列變體可以通過在編碼天然目的蛋白的克隆DNA序列中突變來制備。用于誘變和改變核苷酸序列的方法是本領(lǐng)域熟知的(見例如，Kunkel (1985)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488 492 ;Kunkel 等人(1987)Methods Enzymol. 154 :367382 ;美國專利號4，873，192 ;及其中援引的參考文獻(xiàn)；所述文獻(xiàn)通過引用的方式并入本文)。在構(gòu)建目的蛋白的變體中，將如此進(jìn)行對編碼所述變體的核苷酸序列的修飾，從而變體繼續(xù)擁有想要的活性。如技術(shù)人員將會理解，鑒于遺傳密碼的簡并性，多種修飾的多核苷酸編碼YmaH蛋白。在本發(fā)明的一些其他實施方案中，芽孢桿菌屬細(xì)胞包含編碼YmaH蛋白的多核苷酸，所述的多核苷酸包含與SEQ ID NO :46的多核苷酸序列具有至少約70%序列同一性、至少約75%序列同一性、至少約80%序列同一性、至少約85%序列同一性、至少約90%序列同一‘丨生、至少約92%序列同一‘丨生、至少約95%序列同一‘丨生、至少約97%序列同一性、至少約98%序列同一性、或至少約99%序列同一性的核苷酸序列。在其他實施方案中，修飾的芽孢桿菌屬細(xì)胞包含多核苷酸構(gòu)建體，其包含與枯草芽孢桿菌菌株168的ymaH編碼序列類似的ymaH編碼序列。該菌株的基因組(其含于一個4215Kb的基因組中)已經(jīng)充分表征(見，Kunst等人，Nature390 :249-256 [1997];和Henner等人，Microbiol. Rev. ,44 :57-82 [1980])。在一些實施方案中，編碼YmaH的多核苷酸構(gòu)建體編碼YmaH蛋白，其中所述的YmaH蛋白與野生型形式的YmaH蛋白的氨基酸序列共有至少約65%氨基酸序列同一性、至少約70%氨基酸序列同一性、至少約75%氨基酸序列同一性、至少約80%氨基酸序列同一性、至少約85%氨基酸序列同一性、至少約90%氨基酸序列同一性、至少約92%氨基酸序列同一性、至少約95%氨基酸序列同一性、至少約97%氨基酸序列同一性、至少約98%氨基酸序列同一性和至少約99%氨基酸序列同一性，并且與野生型多肽(SEQ ID NO :45)相比時，具有可比較或改善的增強(qiáng)宿主細(xì)胞中目的蛋白產(chǎn)生的能力，并且保留了增強(qiáng)芽孢桿菌(例如,枯草芽孢桿菌)宿主細(xì)胞中目的蛋白產(chǎn)生的能力。還在其他實施方案中，修飾的芽孢桿菌屬細(xì)胞包含編碼YmaH的多核苷酸構(gòu)建體，其包含多核苷酸序列，所述多核苷酸序列與具有SEQ ID NO :46的野生型芽孢桿菌屬序列的基因同源、直向同源或旁系同源并且保留增強(qiáng)目的蛋白產(chǎn)生的能力。在其他實施方案中，本發(fā)明的經(jīng)修飾芽孢桿菌屬細(xì)胞也包括多核苷酸構(gòu)建體，其包含編碼因結(jié)構(gòu)上和/或功能上相似而相關(guān)的YmaH蛋白的編碼序列。在一些實施方案中，這些蛋白質(zhì)從不同的屬和/或物種衍生，包括生物類別之間的不同類別(例如，細(xì)菌蛋白和真菌蛋白)。在一些實施方案中，這些蛋白質(zhì)衍生自不同的屬和/或物種。在額外的實施方案中，從相同的物種提供相關(guān)蛋白。實際上，不意圖使本發(fā)明限于來自任何具體來源的相關(guān)蛋白。此外，術(shù)語“相關(guān)蛋白”包括三級結(jié)構(gòu)同源物和一級序列同源物(例如，本發(fā)明的YmaH)。例如，本發(fā)明包括此類同源物，其包括，但不限于下述YmaH蛋白，如大腸桿菌的 YmaH(HFQ_EC0LI)、福氏志賀菌(Shighella flexneri)的 YmaH(HFQ_SHIFL)、鼠傷寒沙門菌(Salmonella typhimurium)的YmaH (HFQ_SALTY)、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌(Yersinia enterocolitica)的 YmaH(HFQ_YEREN)、鼠疫耶爾森菌(Yersinia pestis)的YmaH (HFQ_YERPE)、胡蘿卜軟腐歐文氏菌(Erwinia carotovora)的 YmaH(HFQ_ERWCA)、流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae)的 YmaH(HFQ_HAEIN)、多殺巴斯德氏菌(Pasteurellamultocida)的 YmaH(HFQ_PASMU)、霍亂弧菌(Vibrio cholerae)的 YmaH(HFQ_VIBCH)、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的 YmaH(HFQ_PSEAE)、地經(jīng)草黃單胞菌(Xanthomonasaxonopodis)的 YmaH(HFQ_XANAC)、野油菜黃單胞菌(Xanthomonas campestris)的YmaH (HFQ_XANCP)、苛養(yǎng)木桿菌(Xylella fastidiosa)的 YmaH (GSQ_XYLFA)、腦膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitidis)的 YmaH(HFQ_NEIMA)、爺科雷爾氏菌(Ralstoniasolanacearum)的 YmaH(HFQ_RALSO)、根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)的YmaH(HFQ_AGRTS)、馬耳他布氏菌(Brucella me Ii tens is)的 YmaH (HFQ_BRUME)、百脈根根瘤菌(Rhizobium loti)的 YmaH (HFQ_RHILO)、莖瘤固氮根瘤菌(Azorhizobiumcaulinodans)的 YmaH(HFQ_AZOCA)、新月柄桿菌(Caulobacter crescentus)的 YmaH(HFQ_CAUCR)、Aquifex melitensis 的 YmaH(HFQ_AQUAE)、海棲熱袍菌(Thermotoga maritime)的 YmaH(HFQ_THEMA)、丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)的 YmaH(HFQ_CLOAB)、產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridium perfringens)的 YmaH(HFQ_CLOPE)、耐喊芽抱桿菌(BaciIIus halodurans)的 YmaH (HFQ_BACHD)、枯草芽抱桿菌的 YmaH (HFQ_BACSU)、泉
生熱袍菌(Thermoanaerobacter tengcongensis)的 YmaH(HFQ_THETN)、金黃色葡萄球菌(S. aureaus)的YmaH(Q99UG9)和M. jannasci 的YmaH(Q58830) (Sauter等人，Nucleic AcidsRes. 31 :4091-4098[2003])。相關(guān)(和衍生性)蛋白包含“變體YmaH蛋白”。在一些優(yōu)選的實施方案中，變體蛋白因少數(shù)氨基酸殘基而不同于親代蛋白并且彼此不同。差異性氨基酸殘基的數(shù)目可以是一個或多個，優(yōu)選地約1、2、3、4、5、10、15、20、30、40、50個或更多個氨基酸殘基。在一些優(yōu)選的實施方案中，變體之間不同氨基酸的數(shù)目在約I和約10之間。在一些特別優(yōu)選的實施方案中，相關(guān)蛋白并且特別地是變體蛋白包含至少約70 %、約75 %、約80 %、約85 %、約90 %、約95%、約97%、約98%或約99%氨基酸序列同一性。適合產(chǎn)生本發(fā)明的YmaH蛋白變體的幾種方法是本領(lǐng)域已知的，包括但不限于位點飽和誘變、掃描誘變、插入誘變、隨機(jī)誘變、位點定向誘變和定向進(jìn)化以及多種其他重組方法。對野生型和突變體蛋白的表征借助任何合適的手段實現(xiàn)并且優(yōu)選地基于對目的特征的評估。例如，構(gòu)思能夠進(jìn)一步增強(qiáng)修飾的芽孢桿菌屬細(xì)胞產(chǎn)生目的蛋白的YmaH蛋白將會有用。 ymaH在本發(fā)明的經(jīng)修飾芽孢桿菌屬細(xì)胞中的過量表達(dá)可以通過多種手段實現(xiàn)，所述的手段包括增強(qiáng)編碼YmaH的多核苷酸的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯。例如，在轉(zhuǎn)錄水平，ymaH的過量表達(dá)可以通過增加宿主細(xì)胞中編碼ymaH的多核苷酸序列的數(shù)目和/或通過提高ymaH啟動子的結(jié)合強(qiáng)度以增強(qiáng)關(guān)聯(lián)的RNA聚合酶的活性來實現(xiàn)。在轉(zhuǎn)錄水平，ymaH的過量表達(dá)可以通過突變核糖體結(jié)合位點(RBS)來增加核糖體對該RBS的親和力，從而增強(qiáng)翻譯活性來實現(xiàn)。