專利名稱：一種預(yù)防和治療人乳頭瘤病毒感染類疾病的化合物及其篩選方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及治療和預(yù)防人乳頭瘤病毒感染和子宮頸癌相關(guān)的領(lǐng)域，尤其在設(shè)計和 使用的El解旋酶抑制劑，以預(yù)防或治療HPV相關(guān)宮頸癌和其他疾病。
背景技術(shù)：
子宮頸癌(Cervical Cancer)是世界范圍內(nèi)僅次于乳腺癌的威脅婦女生命健康的 第二號殺手(國際衛(wèi)生組織資料)，每年造成約超過30萬成年女性因患子宮頸癌而死亡。 目前已證實導(dǎo)致宮頸癌的病因是人乳頭瘤病毒(Human Papillomavirus，簡稱HPV)的DNA 致癌病毒的侵染所致。該病毒主要通過兩性接觸傳染，專性侵染人體上皮細胞特別是生殖 器官，部分病毒攜帶者在反復(fù)感染后表現(xiàn)出多種臨床癥狀。女性受高危險型(HPV16、HPV18 等)病毒感染后，小部分患者由最初的宮頸細胞學(xué)異常，發(fā)展成I-III的宮頸內(nèi)皮細胞瘤樣 變(CINI-III)和浸潤性宮頸癌變(ICC)，最終發(fā)展成致命的子宮頸癌。HPV病毒在長期的進化中形成了上百種變異類型，其中HPV16、HPV18等13種高危 險類型，已被確認能夠?qū)е聦m頸癌癥。部分低危險型(HPV6、HPVll等)病毒感染可導(dǎo)致男 女兩性生殖器官部位的尖銳濕疣。HPV除了直接導(dǎo)致宮頸癌，新的研究質(zhì)料也提供了證據(jù)， HPV的感染很可能和支氣管肺癌、直腸癌、口腔癌和皮膚癌等癌癥有這緊密的關(guān)系。根據(jù)國 際衛(wèi)生組織WHO的有關(guān)資料，除了導(dǎo)致宮頸癌，HPV感染還可能和60 %的皮膚癌，60 %的食 管癌，50%的肺癌、50%的乳腺癌、25%的口腔癌等人類重大癌癥的發(fā)病相關(guān)。目前國內(nèi)外還沒有任何有效的預(yù)防和治療人乳頭瘤病毒的化合物，主要是由于很 難通過常規(guī)的手段(如普遍撒網(wǎng)的大通量篩選等)找到針對該病毒的具有特異性高的抑制 劑化合物。而由于我們對人乳頭瘤病侵染毒繁殖所必須的解旋酶的分子結(jié)構(gòu)和分子機理的 掌握和了解，我們可以通過對分子結(jié)構(gòu)進行計算機的模擬和分析，并通過以結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)的 分子對接用計算機對大分子庫進行有效的篩選，從而能從幾十萬到上百萬的分子庫中很快 的選出能結(jié)合目標蛋白的少數(shù)的化合物，從而通過試驗篩選很快驗證和確定具有對目標蛋 白有高特異性的抑制功能的化合物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)中的上述缺陷，提出一種方便、省時、高效的預(yù)防和 治療人乳頭瘤病毒感染類疾病的化合物的篩選方法，并提供了通過上述篩選方法篩選出來 的特異性高、針對性強的預(yù)防和治療人乳頭瘤病毒感染類疾病的化合物，由其指出了其在 預(yù)防和治療HPV感染、子宮頸癌及尖銳濕疣等疾病上的應(yīng)用。實現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案如下—種預(yù)防和治療人乳頭瘤病毒感染類疾病的化合物的篩選方法，采用結(jié)構(gòu)計算機 輔助藥物設(shè)計方法，以人乳頭瘤病毒El解旋酶結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)進行篩選，得到能抑制El的候選 化合物。
