專利名稱：新的人乳頭狀瘤病毒(hpv)蛋白構(gòu)建體及其在預(yù)防hpv疾病中的用途的制作方法
新的人乳頭狀瘤病毒(HPV)蛋白構(gòu)建體及其在預(yù)防HPV疾
病中的用途背景本說明書涉及人疫苗領(lǐng)域。更具體而言，本說明書涉及用于預(yù)防或治療人乳頭狀瘤病毒(HPV)感染或疾病的藥物組合物和免疫原性組合物。乳頭狀瘤病毒是高物種特異性的小的DNA腫瘤病毒。人乳頭狀瘤病毒是感染基底上皮(皮膚或粘膜)細(xì)胞的DNA病毒。已經(jīng)描述了 100多種獨(dú)特的人乳頭狀瘤病毒(HPV) 基因型。HPV —般對皮膚(例如HPV-I和HPV-2)或粘膜表面(例如HPV-6和HPV-11)的扁平上皮有特異性，并且通常引起持續(xù)數(shù)月或數(shù)年的良性腫瘤(疣)。致癌性人乳頭狀瘤病毒(HPV)型的持續(xù)感染是全球女性癌癥死亡第二最常見原因子宮頸癌的必然原因。國際間已有共識(shí)，即“高危”基因型，包括基因型16、18、31、33、35、 39、45、51、52、56、58、59和66，可導(dǎo)致子宮頸癌，并且與其它粘膜肛門生殖器癌和頭頸癌有關(guān)。全世界，HPV-16和HPV-18是主要的致癌型，累計(jì)占全部侵襲性子宮頸癌病例的70-80% 以上。被稱為“低?！钡钠渌蛐透腥荆梢鹆夹曰蜉p度子宮頸組織改變和生長在女性子宮頸、陰道、外陰和肛門以及男性陰莖、陰囊或肛門上的生殖器疣(尖銳濕疣)。它們還會(huì)引起需要外科手術(shù)的兒童和成人聲帶上的上皮生長(青少年呼吸道乳頭狀瘤病或復(fù)發(fā)性呼吸道乳頭狀瘤病)。兩種預(yù)防性HPV疫苗目前已在許多國家得到許可。兩者均使用由獨(dú)特HPV型的重組Ll衣殼蛋白組成的病毒樣顆粒(VLP)以預(yù)防HPV-16和HPV-18子宮頸癌前病變和癌癥。Cervarix (GlaxoSmithKline Biologicals)含有使用桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)在粉紋夜蛾(Trichoplusia ni)細(xì)胞底物中產(chǎn)生并用免疫刺激劑3_0_脫?；?4’ -單磷酰脂質(zhì)A(MPL)和氫氧化鋁鹽配制的HPV-16和HPV-18VLP。Gardasi 1 (Merck)含有在酵母釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中產(chǎn)生并用非晶形羥基磷酸硫酸鋁鹽(amorphous aluminium hydroxyphosphate sulphate salt)配制的 HPV-16 禾口 HPV—18VLP。另夕卜， Gardasi 1 含有涉及75-90%生殖器疣的得自非致癌型HPV-6和HPV-Il的VLP。在隨機(jī)臨床試驗(yàn)中已證實(shí)，兩種疫苗對致癌型HPV-16和HPV-18感染以及相關(guān)癌前病變有特定保護(hù)作用。造成引發(fā)子宮頸癌的致癌性HPV型的清單至少包括存在于子宮頸癌中的HPV 16、 18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68 和 73 型(Mahdavi 等，2005 ；Quint 等，2006)?，F(xiàn)有疫苗能夠提供針對由這些HPV型中的一些所致感染和/或疾病提供不同程度的特定保護(hù)。然而具有含有其它HPV型的抗原以進(jìn)一步提高針對所有引起子宮頸癌的HPV 型的覆蓋范圍，或者可誘導(dǎo)針對相關(guān)和無關(guān)HPV型的廣泛交叉保護(hù)的疫苗，可能具有潛在益處。具有進(jìn)一步有效針對引起皮膚癌的HPV型(例如HPV 5或HPV 8或HPV 38或者這些中的兩種或更多種的任何組合)的疫苗，可能具有潛在益處。除了目前已獲批準(zhǔn)的LlVLP疫苗外，在例如以下文獻(xiàn)中提出將L2的肽用于HPV疫苗W0 2003/097673 ；WO 2004/052395 ；W02006/083984 ；WO 2009/001867 ；Kondo 等，2008JMed Virol 80，841-846 ;Kondo 等，2006Virology 358，266-272 ;Schellenbacher 等，2009 25th International Papillomavirus Conference (2009 年第二十五屆乳頭狀瘤病毒國際會(huì)議)，5 月 8-14 日，Malmo, Sweden ；Coursaget 等，25th International Papillomavirus Conf erence(第二十五屆乳頭狀瘤病毒國際會(huì)議)，5月8-14日，Malmo，Sweden ；Slupetzky 等，2007Vaccine 25，2001-2010 ;Xu 等，2006 Arch Virol 151，2133-2148 ;Gambhira 等， 2007 J Virol 81，13927-13931 ;Alphs等，2008 PNAS105，5850-5 ；Kawana等，2003 Vaccine 21,4256-60 ；Kawana 等，2001Vaccine 19,1496-1502。簡述本說明書涉及含有抗原的針對人乳頭狀瘤病毒的改進(jìn)疫苗，所述疫苗提供針對引發(fā)其它癌癥的HPV型和/或與生殖器疣有關(guān)的低危HPV型的保護(hù)。改進(jìn)的疫苗含有嵌合Ll 多肽，其中插入至少一個(gè)包含L2多肽的表位的肽。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，提供人乳頭狀瘤病毒(HPV)LllS型多肽或其片段， 其包含至少一個(gè)插入HPV Ll多肽內(nèi)的包含L2多肽的表位的肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多肽包含L2多肽的至少兩個(gè)肽。在一個(gè)備選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供人乳頭狀瘤病毒(HPV)Llie型多肽或其片段，其含有包含插入HPV Ll多肽內(nèi)的HPV L2多肽的氨基酸56-75的肽。本發(fā)明的嵌合多肽可以殼?；虿《緲宇w粒(VLP)提供。這類多肽、殼粒和VLP可配制成免疫原性組合物。本文描述了其制備方法，及其例如在配制用于預(yù)防HPV感染的藥物中的用途。本發(fā)明還提供一種組合物，所述組合物包含(i)至少一種人乳頭狀瘤病毒(HPV)Ll病毒樣顆粒(VLP)；和(ii)至少一種嵌合HPV Ll多肽、殼?；騐LP，其在Ll序列中包含L2肽。