本領(lǐng)域技術(shù)人員會認(rèn)識到可以通過單獨增加ymaH基因的拷貝數(shù)或聯(lián)合為實現(xiàn)YmaH過量表達(dá)對ymaH基因做出的其他可能修飾來實施ymaH的過量表達(dá)。在一個實施方案中，本發(fā)明的經(jīng)修飾芽孢桿菌屬細(xì)胞包含多核苷酸構(gòu)建體，其包含與ymaH啟動子有效連接的編碼ymaH的多核苷酸序列。ymaH的轉(zhuǎn)錄可以天然地受兩個啟動子驅(qū)動存在于miaA編碼區(qū)上游的SigA啟動子，和緊鄰枯草芽孢桿菌miaA操縱子中ymaH編碼區(qū)上游的SigH啟動子。ymaH啟動子可以是驅(qū)動yamH表達(dá)的任意啟動子(例如，SigA和/或SigH啟動子)，并且可以是在選擇的宿主細(xì)胞中顯示轉(zhuǎn)錄活性的任何核酸序列并且包括突變的、截短的和雜合的啟動子，并且可以從編碼與宿主細(xì)胞同源或異源的胞外或胞內(nèi)多肽的基因中獲得。啟動子序列可以對宿主細(xì)胞為天然的或外來的。在一個實施方案中，本發(fā)明的經(jīng)修飾芽孢桿菌屬細(xì)胞包含多核苷酸構(gòu)建體(例如，SEQ ID NO :23，如下文顯示)，其包含與SigH啟動子有效連接的編碼YmaH的多核苷酸序列。SEQ ID NO :23也例示了包含與SigH啟動子呈天然連續(xù)的YmaH編碼序列的多核苷酸構(gòu)建體ggcaccgaattcgacgtggtttcgcaacaaaatgcaggtcacatggttcgatatgacaccgcctgttgatatggagctgaaaaaaaaggaaattttcacacatatagcaggaaaactcgaactttaatcgaaactgtatgatatagagaatcaaggaggacgaaacatgaaaccgattaatattcaggatcagtttttgaatcaaatccggaaagaaaatacgtatgtcactgtttttttgctgaacggctttcagttgcggggccaggtgaaaggctttgataactttaccgtattgttggaatcggaaggtaagcagcagcttatatataaacatgcgatctcaacgtttgcgccgcaaaaaaacgtccagcttgaactcgaatagatcaaaaaatgccatgtcaagacatgaggaaaggctgtcgggggttcccggcggccatttttaaca
tgaatccacttttgctccaagctttttgtgtaagctgaccatgccaaggcacggtctttttttatgagggatccggagcc (SEQ ID NO 23)。在另一個實施方案中，本發(fā)明的經(jīng)修飾芽孢桿菌屬細(xì)胞包含多核苷酸構(gòu)建體(例如，SEQ ID NO :26 (SigAl)和SEQ ID NO :31 (SigA2構(gòu)建體))，其包含與SigA啟動子有效連接的編碼YmaH的多核苷酸序列。SEQ ID NOs :26和31例示了其中ymaH編碼序列與SigA啟動子序列呈連續(xù)以提供嵌合多核苷酸構(gòu)建體的實施方案。在一些優(yōu)選的實施方案中，嵌合多核苷酸構(gòu)建體因而包含自然界中與ymaH編碼序列不呈連續(xù)的啟動子序列。例如，SEQID NOS 26和31例示了包含與編碼YmaH的多核苷酸序列有效連接的SigA啟動子的嵌合構(gòu)建體，如下文所示gcgccgaattctcataccctgaaaggaaagacaagggaaattgtcggcaatgagccgctcggcaggtagaaggatgtttaccgatgcaaaaaaagggcaaaatggataggtggttgtccatgttgaatgctataatgggggagatttataaaagagagtgatacatattgaataatacgaagcagccccacacatatagcaggaaaactcgaactttaatcgaaactgtatgatatagagaatcaaggaggacgaaacatgaaaccgattaatattcaggatcagtttttgaatcaaatccggaaagaaaatacgtatgtcactgtttttttgctgaacggctttcagttgcggggccaggtgaaaggctttgataactttaccgtattgttggaatcggaaggtaagcagcagcttatatataaacatgcgatctcaacgtttgcgccgcaaaaaaacgtccagcttgaactcgaatagatcaaaaaatgccatgtcaagacatgaggaaaggctgtcgggggttcccggcggccatttttaacatgaatccacttttgctccaagctttttgtgtaagctgaccatgccaaggcacggtctttttttatgagggatccggtgcc(SEQ ID NO 26)gcgccgaattctcataccctgaaaggaaagacaagggaaattgtcggcaatgagccgctcggcaggtagaaggatgtttaccgatgcaaaaaaagggcaaaatggataggtggttgtccatgttgaatgctataatgggggagatttataaaagagagtgctcgaactttaatcgaaactgtatgatatagagaatcaaggaggacgaaacatgaaaccgattaatattcaggatcagtttttgaatcaaatccggaaagaaaatacgtatgtcactgtttttttgctgaacggctttcagttgcggggccaggtgaaaggctttgataactttaccgtattgttggaatcggaaggtaagcagcagcttatatataaacatgcgatctcaacgtttgcgccgcaaaaaaacgtccagcttgaactcgaatagatcaaaaaatgccatgtcaagacatgaggaaaggctgtcgggggttcccggcggccatttttaacatgaatccacttttgctccaagctttttgtgtaagctgaccatgccaaggcacggtctttttttatgagggatccggtgcc(SEQ ID NO 31)
又在另一個實施方案中，本發(fā)明的芽孢桿菌屬細(xì)胞包含多核苷酸構(gòu)建體(例如，SEQ ID NO :22，如下文顯示)，其包含編碼YmaH的多核苷酸序列和SigA與SigH啟動子。tcataccctgaaaggaaagacaagggaaattgtcggcaatgagccgctcggcaggtagaaggatgtttaccgatgcaaaaaaagggcaaaatggataggtggttgtccatgttgaatgctataatgggggagatttataaaagagagtgatacatattgaataatacgaagcagcccgttgtcattttagtcggaccgacggcagtggggaaaaccaatttaagtattcagctagccaaatccttaaacgcggaaattatcagcggagattcgatgcagatttataaagggatggatattggaacagctaaaattaccgaacaggagatggagggagtgccccatcatctgattgacattttagatccccaagactctttctctactgccgattatcaaagcttagtaagaaataaaatcagcgagattgcaaatagaggaaagcttccgatgattgacggcggtacagggctttatatacaatctgagctttacgattatacatttacggaagaggcaaatgatcccgtgtttcgagagagcatgcaaatggctgctgagcgggaaggcgctgactttcttcatgccaaacttgctgcagcagatcccgaggcagcagctgcgattcatccgaataatacaagaagagtcattcgcgcactggaaattttacatacgtccggaaaaacgatgtcccagcatttgaaggaacaaaaacgagaacttctgtacaatgcagtgttaattggcctgacaatggat