進一步地，所述的以人乳頭瘤病毒El解旋酶結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)包括(a) 一個由原子坐標確定下來的El蛋白分子結(jié)構(gòu)和由El形成的六聚體的結(jié)構(gòu)；(b) 一個由原子坐標確定下來的El蛋白分子與ATP或ADP相結(jié)合的復(fù)合體結(jié)構(gòu)；(c) 一個El蛋白單獨的結(jié)構(gòu)或與一個化合物或多肽結(jié)合的復(fù)合體結(jié)構(gòu)。進一步地，上述篩選方法還包括El解旋酶功能檢測，所述El解旋酶功能檢測方法 采用電泳遷移率試驗。本發(fā)明還提供了利用上述篩選方法得到的預(yù)防和治療人乳頭瘤病毒感染類疾病 的化合物，所述化合物為曲伐沙星及其衍生物、加替沙星及其衍生物。進一步地，本發(fā)明所述的人乳頭瘤病毒感染類疾病包括子宮頸癌或尖銳濕疣。即本發(fā)明主要是使用乳頭瘤病毒El解旋酶的三維分子結(jié)構(gòu)，來設(shè)計和篩選特異 對El抑制劑，用于治療和預(yù)防HPV感染及相關(guān)的宮頸癌和尖銳濕疣藥物。本發(fā)明所述闡明 了一個通過結(jié)構(gòu)和計算分析設(shè)計，以及試驗篩選的方法來找到針對El分子靶點的有效抑 制化合物。這些化合物結(jié)合在El空間分子結(jié)構(gòu)的不同的點，用于破壞El自身的功能，阻斷 El與DNA，與三磷酸腺苷，以及與E2的相互作用，所有這些都是El對病毒基因組復(fù)制必不 可少的功能。本發(fā)明提供了對抑制El功能的抗HPV病毒分子藥物的設(shè)計，篩選，識別和檢 測的方法，同時還提供對這類抑制劑化合物在預(yù)防和治療病毒感染和癌癥(包括但不限于 在HPV和宮頸癌和尖銳濕疣上使用這些化合物)中的應(yīng)用。本發(fā)明主要是基于以下原理進行相關(guān)化合物篩選的HPV是DNA病毒，病毒的基因是DNA。病毒進入人體上皮細胞后，其DNA基因必須 在細胞內(nèi)復(fù)制，才能完成病毒的繁殖和侵染，而病毒DNA基因的復(fù)制必須要HPV病毒的解 旋酶，El蛋白，來打開病毒DNA雙鏈。同時，HPV El和HPV E2蛋白的結(jié)合和相互作用也對 病毒DNA的復(fù)制起動有著關(guān)鍵的作用，因而，HPV El和HPV E2也稱DNA復(fù)制啟動子。上述 HPV El蛋白的功能為ATP酶和DNA解旋酶；以六倍復(fù)合體的形式識別并結(jié)合在DNA復(fù)制的 病毒起源點；它是病毒DNA復(fù)制所必須要的。HPV E2蛋白的功能為病毒基因轉(zhuǎn)錄的主要 調(diào)節(jié)因子；以二聚物的形式與病毒轉(zhuǎn)錄引物結(jié)合；參與病毒DNA復(fù)制過程；與El相互作用 并使El補充到病毒復(fù)制起源點。人乳頭瘤病毒的復(fù)制，需要有幾個不同的生物活性環(huán)節(jié)，包括病毒DNA由病毒的 DNA解旋酶El把DNA雙鏈打開，并以此作為復(fù)制模板由細胞的酶聚合酶啟動DNA復(fù)制引物。 El解旋酶的突變或El酶的抑制化合物可導(dǎo)致病毒DNA復(fù)制失敗，阻斷病毒的復(fù)制，以達到 預(yù)防和抑制HPV病毒的侵染，從而預(yù)防和治療子宮頸癌的效果。人乳頭瘤病毒El解旋酶和人體細胞的解旋酶(稱MCM)幾乎沒有氨基酸序列的保 守性，MCM解旋酶是為人體細胞染色體的復(fù)制的酶。HPV El和MCM在立體結(jié)構(gòu)上有著根本 的不同(Brewster et al，PNAS，2008)。由于El的解旋酶對HPV病毒的復(fù)制是必不可少的， 而El和MCM解旋酶的序列和結(jié)構(gòu)都不同，這樣，El解旋酶提供了一個極好的特異性很高的 防病毒的藥物靶點。因為El是針對病毒的高特異性分子靶，針對El的藥物可以幫助降低 對人體細胞的毒性。由于解析出了 HPV El蛋白分子的晶體結(jié)構(gòu)，我們能夠通過分子結(jié)構(gòu)的分析和建立 分子結(jié)構(gòu)模型來設(shè)計和開發(fā)El酶的有效的抑制劑作為抗病毒和抗子宮癌的小分子藥物。 這些El酶的有效小分子抑制劑同時也可作為分子工具，用來進一步研究解旋酶的功能和調(diào)控機制。到目前為止，尚無任何有效的藥物來抑制人乳頭狀瘤HPV病毒的復(fù)制，侵染和繁 殖。針對人乳頭狀瘤病毒El的解旋酶的小分子藥物，是一種全新的抑制HPV病毒復(fù)制的有 效藥物。根據(jù)在此顯示的El和核苷酸(ATP和ADP)復(fù)合體的原子結(jié)構(gòu)模型，我們能夠通過 對結(jié)構(gòu)模型的詳細的計算分析，來幫助我們設(shè)計對El解旋酶的小分子抑制劑，以便達到對 El本身活性的抑制，或?qū)l與DNA或與E2或其它DNA復(fù)制蛋白的相互結(jié)合的抑制，從而能 有效地抑制HPV病毒的復(fù)制，可用于治療HPV感染以及相關(guān)的子宮頸癌和尖銳濕疣等疾病。