本發(fā)明還提供一種組合物，所述組合物包含兩種或更多種嵌合HPV Ll多肽、殼?；騐LP的組合，各Ll在Ll序列中包含L2肽。本發(fā)明還提供一種組合物，所述組合物包含⑴至少一種人乳頭狀瘤病毒(HPV)Ll病毒樣顆粒(VLP)；和(ii)至少一種在Ll序列中包含L2肽的嵌合HPV Ll多肽、殼?；騐LP，用于預(yù)防或治療HPV感染相關(guān)病癥。本發(fā)明還提供一種組合物，所述組合物包含兩種或更多種在Ll序列中包含L2肽的嵌合人乳頭狀瘤病毒(HPV)Ll多肽、殼?；騐LP的組合，用于預(yù)防或治療HPV感染相關(guān)病癥。本發(fā)明還提供以下用途⑴至少一種人乳頭狀瘤病毒(HPV)Ll病毒樣顆粒(VLP)；和(ii)至少一種在Ll序列中包含L2肽的嵌合HPV Ll多肽、殼?；騐LP在制備用于預(yù)防或治療HPV感染相關(guān)病癥的藥物中的用途。本發(fā)明還提供兩種或更多種在Ll序列中包含L2肽的嵌合HPVLl多肽、殼?；騐LP 的組合在制備用于預(yù)防或治療HPV感染相關(guān)病癥的藥物中的用途。本發(fā)明還提供在Ll序列中包含兩個(gè)或更多個(gè)L2肽的嵌合HPVLl多肽、殼?；?VLP。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供用于誘導(dǎo)人的抗HPV抗體的方法，所述方法包括將本文所述的本發(fā)明的免疫原性組合物給予人。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供用于誘導(dǎo)人的抗HPV中和抗體的方法，所述方法包括將本文所述的本發(fā)明的免疫原性組合物給予人。這類方法還可誘導(dǎo)交叉中和抗體。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供用于誘導(dǎo)人的針對HPV的細(xì)胞免疫的方法，所述方法包括將本文所述的本發(fā)明的免疫原性組合物給予人。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供用于誘導(dǎo)人的針對HPV的中和抗體和細(xì)胞免疫的方法，所述方法包括將本文所述的本發(fā)明的免疫原性組合物給予人。這類方法還可誘導(dǎo)交叉中和抗體。本發(fā)明還提供用于預(yù)防HPV感染或與HPV感染有關(guān)的HPV疾病的方法，所述方法包括將本發(fā)明的免疫原性組合物給予人。本發(fā)明還提供用于制備免疫原性組合物的方法，所述方法包括將(i)至少一種人乳頭狀瘤病毒(HPV)Ll病毒樣顆粒(VLP)與(ii)至少一種在Ll序列中包含L2肽的嵌合HPV Ll多肽、殼粒或VLP和(iii)藥學(xué)上可接受的稀釋劑或載體和任選(iv)佐劑混合， 以產(chǎn)生本文所述的免疫原性組合物。本發(fā)明還提供用于純化本文所述嵌合多肽的方法，所述方法包括陰離子交換層析和羥磷灰石層析。本發(fā)明還提供用于制備免疫原性組合物的方法，所述方法包括將兩種或更多種在 Ll序列中包含L2肽的嵌合HPV Ll多肽、殼?；騐LP混合。本發(fā)明還提供制備組合物的方法，所述方法包括將包含插入Ll多肽內(nèi)的L2多肽的肽表位的HPV Ll多肽和藥學(xué)上可接受的稀釋劑或載體混合。附圖簡述

圖1表示HPV 16和HPV 18的C端截短的Ll序列。圖1 (a)禾Π (b)的HPV 16序列和HPV 18序列的氨基酸編號(hào)在本說明書全文中分別與HPV 16和HPV 18的Ll相關(guān)地使用。圖2表示HPV 16和HPV 18L1的暴露環(huán)和L2肽插入Ll序列的示例性位置。圖3表示在暴露環(huán)區(qū)和C端侵入臂(invading arm)區(qū)中HPV 16、18和其它型的 Ll序列的比對。最上面的序列是圖1所示的HPV 16L1序列。圖4表示各種不同的HPV型的L2肽。圖5表示嵌合L1/L2多肽純化的流程圖。詳述導(dǎo)言本說明書涉及用于預(yù)防和治療人乳頭狀瘤病毒(HPV)感染引發(fā)的疾病的組合物和方法。更具體而言，本說明書涉及含有主要衣殼蛋白Ll和命名為L2的次要衣殼蛋白的免疫原性組分的嵌合多肽。本文公開的嵌合多肽包括其中插入至少一個(gè)L2肽的Ll多肽。 選擇包含L2多肽的至少一個(gè)表位的L2肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，Ll多肽是HPV 18型Ll多肽。因此，嵌合L1/L2多肽包括其中插入至少一個(gè)包含L2多肽的表位的肽的HPV 18型Ll多肽或其片段。例如，L2肽可來自18型以外的HPV型(即非HPV 18型L2肽)。有利的是，L1/L2多肽能夠誘導(dǎo)對包含L2 多肽(從中選出肽)的天然蛋白質(zhì)的免疫應(yīng)答。另外，L1/L2多肽可能能夠誘導(dǎo)對至少一種其它天然L2蛋白的免疫應(yīng)答。在一個(gè)實(shí)施方案中，L2肽選自HPV L2多肽N端的氨基酸1-200，例如選自HPV L2 多肽N端的氨基酸1-150。在具體實(shí)施方案中，L2肽選自包含HPV L2多肽的氨基酸殘基 17-36的肽；包含HPV L2多肽的氨基酸殘基56-75的肽；包含HPV L2多肽的氨基酸殘基 96-115的肽；以及包含HPV L2多肽的氨基酸殘基108-120的肽。在不同的實(shí)施方案中，L2 肽包括由SEQ ID NO :1-31表示的氨基酸序列。在一個(gè)示例性實(shí)施方案中，L2肽由HPV 33 型L2的氨基酸17-36(其與HPVll型L2的氨基酸17-36相同)組成。在另一個(gè)示例性實(shí)施方案中，L2肽由HPV 58型L2的氨基酸56-75(其與HPV 6型L2的氨基酸56-75相同) 組成。更概括地講，可選擇包含與至少兩種不同HPV型的L2多肽相同的至少8個(gè)連續(xù)氨基酸(也就是說兩種或更多種HPV型之間的共有序列)的L2肽。在另一個(gè)實(shí)施方案中，嵌合L1/L2多肽包括其中插入包含HPV L2多肽的氨基酸 56-75的肽的HPV Ll 16型多肽或其片段。例如，L2肽可包含HPV致癌型(例如HPV 58型) 的HPV L2多肽的氨基酸56-75。在某些實(shí)施方案中，與天然L2多肽相比，插入Ll多肽以形成嵌合L1/L2多肽的L2 肽包含至少一個(gè)氨基酸插入、缺失或取代。在一個(gè)實(shí)施方案中，L2肽具有至少一個(gè)氨基酸插入、缺失或取代，其去除兩個(gè)半胱氨酸之間的二硫鍵或去除能夠形成二硫鍵的兩個(gè)半胱氨酸之間的氨基酸。有利的是，包含具有氨基酸插入、缺失或取代的L2肽的多肽能夠誘導(dǎo)針對至少一種天然L2蛋白(或天然存在的L2多肽)的免疫應(yīng)答。