專利名稱：：一種人乳頭瘤病毒常見型四重?zé)晒舛縫cr分型檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種人乳頭瘤病毒常見型四重?zé)晒舛縋CR分型檢測方法，具體地說，本發(fā)明涉及應(yīng)用四重實時熒光定量PCR技術(shù)在一個PCR反應(yīng)管中快速、平行地同時檢測四型人乳頭瘤病毒(HPV-6，-ll，-16，-18)的方法。
背景技術(shù)：
：人乳頭瘤病毒(H咖anp即illomavirus，HPV)是一種雙鏈DNA病毒，通過人體接觸傳播，在多種皮膚黏膜的良、惡性增生和生殖器感染中較為常見，迄今為止，全世界已發(fā)現(xiàn)逾120多種HPV基因型，各型HPV與其生物學(xué)行為存在著高度相關(guān)性，不同基因型的HPV具有不同的致病危險性，一般分為高危型HPV和低危型HPV。高危型HPV感染可以引起女性宮頸及其他生殖器癌變，而宮頸癌是最常見的女性惡性腫瘤之一，全球每年約有50萬新增病人，發(fā)病率在女性腫瘤中占第二位，但其死亡率則占第一位，95%以上的宮頸癌與人乳頭瘤病毒感染有關(guān)。低危型HPV感染可導(dǎo)致宮頸上皮細(xì)胞輕度病變、產(chǎn)生生殖器疣、皮膚、經(jīng)常性喉或呼吸道乳頭狀瘤等。在引起人類生殖器、肛門等部位感染的諸多基因型HPV中，最常見的只有四種基因型別HPV(HPV-6、-11、-16、-18)。一些研究表明，大約70%的宮頸上皮細(xì)胞發(fā)育不良和宮頸癌是有HPV-16，-18感染引起的，其中HPV-16約占55%，HPV-18約占10-15%，另外，相當(dāng)一部分的陰道、外陰、肛門、陰莖等部位癌變與HPV-16、-IS持續(xù)感染密切相關(guān)。在男女外生殖器病變中，90X以上的外生殖器疣是由HPV-6、，-11感染引起的，另外肛門疣也主要是HPV-6，_11感染造成的。在中國，約有90%的生殖器疣肛門疣由HPV-6、-ll型引起，中國婦女宮頸癌組織中HPV感染率大于95%，其中HPV-16、-18型占90%以上。鑒于HPV-6、-11、-16、-18的高感染率及其危害性，預(yù)防HPV感染尤其是HPV-6、-11、-16、-18感染可以有效控制宮頸癌和尖銳濕疣等的發(fā)生，因此，全球很多公司都在研制HPV疫苗，Merck公司已經(jīng)研制出了針對HPV-6、-11、-16、_18型的四價疫苗，并在很多國家得以應(yīng)用，然而，在應(yīng)用四價疫苗前，必須要了解被接種者是否感染了HPV，尤其是HPV-6、-11、-16、-18，只有在被接種者未感染HPV-6、-11、-16、-18情況下，才可以接種HPV四價疫苗，所以首先必須為接種者檢測HPV-6、-11、16、-18，因此，同時快速準(zhǔn)確的HPV-6、-ll、16、-18分型檢測意義重大。HPV感染的潛伏期長，不易在體外培養(yǎng)，亞臨床感染常見，加之血清學(xué)試驗又不能區(qū)別近期和遠(yuǎn)期感染，因此，對HPV感染的分型診斷，目前主要依賴分子生物學(xué)手段對病毒DNA進(jìn)行檢測。目前常用的方法有PCR、基因芯片技術(shù)、DNA測序和第二代雜交捕獲法，其中雜交信號放大法的雜交捕獲II代(HC-II)和靶DNA擴(kuò)增法的PCR方法是目前應(yīng)用最多的HPV-DNA檢測方法。但是，這些方法大多對操作人員要求高，試劑昂貴，同時所需臨床標(biāo)本量大，需對臨床標(biāo)本多次擴(kuò)增及多次分離分析，技術(shù)復(fù)雜，無法在臨床檢測中快速高通量地檢出患者感染的HPV病毒類型及病毒載量。目前第二代雜交捕獲法(HC-II)是惟一通過FDA批準(zhǔn)的可在臨床使用的一種檢測HPV-DNA的技術(shù)，但仍然存在不能分型和定量的缺點。在PCR基礎(chǔ)上發(fā)展起來的多重實時熒光PCR技術(shù)同時檢測多種或型病毒也有應(yīng)用。但是，目前報道的熒光定量PCR檢測HPV要么通量低，要么技術(shù)復(fù)雜、試劑昂貴、要么未實現(xiàn)四型HPV單管同時定量檢測，難以滿足臨床上同時檢測多個亞型的需要。但是，由于熒光定量PCR方法由于成本低、方便快速、操作簡單、可以定量等諸多優(yōu)點，該方法值得優(yōu)化提高從而能夠在臨床上廣泛應(yīng)用。熒光定量PCR技術(shù)發(fā)展日新月異，美國AlleLogicBiosciences公司推出了最新一代熒光定量探針-AllGlo探針，它擁有普通TaqMan、TaqMan-MGB及MolecularBeacon探針?biāo)袃?yōu)點。本研究通過檢測AllGlo特異性探針的熒光增量得知檢測結(jié)果，能在一個PCR反應(yīng)中同時檢測四型HPV，靈敏度、特異性和重復(fù)性都達(dá)到了95%。與HC-II方法相比，多重實時熒光PCR方法具有一下優(yōu)勢靈敏度高，線性范圍廣，本研究所建立的多重實時熒光PCR方法靈敏度可以達(dá)到10Copies/Test，最高可達(dá)109Copies/Test。