下面對本發(fā)明中涉及的結(jié)構(gòu)計算機輔助藥物設(shè)計的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)-人乳頭瘤病毒El 解旋酶結(jié)構(gòu)作進一步的介紹本發(fā)明所指的人乳頭狀瘤病毒(HPV)El蛋白是指包含50個或更多氨基酸的El多 肽序列，或更長的El，包括全長El蛋白，El本身，或作為El融合蛋白。一個同源蛋白的蛋白質(zhì)，包括不是天然出現(xiàn)的蛋白質(zhì)，并且有一個或幾個氨基酸， 但不局限于一個或幾個氨基酸的不同或被刪除(例如，蛋白質(zhì)截斷的片段)，或被插入倒， 取代和/或衍生(如糖基化，磷酸化，乙酰化，豆蔻?；?，異戊二烯化等)。最好是一個具有 特定同源蛋白質(zhì)的氨基酸序列至少和一種天然蛋白質(zhì)有約30%的相似性。一個純化的蛋白質(zhì)，根據(jù)本發(fā)明，是一個已經(jīng)從它的天然環(huán)境(即已受人為操做 過程)，可以包括純化或部分純化的蛋白質(zhì)，基因工程產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，或是合成產(chǎn)生的蛋白 質(zhì)。因此，“純化”并不反映蛋白質(zhì)純化的何種程度。最好是一個純化的蛋白質(zhì)，尤其是其片 段，使用基因工程產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，或是合成產(chǎn)生的蛋白質(zhì)(如果是一個較小的蛋白質(zhì)肽)。 術(shù)語“片斷”是指蛋白質(zhì)的一部分。作為對人乳頭狀瘤病毒El的結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)分析的結(jié)果，這 個蛋白質(zhì)的各個部分的結(jié)構(gòu)和功能特性對計算機輔助藥物設(shè)計方法具有重要的價值。使用 的人乳頭狀瘤病毒El多肽蛋白部分片斷的結(jié)構(gòu)和功能來設(shè)計和篩選藥物的方法是本發(fā)明 的一部分。本發(fā)明所提到的人乳頭狀瘤病毒E 1解旋酶，包括人乳頭狀瘤病毒HPV類型6，11， 16，18，35，52，58和所有其他已知的HPV類型的El解旋酶蛋白，以其一級結(jié)構(gòu)(例如，序列) 和二級結(jié)構(gòu)，和三級結(jié)構(gòu)的相似。換言之，包括任何一種HPV病毒的El解旋酶以及具有相 似的結(jié)構(gòu)和功能的解旋酶。因此，人乳頭狀瘤病毒El的病毒解旋酶蛋白，通過舉例的方式， 可以包括純化，部分純化，重組，突變/修飾，合成蛋白質(zhì)多肽。本發(fā)明提供了 HPV El解旋酶與核苷酸復(fù)合物的三維結(jié)構(gòu)的原子坐標。本發(fā)明也 提供了根據(jù)這三維結(jié)構(gòu)信息來確定能抑制該El解旋酶的藥物結(jié)合部位，包括阻止六聚體 的形成，核苷酸的結(jié)合，及與HPV E2的相互作用。本發(fā)明還包括了特異針對El的解旋酶抑 制劑藥物的篩選實驗。本發(fā)明的一個體現(xiàn)，涉及到以結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)來鑒定抑制劑化合物，用于調(diào)節(jié)和抑制 乳頭狀瘤病毒El解旋酶在病毒復(fù)制中的作用。這種抑制化合物可以調(diào)節(jié)El蛋白結(jié)合核苷 酸或DNA的能力，或是與另一乳頭狀瘤病毒E2蛋白的結(jié)合能力。該方法是一個結(jié)構(gòu)計算機 輔助藥物設(shè)計方法為基礎(chǔ)，包括如下步驟(1)提供可以確定El三維結(jié)構(gòu)的原子坐標，包括 此處所述的El三維結(jié)構(gòu)的原子坐標；及(2)通過對三維結(jié)構(gòu)的分析計算機模擬來篩選出結(jié) 合在某一個特定結(jié)構(gòu)區(qū)域的抑制劑化合物。這里披露了合適的結(jié)構(gòu)和模式結(jié)構(gòu)可用以作對El的藥物設(shè)計。