agagacacgctttacgaaagaattaatcagcgggtcgatttgatgatgcagtcaggccttcttccggaagtgaaacgcttatacgacaagaacgtgagagactgtcaatcaatacaggcgataggctataaagagctgtatgcatattttgacggttttgtgacactttccgatgctgtcgaacagctaaagcagaactcgaggcggtatgcgaaacgccagctgacgtggtttcgcaacaaaatgcaggtcacatggttcgatatgacaccgcctgttgatatggagctgaaaaaaaaggaaattttcacacatatagcaggaaaactcgaactttaatcgaaactgtatgatatagagaatcaaggaggacgaaacatgaaaccgattaatattcaggatcagtttttgaatcaaatccggaaagaaaatacgtatgtcactgtttttttgctgaacggctttcagttgcggggccaggtgaaaggctttgataactttaccgtattgttggaatcggaaggtaagcagcagcttatatataaacatgcgatctcaacgtttgcgccgcaaaaaaacgtccagcttgaactcgaatagatcaaaaaatgccatgtcaagacatgaggaaaggctgtcgggggttcccggcggccatttttaacatgaatccacttttgctccaagctttttgtgtaagctgaccatgccaaggcacggtctttttttatgag(SEQ ID NO 22)用于指導(dǎo)ymaH基因表達(dá)的合適啟動子的實例是來自包括編碼miaA基因的枯草芽孢桿菌操縱子中的SigA和SigH啟動子。例如，在一個實施方案中，本發(fā)明提供了定義SigA啟動子的多核苷酸序列(SEQ ID NO :47,如下文所示)。tcataccctgaaaggaaagacaagggaaattgtcggcaatgagccgctcggcaggtagaaggatgtttaccgatgcaaaaaaagggcaaaatggataggtggttgtccatgttgaatgctataatgggggagatttataaaagagagtgatacata(SEQ ID NO 47)在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了定義SigH啟動子的多核苷酸序列(SEQ IDNO :48，如下文所示)。aaaggaaattttcacacatatagcaggaaaactcgaactttaatcgaaactgtatgatatagagaatcaaggaggacgaaac(SEQ ID NO 48)可以用于表達(dá)ymaH基因的啟動子的其他實例包括由σ A因子識別的Sigma A啟動子，其包括天藍(lán)色鏈霉菌(Streptomyces coelicolor)瓊脂糖酶基因(dagA)的啟動子、遲緩芽孢桿菌堿性蛋白酶基因(aprH)、地衣芽孢桿菌堿性蛋白酶基因(枯草蛋白酶Carlsberg基因)的啟動子、枯草芽孢桿菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)的啟動子、枯草芽孢桿菌α-淀粉酶基因(amyE)的啟動子、地衣芽孢桿菌α-淀粉酶基因(amyL)的啟動子、嗜熱脂肪芽孢桿菌生麥芽糖淀粉酶基因(amyM)的啟動子和解淀粉芽孢桿菌α -淀粉酶基因(amyQ)啟動子?？梢杂糜诒磉_(dá)ymaH基因的啟動子的實例包括由H因子識別的SigmaH 啟動子，其包括 spoOA、spoOF、spoVG 和 citG(見，Helmann, J. D.和 C. P. Moran. 2002.RNA 聚合酶和 sigma 因子(RNA polymerase and sigma factors)，第 289-312 頁，在A. L. Sonenshein，J. A. Hoch和R. Losick (編著)，枯草芽孢桿菌及其進(jìn)化最近的親戚從基因至細(xì)胞(Bacillus subtilis and its closest relatives from genes to cells).美國微生物學(xué)會(American Society for Microbiology)，Washington, D. C.)。在一些實施方案中，共有的SigA和/或SigH啟動子用于本發(fā)明中。共有啟動子的構(gòu)建可以通過位點定向誘變以產(chǎn)生下述啟動子來實現(xiàn)，其中所述的啟動子更完美地符合對枯草芽孢桿菌的“sigma A型”啟動子的“-10”和“-35”區(qū)已建立的共有的序列(Voskuil等人，Mol Microbiol 17:271 279[1995])。在其他實施方案中，可以通過位點定向誘變以產(chǎn)生下述啟動子來產(chǎn)生共有啟動子，其中所述的啟動子更完美地符合對枯草芽孢桿菌的營養(yǎng)期“sigma H型”啟動子的“-10”和“-35”區(qū)已建立的共有序列(見，Helman和Moran在《枯草芽孢桿菌及其進(jìn)化最近的親戚》(Bacillus subtilis and its closest relatives)，第 21 章，第 289-312 頁中；Sonenshein 等人(2002 ASM Press, Wshington, D. C.)。sigmaA型啟動子的“_35”區(qū)的共有序列是TTGaca并且對于“_10”區(qū)是tgnTATaat，并且sigma
H型啟動子的“一35”區(qū)的共有序列是RnAGGAwWW并且對于“_10”區(qū)是RnnGAAT。大寫字母表示高度保守的位置；小寫字母表示較不保守的位置；縮寫R可以是A或G，并且W可以是A或T。共有啟動子可以獲自能在芽孢桿菌宿主細(xì)胞中發(fā)揮作用的任一啟動子。在一些實施方案中，包含SEQ ID NO :47的SigA啟動子由天然存在于miaA編碼序列上游的多核苷酸序列(NP—389615 ;SEQ ID NO :49，下文顯示)定義，而包含SEQ ID NO:48的SigH啟動子由天然存在于yamH編碼區(qū)上游的多核苷酸序列(SEQ ID N0:46，下文顯示)定義。ttgaataatacgaagcagcccgttgtcattttagtcggaccgacggcagtggggaaaaccaatttaagtattcagctagccaaatccttaaacgcggaaattatcagcggagattcgatgcagatttataaagggatggatattggaacagctaaaattaccgaacaggagatggagggagtgccccatcatctgattgacattttagatccccaagactctttctctactgccgattatcaaagcttagtaagaaataaaatcagcgagattgcaaatagaggaaagcttccgatgattgacggcggtacagggctttatatacaatctgagetttacgattatacatttacggaagaggcaaatgatcccgtgtttcgagagagcatgcaaatggctgctgagcgggaaggcgctgactttcttcatgccaaacttgctgcagcagatcccgaggcagcagctgcgatteatccgaataatacaagaagagtcattcgcgcactggaaattttacatacgtccggaaaaacgatgtcccagcatttgaaggaacaaaaacgagaacttctgtacaatgcagtgttaattggcctgacaatggatagagacacgctttacgaaagaattaatcagcgggtcgatttgatgatgcagtcaggccttcttccggaagtgaaacgcttatacgacaagaacgtgagagactgtcaatcaatacaggcgataggctataaagagctgtatgcatattttgacggttttgtgacactttccgatgctgtcgaacagctaaagcagaactcgaggcggtatgcgaaacgccagctgacgtggtttcgcaacaaaatgcaggtcacatggttcgatatgacaccgcctgttgatatggagctgaaaaaaaaggaaattttcacacatatagcaggaaaactcgaactttaa(SEQ ID NO :49)atgaaaccgattaatattcaggatcagtttttgaatcaaatccggaaagaaaatacgtatgtcactgtttttttgctgaacggctttcagttgcggggccaggtgaaaggctttgataactttaccgtattgttggaatcggaaggtaagcagcagcttatatataaacatgcgatctcaacgtttgcgccgcaaaaaaacgtccagcttgaactcgaatag(NP—389616 ；SEQ ID NO :46)在一些實施方案中，SigA/SigH構(gòu)建體包含已經(jīng)被突變的啟動子序列，當(dāng)與相應(yīng)野生型啟動子的活性相比時提高了啟動子活性，從而導(dǎo)致YmaH蛋白過量表達(dá)。因而，應(yīng)當(dāng)理解定義SigA和SigH啟動子的序列的變體用于YmaH表達(dá)構(gòu)建體中。用于在芽孢桿菌中產(chǎn)生啟動子變體的方法是本領(lǐng)域熟知的(見例如，Helmann等人，2002. RNA聚合酶和sigma因子(RNA polymerase and sigma factors),第 289-312 頁，在 A. L. Sonenshein, J. A. Hoch 和R. Losick(編著)，枯草芽孢桿菌及其進(jìn)化最近的親戚從基因至細(xì)胞(Bacillus subtilisand its closest relatives from genes to cells).美國微生物學(xué)會(American Societyfor Microbiology), Washington, D. C.)。不意圖使本發(fā)明限于任何具體的啟動子，因為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任意合適啟動子可以用于本發(fā)明中。然而，在一些實施方案中，該啟動子是枯草芽孢桿菌sigH啟動子,而在其他實施方案中，該啟動子是枯草芽孢桿菌sigA啟動子。在又一些實施方案中，sigH和sigA啟動子起到實現(xiàn)YmaH蛋白過量表達(dá)的作用。在一些實施方案中，本發(fā)明的SigA/SigH多核苷酸構(gòu)建體還包含必要核糖體結(jié)合位點以確保ymaH RNA轉(zhuǎn)錄物的最佳翻譯。在一些實施方案中，該多核苷酸構(gòu)建體包含miaA基因的核糖體結(jié)合位點(RBS)序列(aagagag;SEQ ID NO :50)，而在其他實施方案中，多核苷酸構(gòu)建體包含ymaH基因的RBS序列(ggagg ；SEQ ID NO :51)。又在其他實施方案中，該