本項研究采用AllGlo探針技術(shù)，設(shè)計了四對特異引物和相應(yīng)的探針，應(yīng)用四重?zé)晒舛縋CR技術(shù)同時檢測四型HPV，并對該技術(shù)反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，建立了一種基于AllGlo探針技術(shù)的單管四重?zé)晒舛縋CR同時檢測四型HPV的方法，適合于尖銳濕疣的快速早期預(yù)防和診治，以及宮頸癌危險因素的評估，為生殖系統(tǒng)常見HPV感染的病程監(jiān)測和療效判斷提供指導(dǎo)，應(yīng)用前景廣闊。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種人乳頭瘤病毒常見型四重?zé)晒舛縋CR分型檢測方法。人乳頭瘤病毒常見型四重?zé)晒舛縋CR分型檢測方法包括如下步驟(1)引物設(shè)計在基因庫中檢索獲得四型人乳頭瘤病毒，即HPV-6、-ll、-16、-18特異性的保守基因，通過網(wǎng)上序列比對，確定HPV-6、-ll、-16、-18亞型的高度保守序列區(qū)，作為待檢靶基因特異性核酸序列設(shè)計特異引物；(2)熒光探針設(shè)計根據(jù)步驟(1)中的四型HPV的待檢靶基因特異性核酸序列設(shè)計熒光探針；(3)標(biāo)準(zhǔn)分子的構(gòu)建根據(jù)步驟(1)確定的特異引物，利用基因克隆技術(shù)構(gòu)建四種分別含有HPV-6、-11、-16、-18高度保守序列區(qū)的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子；(4)四重?zé)晒釶CR反應(yīng)液組成使用步驟(1)中的引物和步驟(2)中的探針及2XqPCRMix定量PCR試劑組成四重?zé)晒釶CR反應(yīng)液；(5)四重?zé)晒釶CR反應(yīng)的優(yōu)化和建立通過100-400nM范圍內(nèi)各個濃度的引物和探針的組合，組成不同的四重?zé)晒舛縋CR反應(yīng)體系，根據(jù)反應(yīng)效率和曲線確定最終的PCR反應(yīng)體系；(6)標(biāo)準(zhǔn)曲線制備使用步驟(5)中的四重?zé)晒釶CR反應(yīng)體系，將已知拷貝數(shù)的含有四型HPV目的擴(kuò)增片段的重組質(zhì)粒連續(xù)IO倍倍比稀釋，加入到熒光定量PCR主反應(yīng)液中，綜合分析儀器給出的各項數(shù)據(jù)，設(shè)定合理的閾值(Threshold)和基線(Baseline)，進(jìn)行結(jié)果分析，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線；(7)臨床標(biāo)本檢測用已知HPV基因型別和病毒載量的臨床標(biāo)本病毒DNA提取液作為模板，進(jìn)一步用步驟(5)和(6)的方法和條件進(jìn)行四重?zé)晒舛縋CR擴(kuò)增。所述的特異性的保守基因，指的是HPV-6的衣殼蛋白基因，HPV-11的衣殼蛋白基因，HPV-16的E6蛋白基因和HPV-18的LI基因。所述的待檢靶基因特異性核酸序列，指的是針對每一種亞型病毒基因所特有的一段基因序列。所述的特異性熒光定量PCR引物，指的是長度為20±3Nt的寡核苷酸鏈，與四型HPV待檢靶基因特異性核酸序列完全相同或互補。所述的特異性熒光定量PCR熒光探針，指的是長度為20±3Nt的寡核苷酸鏈，與四型HPV待檢靶基因特異性核酸序列完全相同或互補，所有探針的5'端和3'端均使用AllGlo探針進(jìn)行標(biāo)記，AllGlo探針的每種染料既是報告基團(tuán)又是粹滅基團(tuán)。步驟(1)、(2)所述的引物及其特異性定量PCR熒光探針序列如下HPV-6:上游引物GTTATCGCCTCCCCCAAAT下游引物ATCTGGCTTTTCCTTTTCAGG探針URA-CCATTACCTGTCAAAAGCCCAC-URAHPV-11:上游引物TTGCGAAAGGAACAAATGTTT下游引物GGAAGACACCAATGAGCCACT探針MAR-TGGGGGAACCTGTGCC-MARHPV-16:上游弓I物AGGACCCACAGGAGCGAC下游弓I物AGTCATATACCTCACGTCGCAGT探針NEP-ATGCACAGAGCTGCAAACAA-NEPHPV-18:上游引物GGTTCAGGCTGGATTGCG下游引物TACACGCACACGCTTGGC探針JUP-TCGCAAACGTTCTGCTCC-JUPURA、MAR、NEP、JUP是AllGlo探針的四種不同熒光素。所述的四重?zé)晒舛縋CR反應(yīng)體系，指的是由四組引物、探針以及2XqPCRMix定量PCR試劑組成的混合液。所述的標(biāo)準(zhǔn)分子，指的是利用基因克隆技術(shù)構(gòu)建的人工重組質(zhì)粒，每種質(zhì)粒只重組一種特異待檢靶基因序列。