在結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)的藥物設(shè)計方法的首選的目標結(jié)構(gòu)，包括用任何建模方法產(chǎn)生的任何結(jié)構(gòu)模型，如通過結(jié)構(gòu) 分子置換和同源序列的模型建立。根據(jù)本發(fā)明，首選的藥物設(shè)計步驟從一個或多個化合物的數(shù)據(jù)庫通過計算機篩 選，根據(jù)El三維結(jié)構(gòu)來和化合物的數(shù)據(jù)庫進行匹配和對接。如果由本發(fā)明的方法篩選確定 合適的化合物后，可以直接合成和測試該化合物本對一個或多個人乳頭瘤El解旋酶的調(diào) 節(jié)和抑制作用，以及和El的結(jié)合的具體方式。本發(fā)明的以El結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)的藥物設(shè)計中的一個體現(xiàn)，是包括能根據(jù)El單體或六 聚體的結(jié)構(gòu)來確定能與之結(jié)合化合物，此化合物能結(jié)合的條件之一是和結(jié)合部位有互補的 形狀。這種方法在此被稱為“幾何方法”。在一個幾何方法中，內(nèi)部自由度(和相應(yīng)的分子 構(gòu)象空間的局部極小值)通過只考慮兩個，剛體(硬球)的幾何相互作用可以得到降低， 其中一個剛體含有一個“口袋”或“溝”的位點用于結(jié)合第二個剛體(及與之形狀上互補的 分子，如配體，或化合物)。這種幾何方法在Kuntz et al. , J. Mol. Biol. ,vol. 161, p. 269, 1982中也有描述。用這種幾何方法確定的化合物分子可以通過設(shè)計和修改，來以滿足這些 化合物在這個口袋或溝的結(jié)合位點具備化學(xué)互補性，形成如氫鍵，離子鍵，或范德華鍵等相 互作用。根據(jù)本發(fā)明，使用本發(fā)明的方法測試合適的入選的化合物可包括蛋白質(zhì)，多肽或 其他有機分子和無機分子。合適的有機分子包括有機小分子。肽是指小分子量的化合物經(jīng) 水解產(chǎn)生兩個或兩個以上氨基酸。多肽是指兩個或兩個以上肽。首選治療化合物的設(shè)計包 括“L”和/或“D”氨基酸組成的肽，有機小分子，或同質(zhì)或異質(zhì)聚合物，包括直鏈或有支鏈 聚合物。一個能結(jié)合El并能調(diào)制(調(diào)節(jié)，修改，上調(diào)，下調(diào))E1解旋酶的活性的候選化合 物可通過本發(fā)明以上討論的以結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)的篩選方法來確定。至于候選的化合物對El蛋 白靶點的實際結(jié)合能力可用在一些下面詳細討論的已知的技術(shù)來確定。一個“推定的化合 物”是一個未經(jīng)證實是否有調(diào)節(jié)抑制活性的化合物，至少對于這樣一個化合物對El的結(jié)合 能力和/或調(diào)節(jié)生物活性來說。因此，一個公認的化合物庫可使用這里討論的以結(jié)構(gòu)為基 礎(chǔ)的篩選鑒定方法，來篩選出可以結(jié)合并調(diào)節(jié)，甚至模仿其中的目標蛋白質(zhì)或位點的一個 或多個候選化合物。另外，一個能結(jié)合El的目標蛋白候選化合物也可以使用以上討論的結(jié) 構(gòu)為基礎(chǔ)的藥物設(shè)計來從頭設(shè)計。本發(fā)明用以測試這些篩選出的化合物的實際效果可以包括基于細胞的檢測和非 基于細胞的檢測。一個特別優(yōu)選的非細胞為基礎(chǔ)的檢測，是電泳遷移率試驗(EMSA)。更具 體地說，電泳遷移率試驗(EMSA)可以用來監(jiān)測雙鏈DNA是否在有ATP時被El成功的解旋。 可以利用這種技術(shù)來評估在候選化合物的存在和缺席的時候El解旋酶體外的功能變化。 這種方法對篩選El的解旋酶分子抑制劑非常有用。其他合適的檢測衡量候選化合物結(jié)合的蛋白質(zhì)的能力的方法，和/或衡量這 些化合物能夠影響蛋白質(zhì)結(jié)合其它蛋白或配體的方法包括，免疫印跡，酶聯(lián)免疫吸附法 (ELISA)，放射免疫法(RIA)，免疫沉淀，表面等離子體共振，化學(xué)發(fā)光，熒光偏振，磷光，免疫 組織化學(xué)分析，基質(zhì)輔助激光解吸/電離時間飛行(WMALDI-TOF)質(zhì)譜，microcytometry， 基因芯片，顯微鏡，熒光激活細胞分選(流式細胞儀)和流式細胞儀。