多核苷酸構(gòu)建體包含miaA和ymaH基因的核糖體結(jié)合位點序列。在一些實施方案中，本發(fā)明提供具有ymaH編碼序列上游的啟動子和核糖體結(jié)合位點序列的構(gòu)建體。本發(fā)明不限于本文中所公開的核糖體結(jié)合位點序列，因為它還包括任何合適的核糖體結(jié)合位點序列，它們已經(jīng)被突變以增加表達(dá)ymaH基因的水平。用于獲得增加基因在芽孢桿菌中表達(dá)的突變的核糖體結(jié)合序列方法是本領(lǐng)域已知的。例如，Band和Henner通過修飾RBS以獲得與16SrRNA的更嚴(yán)格堿基配對而成功地增加干擾素在枯草芽孢桿菌中表達(dá)的水平(Band，L.和D. J. Henner, DNA 3 :17-21[1984])。在修飾的細(xì)胞中產(chǎn)生目的蛋白在一些實施方案中，本發(fā)明提供通過培養(yǎng)能夠產(chǎn)生目的蛋白的修飾細(xì)胞并且在表達(dá)該目的蛋白的合適生長條件下培育該細(xì)胞，用于在修飾的芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞中產(chǎn)生目的蛋白的方法，其中所述修飾的芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞包含至少一個失活的Phr基因(例如，失活的phrA和/或phrE基因)或失活的phr和/或失活的rap基因。所述方法提供任一種上文所述目的蛋白的產(chǎn)生。在一些實施方案中，由本發(fā)明方法產(chǎn)生的目的蛋白是蛋白酶(例如，枯草蛋白酶)。在一個實施方案中，本發(fā)明的方法包括通過將失活性DNA構(gòu)建體導(dǎo)入芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞而失活至少一個Phr基因以產(chǎn)生修飾的芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞，并且在合適條件下培育修飾的細(xì)胞，旨在以比未修飾或前體芽孢桿菌宿主細(xì)胞所產(chǎn)生水平高的水平產(chǎn)生目的蛋白。前體宿主細(xì)胞包括如上所述的芽孢桿菌菌株的前體宿主細(xì)胞，所述的芽孢桿菌菌株包括嗜堿芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、短芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、克勞氏芽孢桿菌、凝固芽孢桿菌、堅強(qiáng)芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌或蘇云金芽孢桿菌株。在一些實施方案中，該前體宿主細(xì)胞是枯草芽孢桿菌宿主細(xì)胞。優(yōu)選地，前體宿主細(xì)胞是如上所述包含編碼目的多肽的重組多核苷酸的重組細(xì)胞。在一些實施方案中，目的多肽是酶(例如，蛋白酶，如枯草蛋白酶)。失活前體芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞中至少一個Phr基因(例如phrA和/或phrE)的方法產(chǎn)生修飾的芽孢桿菌屬細(xì)胞，其以比相應(yīng)未修飾的前體宿主細(xì)胞所實現(xiàn)水平高的水平產(chǎn)生目的多肽。在一個實施方案中，該方法包括通過將用來缺失固有phrA基因的失活性DNA構(gòu)建體導(dǎo)入前體芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞中而失活PhrA基因。例如，導(dǎo)入SEQ ID N0:17的失活性DNA構(gòu)建體以通過同源重組缺失固有的phrA基因。在另一個實施方案中，該方法包括通過將用于缺失固有PhrE基因的失活性DNA構(gòu)建體導(dǎo)入前體芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞中而失活phrE基因。例如，導(dǎo)入SEQ ID NO : 18的失活性DNA構(gòu)建體以通過同源重組缺失固有的phrE基因。又在另一個實施方案中，使用SEQ ID NO: 17和18的失活性構(gòu)建體使phrA和phrE基因均失活。本發(fā)明的方法類似地用來失活其他Phr基因，包括phrC、phrF、phrG、phrH、phrl 和 phrK,和 / 或 rap 基因，包括 rapB、rapC、rapD、rapE、rapF、rapG、rapH、rapl、rapj和 rapKo根據(jù)一個實施方案,通過插入中斷phrA基因的選擇標(biāo)記失活phrA基因。備選地，PhrA基因的失活因失活rapA基因所致，通過在rapA基因中導(dǎo)入包含終止子序列的選擇標(biāo)記，從而阻止rapA和phrA蛋白功能性表達(dá)。根據(jù)一個實施方案，通過插入中斷rapA基因
的選擇標(biāo)記來失活rapA基因。用于失活phr和/或rap基因的方法在下文實驗部分例舉。如上所述包含至少一個失活phr基因和/或rap基因的修飾芽孢桿菌屬細(xì)胞的目的蛋白(例如，蛋白酶)產(chǎn)生大于從相應(yīng)未修飾的前體細(xì)胞中獲得的目的蛋白產(chǎn)生。在一些實施方案中，修飾的芽孢桿菌屬細(xì)胞的目的蛋白產(chǎn)生因表達(dá)一個或多個拷貝的包含于表達(dá)構(gòu)建體中的編碼YmaH的多核苷酸而進(jìn)一步增強(qiáng)，其中所述的表達(dá)構(gòu)建體存在于已經(jīng)導(dǎo)入修飾細(xì)胞中的多拷貝/復(fù)制型質(zhì)粒上。使用上述編碼YmaH的多核苷酸構(gòu)建體(例如，SigA ;SigAl、SigA2、SigA3)或SigH構(gòu)建體中任一者轉(zhuǎn)化修飾的芽孢桿菌屬細(xì)胞。在一些實施方案中，在修飾前體宿主細(xì)胞以在至少一個Phr和/或rap基因中含有缺失之前，將復(fù)制型質(zhì)粒上存在的編碼YmaH的多核苷酸導(dǎo)入該前體宿主細(xì)胞。因而，在一些實施方案中，本發(fā)明提供包含載體的修飾的芽孢桿菌屬細(xì)胞，其中所述的載體包含摻入該載體的表達(dá)構(gòu)建體，該表達(dá)構(gòu)建體包含與YmaH啟動子有效連接的編碼YmaH的多核苷酸。在一些實施方案中，通過導(dǎo)入包含與SigH啟動子有效連接的編碼YmaH的多核苷酸的SigH表達(dá)構(gòu)建體(例如，SEQ ID N0:23的表達(dá)構(gòu)建體)實現(xiàn)YmaH的過量表達(dá)。在實施方案中，通過導(dǎo)入包含與SigA啟動子有效連接的編碼YmaH的多核苷酸的SigA表達(dá)構(gòu)建體來實現(xiàn)YmaH的過量表達(dá)。SigA構(gòu)建體的實例包括SEQ ID NO :26的SigAl表達(dá)構(gòu)建體、SEQ ID NO 31的SigA2表達(dá)構(gòu)建體和SEQ ID NO 22的SigA3構(gòu)建體。在一些實施方案中，載體是多拷貝/復(fù)制型質(zhì)粒載體，其形成在修飾的細(xì)胞中過量表達(dá)YmaH的染色體外自我復(fù)制型遺傳元件。一般而言，載體是攜帶選擇標(biāo)記基因的質(zhì)粒載體，所述的選擇標(biāo)記基因允許輕易選擇含有該質(zhì)粒的宿主細(xì)胞。在宿主細(xì)胞中自主復(fù)制的載體包括含有復(fù)制起點的載體，其中所述的復(fù)制起點能夠使該載體在芽孢桿菌屬細(xì)胞中自主復(fù)制。細(xì)菌復(fù)制起點的實例是允許在大腸桿菌中復(fù)制的質(zhì)粒pBR322、pUC19、pACYC177和pACYC184的復(fù)制起點，和允許在芽孢桿菌中復(fù)制的質(zhì)粒pUBllO、pC194、pE194、pTA1060和ρΑΜβΙ的復(fù)制起點。復(fù)制起點可以是一種具有突變的復(fù)制起點，所述突變使該復(fù)制起點在芽孢桿菌屬細(xì)胞中的功能是對溫度敏感(見例如，Ehrlich, Proceedings of theNational Academy of Sciences USA 75 :1433[1978])。