所述的四重?zé)晒舛縋CR反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線，指的是不同稀釋度標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子用四重?zé)晒舛縋CR反應(yīng)液進(jìn)行檢測所得，標(biāo)準(zhǔn)曲線的r2均大于0.98，擴(kuò)增效率在1.00-1.25之間，滿足熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的要求。本發(fā)明根據(jù)四型HPV特異性基因的保守基因，登錄GeneBank獲取相關(guān)序列，應(yīng)用Clustalw軟件對所有序列比對分析，挑選最保守的基因序列用PrimerPremiers5.0軟件設(shè)計引物，登錄NCBI通過BLAST程序比對分析，每型病毒篩選出一對特異性最強(qiáng)的引物和相應(yīng)的特異探針，用自制的不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)分子(四型HPV靶基因質(zhì)?？寺≥d體)作為模板，在QiagenRotorGene6000熒光定量PCR儀中(能夠同時檢測5種熒光)進(jìn)行單、四重?zé)晒舛縋CR實驗，優(yōu)化四重?zé)晒舛縋CR反應(yīng)體系，確定該方法的靈敏度、特異性、重復(fù)性等，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，最后用該方法檢測IO份臨床標(biāo)本，同時與臨床實驗室在用的單重T叫Man方法檢測結(jié)果進(jìn)行比較，分析四重?zé)晒舛縋CR方法的可靠性。本發(fā)明是一種臨床最常見的四型人乳頭瘤病毒(HPV)的早期、快速、簡便而有效的四重實時熒光定量PCR檢測方法，涉及的四型HPV包括HPV-6、HPV-11、HPV-16和HPV-18，由于采用AllGlo熒光素標(biāo)記探針，使其檢測靈敏度大大提高，達(dá)到10-100個拷貝的病毒分子，對于單個檢測樣本檢測時間約為1.5個小時，操作簡便，并且可以特殊進(jìn)行大批量的樣本分析檢測，較現(xiàn)有的單重?zé)晒舛縋CR技術(shù)在檢測通量方面有了極大提高，較HC-II技術(shù)在檢測靈敏度、耗時、定量等方面均有很大的提高或改進(jìn)，對HPV感染的流行監(jiān)控、快速鑒定、療效判斷及指導(dǎo)HPV四價疫苗的應(yīng)用等方面具有很大幫助，其應(yīng)用前景看好。本發(fā)明可以簡便快速地在一個反應(yīng)管中同時、快速地檢測臨床常見四型HPV感染，對尖銳濕疣及常見型HPV致婦女宮頸癌變的早期防治、阻斷傳染源、減少HPV感染、監(jiān)測臨床療效等均有很大的臨床價值。采用本發(fā)明提供的方法，解決了現(xiàn)有HPV的某些檢測方法要么不能分型、要么不能檢測多重感染、要么不能定量、或者成本高、操作繁瑣等諸多缺陷，實現(xiàn)了單管PCR同時分型檢測四型HPV，而且能夠定量檢測，操作簡單快速，靈敏度高，特異性好，重復(fù)性好，結(jié)果準(zhǔn)確可靠。圖l-5是四型HPV四重?zé)晒舛縋CR特異性實驗擴(kuò)增圖(各型HPV模板質(zhì)粒量均為10^opies/iU:圖1是HPV-6在四重?zé)晒舛縋CR體系中的特異性擴(kuò)增圖，圖2是HPV-11在四重?zé)晒舛縋CR體系中的特異性擴(kuò)增圖，圖3是HPV-16在四重?zé)晒舛縋CR體系中的特異性擴(kuò)增圖，圖4是HPV-18在四重?zé)晒舛縋CR體系中的特異性擴(kuò)增圖。圖6-9是四型HPV四重PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線模板質(zhì)粒量(Copies/y1)分別為(從左至右)為107、106、105、104、103。具體實施例方式人乳頭瘤病毒常見型四重?zé)晒舛縋CR分型檢測方法包括如下步驟(1)引物設(shè)計在基因庫中檢索獲得四型人乳頭瘤病毒，即HPV-6、-ll、-16、-18特異性的保守基因，通過網(wǎng)上序列比對，確定HPV-6、-ll、-16、-18亞型的高度保守序列區(qū)，作為待檢靶基因特異性核酸序列設(shè)計特異引物；(2)熒光探針設(shè)計根據(jù)步驟(1)中的四型HPV的待檢靶基因特異性核酸序列設(shè)計熒光探針；(3)標(biāo)準(zhǔn)分子的構(gòu)建根據(jù)步驟(1)確定的特異引物，利用基因克隆技術(shù)構(gòu)建四種分別含有HPV-6、-11、-16、-18高度保守序列區(qū)的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子；(4)四重?zé)晒釶CR反應(yīng)液組成使用步驟(1)中的引物和步驟(2)中的探針及2XqPCRMix定量PCR試劑組成四重?zé)晒釶CR反應(yīng