在一個(gè)實(shí)施方案中，HPV Ll蛋白具有一個(gè)或多個(gè)氨基酸的C端缺失。在某些實(shí)施方案中，將L2肽插入Ll多肽的暴露區(qū)。在不同的實(shí)施方案中，暴露環(huán)可以是Ll多肽的DE 環(huán)(例如介于氨基酸132-142之間)環(huán)(例如介于氨基酸172-182之間);HI環(huán)(例如介于氨基酸345-359之間)；和/或C端(例如介于氨基酸4 和445之間)。在一個(gè)實(shí)施方案中，將兩個(gè)或更多個(gè)L2肽插入Ll多肽內(nèi)。例如，可將兩個(gè)或更多個(gè)L2肽插入相同位點(diǎn)(例如作為一連串的氨基酸或多聯(lián)體(concatamer))，或者插入不同的位點(diǎn)，例如插入 Ll多肽的DE環(huán)和C端。任選在插入相同位點(diǎn)時(shí)，兩個(gè)或更多個(gè)L2肽可通過至少一個(gè)其它氨基酸連接，例如通過包含多個(gè)氨基酸的間隔基連接。在將兩個(gè)或更多個(gè)L2肽插入Ll多肽時(shí)，L2肽可相同或不同。通常，L2肽包含天然L2多肽的至少8個(gè)連續(xù)氨基酸。在某些實(shí)施方案中，將L2肽插入Ll多肽而又不缺失Ll多肽的氨基酸。在其它實(shí)施方案中，將L2肽插入Ll多肽同時(shí)缺失Ll多肽的一個(gè)或多個(gè)氨基酸。在一些實(shí)施方案中，嵌合L1/L2呈嵌合多肽的超分子裝配體(supramolecular assembly)，例如呈多肽顆粒，例如非晶形聚集體，或者更有序的結(jié)構(gòu)，例如殼粒或病毒樣顆粒(VLP)或小的非VLP結(jié)構(gòu)。本說明書的另一個(gè)方面涉及編碼上述嵌合L1/L2多肽的核酸分子。這類核酸可存在于原核或真核表達(dá)載體中。合適的表達(dá)載體包括例如重組桿狀病毒?？蓪⒅亟M核酸(例如表達(dá)載體)導(dǎo)入(例如感染、轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化)宿主細(xì)胞。這類宿主細(xì)胞也是本說明書的特征。可使用這些宿主細(xì)胞產(chǎn)生嵌合L1/L2多肽，例如通過使宿主細(xì)胞在適于表達(dá)重組多肽的條件下復(fù)制。然后可任選對多肽進(jìn)行分離和/或純化，例如在配制到免疫原性組合物中 本文公開的任何嵌合L1/L2多肽可用于醫(yī)學(xué)，例如作為用于預(yù)防或治療由HPV引起的感染或疾病的免疫原性組合物(例如疫苗)。這些組合物適用于通過將免疫原性組合物給予人受試者而誘導(dǎo)人的抗HPV抗體的方法。有利的是，將免疫原性組合物給予人受試者誘導(dǎo)預(yù)防、改善或治療HPV感染或疾病的抗體。因此，本說明書還提供用于預(yù)防、改善或治療HPV感染或疾病的免疫原性組合物。 這類免疫原性組合物包含與藥學(xué)上可接受的賦形劑、稀釋劑或載體組合的上述嵌合L1/L1 多肽(例如蛋白質(zhì))、殼粒或VLP。在一些實(shí)施方案中，免疫原性組合物還包含佐劑。合適的佐劑包括鋁鹽(例如氫氧化鋁)和/或3-脫?；鶈瘟柞Ｖ|(zhì)A(3D-MPL)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述組合物包含(i)至少一種包含人乳頭狀瘤病毒(HPV)Ll 多肽或其片段或者由之組成的病毒樣顆粒(VLP)；和(ii)至少一種含有其中插入至少一個(gè)包含L2多肽的表位的肽的人乳頭狀瘤病毒(HPV)Ll多肽或其片段的嵌合多肽。本文公開的任何嵌合L1/L2多肽(包括上述超分子裝配體、多肽顆粒、殼粒和/或VLPQ適用于含有與嵌合L1/L2多肽組合的VLP的組合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，用于與嵌合L1/L2多肽組合的VLP由Ll多肽或其片段組成。 在具體實(shí)施方案中，HPV LlVLP是HPV 16 Ll VLP和/或HPV 18 Ll VLP。同樣，嵌合多肽還可包含HPV 16 Ll多肽或其片段和/或HPV 18 Ll多肽或其片段。在一個(gè)實(shí)施方案中，示例性實(shí)施方案中的這類組合物包含(ii)的至少一種嵌合多肽，其由L2肽插入其中的HPV 16 Ll多肽或其片段、HPV 18 Ll多肽或其片段或者L2肽插入其中的HPV 16 Ll多肽或其片段和HPV 18 Ll多肽或片段兩者組成。上文公開的嵌合肽可包含Ll多肽的C端缺失一個(gè)或多個(gè)氨基酸的Ll多肽。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，免疫原性組合物包含HPV 16 Ll VLP和HPV 18 Ll VLP兩者以及具有HPV 16 Ll多肽和HPV 18 Ll多肽兩者的嵌合多肽。在這類實(shí)施方案中，具有HPV 16 Ll多肽的嵌合多肽和具有HPV 18多肽的嵌合多肽可包含不同的L2肽。示例性Ll片段包括沒有C端34個(gè)氨基酸的HPV 16 Ll或沒有C端35個(gè)氨基酸的HPV 18 Li。同樣，在另一個(gè)實(shí)施方案中，免疫原性組合物可包含兩種或更多種嵌合多肽的組合，所述嵌合多肽包含人乳頭狀瘤病毒(HPV) Ll多肽或其片段與至少一個(gè)插入HPV Ll多肽內(nèi)的包含L2多肽的表位的肽。例如，所述組合可包括具有相同或不同Ll組分的嵌合多肽。 同樣，組合中的嵌合多肽可包含相同或不同的L2組分。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，嵌合多肽包含相同HPV型的Ll多肽，而L2肽不同。在示例性制劑中，免疫原性組合物包括10-50 μ g的各VLP和/或嵌合多肽/人劑量。在一個(gè)實(shí)施方案中，各VLP和/或嵌合多肽存在的量約20 μ g?？赏ㄟ^將至少一種包含人乳頭狀瘤病毒(HPV)Ll多肽或其片段和至少一個(gè)插入 HPV Ll多肽內(nèi)的包含L2多肽的表位的插入肽的嵌合多肽，與至少一種其它嵌合多肽，或與至少一種人乳頭狀瘤病毒(HPV) Ll病毒樣顆粒(VLP)以及藥學(xué)上可接受的稀釋劑或載體和任選佐劑混合，來制備本文所述免疫原性組合物。術(shù)語為了便于回顧本說明書的各種實(shí)施方案，提供下列術(shù)語解釋。其它術(shù)語和解釋可提供于本說明書的上下文中。除非另有說明，否則本文使用的所有科技術(shù)語具有本說明書所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的相同含義。