本發(fā)明的一個組成部分，是由上述方法鑒定出的化合物，通過對El解旋酶的抑制作用，可用來預(yù)防或治療HPV感染和子宮頸癌。這些化合物既可以通過本行業(yè)所知的傳統(tǒng) 的固相合成與制備。這項發(fā)明的范圍不僅包括各種異構(gòu)體可能存在，但也可能形成的各種異構(gòu)體的混 合物。本發(fā)明中的化合物在有堿性氨基時與酸形成鹽，或在有酸性基團(如羧酸膦酸) 時與堿形成鹽。所有這些新產(chǎn)品的鹽有利于分離和/或純化。這類酸和堿的鹽如是藥學(xué)上 可接受的話具有特別價值。醫(yī)藥上可以接受的酸類鹽包括鹽酸，草酸，硫酸，硝酸，苯磺酸， 對甲苯磺酸，醋酸，馬來酸，酒石酸等。藥物使用基本鹽類包括鈉，鉀，鈣，鎂的鹽。除了用理性的基于結(jié)構(gòu)的藥物設(shè)計，其與El結(jié)合的抑制劑可以通過上述的解旋 酶功能檢測來發(fā)現(xiàn)，也就是以測定某種化合物對解旋酶的抑制能力。用這種方式，我們已確 定了一些能結(jié)合El六聚體的化合物，并對El六聚體解旋酶功能有抑制作用的化合物，包括 曲伐沙星(trovafloxacin)與加替沙星(gatifloxacin)。因此，本發(fā)明的一個方面是一種 通過在為需要接受這種治療哺乳動物上使用travafloxacin或gatifloxacin及其衍生物 來預(yù)防或治療HPV感染和宮頸癌的方法。本發(fā)明的化合物可以用來為病人直接使用。較好的病人是一種動物，更好是哺乳 動物，最好為人類。這種化合物可以通過各種形式和路線進行使用，例如，口頭或腸外。腸 外使用包括但不限于由下列使用路線靜脈注射，肌肉注射，皮下注射，眼科，口腔和舌下； 局部包括眼科，皮膚，眼，鼻和直腸通過充氣和氣溶膠吸入；腹腔和直腸系統(tǒng)性，生殖系統(tǒng)。醫(yī)生將決定本治療藥物最合適的劑量用于預(yù)防或治療目的，它會隨特定的病人而 定。醫(yī)生通常會先從小劑量開始遞增，直到達到最佳治療效果的劑量。治療劑量一般都可 以從約0. 1至約1000毫克/天，最好是從大約10到100毫克/天，或約0. 1到50毫克/ 公斤體重量，最好每天約0. 1至約20毫克/公斤體重的身體，可以在幾個不同的劑量單位 的使用。高劑量，在約2倍到4倍左右的劑量可用于口服使用。目前國內(nèi)外還沒有任何有效的預(yù)防和治療人乳頭瘤病毒的化合物。本發(fā)明的技術(shù) 和成果可以用來找到和開發(fā)針對該病毒的具有特異性高的抑制劑化合物作為預(yù)防和治療 人乳頭瘤的感染和其引起的疾病。與現(xiàn)有技術(shù)相比(如普遍撒網(wǎng)的高勞力強度的大通量篩 選)，本發(fā)明具采用了現(xiàn)代蛋白分子結(jié)晶學(xué)，計算機對分子結(jié)構(gòu)的模擬和分析和基于結(jié)構(gòu)的 分子對接，以及有效的試驗測試系統(tǒng)的建立，從而能從幾十萬到上百萬的分子庫中很快的 選出能結(jié)合目標蛋白的少數(shù)的化合物，并通過試驗篩選很快驗證和確定對目標蛋白有高特 異性的抑制功能的化合物作為抗人乳頭瘤的有效藥物。


圖1為HPV 35E1蛋白Superdex-200的洗脫峰不同部分的凝膠電泳圖；圖2為HPV35 El蛋白的Superdex-200柱層析圖；圖3為El解旋酶的解旋雙鏈DNA活性測試結(jié)果圖；圖4為El解旋酶對ATP水解活性的檢測結(jié)果圖；圖5為El的分子結(jié)構(gòu)圖其中A為El六聚體的側(cè)視結(jié)構(gòu)示意圖；B為El六聚體 的俯視結(jié)構(gòu)示意圖；C為El單體的N-端結(jié)構(gòu)域；D為El單體的C-端結(jié)構(gòu)域；圖6為根據(jù)結(jié)構(gòu)進行計算機分子對接所得到的結(jié)果圖其中A為曲伐沙星(trovafloxacin)對接在El六聚體結(jié)構(gòu)的結(jié)合部位圖，B為加替沙星(gatifloxacin)對接 在El六聚體結(jié)構(gòu)的結(jié)合部位圖；圖7為候選化合物曲伐沙星的結(jié)構(gòu)圖；圖8為候選化合物加替沙星的結(jié)構(gòu)圖；圖9為候選化合物曲伐沙星和加替沙星對El解旋酶的抑制劑作用圖。