)液；(5)四重?zé)晒釶CR反應(yīng)的優(yōu)化和建立通過100-400nM范圍內(nèi)各個濃度的引物和探針的組合，組成不同的四重?zé)晒舛縋CR反應(yīng)體系，根據(jù)反應(yīng)效率和曲線確定最終的PCR反應(yīng)體系；(6)標(biāo)準(zhǔn)曲線制備使用步驟(5)中的四重?zé)晒釶CR反應(yīng)體系，將已知拷貝數(shù)的含有四型HPV目的擴(kuò)增片段的重組質(zhì)粒連續(xù)IO倍倍比稀釋，加入到熒光定量PCR主反應(yīng)液中，綜合分析儀器給出的各項數(shù)據(jù)，設(shè)定合理的閾值(Threshold)和基線(Baseline)，進(jìn)行結(jié)果分析，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線；(7)臨床標(biāo)本檢測用已知HPV基因型別和病毒載量的臨床標(biāo)本病毒DNA提取液作為模板，進(jìn)一步用步驟(5)和(6)的方法和條件進(jìn)行四重?zé)晒舛縋CR擴(kuò)增。所述的特異性的保守基因，指的是HPV-6的衣殼蛋白基因，HPV-11的衣殼蛋白基因，HPV-16的E6蛋白基因和HPV-18的LI基因。所述的待檢靶基因特異性核酸序列，指的是針對每一種亞型病毒基因所特有的一段基因序列。所述的特異性熒光定量PCR引物，指的是長度為20士3Nt的寡核苷酸鏈，與四型HPV待檢靶基因特異性核酸序列完全相同或互補。所述的特異性熒光定量PCR熒光探針，指的是長度為20±3Nt的寡核苷酸鏈，與四型HPV待檢靶基因特異性核酸序列完全相同或互補，所有探針的5'端和3'端均使用AllGlo探針進(jìn)行標(biāo)記，AllGlo探針的每種染料既是報告基團(tuán)又是粹滅基團(tuán)。步驟(1)、(2)所述的引物及其特異性定量PCR熒光探針序列如下HPV-6:上游引物GTTATCGCCTCCCCCAAAT下游引物ATCTGGCTTTTCCTTTTCAGG探針URA-CCATTACCTGTCAAAAGCCCAC-URAHPV-11:上游引物TTGCGAAAGGAACAAATGTTT下游引物GGAAGACACCAATGAGCCACT探針MAR-TGGGGGAACCTGTGCC-MARHPV-16:上游引物AGGACCCACAGGAGCGAC下游引物AGTCATATACCTCACGTCGCAGT探針NEP-ATGCACAGAGCTGCAAACAA-NEPHPV-18:上游引物GGTTCAGGCTGGATTGCG下游引物TACACGCACACGCTTGGC探針JUP-TCGCAAACGTTCTGCTCC-JUPURA、MAR、NEP、JUP是AllGlo探針的四種不同熒光素。所述的四重?zé)晒舛縋CR反應(yīng)體系，指的是由四組引物、探針以及2XqPCRMix定量PCR試劑組成的混合液。所述的標(biāo)準(zhǔn)分子，指的是利用基因克隆技術(shù)構(gòu)建的人工重組質(zhì)粒，每種質(zhì)粒只重組一種特異待檢靶基因序列。所述的四重?zé)晒舛縋CR反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線，指的是不同稀釋度標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子用四重?zé)晒舛縋CR反應(yīng)液進(jìn)行檢測所得，標(biāo)準(zhǔn)曲線的r2均大于0.98，擴(kuò)增效率在1.00-1.25之間，滿足熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的要求。實施例1.四型HPV目的基因質(zhì)?？寺≥d體的構(gòu)建采用T-A載體克隆方案，將四種目的基因PCR產(chǎn)物經(jīng)過電泳確認(rèn)擴(kuò)增片段分子量后，擴(kuò)增片段克隆至PMD-19T質(zhì)粒中，16t:連接過夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸埃希菌DH5a中，在LB培養(yǎng)基(含Ampl00g/ml)上篩選陽性菌落，經(jīng)質(zhì)粒小提試劑盒回收、抽提、純化、重組質(zhì)粒，并在英俊(上海)生物公司測序驗證，序列經(jīng)Blast后完全正確的目的質(zhì)粒用紫外分光光度計定量后，用1XTE(pH8.0)緩沖液稀釋到1010拷貝/iU作為儲存液，-2(TC保存?zhèn)溆谩?.DNA模板提取分泌物拭子標(biāo)本用生理鹽水溶解，組織塊或尖銳濕疣疣體置4%氫氧化鈉液中，用金屬棒搗碎。振蕩重懸1分鐘，高速低溫離心lmin(4°C，12000g/min)，棄上清液，往沉淀物中加50ii1DNA提取液(達(dá)安分子診斷公司)，IO(TC加熱10min，高速低溫離心5min(4。C，12000g/min)，備用。