分子生物學(xué)的常見術(shù)語的定義可參見Benjamin Lewin,Genes V, Oxford University Press 出版，1994(ISBN 0-19-854287-9) ；Kendrew 等 (主編)，The Encyclopedia of Molecular Biology, Blackwell Science Ltd.出版，1994(ISBN0-632-02182-9)；以及 Robert A. Meyers(主編)，Molecular Biology and Biotechnology :a Comprehensive Desk Reference, VCH Publishers, Inc.出版， 1995(ISBN 1-56081-569-8)。單數(shù)術(shù)語包括復(fù)數(shù)的對象，除非上下文另有明確規(guī)定。同樣，詞語“或”意指包括 “和”，除非上下文另有明確規(guī)定。術(shù)語“多種(個(gè))”是指兩種(個(gè))或更多種(個(gè))。還要進(jìn)一步理解的是，對于核酸或多肽，給出的所有堿基大小或氨基酸大小和所有分子量或分子質(zhì)量值是近似值，為了描述給出。另外，給出的有關(guān)物質(zhì)(例如抗原)的濃度或水平的數(shù)值限制意指近似值。因此，如果指明濃度為至少(例如)200pg，則是指此濃度應(yīng)理解為至少大約(或“約”或“ ”)200pg。雖然類似于或等同于本文所述方法和材料的方法和材料可用于實(shí)施或檢驗(yàn)本說明書，但下面描述了合適的方法和材料。術(shù)語“包含”是指“包括”。因此，除非上下文另有要求，否則詞語“包含”和各種變化應(yīng)理解為表示含有規(guī)定的化合物或組合物(例如核酸、 多肽、抗原)或步驟，或一類化合物或一系列步驟，而非排除任何其它的化合物、組合物、步驟或化合物類、組合物類、系列步驟?？s寫詞“e.g. ”源于拉丁文exempli gratia，本文用來表示非限制性實(shí)例。因此，縮寫詞“e.g. ”是術(shù)語“例如”的同義詞。縮寫“HPV”的術(shù)語“人乳頭狀瘤病毒”是指能夠感染人的乳頭狀瘤病毒屬 (Papillomavirus)的成員。有兩大類的HPV(生殖器類和皮膚類)，其每一類都含有按遺傳相似性分類的多個(gè)病毒“型”或“株”(例如HPV16、HPV 18,HPV 33,HPV 58等)。在本說明書的情況下，術(shù)語“型，，可用來命名HPV和/或指定HPV型的多肽。在以術(shù)語“非”作為開頭時(shí)，命名的HPV或多肽是所提及的HPV或多肽以外的至少一種其它或另外的HPV型。例如，“HPV 18型Ll多肽”是指HPV 18型的Ll多肽。相比之下，“非HPV 18型Ll多肽”是指HPV 18型以外的任何型的Ll多肽。術(shù)語“多肽”是指其中單體是通過酰胺鍵連接在一起的氨基酸殘基的聚合物。本文使用的術(shù)語“多肽”或“蛋白質(zhì)”意指包括任何氨基酸序列并包括修飾序列(例如糖蛋白)。 術(shù)語“多肽”具體是指涵蓋天然存在的蛋白質(zhì)以及重組或合成產(chǎn)生的蛋白質(zhì)。提及多肽時(shí)， 術(shù)語“片段”是指多肽的部分(即亞序列)。術(shù)語“免疫原性片段”是指保留全長參比蛋白質(zhì)或多肽的至少一個(gè)主要免疫原性表位的所有多肽片段。多肽內(nèi)的方向一般以N端至C端方向列舉，由各個(gè)氨基酸的氨基和羧基部分的方向確定。多肽從N端或氨基端向C端或羧基端解讀。術(shù)語“多核苷酸”和“核酸序列”是指核苷酸長度至少為10個(gè)堿基的聚合形式。核苷酸可以是核糖核苷酸、脫氧核糖核苷酸或之一的修飾形式。該術(shù)語包括DNA的單鏈和雙鏈形式。所謂“分離的多核苷酸”是指不與從中得到該多核苷酸的生物的天然存在的基因組中兩個(gè)與之直接鄰接的編碼序列(一個(gè)位于5'端，一個(gè)位于3'端)直接鄰接的多核苷酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，多核苷酸編碼多肽。通過參照各個(gè)核苷酸單位的連接性定義核酸的5'和3'方向，并根據(jù)脫氧核糖(或核糖)糖環(huán)的碳位置命名。以5' -3'方向讀取多核苷酸序列的信息(編碼)內(nèi)容。對于核酸、多肽或其它細(xì)胞組分，術(shù)語“異源”表示該組分存在于非在自然界中正常存在之處和/或它來源于不同的來源或物種。術(shù)語“天然”和“天然存在的”是指在與其天然狀態(tài)相同的狀態(tài)下存在的成分，例如蛋白質(zhì)、多肽或核酸。也就是未經(jīng)人工修飾的成分。應(yīng)當(dāng)理解的是，在本說明書的情況下，有許多天然/天然存在的HPV型(和HPV蛋白和多肽)，例如得自不同的天然存在的HPV型。在提及核酸或多肽(例如HPV Ll或L2核酸或多肽)時(shí)，“變體”是不同于參比核酸或多肽的核酸或多肽。通常，變體和參比核酸或參比多肽之間的差異構(gòu)成與參比物相比按比例為少量的差異。變體核酸可因一個(gè)或多個(gè)核苷酸的添加、缺失或取代，或者因人工核苷酸類似物的取代而不同于與其進(jìn)行比較的參比核酸。同樣，變體多肽可因一個(gè)或多個(gè)氨基酸的添加、缺失或取代，或者因氨基酸類似物的取代而不同于與其進(jìn)行比較的參比多肽?！翱乖笔强梢源碳?dòng)物產(chǎn)生抗體和/或T細(xì)胞應(yīng)答的化合物、組合物或物質(zhì)，包括被注射、吸收或以其它方式引入動(dòng)物中的組合物。術(shù)語“抗原”包括所有相關(guān)的抗原表位。 術(shù)語“表位”或“抗原決定簇”是指B細(xì)胞和/或T細(xì)胞對之產(chǎn)生應(yīng)答的抗原上的位點(diǎn)?！皟?yōu)勢抗原表位”或“優(yōu)勢表位”是對其產(chǎn)生功能上重要的宿主免疫應(yīng)答(例如抗體應(yīng)答或T細(xì)胞應(yīng)答)的表位。因此，對于針對病原體的保護(hù)性免疫應(yīng)答，優(yōu)勢抗原表位是當(dāng)被宿主免疫系統(tǒng)識(shí)別時(shí)產(chǎn)生免遭由該病原體引起的疾病的保護(hù)的抗原部分。術(shù)語“T細(xì)胞表位”是指當(dāng)與合適的MHC分子結(jié)合時(shí)被T細(xì)胞(通過T細(xì)胞受體)特異性結(jié)合的表位。“B細(xì)胞表位” 是被抗體(或B細(xì)胞受體分子)特異性結(jié)合的表位。“免疫應(yīng)答”是免疫系統(tǒng)的細(xì)胞(例如B細(xì)胞、T細(xì)胞或單核細(xì)胞)對刺激的應(yīng)答。 免疫應(yīng)答可以是B細(xì)胞應(yīng)答，其導(dǎo)致特異性抗體(例如抗原特異性中和抗體)的產(chǎn)生。