具體實施例方式以下結(jié)合附圖對本發(fā)明的優(yōu)選實施例進行說明，應(yīng)當理解，此處所描述的優(yōu)選實 施例僅用于說明和解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。所有百分比是按重量和所有溶劑混 合比例是按體積，除非另有說明。實施例1 人乳頭瘤病毒(HPV)El蛋白的制備和酶活性的測定(一 )人乳頭瘤病毒(HPV)El蛋白的制備人乳頭瘤病毒(HPV)El蛋白的制備將以HPV35型的El解旋酶為例。HPV35 El解 旋酶的的表示和提純是用大腸桿菌表達系統(tǒng)。用的質(zhì)粒是PGEX-2T為載體。誘導(dǎo)El蛋白 表達的條件是0. 4mM的IPTG，16度，16小時。細胞破碎是在50mM Tris-HCl, pH 8. 0 度 下)，0.25M NaCl, 5mM EDTA, 5mM DTT，5%甘油，0. 2% NP-40的溶液中，用法式破碎機或超 聲波機。細胞破碎物離心40000xG，上清液里的GST-El用谷胱甘肽(glutathione)以親和 層析的方法提出。GST-El融合蛋白使用凝血酶切開，洗脫的El蛋白用Superdex-200柱層 析來提純。如圖1所示，經(jīng)Superdex-200提純后的El蛋白有很高的純度。純化的El蛋白 在IOOmM HEPES，pH7. 5，250mM NaCl,5mM DTT，和5%的甘油的溶液里濃縮后，在-80度下保 存。( 二)六聚體聚合能力的檢測六聚體的聚合是El體現(xiàn)解旋酶功能的必備條件。El單體分子形成六聚是用 Superdex-200凝膠過濾色譜法。蛋白質(zhì)O毫克/毫升，Img總蛋白)和ImMATP注入 Superdex-200柱子上。如圖2所示，HPV35 El蛋白在Superdex-200柱層析分析法中，形成 六聚體和小部分單體，以六聚體和少量單體流出柱子。而化合物對六聚體形成的抑制作用 可用此法檢測。(三)解旋酶活性檢測解旋酶活性的檢測使用的底物是從兩個互補鏈退火而成的。兩條互補鏈的序列 是(dT) 44GCTCGTGCAGACGTCGAGGTGAGGACGAGCTCCTCGTGACCACGand CGTGGTCACGAGGAGCTCGTC CTCACCTCGACGTCTGCACGAGC (dT) 44。((dT) 44是指44個dT)。此底物包括44核甘酸的兩個單 鏈DNA分叉尾巴和44個核苷酸的雙鏈DNA，5 ‘末端有32P的放射標記。El解旋酶活性檢 測是在65°C，60分鐘，20微升含0. 5nM雙鏈DNA底物，75nM El蛋白單體，30nM Tris (pH8), 75mM NaCl，50nM 醋酸鉀，IOmM MgAcetate, 5mM ATP，ImMDTT 和 0. 1 毫克 / 毫升牛血清白蛋 白。反應(yīng)終止是用5ul含有IOOmM EDTA，0. 5% SDS，0. 1 %二甲苯藍，0. 1 %溴酚藍和50% 甘油。反應(yīng)物經(jīng)12%聚丙烯酰胺凝膠電泳后，用放射自顯影法來檢測和量化底物DNA的解 旋程度，從而的出解旋酶的活性程度。如圖3所示為El解旋酶的解旋雙鏈DNA活性測試結(jié) 果，雙鏈DNA(dsDNA)底物被El解旋酶解開成單鏈DNA (ssDNA)產(chǎn)物，第1_5道El蛋白濃度 遞減，第6道只有dsDAN底物，第7道dsDNA底物加熱到100度。
(四)ATP酶活性測定El解旋酶對ATP的水解用兩種方法進行。第一中方法是(參見Greenleaf et al.，2008)，沒有同位素標記的 ATP 10_500uM 和 IOuM 的 γ -32Ρ 標記的 ATP (3000Ci/mmol) 以及IuM的El六聚體蛋白混合后在25度下反應(yīng)30分鐘，然后用薄版層析法檢測ATP水 解程度(如圖4所示)。第二種方法是，使用Enzchek的檢測試劑盒Gnvitrogen公司)， 檢測El解旋酶對ATP的水解和磷釋放。所有的反應(yīng)進行解旋酶在65度進行，使用InM的 El單體蛋白，50-2500μΜ的ATP。所用的溶液是解旋酶活性測定的溶液相同。數(shù)據(jù)米氏 (Michaelis-Menten)方程式來分析數(shù)據(jù)。如圖4所示為El解旋酶對ATP水解活性的檢測， 隨著El解旋酶濃度的增加，ATP被水解成ADP的量也越大。