3.AllGlo探針?biāo)闹責(zé)晒舛縋CR3.1引物及探針查閱相關(guān)的專業(yè)文獻(xiàn)，根據(jù)文獻(xiàn)報道獲取四型HPV特異性保守基因，登錄GeneBank獲取相關(guān)序列，應(yīng)用Clustalw軟件對所有序列比對分析，挑選最保守的基因序列用PrimerPremiers5.0軟件設(shè)計引物，登錄NCBI通過BLAST程序比對分析，每型病毒篩選出一對特異性最強(qiáng)的引物和相應(yīng)的特異探針(見表l)。四型HPV單管多重?zé)晒舛縋CR引物和相應(yīng)的AllGlo探針由上海超世生物公司合成。為了確保多重?zé)晒舛縋CR的特異性和靈敏度，所有的引物和探針均與GenBank里的擴(kuò)增靶序列進(jìn)行BLAST，所有引物和探針的Tm值幾乎一致。為了增加與相應(yīng)型別HPV擴(kuò)增靶序列雜交的特異性，每條探針與非特異雜交序列至少有9個堿基不互補配對。采用QiagenRotorGene6000熒光定量PCR儀中(能夠同時檢測5種熒光)進(jìn)行多重?zé)晒舛縋CR實驗。表lAllGlo探針?biāo)闹囟縋CR檢測四型HPV引物和探針<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>基因序號擴(kuò)增耙位引物名稱引物序列探針產(chǎn)物長度(bp)EU834744.1LlgeneHPV18FHPV18RGGTTCAGGCTGGATTGCGTACACGCACACGCTTGGCJUP-TCGCAAACGTTCTGCTCC-JUP100探針采用美國AlleLogicBiosciences公司推出了最新一代熒光定量探針-AllGlo探針URA、MAR、NEP、JUP均為不同波長的AllGlo探針標(biāo)記熒光素。3.2單重?zé)晒舛縋CR條件優(yōu)化采用四個引物探針比例對熒光定量PCR進(jìn)行優(yōu)化40iUPCR反應(yīng)體系，2XqPCRMix(上海超世生物公司)20ia，io4c0pies/ia的質(zhì)粒模板iyi，引物(上、下游)與相應(yīng)型別探針分別加1.6ii1、1.6ii1(400nM:400nM)，1.6ii1、0.8ii1(400nM:200nM)，0.8ii1、0.8ii1(200nM:200nM)，0.8ii1、0.4ii1(200nM:100nM)，用雙蒸水補至40ii1，所有引物探針應(yīng)用濃度均為lOyM.，每種引物探針比例均平行做兩管，同時用空白質(zhì)粒做對照。于QiagenRotorGene6000熒光定量PCR儀(Qiagen公司生產(chǎn))擴(kuò)增，循環(huán)條件95°C5min，95。C10s、58。C20s(45cycles)。實時分析軟件計算擴(kuò)增Ct值，以擴(kuò)增Ct值統(tǒng)計實驗結(jié)果。以獲得最低的Ct值和較高的熒光強(qiáng)度增加值時的引物探針濃度比例為最佳。3.3四重?zé)晒舛縋CR條件優(yōu)化根據(jù)單重?zé)晒舛縋CR條件優(yōu)化實驗所得結(jié)果，選擇引物探針濃度比例為400nM:400nM和400nM:200nM兩種比例進(jìn)行四重PCR，PCR反應(yīng)體系及擴(kuò)增條件同上，將四種引物和探針加入同一管中，然后各管分別加入一型lOtopies/iU的HPV質(zhì)粒模板1Pl，陰性對照加空白質(zhì)粒各1Pi進(jìn)行單目的基因多重PCR擴(kuò)增，另外，加1四型HPV質(zhì)粒和空白質(zhì)粒的混合液作為模板，用雙蒸水補至40iU，每個反應(yīng)平行做3管。以獲得最低的Ct值和較高的熒光強(qiáng)度增加值時的引物探針濃度比例作為四重PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線制作和其他實驗的最終擴(kuò)增條件。3.4四重?zé)晒舛縋CR的特異性、敏感性試驗將已知拷貝數(shù)的含單一型別的HPV目的擴(kuò)增片段的重組質(zhì)粒，使用時連續(xù)10倍倍比稀釋至濃度在1.0X10?？截?ia-1.0X108COpieS/iil之間作為單基因多重PCR的標(biāo)準(zhǔn)品；同時，將四種單一型別的HPV重組質(zhì)粒和空白質(zhì)?；旌虾筮M(jìn)行IO倍倍比稀釋成1.0X10°Copies/ii1-1.0X108Copies/ii1之間，作為多基因多重?zé)晒舛縋CR的標(biāo)準(zhǔn)品。取不同載量的標(biāo)準(zhǔn)品1P1作為四重?zé)晒舛縋CR的模板，同時用空白質(zhì)粒和雙蒸水做對照實驗，對各稀釋度模板按照步驟(3.3)確立的反應(yīng)體系和擴(kuò)增條件同時進(jìn)行熒光PCR檢測，所有檢測標(biāo)本至少檢測兩次，擴(kuò)增完成后用儀器自帶的軟件自動分析結(jié)果，從而確定該方法的最低檢出限，評估四型HPV熒光定量PCR的檢測靈敏度。