免疫應(yīng)答也可以是T細(xì)胞應(yīng)答，例如CD4+應(yīng)答或CD8+應(yīng)答。在某些情況下，應(yīng)答對特定抗原有特異性(即“抗原特異性應(yīng)答”)。如果抗原來源于病原體，則抗原特異性應(yīng)答是“病原體特異性應(yīng)答”?！氨Ｗo(hù)性免疫應(yīng)答”是抑制病原體的有害功能或活性、降低病原體的感染或減少因病原體感染產(chǎn)生的癥狀(包括死亡)的免疫應(yīng)答?？赏ㄟ^例如在噬斑減少測定或 ELISA中和測定中抑制病毒復(fù)制或噬斑形成，或者體內(nèi)測定抗病原體攻擊的抗性，來測定保護(hù)性免疫應(yīng)答?！白魟笔且苑翘禺愋苑绞皆鰪?qiáng)免疫應(yīng)答產(chǎn)生的物質(zhì)。常見佐劑包括抗原吸附在其上的無機(jī)物(明礬、氫氧化鋁、磷酸鋁)的懸浮液；乳液，包括油包水和水包油乳液(及其變化，包括復(fù)合乳液和可逆乳液)、脂糖(liposaccharide)、脂多糖、免疫刺激性核酸(例如 CpG寡核苷酸)、脂質(zhì)體、Toll樣受體激動(dòng)劑(特別是TLR2、TLR4、TLR7/8和TLR9激動(dòng)劑) 和這類組分的各種組合?！懊庖咴越M合物”是適于給予人或動(dòng)物受試者(例如在實(shí)驗(yàn)情況下)的能夠誘導(dǎo)例如針對病原體(例如人乳頭狀瘤病毒)的特異性免疫應(yīng)答的物質(zhì)的組合物。因此，免疫原性組合物包含一種或多種抗原(例如病毒的抗原亞基，例如其多肽)或抗原表位。免疫原性組合物還可包含一種或多種能夠誘導(dǎo)或提高免疫應(yīng)答的其它組分，例如賦形劑、載體和/ 或佐劑。在某些情況下，給予免疫原性組合物誘導(dǎo)防止受試者免遭由病原體引起的癥狀或病況的免疫應(yīng)答。在某些情況下，在受試者暴露于病原體后，通過抑制病原體(例如人乳頭狀瘤病毒)的復(fù)制來預(yù)防(或治療，例如減輕或改善)由病原體引起的癥狀或疾病。例如， 在本說明書的情況下，旨在給予受試者或受試者群以誘導(dǎo)針對人乳頭狀瘤病毒的保護(hù)性或治標(biāo)性免疫應(yīng)答的某些實(shí)施方案的免疫原性組合物是疫苗組合物或疫苗。
嵌合L1/L2多肽本發(fā)明涉及多肽，所述多肽可配制成疫苗組合物，并且滿足對提供針對HPV感染和/或疾病的保護(hù)且不同于現(xiàn)有市售疫苗的安全有效的疫苗組合物的需要。具體而言，本發(fā)明涉及嵌合多肽，所述嵌合多肽包含其中插入至少一個(gè)肽的HPV Ll多肽，所述至少一個(gè)肽包含HPV L2多肽的抗原表位。本文公開的HPV Ll和L2多肽可來自HPV的任何基因型，特別包括高危的引起癌癥的 HPV 型 HPV 16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68 或 73 和引起生殖器疣的 HPV型(例如HPV 6或11)及引起皮膚疣的型，例如HPV5型和HPV8型，甚至與普通疣有關(guān)的2型和3型，以及與良性皮膚疣有關(guān)的HPV76。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供人乳頭狀瘤病毒(HPV)LllS型多肽或其片段，其包含至少一個(gè)插入HPV Ll多肽內(nèi)的包含L2多肽的表位的肽。L2多肽的表位是這樣的肽，即在適當(dāng)提供時(shí)，其能夠誘導(dǎo)可識(shí)別人乳頭狀瘤病毒(例如天然存在的人乳頭狀瘤病毒)的天然(例如全長)L2多肽的免疫應(yīng)答。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供人乳頭狀瘤病毒(HPV)Ll 16型多肽或其片段，其包含至少一個(gè)包含HPV L2多肽的氨基酸56-75的肽。Ll多肽可以是全長Ll多肽。在某些實(shí)施方案中，Ll多肽是Ll的片段，例如通過缺失N端或C端的一個(gè)或多個(gè)氨基酸而截短的片段。因此，在某些實(shí)施方案中，Ll多肽是與天然蛋白質(zhì)(即自然界存在的蛋白質(zhì))相比，從其一端或兩端除去一個(gè)或多個(gè)氨基酸的截短物。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，Ll多肽具有C端缺失。圖Ia中給出示例性的Ll HPV 16序列。圖Ib中給出示例性的Ll HPV 18序列。截短的Ll蛋白也許能夠自組裝成例如殼?；騐LP。在電子顯微鏡下，病毒樣顆粒通常類似于HPV病毒。病毒樣顆粒通常由72個(gè)殼粒組成，而殼粒由呈五聚體單位的5個(gè)Ll 多肽組成。本文使用的至少一種Ll蛋白適宜包含截短的Ll蛋白，如果多種HPV VLP、嵌合多肽或殼粒存在，則組合物中適宜全部Ll蛋白是截短的Ll蛋白。截短適宜除去核定位信號(hào)。截短適宜為C端截短。C端截短適宜除去少于50個(gè)氨基酸，例如少于40個(gè)氨基酸。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，C端截短除去HPV 16的34個(gè)氨基酸和HPV 18的35個(gè)氨基酸。本文使用的截短Ll蛋白適宜為功能性Ll蛋白衍生物或變體。功能性Ll蛋白衍生物或變體能夠引起免疫應(yīng)答(任選在適當(dāng)加入佐劑時(shí))，所述免疫應(yīng)答能夠識(shí)別包含全長Ll蛋白和/或從中得到Ll蛋白的HPV型的病毒(或由全長Ll蛋白和/或從中得到Ll 蛋白的HPV型組成的VLP)。本文公開的嵌合HPV Ll多肽中的L2肽的位置很重要。在本文公開的任何實(shí)施方案中，L2肽可位于Ll蛋白的暴露環(huán)之一或C端侵入臂上。當(dāng)Ll呈殼粒或病毒樣顆粒形式時(shí)，存在環(huán)和侵入臂(Chen等2000 Mol Cell 5， 557-567)。在本文公開的任何實(shí)施方案中，L2肽可位于選自其中位置與圖1所示HPV 16和 HPV 18 Ll參比序列有關(guān)的下列Ll序列區(qū)域的位置上，或者位于另一HPV Ll序列的等同位
置上⑴氨基酸5O-6I中的BC環(huán)(ii)氨基酸132-142(例如氨基酸132-141，特別是氨基酸137-13 中的DE環(huán)