實施例2 乳頭瘤病毒El解旋酶蛋白的結(jié)晶，分子結(jié)構(gòu)模型和藥物篩選(一)乳頭瘤病毒El解旋酶蛋白的結(jié)晶以牛乳頭瘤病毒El為例。此El蛋白表達 和分離提純可用實例1所描述的進行。乳頭瘤病毒El蛋白結(jié)晶是用20mg/ml的蛋白濃度， 在含有 IOOmM MES (pH 7. 5), 300mM KP04 (pH 7. 5)，190mM NaCl, 8% PEG6K 的溶液里，用懸 滴氣相擴散法，在18度的條件下進行。結(jié)晶的晶包常數(shù)為P2(1)2(1)2(1)，a = 133.211， b = 179. 192，和 c = 185. 350, α = β = g = 90。晶體衍射分辯率為 3. 1 挨。( 二 )晶體結(jié)構(gòu)分子模型El的六聚體的總體結(jié)構(gòu)如圖5 (A、B)所示，El亞基組裝成有一中央通道的同源六聚結(jié)構(gòu)。從側(cè)面看，六聚 體環(huán)顯示為兩個不同直徑的環(huán)，在頂部小環(huán)和底部大環(huán)。這兩個層次的環(huán)六聚體的厚度大 約是80埃。從頂部看，在六聚體環(huán)從六個點從較大的底部環(huán)中心輻射出去。六聚體的總體構(gòu)象具有不對稱的外觀，不同亞基之間有不同空間距離。這些每個 亞基之間存在著較大的底部是ATP的結(jié)合部位，亞基間ATP結(jié)合和水解驅(qū)動El六聚體構(gòu)象 變化用來打開DNA雙鏈或解旋。ATP具體的結(jié)合位點位于在較大底部的AAA+的Walker-A 域處。一個亞基貢獻 Walker-A(GPPNTGKS)和 Walker-B (AALVDD)和傳感器 1 (VTSNI)用來 結(jié)合ATP的磷酸部分，而鄰近的亞單位提供了一個精氨酸“手指”(Arg538)對ATP水解至關(guān) 重要，傳感器2(Lys425)和其他一些周邊的氨基酸也參與結(jié)合和水解ATP。El的單體結(jié)構(gòu)在El的單體結(jié)構(gòu)中包含兩個單獨的結(jié)構(gòu)域，較小的N-端結(jié)構(gòu)域和大C端的AAA+ 域。N-端的結(jié)構(gòu)域全是α-螺旋，但C-端的結(jié)構(gòu)域有5個結(jié)構(gòu)形成的對版，如圖 5(C、D)所示。整體結(jié)構(gòu)非常象SV40大T抗原的結(jié)構(gòu)(Li el al. ,Nature, 2003 ；Gai et al.， Cell，2004)，有一個長的α -螺旋連接的N-端域到C-端域。在C-端域，它包含了 β-發(fā) 夾結(jié)構(gòu)，是位于六聚體中央通道里，對DNA結(jié)合和解旋起很重要的作用。(三)計算機模型藥物篩選根據(jù)牛乳頭瘤病毒El的晶體結(jié)構(gòu)，通過計算機模擬建立了人乳頭瘤病毒16和18 型El解旋酶的結(jié)構(gòu)模型，并以此結(jié)構(gòu)模型，對小分子化學(xué)數(shù)據(jù)庫進行計算機對接，以篩選 出能結(jié)合El的化合物。用這種方法，我們篩選出一些能結(jié)合在人乳頭瘤16型El上的化合 物，其中兩種候選化合物曲伐沙星和加替沙星(trovafIoxacin和gatifloxacin)的結(jié)構(gòu)如 圖7、8，所示它們結(jié)合在El蛋白上的位點分別如圖6A、B所示，兩個分子對接的自由能分別 是-7. 69kcal/mol 禾口 -6. 95kcal/mol。
(四)對El活性抑制劑的檢測基于結(jié)構(gòu)和計算模擬篩選出的候選化合物曲伐沙星與加替沙星(trovafloxacin 和gatifloxacin)對El解旋酶抑制劑作用用實樣來檢測，以測驗這些化合物是否能抑制 El解開雙鏈DNA底物的活性。如圖9所示，曲伐沙星加在HPV16E1解旋酶反應(yīng)混合物中， 讓反應(yīng)進行60分鐘，然后用凝膠電泳分析反應(yīng)結(jié)果。曲伐沙星(trovafloxacin)濃度使用 為20uM,40uM,80uM, 160uM。由圖9可以看出，曲伐沙星(trovafloxacin)濃度以線性方式 抑制El雙鏈DNA解旋成單鏈的功能。