3.5四重?zé)晒舛縋CR標(biāo)準(zhǔn)曲線制備將1(TCopies/y1四個型別HPV重組質(zhì)粒等量混合均勻，稀釋成含每種HPV質(zhì)粒(Copies/111)103、104、105、106、107作為制備標(biāo)準(zhǔn)曲線的標(biāo)準(zhǔn)品，按照步驟(3.3)確立的反應(yīng)體系和擴(kuò)增條件同時進(jìn)行熒光PCR檢測，所有檢測標(biāo)本至少檢測兩次，擴(kuò)增完成后用儀器自帶軟件分析結(jié)果，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。3.6四重?zé)晒舛縋CR的重復(fù)性試驗將已知拷貝數(shù)的四型HPV重組質(zhì)?；旌弦?104Copies/iU)平均分成10份，-20°。冷凍保存作為模板，按制備標(biāo)準(zhǔn)曲線的四重?zé)晒舛浚?的反應(yīng)體系和擴(kuò)增條件進(jìn)行擴(kuò)增，同時按照步驟(3.5)制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，每周檢測一次，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線儀器自動給出定量檢測結(jié)果，連續(xù)5周，最后統(tǒng)計軟件分析5次檢測結(jié)果的重復(fù)性(CV%)。3.7結(jié)果判定3.7.1分析條件設(shè)定根據(jù)儀器所帶分析軟件自動分析結(jié)果，閾值設(shè)定原則以閾值線剛好覆蓋陰性對照品擴(kuò)增線和儀器噪音進(jìn)行調(diào)整。3.7.2質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)空白對照物無擴(kuò)增曲線和Ct值，陽性對照的Ct值應(yīng)與標(biāo)準(zhǔn)曲線的相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品的Ct值相對應(yīng)，并且出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，否則實驗視為無效。3.7.3結(jié)果描述及判定A.陰性無Ct值無擴(kuò)增曲線B.陽性及定量判斷Ct值《35且出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線判定為陽性，且根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線自動獲取定量值，表示樣品中存在HPV病毒顆粒。C.有效原則Ct值》35的樣品定量結(jié)果不可靠，需重做實驗，無Ct值為陰性，有Ct值但>35需重新取標(biāo)本復(fù)查。3.8臨床標(biāo)本檢測取10份經(jīng)雜交捕獲法(HybridC即tur，HC_2，凱普生物科技有限公司，HybriBioLimited，HONGKONG)確定基因型別的宮頸細(xì)胞刷標(biāo)本(Cervicalcytobrushsamples)或生殖器疣體或分泌物標(biāo)本，按試劑盒說明提取DNA(達(dá)安基因診斷公司或凱普生物科技有限公司)，每份DNA提取樣品平均分成4份，2份用臨床實驗室廣泛使用的TaqMan單探針技術(shù)單重?zé)晒舛縋CR方法檢測HPV6-11混合型和HPV16-18混合型(廣州達(dá)安公司)，l份標(biāo)本用AllGlo探針多重?zé)晒舛縋CR單管同時檢測HPV-6、-ll、-16、-18，剩余樣品置-7(TC冷凍保存(以備必要時復(fù)查用)。進(jìn)一步驗證四重?zé)晒釶CR方法的特異性。在每一個檢測試驗中采用同管等量的DNA模板，平行兩管，只有當(dāng)所有平行試驗結(jié)果一致時，才確定該份DNA樣品的檢測結(jié)果，否則需重新進(jìn)行檢測，最后與T叫Man單探針技術(shù)檢測結(jié)果進(jìn)行比較(表2)。結(jié)果1.四重?zé)晒舛縋CR條件優(yōu)化結(jié)果各型HPV標(biāo)準(zhǔn)分子(104Copies/iU)在四重?zé)晒舛縋CR體系中進(jìn)行擴(kuò)增后，當(dāng)引物探針比例為(nM))400:400時，HPV-6、-11、-16、-18的Ct值分別為23-24、20-21、21-22、22-24;當(dāng)引物探針比例為(nM)400:200時，HPV-6、-11、-16、-18的Ct值分別為22-23、20-21、22-23、23-25。2.四重?zé)晒舛縋CR的特異性、敏感性試驗結(jié)果各型HPV標(biāo)準(zhǔn)分子(104COpieS/Pl)在四重?zé)晒舛縋CR體系中進(jìn)行擴(kuò)增后，其特異性均為100%9(見附圖1-5)。HPV-6、-ll、-16、-18在四重?zé)晒舛縋CR體系中檢測靈敏度分別為(Copies/ii1)102、101、3.