如上文所示，在本發(fā)明的一些實施方案中，將編碼YmaH蛋白的多核苷酸借助能夠在宿主細(xì)胞內(nèi)部復(fù)制的表達(dá)載體導(dǎo)入修飾的細(xì)胞中。用于芽孢桿菌的合適復(fù)制型和整合型質(zhì)粒是本領(lǐng)域已知的(見例如，Harwood和Cutting(編著),芽孢桿菌分子生物學(xué)方法(Molecular Biological Methods for Bacillus) , Tohn ffilev& Sons, [1990]，特別地是第3章；用于枯草芽孢桿菌的合適復(fù)制型質(zhì)粒包括第92頁上所列的那些復(fù)制型質(zhì)粒)。在一些實施方案中，YmaH多肽的過量表達(dá)因表達(dá)至少一個拷貝的編碼YmaH的多核苷酸所致，其中所述的多核苷酸整合入宿主細(xì)胞的基因組中。因而，在一些實施方案中，當(dāng)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞時，它整合到基因組中并且隨該載體已經(jīng)整合于其中的基因組一起復(fù)制。YmaH基因的多個拷貝可以整合于宿主細(xì)胞中的幾個位置處。備選地，攜帶編碼YmaH的序列和選擇標(biāo)記(例如，抗微生物劑抗性標(biāo)記，如，編碼氯霉素乙?；D(zhuǎn)移酶的基因)的可擴(kuò)增表達(dá)盒可以借助單個交換事件整合入基因組中并且隨后通過用增加濃度的適宜抗微生物劑(例如，氯霉素)攻擊轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增。在其他實施方案中，本發(fā)明提供摻入整合型載體中的多核苷酸構(gòu)建體。在一些實
施方案中，將摻入整合型載體中的本發(fā)明多核苷酸構(gòu)建體靶向芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞的染色體序列以產(chǎn)生包含多個載體拷貝的穩(wěn)定串聯(lián)整合的修飾宿主細(xì)胞。摻入整合載體中的多核苷酸構(gòu)建體一般包含選擇標(biāo)記基因，所述的選擇標(biāo)記基因為細(xì)胞提供針對抗微生物劑的抗性并且允許擴(kuò)增整合的ymaH構(gòu)建體。串聯(lián)整合至單個位點中以及單拷貝和兩位點整合可能出現(xiàn)。無論該多核苷酸構(gòu)建體是摻入載體還是在質(zhì)粒DNA不存在的情況下使用，該構(gòu)建體均用來利用本領(lǐng)域已知的任何合適方法轉(zhuǎn)化修飾的細(xì)胞。培養(yǎng)方法本發(fā)明提供通過培養(yǎng)能夠產(chǎn)生目的蛋白的修飾細(xì)胞并且在表達(dá)該目的蛋白的合適生長條件下培育該細(xì)胞，用于在修飾的芽孢桿菌屬細(xì)胞中產(chǎn)生該目的蛋白的方法。在一些實施方案中，本發(fā)明的宿主細(xì)胞和修飾的宿主細(xì)胞在常規(guī)的營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)。合適的具體培養(yǎng)條件，如溫度、PH等是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。額外的優(yōu)選培養(yǎng)條件是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的并且在多種參考出版物中描述。在一些實施方案中，由修飾的宿主細(xì)胞產(chǎn)生的目的蛋白被約束于宿主細(xì)胞的胞內(nèi)環(huán)境，而在其他實施方案中，由宿主細(xì)胞產(chǎn)生的目的蛋白分泌至胞外空間(即，培養(yǎng)基)。因而，在一些實施方案中，可以從表達(dá)目的蛋白的細(xì)胞的胞內(nèi)環(huán)境通過裂解宿主細(xì)胞并且通過本領(lǐng)域已知的方法回收目的蛋白而回收此目的蛋白。在其他實施方案中，在適于表達(dá)并從細(xì)胞培養(yǎng)物回收目的蛋白的條件下培養(yǎng)修飾的宿主細(xì)胞。由本發(fā)明過量表達(dá)ymaH的修飾的宿主細(xì)胞產(chǎn)生的目的蛋白分泌至培養(yǎng)基中。在一些實施方案中，從培養(yǎng)基通過傳統(tǒng)方法回收由所述細(xì)胞產(chǎn)生的目蛋白(例如，蛋白酶)，所述的方法包括但不限于通過離心或過濾將宿主細(xì)胞與培養(yǎng)基分離、借助鹽(例如，硫酸銨)沉淀上清液或濾液的蛋白性組分、層析純化法(例如，離子交換、凝膠過濾、親和層析)。因而，適于回收本發(fā)明蛋白酶的任何方法用于本發(fā)明中。實際上，不意圖使本發(fā)明限于任何具體的純化方法。在一些實施方案中，其他重組構(gòu)建將編碼目的蛋白的異源或同源多核苷酸序列接合于編碼多肽結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列，其中所述的多肽結(jié)構(gòu)域促進(jìn)可溶性蛋白的純化(KrollDJ等人，DNA Cell Biol 12 :441-53 [1993])。此類促進(jìn)純化的結(jié)構(gòu)域包括但不限于金屬螯合肽，如允許在固定的金屬上純化的組氨酸-色氨酸模塊(Porath,Protein Expr Purif 3 263-281 [1992])、允許在固定的免疫球蛋白上純化的蛋白A結(jié)構(gòu)域和FLAGS延伸/親和純化系統(tǒng)中所用的結(jié)構(gòu)域(Immunex Corp,Seattle WA)。在純化結(jié)構(gòu)域和異源蛋白之間包括可剪切接頭序列如因子XA或腸激酶(Invitrogen, San Diego CA)也用來促進(jìn)純化。在一些實施方案中，在合適的營養(yǎng)培養(yǎng)基中于允許目的蛋白(例如，蛋白酶)表達(dá)的條件下培養(yǎng)本發(fā)明的轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，然后從培養(yǎng)物回收所得的蛋白酶。用來培養(yǎng)所述細(xì)胞的培養(yǎng)基包含適于培育所述宿主細(xì)胞的任何常規(guī)培養(yǎng)基，如含有適宜補充物的極限培養(yǎng)基或復(fù)合培養(yǎng)基。合適的培養(yǎng)基從商業(yè)供應(yīng)商可獲得或可以根據(jù)公開的配方(例如，在美國典型培養(yǎng)物保藏中心的目錄中)制備。在一些實施方案中，宿主細(xì)胞在分批、補料分批或連續(xù)發(fā)酵條件下培養(yǎng)。經(jīng)典的分批發(fā)酵方法使用一個封閉系統(tǒng)，其中培養(yǎng)基在發(fā)酵運行開始之前制得，培養(yǎng)基用想要的生物接種并且發(fā)酵在后續(xù)不添加任何組分至培養(yǎng)基的情況下進(jìn)行。在某些情況下，在分批方法期間改變生長培養(yǎng)基的PH和含氧量，但不改變其碳源含量。該分批系統(tǒng)的代謝物和細(xì)胞生物質(zhì)不斷變化直至發(fā)酵停止時間。在分批系統(tǒng)中，細(xì)胞通常經(jīng)靜止滯后期進(jìn)展至高速生長對數(shù)期并且最終至穩(wěn)定期，在此時生長速率下降或停頓。若不處理，處于穩(wěn)定期的細(xì)胞最終死亡。通常，處于對數(shù)期的細(xì)胞產(chǎn)生大量的蛋白質(zhì)。所述標(biāo)準(zhǔn)分批培養(yǎng)系統(tǒng)的一種變例是“補料分批發(fā)酵”系統(tǒng)。在這個系統(tǒng)中，養(yǎng)分(例如，碳源、氮源、O2和通常而言，其他養(yǎng)分)僅在它們在培養(yǎng)物中的濃度降至閾值以下時才添加。當(dāng)分解代謝物阻抑傾向于抑制細(xì)胞代謝時并且需要在培養(yǎng)基中存在有限量的養(yǎng)分時，補料分批培養(yǎng)系統(tǒng)是有用的。測量補料分批系統(tǒng)中實際的養(yǎng)分濃度基于可度量因素如pH、溶解氧和廢氣(如CO2)分壓來估計。分批發(fā)酵和補料分批發(fā)酵是本領(lǐng)域常見和熟知的。連續(xù)發(fā)酵是開放系統(tǒng)，在其中連續(xù)地添加定義的培養(yǎng)基至生物反應(yīng)器并且同時取出等量的條件培養(yǎng)基用于加工。連續(xù)發(fā)酵通常以其中細(xì)胞主要處于對數(shù)期生長的恒定高密度維持培養(yǎng)物。連續(xù)發(fā)酵允許調(diào)節(jié)影響細(xì)胞生長和/或終產(chǎn)物濃度的一個因素或任意數(shù)目的因素。例如，在一些實施方案中，以固定的速率維持限制性養(yǎng)分如碳源或氮源，并且允許調(diào)節(jié)全部其他參數(shù)。在其他系統(tǒng)中，連續(xù)地改變影響生長的眾多因素，同時通過培養(yǎng)基濁度度量的細(xì)胞濃度保持恒定。連續(xù)系統(tǒng)盡力保持穩(wěn)態(tài)生長條件。因此，因培養(yǎng)基抽取所致的細(xì)胞損失可以針對該發(fā)酵物中的細(xì)胞生長速率來平衡。調(diào)節(jié)用于連續(xù)發(fā)酵過程的養(yǎng)分和生長因子的方法以及使產(chǎn)物形成率最大化的技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，并且用于根據(jù)本發(fā)明方法產(chǎn)生目的蛋白(例如，蛋白酶)。如上文所示，本發(fā)明的經(jīng)修飾芽孢桿菌以這樣的水平產(chǎn)生目的蛋白，所述的水平大于從相應(yīng)未修飾的前體芽孢桿菌屬細(xì)胞中獲得的水平。通過過量表達(dá)YmaH進(jìn)一步增加修飾細(xì)胞的增強(qiáng)的蛋白質(zhì)產(chǎn)生水平。