(iii)氨基酸 172-182(例如 176-182，特別是 176-179)中的 EF 環(huán)(iv)氨基酸 271490(例如 272-275，特別是 272-273)中的 TO 環(huán)(ν)氨基酸 345-359(例如 347-350，特別是 349-350)中的 HI 環(huán)(vi)氨基酸 429-445 (例如 HPV 16 的 423-440，特別是 423_424、431_433 或 437-438 和 HPV 18 的 424-425、432-433 或 439-440)中的 C 端臂。在本文公開的任何實(shí)施方案中，可將HPV L2肽插入Ll序列而又不除去Ll氨基酸。 或者可將L2肽插入Ll序列同時(shí)在插入位置除去Ll序列的一個(gè)或多個(gè)氨基酸，例如可以在插入 L2 肽的位置除去 Ll 序列的 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或 20個(gè)氨基酸。因此，L2肽可取代Ll序列的一個(gè)或多個(gè)氨基酸，例如L2肽可將相等長度的 Ll序列置換成L2肽序列。如果嵌合L1/L2多肽中存在兩個(gè)或更多個(gè)L2肽，則它們可以是相同HPV型的不同 L2肽，或者它們可以是不同HPV型的肽，在這種情況下，它們可來自不同HPV型的相應(yīng)區(qū)域。在一個(gè)實(shí)施方案中，將L2肽插入允許裝配嵌合多肽的超分子裝配體的位點(diǎn)，例如在多肽顆粒中，例如殼?；虿《緲宇w粒(VLP)或小的非VLP樣結(jié)構(gòu)。例如，為了保持VLP 結(jié)構(gòu)，將L2肽在這樣的位點(diǎn)插入Ll多肽中，即不干擾參與形成參與維持殼粒間相互作用并由此維持VLP構(gòu)象的二硫橋的位點(diǎn)?？赏ㄟ^電子顯微鏡術(shù)評價(jià)這類超分子結(jié)構(gòu)，例如參見 Sadeyen 等，2003， Virology 309，32-40 ;Slupetzky 等，2007 Vaccine 25，2001-2010； Varsani 等，2003，J of Virology 77,8386-8393 ;Chen等，2000，Deschuyteneer M等，2010， Human Vaccines6 :5，407-419。通常，與天然VLP (即其中Ll蛋白是全長或截短的，但不含 L2肽的VLP)相比，嵌合VLP具有相似或相同的大小。嵌合VLP的直徑可為50nm的范圍。 在備選實(shí)施方案中，形成直徑20-35nm的小的非VLP結(jié)構(gòu)。插入L2肽的位點(diǎn)可允許待維持的構(gòu)象依賴性中和表位的存在?？赏ㄟ^使用以下單克隆抗體來檢測中和表位如HPV 16的V5、H16、E70和U4 (Christensen等，2001 ；Carter 等，2003，2006 ；Day等，2007)和HPV 16的J4 (Combita等，2002)。其它中和表位是本領(lǐng)域已知的，并且同樣可使用單克隆抗體來鑒定其存在與否。然而，維持Ll多肽上的所有Ll中和表位可能不是必需的，例如，尤其在本文所述的還含有非嵌合Ll VLP的組合物中。用于插入L2肽的合適位點(diǎn)將L2肽暴露在Ll多肽的表面，特別是當(dāng)作為VLP提供時(shí)，例如表1所示位點(diǎn)。表1和表2表示可提供合適的L2肽插入位點(diǎn)的HPV Ll暴露區(qū)(Carter等，2003 ； Bishop等，2007 ;Chen等，2000)和這些區(qū)內(nèi)的超變區(qū)。適宜將L2肽插入C端侵入臂中，或者插入DE環(huán)或TO環(huán)或HI環(huán)中。適宜將L2肽插入環(huán)或C端臂的超變區(qū)中。表1所示各區(qū)為HPV 16的各區(qū)；可在其它HPV型的Ll中鑒定類似區(qū)，表2中給出了 HPV 18 L2的類似區(qū)。表IHPV 16 的 HPV Ll 暴露環(huán)
權(quán)利要求
1.一種人乳頭狀瘤病毒(HPV) 18型Ll多肽或其片段，其包含至少一個(gè)插入HPV Ll多肽內(nèi)的包含L2多肽的表位的肽。
2.權(quán)利要求1的多肽，其中所述L2多肽的肽是非HPV18型肽。
3.權(quán)利要求1或2的多肽，其中所述多肽能夠誘導(dǎo)對包含L2多肽的天然蛋白質(zhì)的免疫應(yīng)答。
4.權(quán)利要求3的多肽，其中所述多肽能夠誘導(dǎo)對至少一種其它天然L2蛋白的免疫應(yīng)答。
5.權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的多肽，其中所述HPVLl蛋白包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸的C端缺失。
6.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的多肽，其中將至少一個(gè)L2肽插入Ll多肽的暴露區(qū)內(nèi)。
7.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的多肽，其中將至少一個(gè)L2肽插入Ll蛋白的DE環(huán)內(nèi)。
8.權(quán)利要求7的多肽，其中將至少一個(gè)L2肽插入氨基酸132-142之間。
9.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的多肽，其中將至少一個(gè)L2肽插入Ll蛋白的TO環(huán)。
10.權(quán)利要求9的多肽，其中將至少一個(gè)L2肽插入氨基酸172-182之間。
11.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的多肽，其中將至少一個(gè)L2肽插入Ll蛋白的HI環(huán)中。
12.權(quán)利要求11的多肽，其中將至少一個(gè)L2肽插入氨基酸345-359之間。
13.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的多肽，其中將至少一個(gè)L2肽插入Ll多肽的C端內(nèi)。
14.權(quán)利要求13的多肽，其中將至少一個(gè)L2肽插入氨基酸4 和445之間。
15.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的多肽，其包含兩個(gè)或更多個(gè)插入Ll多肽內(nèi)的L2肽。
16.權(quán)利要求15的多肽，其中將兩個(gè)或更多個(gè)L2肽插入不同位點(diǎn)。
17.權(quán)利要求16的多肽，其中將第一L2肽插入DE環(huán)，將第二 L2肽插入Ll多肽的C端。
18.權(quán)利要求15-17中任一項(xiàng)的多肽，其中所述兩個(gè)或更多個(gè)L2肽不同。
19.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的多肽，其中至少一個(gè)L2肽包含天然L2多肽的至少8個(gè)連續(xù)氨基酸。