四重?zé)晒舛縋CR標(biāo)準(zhǔn)曲線制備結(jié)果各型HPV標(biāo)準(zhǔn)分子的標(biāo)準(zhǔn)曲線在經(jīng)過優(yōu)化的四重?zé)晒舛縋CR反應(yīng)體系進(jìn)行制備，HPV-6、-11、-16、-18的標(biāo)準(zhǔn)曲線的r2分別為0.995、0.999、0.992、0.983，擴(kuò)增效率(Efficiency)分別為1.00、1.12、1.25、1.03(見附圖6-9)。4.四重?zé)晒舛縋CR的重復(fù)性試驗結(jié)果相同的四型HPV標(biāo)準(zhǔn)分子混合液(104Copies/ii1)在四重?zé)晒舛縋CR體系檢測5次，檢測數(shù)據(jù)經(jīng)對數(shù)轉(zhuǎn)換后各型HPV5次檢測的CV均小于5X，詳見表2。:0116]表2四型HPV標(biāo)準(zhǔn)分子混合液重復(fù)性檢測結(jié)果HPV基因第一次第二次第三次第四次第五次MenaSDcv型63.954.054.414.284.044.1460.191390.046162114.134.374.554.344.434.3640.1535580.035187163.914.004.014.374.044.0660.176720.043463184.324.564.394.604.504.4740.1169620.0261425.臨床標(biāo)本檢測檢測結(jié)果10份臨床標(biāo)本采用三種方法檢測，其結(jié)果見表3。表3臨床標(biāo)本試驗結(jié)果比較標(biāo)本HC-2分型單重?zé)晒舛克闹責(zé)晒舛縋CR號PCR61116186-1116-1861116181+_--3.5E5*03.2E50002_+--4.2E4004.6E4003--+-02.6E6002.1E604---+06.9E60007.6E65+_+-5.6E46.3E46.3E406.0E406_++-3.3E55.6E605.1E55.1E607+_++5.5E48.9E74.2E402.2E89.6E48+++-7.6E65.5E45.3E49.8E64.9E409++++6.2E67.3E75.0E48.9E62.9E42.1E810--__000000注:*3.5E5表示3.5X105，單位為Copies/ii1(test)，余同。權(quán)利要求一種人乳頭瘤病毒常見型四重?zé)晒舛縋CR分型檢測方法，其特征在于，包括如下步驟(1)引物設(shè)計在基因庫中檢索獲得四型人乳頭瘤病毒，即HPV-6、-11、-16、-18特異性的保守基因，通過網(wǎng)上序列比對，確定HPV-6、-11、-16、-18亞型的高度保守序列區(qū)，作為待檢靶基因特異性核酸序列設(shè)計特異引物；(2)熒光探針設(shè)計根據(jù)步驟(1)中的四型HPV的待檢靶基因特異性核酸序列設(shè)計熒光探針；(3)標(biāo)準(zhǔn)分子的構(gòu)建根據(jù)步驟(1)確定的特異引物，利用基因克隆技術(shù)構(gòu)建四種分別含有HPV-6、-11、-16、-18高度保守序列區(qū)的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子；(4)四重?zé)晒釶CR反應(yīng)液組成使用步驟(1)中的引物和步驟(2)中的探針及2×qPCRMix定量PCR試劑組成四重?zé)晒釶CR反應(yīng)液；(5)四重?zé)晒釶CR反應(yīng)的優(yōu)化和建立通過100-400nM范圍內(nèi)各個濃度的引物和探針的組合，組成不同的四重?zé)晒舛縋CR反應(yīng)體系，根據(jù)反應(yīng)效率和曲線確定最終的PCR反應(yīng)體系；(6)標(biāo)準(zhǔn)曲線制備使用步驟(5)中的四重?zé)晒釶CR反應(yīng)體系，將已知拷貝數(shù)的含有四型HPV目的擴(kuò)增片段的重組質(zhì)粒連續(xù)10倍倍比稀釋，加入到熒光定量PCR主反應(yīng)液中，綜合分析儀器給出的各項數(shù)據(jù)，設(shè)定合理的閾值(Threshold)和基線(Baseline)，進(jìn)行結(jié)果分析，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線；(7)臨床標(biāo)本檢測用已知HPV基因型別和病毒載量的臨床標(biāo)本病毒DNA提取液作為模板，進(jìn)一步用步驟(5)和(6)的方法和條件進(jìn)行四重?zé)晒舛縋CR擴(kuò)增。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種人乳頭瘤病毒常見型四重?zé)晒舛縋CR分型檢測方法，其特征是，所述的特異性的保守基因，指的是HPV-6的衣殼蛋白基因，HPV-ll的衣殼蛋白基因，HPV-16的E6蛋白基因和HPV-18的LI基因。