在本發(fā)明的一些實施方案中，YmaH在芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞中過量表達(dá)導(dǎo)致目的蛋白的產(chǎn)生增加，高于不過量表達(dá)YmaH的相應(yīng)的修飾前體芽孢桿菌屬細(xì)胞中所獲得的水平。在一些實施方案中，本發(fā)明提供過量表達(dá)YmaH的修飾的芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞。在一些實施方案中，重組芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞是這樣的細(xì)胞，該細(xì)胞被改變以產(chǎn)生比相同條件培育時未改變的親代/前體芽孢桿菌屬細(xì)胞更高水平的蛋白酶。本發(fā)明還包括用于以比前體宿主細(xì)胞所需要的更少時間在過量表達(dá)YmaH的修飾細(xì)胞中產(chǎn)生目的蛋白的方法。例如，本發(fā)明的修飾宿主細(xì)胞能夠比相應(yīng)未修飾的前體宿主細(xì)胞以更高水平并以更早的時間產(chǎn)生目的蛋白。因而，在一些實施方案中，本發(fā)明提供以比親代宿主細(xì)胞所產(chǎn)生水平高的水平并且以該前體宿主細(xì)胞達(dá)到其最大表達(dá)水平所花費時間的約1/6時間產(chǎn)生目的蛋白(例如，蛋白酶)的方法。在其他實施方案中，修飾的宿主以比該前體宿主細(xì)胞達(dá)到其最大表達(dá)水平所花費時間的約1/5、約1/4、約1/3或約1/2時間產(chǎn)生目的蛋白。產(chǎn)生/活性的度量實驗以下實施例為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員提供如何制造和使用本發(fā)明的完整公開和描述，并且不意圖限制本發(fā)明人視為其發(fā)明的范圍，它們也不意圖表明下文的實驗是所進(jìn)行的全部或僅有實驗。已經(jīng)作出努力以確保所用數(shù)字(例如量、溫度等)方面的準(zhǔn)確度，但是應(yīng)當(dāng)考慮一些實驗性誤差和偏差。除非另外指明，份數(shù)是以重量計的份數(shù)，分子量是重均分子量，溫度是攝氏度，并且壓力是在大氣壓或接近大氣壓。在以下的實驗公開中，使用以下縮寫V (攝氏度)；rpm(轉(zhuǎn)/分鐘)；H20(7jO ;aa (氨基酸)；bp(堿基對)；kb (千堿基對)；kD (千道爾頓)；gm(克)；Ug和Ug (微克)；mg (毫克);ng(納克);μ1和ul (微升);ml (毫升);mm (毫米);nm (納米);yn^Pum (微米)；Μ(摩爾)；mM(毫摩爾)；μ M和uM(微摩爾)；U(單位)；V(伏特)；麗(分子量)；sec (秒);min (分鐘)山和匕丨小時)；OD28tl (在280nm處的光密度)；0D4(I5 (在405nm處的光密度);0D_ (在600nm處的光密度);PAGE (聚丙烯酰胺凝膠電泳);LAS (十二烷基磺酸納)；SDS (十_■燒基硫酸納)JPTris (二(輕甲基)氣基甲燒)。實施例Iphr基因缺失在枯草芽抱桿菌菌株BG2942 ( Δ nprE, degU(Hy) 32, amyE: : [PxylRA-comK eryR])中缺失 phr 基因phrA、phrE、phrC、phrF、phrG、phrH、phrI 和 phrK,并且使用 AAPF 測定法，確定所得的修飾枯草芽孢桿菌菌株中的AprE蛋白酶表達(dá)。在芽孢桿菌染色體phr基因座中插入側(cè)翼分布有Iox位點的壯觀霉素選擇標(biāo)記來缺失phr基因，同時保持上游rap基因和下游基因完好無損。在圖2中說明用來缺失phr基因的失活盒。還在攜帶用于表達(dá)FNA的可擴(kuò)增性表達(dá)構(gòu)建體PaprE-FNA (aprE啟動子-FM的核苷酸序列SEQ ID NO 19)的枯草芽抱桿菌菌株 BG3594 (degU (Hy) 32, ορρΑ, Δ spoIIE, Δ aprE, Δ nprE)中進(jìn)行 phrA 和 phrE基因的缺失。gaattcctccattttcttctgctatcaaaataacagactcgtgattttccaaacgagctttcaaaaaagcctctgccccttgcaaatcggatgcctgtctataaaattcccgatattggcttaaacagcggcgcaatggcggccgcatctgatgtctttgcttggcgaatgttcatcttatttcttcctccctctcaataattttttcattctatcccttttctgtaaagtttatttttcagaatacttttatcatcatgctttgaaaaaatatcacgataatatccattgttctcacggaagcacacgcaggtcatttgaacgaattttttcgacaggaatttgccgggactcaggagcatttaacctaaaaaagcatgacatttcagcataatgaacatttactcatgtctattttcgttcttttctgtatgaaaatagttatttcgagtctctacggaaatagcgagagatgatatacctaaatagagataaaatcatctcaaaaaaatgggtctactaaaatattattccatctattacaataaattcacagaatagtcttttaagtaagtctactctgaatttttttaaaaggagagggtaaagagtgagaagcaaaaaattgtggatcagtttgctgtttgctttagcgttaatctttacgatggcgttcggcagcacatcctctgcccaggcggcagggaaatcaaacggggaaaagaaatatattgtcgggtttaaacagacaatgagcacgatgagcgccgctaagaagaaagatgtcatttctgaaaaaggcgggaaagtgcaaaagcaattcaaatatgtagacgcagcttcagctacattaaacgaaaaagctgtaaaagaattgaaaaaagacccgagcgtcgcttacgttgaagaagatcacgtagcacatgcgtacgcgcagtccgtgccttacggcgtatcacaaattaaagcccctgctctgcactctcaaggctacactggatcaaatgttaaagtagcggttatcgacagcggtatcgattcttctcatcctgatttaaaggtagcaggcggagccagcatggttccttctgaaacaaatcctttccaagacaacaactctcacggaactcacgttgccggcacagttgcggctcttaataactcaatcggtgtattaggcgttgcgccaagcgcatcactttacgctgtaaaagttctcggtgctgacggttccggccaatacagctggatcattaacggaatcgagtgggcgatcgcaaacaatatggacgttattaacatgagcctcggcggaccttctggttctgctgctttaaaagcggcagttgataaagccgttgcatccggcgtcgtagtcgttgcggcagccggtaacgaaggcacttccggcagctcaagcacagtgggctaccctggtaaatacccttctgtcattgcagtaggcgctgttgacagcagcaaccaaagagcatctttctcaagcgtaggacctgagcttgatgtcatggcacctggcgtatctatccaaagcacgcttcctggaaacaaatacggcgcgttgaacggtacatcaatggcatctccgcacgttgccggagcggctgctttgattctttctaagcacccgaactggacaaacactcaagtccgcagcagtttagaaaacaccactacaaaacttggtgattctttctactatggaaaagggctgatcaacgtacaggcggcagctcagtaa(SEQID NO 19) o PaprE-FNA表達(dá)構(gòu)建體包含與枯草芽孢桿菌aprE啟動子有效連接的編碼FNA蛋白