20.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的多肽，其中至少一個(gè)L2肽選自HPVL2多肽N端的氨基酸 1-200。
21.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的多肽，其中至少一個(gè)L2肽選自HPVL2多肽N端的氨基酸 1-150。
22.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的多肽，其中至少一個(gè)L2肽選自 包含HPV L2多肽的氨基酸殘基17-36的肽；包含HPV L2多肽的氨基酸殘基56-75的肽； 包含HPV L2多肽的氨基酸殘基96-115的肽；和包含HPV L2多肽的氨基酸殘基108-120的肽。
23.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的多肽，其中至少一個(gè)L2肽由HPV33型L2的氨基酸17-36 組成。
24.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的多肽，其中至少一個(gè)L2肽由HPV58型L2的氨基酸56-75 組成。
25.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的多肽，其中至少一個(gè)L2肽包含由SEQID N0:l_31表示的氨基酸序列。
26.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的多肽，其中與天然L2多肽相比，至少一個(gè)L2肽包含至少一個(gè)氨基酸插入、缺失和/或取代。
27.權(quán)利要求沈的多肽，其中與天然L2多肽相比，至少一個(gè)L2肽包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸的插入。
28.權(quán)利要求沈的多肽，其中與天然L2多肽相比，至少一個(gè)L2肽包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸的缺失。
29.權(quán)利要求沈的多肽，其中與天然L2多肽相比，至少一個(gè)L2肽包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸的取代。
30.權(quán)利要求沈-29中任一項(xiàng)的多肽，其中至少一個(gè)氨基酸插入、缺失或取代除去兩個(gè)半胱氨酸之間的二硫鍵或除去能夠形成二硫鍵的兩個(gè)半胱氨酸之間的氨基酸。
31.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的多肽，其中至少一個(gè)L2肽包含兩個(gè)或更多個(gè)L2肽。
32.權(quán)利要求31的多肽，其中兩個(gè)或更多個(gè)L2肽是鄰接的。
33.權(quán)利要求31的多肽，其中兩個(gè)或更多個(gè)L2肽通過至少一個(gè)其它氨基酸連接。
34.權(quán)利要求33的多肽，其中兩個(gè)或更多個(gè)L2肽通過包含多個(gè)氨基酸的間隔基連接。
35.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的多肽，其中所述L2肽包含至少8個(gè)連續(xù)氨基酸，所述至少 8個(gè)連續(xù)氨基酸包含與至少兩種HPV型的L2多肽相同的序列。
36.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的多肽，其中將至少一個(gè)L2肽插入Ll多肽內(nèi)而又不缺失 L2多肽的氨基酸。
37.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的多肽，其中將至少L2肽插入Ll多肽內(nèi)同時(shí)又缺失L2多肽的一個(gè)或多個(gè)氨基酸。
38.一種多肽，其包含序列ID No. 32-45中任一個(gè)表示的氨基酸序列。
39.一種人乳頭狀瘤病毒(HPV)Ll 16型多肽或其片段，其含有插入HPV Ll多肽內(nèi)的包含HPV L2多肽的氨基酸56-75的肽。
40.權(quán)利要求39的多肽，其中所述包含HPVL2多肽的氨基酸56-75的肽選自致癌HPV型。
41.權(quán)利要求39或40的多肽，其中將包含HPV58型L2多肽的氨基酸56-75的肽插入 HPV Ll多肽內(nèi)。
42.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的多肽，其中與天然L2多肽序列相比，所述至少一個(gè)L2肽包含至少一個(gè)氨基酸插入、缺失或取代。
43.權(quán)利要求42的多肽，其中與天然L2多肽序列相比，所述至少一個(gè)L2肽包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸的插入。
44.權(quán)利要求42的多肽，其中與天然L2多肽序列相比，所述至少一個(gè)L2肽包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸的缺失。
45.權(quán)利要求42的多肽，其中與天然L2多肽序列相比，所述至少一個(gè)L2肽包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸的取代。
46.權(quán)利要求42-45中任一項(xiàng)的多肽，其中至少一個(gè)氨基酸插入、缺失或取代除去兩個(gè)半胱氨酸之間的二硫鍵或除去能夠形成二硫鍵的兩個(gè)半胱氨酸之間的氨基酸。
47.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的多肽，其中至少一個(gè)L2肽包含兩個(gè)或更多個(gè)L2肽。
48.權(quán)利要求47的多肽，其中兩個(gè)或更多個(gè)L2肽是鄰接的。
49.權(quán)利要求47的多肽，其中兩個(gè)或更多個(gè)L2肽通過至少一個(gè)其它氨基酸連接。
50.權(quán)利要求49的多肽，其中兩個(gè)或更多個(gè)L2肽通過包含多個(gè)氨基酸的間隔基連接。
51.權(quán)利要求42-50中任一項(xiàng)的多肽，其中包含至少一個(gè)含有至少一個(gè)氨基酸插入、缺失或取代的L2肽的多肽能夠誘導(dǎo)對包含L2多肽的天然蛋白質(zhì)的免疫應(yīng)答。