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種人乳頭瘤病毒常見型四重?zé)晒舛縋CR分型檢測方法，其特征是，所述的待檢靶基因特異性核酸序列，指的是針對每一種亞型病毒基因所特有的一段基因序列。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種人乳頭瘤病毒常見型四重?zé)晒舛縋CR分型檢測方法，其特征是，所述的特異性熒光定量PCR引物，指的是長度為20±3Nt的寡核苷酸鏈，與四型HPV待檢靶基因特異性核酸序列完全相同或互補。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種人乳頭瘤病毒常見型四重?zé)晒舛縋CR分型檢測方法，其特征是，所述的特異性熒光定量PCR熒光探針，指的是長度為20±3Nt的寡核苷酸鏈，與四型HPV待檢靶基因特異性核酸序列完全相同或互補，所有探針的5'端和3'端均使用AllGlo探針進(jìn)行標(biāo)記，AllGlo探針的每種染料既是報告基團(tuán)又是粹滅基團(tuán)。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種人乳頭瘤病毒常見型四重?zé)晒舛縋CR分型檢測方法，其特征是，步驟(1)、(2)所述的引物及其特異性定量PCR熒光探針序列如下HPV-6:上游弓I物GTTATCGCCTCCCCCAAAT下游引物ATCTGGCTTTTCCTTTTCAGG探針URA-CCATTACCTGTCAAAAGCCCAC-URAHPV-11:上游引物TTGCGAAAGGAACAAATGTTT下游弓I物GGAAGACACCAATGAGCCACT探針MAR-TGGGGGAACCTGTGCC-MARHPV-16:上游引物AGGACCCACAGGAGCGAC下游引物AGTCATATACCTCACGTCGCAGT探針NEP-ATGCACAGAGCTGCAAACAA-NEPHPV-18:上游弓I物GGTTCAGGCTGGATTGCG下游引物TACACGCACACGCTTGGC探針JUP-TCGCAAACGTTCTGCTCC-JUPURA、MAR、NEP、JUP是AllGlo探針的四種不同熒光素。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種人乳頭瘤病毒常見型四重?zé)晒舛縋CR分型檢測方法，其特征是，所述的四重?zé)晒舛縋CR反應(yīng)體系，指的是由四組引物、探針以及2XqPCRMix定量PCR試劑組成的混合液。8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種人乳頭瘤病毒常見型四重?zé)晒舛縋CR分型檢測方法，其特征是，所述的標(biāo)準(zhǔn)分子，指的是利用基因克隆技術(shù)構(gòu)建的人工重組質(zhì)粒，每種質(zhì)粒只重組一種特異待檢靶基因序列。9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種人乳頭瘤病毒常見型四重?zé)晒舛縋CR分型檢測方法，其特征是，所述的四重?zé)晒舛縋CR反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線，指的是不同稀釋度標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子用四重?zé)晒舛縋CR反應(yīng)液進(jìn)行檢測所得，標(biāo)準(zhǔn)曲線的r2均大于0.98，擴(kuò)增效率在1.00-1.25之間，滿足熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的要求。全文摘要本發(fā)明公開了一種人乳頭瘤病毒常見型四重?zé)晒舛縋CR分型檢測方法。它包括一個以熒光定量PCR技術(shù)為基礎(chǔ)的四重PCR反應(yīng)體系，包含針對4種人乳頭瘤病毒(HPV)基因型的正、反向引物和AllGlo熒光探針，在適合的PCR條件下可在一個反應(yīng)管中同時檢測最多包括HPV-6、-11、-16、-18的DNA載量，包括特異性引物及熒光探針的設(shè)計、標(biāo)準(zhǔn)分子的構(gòu)建、標(biāo)準(zhǔn)曲線制備及臨床標(biāo)本檢測。本發(fā)明可以簡便快速地在一個反應(yīng)管中同時、快速地檢測臨床常見四型HPV感染，實現(xiàn)了單管PCR同時分型檢測四型HPV，且能夠定量檢測，操作簡單快速，靈敏度高，特異性、重復(fù)性好，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，對尖銳濕疣及常見型HPV致婦女宮頸癌變的早期防治、阻斷傳染源、減少HPV感染、監(jiān)測臨床療效均有很大的臨床價值。文檔編號G01N21/64GK101709335SQ200910155289公開日2010年5月19日申請日期2009年12月10日優(yōu)先權(quán)日2009年12月10日發(fā)明者余道軍,李蘭娟申請人:浙江大學(xué)