酶的多核苷酸序列。FNA(PURAFECT PRIME[Genencor])是具有Y217N置換的來自解淀粉芽孢桿菌的枯草蛋白酶BPN’ (SEQ ID NO 20) 0VRSKKLWISLLFALALIFTMAFGSTSSAQAAGKSNGEKKYIVGFKQTMSTMSAAKKKDVISEKGGKVQKQFKYVDAASATLNEKAVKELKKDPSVAYVEEDHVAHAYAQSVPYGVSQIKAPALHSQGYTGSNVKVAVIDSGIDSSHPDLKVAGGASMVPSETNPFQDNNSHGTHVAGTVAALNNSIGVLGVAPSASLYAVKVLGADGSGQYSWIINGIEWAIANNMDVINMSLGGPSGSAALKAAVDKAVASGWWAAAGNEGTSGSSSTVGYPGKYPSVIAVGAVDSSNQRASFSSVGPELDVMAPGVSIQSTLPGNKYGALNGTSMASPHVAGAAALILSKHPNWTNTQVRSSLENTTTKLGDSFYYGKGLINVQAAAQ(SEQ ID NO :20)。下文闡述構(gòu)建這些菌株的更詳細(xì)描述內(nèi)容。表I中提供引物的序列，所述引物用于產(chǎn)生用來缺失Phr基因的構(gòu)建體。對于phrA缺失盒，含有rapA序列的phrA基因上游區(qū)用引物CB2 008-007 (SEQ IDN0:1)和CB2 008-009 (SEQ ID NO :3)擴(kuò)增并且與側(cè)翼分布有IoxP序列并用寡聚物CB2008-009R(SEQ ID NO 4)和 CB2 008-010R(SEQ ID NO 6)擴(kuò)增的壯觀霉素盒融合。phrA 基因的下游區(qū)用寡聚物CB2 008-010 (SEQ ID NO :5)和CB2 008-008 (SEQ ID NO :2)擴(kuò)增并且與含有rapA序列和壯觀霉素盒的PCR產(chǎn)物融合。為產(chǎn)生phrC缺失盒，含有rapC序列的phrC基因上游區(qū)用引物CB2 008-015和CB2 008-016擴(kuò)增并與側(cè)翼分布有IoxP序列并用寡聚物CB2 008-016R和CB2008-017R擴(kuò)增的壯觀霉素盒融合。PhrC基因的下游區(qū)用寡聚物CB2 008-017和CB2008-018擴(kuò)增并且與含有rapC序列和壯觀霉素盒的PCR產(chǎn)物融合。為產(chǎn)生phrE缺失盒，含有rapE序列的phrE基因上游區(qū)用引物CB2008-019A(SEQID NO 7)和 CB2008-019B(SEQ ID NO :9)擴(kuò)增并且與用寡聚物 CB2008_019R(SEQ ID NO:10)和CB2008-020R(SEQ ID NO :12)擴(kuò)增的壯觀霉素盒融合。phrE基因的下游區(qū)用寡聚物CB2008-020 (SEQ ID NO 11)和 CB2008-021 (SEQ ID NO :8)擴(kuò)增并且與含有部分 rapE 序列和該壯觀霉素盒的純化PCR產(chǎn)物融合。為產(chǎn)生phrF缺失盒，含有rapF序列的phrF基因上游區(qū)用引物CB2008-022和CB2008-023擴(kuò)增并且與用寡聚物CB2008-023R和CB2008-024R擴(kuò)增的壯觀霉素盒融合。phrF基因下游區(qū)用寡聚物CB2008-024和CB2008-025擴(kuò)增并且與含有rapF序列和該壯觀霉素盒的純化PCR產(chǎn)物融合。為產(chǎn)生phrG缺失盒，含有rapG序列的phrG基因上游區(qū)用引物CB2008-026和CB2008-027R擴(kuò)增并且與用寡聚物CB2008-027和CB2008-028R擴(kuò)增的壯觀霉素盒融合。phrG基因下游區(qū)用寡聚物CB2008-028和CB2008-029擴(kuò)增并且與含有rapG序列和該壯觀霉素盒的純化PCR產(chǎn)物融合。為產(chǎn)生phrH缺失盒，含有rapH序列的phrH基因上游區(qū)用引物CB2008-011和CB2008-012擴(kuò)增并且與用寡聚物CB2008-012R和CB2008-013R擴(kuò)增的壯觀霉素盒融合。phrH基因下游區(qū)用寡聚物CB2008-013和CB2008-014擴(kuò)增并且與含有rapH序列和該壯觀霉素盒的純化PCR產(chǎn)物融合。為產(chǎn)生phrl缺失盒，含有rapl序列的phrl基因上游區(qū)用引物CB2008-030和
CB2008-031擴(kuò)增并且與用寡聚物CB2008-031R和CB2008-032R擴(kuò)增的壯觀霉素盒融合。phrl基因下游區(qū)用寡聚物CB2008-032和CB2008-033擴(kuò)增并且與含有rapl序列和該壯觀霉素盒的純化PCR產(chǎn)物融合。 為產(chǎn)生phrK缺失盒，含有rapK序列的phrK基因上游區(qū)用引物CB2008-034和CB2008-035擴(kuò)增并且與用寡聚物CB2008-035R和CB2008-036R擴(kuò)增的壯觀霉素盒融合。phrK基因下游區(qū)用寡聚物CB2008-036和CB2008-037擴(kuò)增并且與含有rapK序列和該壯觀霉素盒的純化PCR產(chǎn)物融合。將兩個IoxP位點在壯觀霉素選擇標(biāo)記的兩側(cè)導(dǎo)入以促進(jìn)除去該抗生素抗性。將最終的PCR產(chǎn)物純化并且轉(zhuǎn)化至枯草芽孢桿菌BG2942(AnprE，degU(Hy)32,amyE: : [PxylRA-comK-eryR])中。一旦DNA構(gòu)建體經(jīng)雙交換穩(wěn)定整合入感受態(tài)枯草芽孢桿菌BG2942菌株的染色體，則通過 PCR 分析證實缺失。phrA 區(qū)用引物 CB2008-041(SEQ ID NO 13)和 CB2008-042 (SEQID NO :14)擴(kuò)增，并且 phrE 區(qū)用引物 CB2008-051(SEQ ID NO :15)和 CB2008-052 (SEQ IDNO 16)擴(kuò)增。將所得PCR產(chǎn)物測序以證實不存在PCR誤差和抗生素標(biāo)記插在靶phr基因中。如公開為US2002182734的專利申請中所述進(jìn)行枯草芽孢桿菌BG2942的轉(zhuǎn)化，所述的枯草芽孢桿菌BG2942攜帶在amyE位點中的誘導(dǎo)型ComK構(gòu)建體。攜帶phrA或phrE缺失的BG2942衍生菌株隨后用表達(dá)Cre重組酶的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化。這是通過位點特異性重組消除壯觀霉素抗生素標(biāo)記的必需步驟。表I中示出了以上實驗過程中所用引物的序列和描述。表Igag gat atg gaa gaa gac caa gat ttgCB2008-007: 上游 phrA_ctg (SEQ ID NO:I)__
ggc aat ccc tga cag tgt gtc acc (SEQCB2008-008: 下游 phrA_ID NO:2)__
gcg gcc gcc ata tgc ate cta ggc ccc cga
CB2008-009: ccg caa cga gca aca aac c (SEQ ID phrA 上游 Iox 下游的接頭
_NO:3)__
ggt ttg ttg CtC gtt gcg gtc ggg ggc Cta
CB2008-009-R: gga tgc ata tgg egg ccg c (SEQ ID phrA 上游丨ox 下游的接頭
_NO:4)__
gga tcc age tta tcg ata ccg tcg atg cat
CB2008-010: aaa aaa aga ccc tta ggg g (SEQ ID phrA 下游 Iox 上游的接頭
_NQ:5)__
ccc cta agg gtc ttt ttt tat gca tcg acg
CB2008-010R: gta tcg ata age tgg ate c (SEQ ID phrA 下游 Iox 上游的接頭
_NO:6)__
gga ggg aag ccg ttS aSt caa ^cc u 說,TT
CB2008-011: 上游 phrH_(SEQ ID NO:59)__
gcg gcc gcc ata tgc ate cta ggc ctc ateCB2008-012: phrH上游Iox下游的接頭_|act ttt ttt ctt aat agg c(SEQ IP|_
權(quán)利要求
1.宿主細(xì)胞，其包含rap操縱子,所述rap操縱子包含至少一個失活的phr和/或至少一個失活的rap基因。
2.權(quán)利要求I所述的宿主細(xì)胞,其中所述宿主細(xì)胞過量表達(dá)YmaH。
3.權(quán)利要求I或2所述的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞還包含重組核酸。
4.權(quán)利要求1-3任一項所述的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞還包含編碼目的蛋白的多核苷酸序列。
5.權(quán)利要求4所述的宿主細(xì)胞，其中所述重組核酸包含與編碼目的蛋白的所述多核苷酸序列有效連接的啟動子。
6.權(quán)利要求5所述的宿主細(xì)胞，其中所述啟動子是野生型或突變的aprE啟動子。
7.權(quán)利要求4-6任一項所述的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞以比不包含至少一個失活phr和/或rap基因的宿主細(xì)胞所產(chǎn)生水平高的水平產(chǎn)生所述目的蛋白。
8.權(quán)利要求7所述的宿主細(xì)胞，其中所述目的蛋白是酶。
9.權(quán)利要求8所述的宿主細(xì)胞，其中所述酶是蛋白酶。
10.權(quán)利要求1-8任一項所述的宿主細(xì)胞,其中所述的至少一個失活rap基因是rapA基因。
11.權(quán)利要求1-10任一項所述的宿主細(xì)胞,其中所述的至少一個失活phr基因選自phrA、phrE、phr C、phrF、phrG、phr I 和 phrK。