52.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的多肽，其中L2肽包含至少8個(gè)連續(xù)氨基酸，所述至少8個(gè)連續(xù)氨基酸是與至少兩種HPV型的L2多肽相同的序列。
53.一種殼粒，其包含權(quán)利要求1-52中任一項(xiàng)的多肽。
54.一種病毒樣顆粒(VLP)，其包含權(quán)利要求1-52中任一項(xiàng)的多肽。
55.一種免疫原性組合物，其包含權(quán)利要求I-M中任一項(xiàng)的蛋白質(zhì)、殼粒或VLP和藥學(xué)上可接受的賦形劑、稀釋劑或載體。
56.權(quán)利要求55的免疫原性組合物，其還包含佐劑。
57.權(quán)利要求56的免疫原性組合物，其中所述佐劑包含鋁鹽。
58.權(quán)利要求57的免疫原性組合物，其中所述鋁鹽是氫氧化鋁。
59.權(quán)利要求57或58的免疫原性組合物，其還包含3D-MPL。
60.一種核酸分子，其編碼權(quán)利要求0-52中任一項(xiàng)的多肽。
61.一種表達(dá)載體，其包含權(quán)利要求59的核酸。
62.權(quán)利要求61的表達(dá)載體，其中所述表達(dá)載體是重組桿狀病毒。
63.一種用權(quán)利要求59的核酸或權(quán)利要求61的載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
64.用于藥物的權(quán)利要求1-52中任一項(xiàng)的多肽。
65.一種用于產(chǎn)生權(quán)利要求1-52中任一項(xiàng)的多肽的方法，所述方法包括將權(quán)利要求61 或62的表達(dá)載體導(dǎo)入細(xì)胞，并在產(chǎn)生多肽的條件下使細(xì)胞復(fù)制。
66.一種組合物，其包含(i)至少一種包含人乳頭狀瘤病毒(HPV)Ll多肽或其片段的病毒樣顆粒(VLP)；和( )至少一種包含人乳頭狀瘤病毒(HPV)Ll多肽或其片段的嵌合多肽，所述嵌合多肽包含至少一個(gè)插入HPV Ll多肽內(nèi)的包含L2多肽的表位的肽。
67.權(quán)利要求66的組合物，其中(i)的VLP由Ll多肽或其片段組成。
68.權(quán)利要求66或67的組合物，其中(ii)的至少一種嵌合多肽是權(quán)利要求1-52中任一項(xiàng)的多肽、權(quán)利要求53的殼?；驒?quán)利要求M的VLP。
69.權(quán)利要求66-68中任一項(xiàng)的組合物，其中(i)中的HPVVLP包含HPV 16 Ll VLP和 / 或 HPV 18 Ll VLP。
70.權(quán)利要求66-69中任一項(xiàng)的組合物，其中(ii)的至少一種嵌合多肽包含HPV16 Ll 多肽或其片段和/或HPV 18 Ll多肽或其片段。
71.權(quán)利要求66-70中任一項(xiàng)的組合物，其中(ii)的至少一種嵌合多肽由HPV16 Ll 多肽或其片段、HPV 18 Ll多肽或其片段或者HPV16 Ll多肽或其片段和HPV 18 Ll多肽或其片段兩者組成。
72.權(quán)利要求66-71中任一項(xiàng)的組合物，其中(ii)的至少一種嵌合多肽包含Ll多肽的一個(gè)或多個(gè)氨基酸的C端缺失。
73.權(quán)利要求66-72中任一項(xiàng)的組合物，其中(i)中的VLP包含HPV16 Ll VLP和HPV-18 Ll VLP兩者，且其中(ii)的嵌合多肽包含至少一種包含HPV 16 Ll多肽的嵌合多肽和至少一種包含HPV 18 Ll多肽的嵌合多肽。
74.權(quán)利要求73的組合物，其中包含HPV16 Ll多肽的嵌合多肽和包含HPV 18多肽的嵌合多肽包含不同的L2肽。
75.—種包含兩種或更多種包含人乳頭狀瘤病毒(HPV)Ll多肽或其片段的嵌合多肽的組合的組合物，所述嵌合多肽包含至少一個(gè)插入HPV Ll多肽內(nèi)的包含L2多肽的表位的肽。
76.權(quán)利要求75的組合物，其中所述嵌合多肽是權(quán)利要求1-52中任一項(xiàng)的嵌合多肽。
77.權(quán)利要求75-76的組合物，其中所述嵌合多肽包含相同HPV型的Ll多肽，而L2肽不同。
78.權(quán)利要求66-77中任一項(xiàng)的組合物，其中各VLP和/或嵌合多肽存在的量為 10-50 μ g/人劑量。
79.權(quán)利要求78的組合物，其中各VLP和/或嵌合多肽存在的量為約20μ g。
80.權(quán)利要求66-79中任一項(xiàng)的免疫原性組合物，其還包含藥學(xué)上可接受的賦形劑、稀釋劑或載體。
81.權(quán)利要求80的免疫原性組合物，其還包含佐劑。
82.權(quán)利要求81的免疫原性組合物，其中所述佐劑包含鋁鹽。
83.權(quán)利要求82的免疫原性組合物，其中所述鋁鹽是氫氧化鋁。
84.權(quán)利要求82或83的免疫原性組合物，其還包含3D-MPL。
85.一種用于制備免疫原性組合物的方法，所述方法包括將以下成分混合以產(chǎn)生權(quán)利要求80-84中任一項(xiàng)的免疫原性組合物(i)至少一種人乳頭狀瘤病毒(HPV)Ll病毒樣顆粒(VLP)，與 ( )至少一種包含人乳頭狀瘤病毒(HPV)Ll多肽或其片段的嵌合多肽，其包含至少一個(gè)插入HPV Ll多肽內(nèi)的包含L2多肽的表位的肽，和(iii)藥學(xué)上可接受的稀釋劑或載體，和任選(iv)佐劑。
86.一種誘導(dǎo)人的抗HPV抗體的方法，所述方法包括將權(quán)利要求55-59或66-84中任一項(xiàng)的免疫原性組合物給予人。
87.權(quán)利要求86的方法，其中針對HPV誘導(dǎo)抗體預(yù)防、改善或治療HPV感染或疾病。
88.權(quán)利要求55-59或66-84中任一項(xiàng)的組合物，其用于預(yù)防、改善或治療HPV感染或疾病。
全文摘要
本說明書提供新的人乳頭狀瘤病毒(HPV)蛋白構(gòu)建體及其在預(yù)防HPV疾病中的用途。所述構(gòu)建體是包含L1蛋白的嵌合蛋白，其中HPVL2肽插入L1蛋白中?？蓪⑦@類嵌合蛋白質(zhì)配制成免疫原性例如疫苗組合物，任選與基于HPV L1 VLP的疫苗一起配制。
文檔編號(hào)C07K14/025GK102497880SQ201080038624
公開日2012年6月13日 申請日期2010年6月24日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月25日
發(fā)明者B·D·A·科勞, G·J·M·F·P·鮑多瓦, N·P·F·勒克雷尼耶, N·登杜加, S·吉安尼尼 申請人:葛蘭素史密絲克萊恩生物有限公司