同樣，加替沙星(gatifloxacin)濃度的增加(40uM， 80uM, 120uM，和MOuM)也對El的解旋酶呈現(xiàn)出類似的線性抑制活性，不過其抑制作用沒有 曲伐沙星強烈。4-7道顯示出trovaf loxacin濃度增加對El解旋酶功能抑制的增強。8_11 道顯示出gatifloxacin濃度增加對El解旋酶功能抑制的增強。最后應(yīng)說明的是以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實施例而已，并不用于限制本發(fā)明， 盡管參照前述實施例對本發(fā)明進行了詳細的說明，對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，其依然可 以對前述各實施例所記載的技術(shù)方案進行修改，或者對其中部分技術(shù)特征進行等同替換。 凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的 保護范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種預(yù)防和治療人乳頭瘤病毒感染類疾病的化合物的篩選方法，其特征在于，采用 結(jié)構(gòu)計算機輔助藥物設(shè)計方法，以人乳頭瘤病毒El解旋酶結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)進行篩選，得到能抑 制El的候選化合物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的預(yù)防和治療人乳頭瘤病毒感染類疾病的化合物的篩選方法， 其特征在于，所述的以人乳頭瘤病毒El解旋酶結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)包括(a)一個由原子坐標確定下來的El蛋白分子結(jié)構(gòu)和由El形成的六聚體的結(jié)構(gòu)；(b)一個由原子坐標確定下來的El蛋白分子與ATP或ADP相結(jié)合的復(fù)合體結(jié)構(gòu)；(c)一個El蛋白單獨的結(jié)構(gòu)或與一個化合物或多肽結(jié)合的復(fù)合體結(jié)構(gòu)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的預(yù)防和治療人乳頭瘤病毒感染類疾病化合物的篩選方法，其 特征在于，還包括進一步的El解旋酶功能檢測，所述El解旋酶功能檢測方法采用電泳遷移 率試驗。
4.一種利用權(quán)利要求3的篩選方法得到的預(yù)防和治療人乳頭瘤病毒感染類疾病的化 合物，其特征在于，所述化合物為曲伐沙星及其衍生物。
5.一種利用權(quán)利要求3的篩選方法得到的預(yù)防和治療人乳頭瘤病毒感染類疾病的化 合物，其特征在于，所述化合物為加替沙星及其衍生物。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的預(yù)防和治療人乳頭瘤病毒感染類疾病的化合物，其特征 在于，所述人乳頭瘤病毒感染類疾病包括子宮頸癌或尖銳濕疣。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種預(yù)防和治療人乳頭瘤病毒(HPV)感染類疾病的化合物的篩選方法，該方法采用結(jié)構(gòu)計算機輔助藥物設(shè)計，以人乳頭瘤病毒E1解旋酶結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)進行篩選，得到能抑制E1的候選化合物；上述篩選方法具有方便、省時、高效的特點；本發(fā)明還公開了利用上述篩選方法得到的化合物，如曲伐沙星及其衍生物、加替沙星及其衍生物，這些人乳頭瘤病毒E1解旋酶的抑制劑具有特異性高、針對性強的特點，有助于預(yù)防和治療人乳頭狀瘤病毒感染，以及和HPV感染有關(guān)的疾病，如子宮頸癌和生殖器疣等疾病。
文檔編號C07D401/04GK102086468SQ201010175420
公開日2011年6月8日 申請日期2010年5月18日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月18日
發(fā)明者李大偉, 樓慧強, 陳小江, 陳林 申請人:小江生物技術(shù)有限公司