12.權(quán)利要求11所述的宿主細(xì)胞，其中所述的至少一個失活phr基因是phrA。
13.權(quán)利要求11所述的宿主細(xì)胞，其中所述的至少一個失活phr基因是phrE。
14.權(quán)利要求I至13任一項所述的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞包含至少一個失活的phr基因和至少一個失活的rap基因。
15.權(quán)利要求14所述的宿主細(xì)胞，其中所述的失活rap基因是rapA基因。
16.權(quán)利要求14-15任一項所述的宿主細(xì)胞，其中所述的至少一個失活phr基因選自phrA、phrE、phr C、phrF、phrG、phr I 和 phrK。
17.權(quán)利要求16所述的宿主細(xì)胞,其中所述的至少一個失活phr基因是phrA。
18.權(quán)利要求16所述的宿主細(xì)胞,其中所述的至少一個失活phr基因是phrE。
19.權(quán)利要求1-18任一項所述的宿主細(xì)胞，其包含失活的phrA基因、失活的phrE基因、失活的rapA基因和編碼目的蛋白的重組核酸。
20.權(quán)利要求19所述的宿主細(xì)胞，其中所述目的蛋白是酶。
21.權(quán)利要求20所述的宿主細(xì)胞，其中所述酶是蛋白酶。
22.權(quán)利要求I至21任一項所述的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞是芽孢桿菌屬(Bacillus sp.)宿主細(xì)胞。
23.權(quán)利要求22所述的宿主細(xì)胞，其中所述的芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞是嗜堿芽孢桿菌(Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽抱桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短芽抱桿菌(Bacillus brevis)、環(huán)狀芽抱桿菌(Bacillus circulans)、克勞氏芽抱桿菌(Bacillusclausii)、凝固芽抱桿菌(Bacillus coagulans)、堅強(qiáng)芽抱桿菌(Bacillus firmus)、燦爛芽抱桿菌(Bacillus lautus)、遲緩芽抱桿菌(Bacillus lentus)、地衣芽抱桿菌(Bacilluslicheniformis)、巨大芽抱桿菌(Bacillus megaterium)、短小芽抱桿菌(Bacilluspumilus)、嗜熱脂肪芽抱桿菌(Bacillus stearothermophilus)、枯草芽抱桿菌(Bacillussubtilis)或蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)細(xì)胞。
24.權(quán)利要求22或23所述的宿主細(xì)胞，其中所述的芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞是枯草芽孢桿菌宿主細(xì)胞。
25.用于產(chǎn)生至少一種目的蛋白的方法，其包括提供前體宿主細(xì)胞和包含使至少一個固有phr和/或rap基因失活的失活性多核苷酸的失活性核苷酸構(gòu)建體；將所述的失活性核苷酸構(gòu)建體導(dǎo)入所述前體宿主細(xì)胞以產(chǎn)生修飾的宿主細(xì)胞；和在用于產(chǎn)生所述至少一種目的蛋白的合適條件下生長所述的修飾宿主細(xì)胞。
26.權(quán)利要求25所述的方法，其中所述目的蛋白由所述前體宿主細(xì)胞中存在的重組核酸編碼。
27.權(quán)利要求25所述的方法，其中所述目的蛋白由所述修飾的宿主細(xì)胞中存在的重組核酸編碼。
28.權(quán)利要求25所述的方法，其中所述目的蛋白由所述前體宿主細(xì)胞和/或所述修飾的宿主細(xì)胞中存在的重組核酸編碼。
29.權(quán)利要求26-28任一項所述的方法，其中所述重組核酸包含與編碼所述目的蛋白的多核苷酸序列有效連接的啟動子。
30.權(quán)利要求25-29任一項所述的方法，其中所述目的蛋白是野生型目的蛋白。
31.權(quán)利要求25-30任一項所述的方法，其中所述前體宿主細(xì)胞天然地產(chǎn)生所述目的蛋白。
32.權(quán)利要求25-31任一項所述的方法，其中所述修飾的宿主細(xì)胞的所述目的蛋白產(chǎn)生大于所述前體宿主細(xì)胞的所述目的蛋白產(chǎn)生。
33.權(quán)利要求25-32任一項所述的方法，還包括回收所述目的蛋白的步驟。
34.權(quán)利要25至33求任一項所述的方法，其中所述目的蛋白是酶。
35.權(quán)利要求34所述的方法，其中所述酶是蛋白酶。
36.權(quán)利要求25至35任一項所述的方法，其中所述修飾的宿主細(xì)胞包含在選自degU、degQ、degS、sco4、spoIIE、degQ和degR的至少一個基因中的突變。
37.權(quán)利要求36所述的方法，其中所述宿主細(xì)胞包含deg(Hy)32突變。
38.權(quán)利要求25至37任一項所述的方法，其中被失活的所述至少一個固有phr基因選自 phrA、phrE、phr C、phrF、phrG、phr I 和 phrK。
39.權(quán)利要求25-38任一項所述的方法，其中所述的失活性多核苷酸使固有phrA和PhrE基因和/或rap基因失活。
40.權(quán)利要求39所述的方法，其中所述的至少一個固有phr基因是phrA。
41.權(quán)利要求39所述的方法，其中所述的至少一個固有phr基因是phrE。
42.權(quán)利要求25-41任一項所述的方法，其中失活所述的固有rap基因。
43.權(quán)利要求42所述的方法，其中所述的固有rap基因是rapA。
44.權(quán)利要求25-41任一項所述的方法,還包括使固有rap基因失活。
45.權(quán)利要求25-44任一項所述的方法，其中所述的前體宿主細(xì)胞或修飾的宿主細(xì)胞過量表達(dá)YmaH。
46.權(quán)利要求45所述的方法，其中所述的YmaH過量表達(dá)通過將SigH構(gòu)建體導(dǎo)入所述前體或所述修飾的宿主細(xì)胞中實現(xiàn)。
47.權(quán)利要求46所述的方法，其中所述的SigH構(gòu)建體包含SEQID N0:23，其包含與編碼YmaH蛋白的多核苷酸有效連接的SigH啟動子。
48.權(quán)利要求45所述的方法，其中所述的YmaH過量表達(dá)通過將SigA構(gòu)建體導(dǎo)入所述前體或所述修飾的宿主細(xì)胞中實現(xiàn)。
49.權(quán)利要求48所述的方法，其中所述的SigA構(gòu)建體包含SEQID N0:26和/或31， 其包含與編碼YmaH的多核苷酸有效連接的SigA啟動子。
50.權(quán)利要求25-49任一項所述的方法，其中所述宿主細(xì)胞是芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞。
51.權(quán)利要求50所述的方法，其中所述的芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞是嗜堿芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、短芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、克勞氏芽孢桿菌、凝固芽孢桿菌、堅強(qiáng)芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌或蘇云金芽孢桿菌細(xì)胞。
52.權(quán)利要求50-51任一項所述的方法，其中所述的芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞是枯草芽孢桿菌細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明提供了已經(jīng)受到基因操作以具有增強(qiáng)的目的蛋白產(chǎn)生能力的宿主細(xì)胞。特別地，本發(fā)明涉及具有至少一個失活phr基因的修飾的芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞。修飾的芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞的增強(qiáng)的目的蛋白產(chǎn)生在過量表達(dá)YmaH的修飾芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞中進(jìn)一步增加。也提供了用于在修飾的宿主細(xì)胞中產(chǎn)生目的蛋白的方法。
文檔編號C07K14/32GK102803290SQ201080026055
公開日2012年11月28日 申請日期2010年6月2日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月11日
發(fā)明者克里斯蒂娜·邦焦?fàn)柲? 歐金尼奧·費拉里 申請人:丹尼斯科美國公司