專利名稱：離子通道的抗體的制作方法
離子通道的抗體本公開涉及針對(duì)離子通道的El部分的抗離子通道抗體以及所述抗體的片段，其具有功能修飾特性；包含所述抗體的藥物組合物；所述抗體和包含其的組合物在治療(例如治療/調(diào)節(jié)疼痛)中的用途，以及用于產(chǎn)生和制備所述抗體的方法。離子通道是孔形成蛋白，其通過允許離子流下其電化學(xué)梯度而幫助建立和控制所有活細(xì)胞的細(xì)胞膜電勢(shì)。它們存在于圍繞所有生物學(xué)細(xì)胞的膜中。人基因組含有超過400 個(gè)離子通道基因，其代表大的多樣性并在許多細(xì)胞過程(例如分泌、肌肉收縮以及在心臟和神經(jīng)組織中產(chǎn)生和傳送動(dòng)作電位)中起到關(guān)鍵性的作用。離子通道是集成性膜蛋白，其可采用基于數(shù)個(gè)蛋白的組裝的大分子結(jié)構(gòu)。此類“多亞單位”組裝通常涉及這樣的排布穿過膜平面或脂雙層而圍繞充水孔緊密填裝的相同或同源蛋白。形成孔的亞單位(通常稱為α-亞單位)可與幫助控制離子通道蛋白的活性和細(xì)胞表面表達(dá)的輔助亞單位(膜結(jié)合的或細(xì)胞質(zhì)的)相締合。最近解析了各種離子通道的 X 射線結(jié)構(gòu)(Doyle 等人 Science 280:69(1998) ; Jiang 等人，Nature423 :33(2003) ；Long 等人，Science 309:897(2005))并表明孔結(jié)構(gòu)的組織在離子通道家族成員中是大部分保守的。離子通道孔的開和關(guān)(稱作門控過程)可被各種細(xì)胞或生物化學(xué)過程觸發(fā)。離子通道蛋白的最大的家族是由電壓門控通道(包括例如鈉、鈣和鉀離子通道)， 瞬時(shí)受體電勢(shì)離子通道，超極化活化的離子通道，向內(nèi)整流離子通道，兩孔結(jié)構(gòu)域鉀通道和電壓門控質(zhì)子通道構(gòu)成的。后者以PH敏感的方式去極化。向內(nèi)整流離子通道是由15個(gè)正式成員和I個(gè)非正式成員構(gòu)成的?？苫谕葱詫⒋思易暹M(jìn)一步細(xì)分為7個(gè)亞家族。目前，有約10種電壓門控的鈣通道已被鑒別。基于同源性，將瞬時(shí)受體電勢(shì)離子通道細(xì)分為6個(gè)亞家族經(jīng)典的(TRPC)，辣椒素受體(TRPV)，melastatin(TRPM)，多囊蛋白(TRPP)，黏脂質(zhì)(TRPML)和錨定跨膜蛋白 I (TRPA)。超極化活化的離子通道對(duì)于環(huán)核苷酸cAMP和cGMP是敏感的，其改變通道打開的電壓敏感性。這些通道對(duì)于一價(jià)陽離子K+和Na+是可滲透的。此家族有4個(gè)成員，所有這些形成六個(gè)跨膜α-亞單位的四聚體。當(dāng)這些通道在超極化條件下打開時(shí)，它們作為心臟 (特別是竇房結(jié))的起搏通道起作用。電壓門控和配體門控的離子通道是離子通道蛋白家族中最突出的成員。電壓門控離子通道(例如鈣，鈉和鉀通道)的活性是由細(xì)胞膜電勢(shì)中的變化控制的，而配體門控離子通道(例如GABA-A受體，乙酰膽堿受體)是由特定的細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外配體的結(jié)合控制的。 門控機(jī)制是非常復(fù)雜的，這涉及各種膜、孔和細(xì)胞質(zhì)的結(jié)構(gòu)，并且在離子通道的類別之間有差異。電壓門控的離子通道(有時(shí)稱作電壓敏感性離子通道)是在心臟和神經(jīng)組織中提供細(xì)胞應(yīng)激性的基礎(chǔ)的一類跨膜蛋白。這些通道被細(xì)胞超極化或去極化活化并產(chǎn)生引起控制細(xì)胞膜電勢(shì)的離子流。電壓門控的鈉通道一般負(fù)責(zé)動(dòng)作電位的起始，而電壓門控的鉀通道介導(dǎo)細(xì)胞膜再極化。各種電壓門控離子通道之間經(jīng)微調(diào)的相互作用對(duì)于塑造心臟和神經(jīng)
3動(dòng)作電位是關(guān)鍵的。一類電壓門控鈉通道包含九個(gè)不同的同種型(Navi. 1-1. 9)，并且已描述了四種不同的鈉通道特異性附屬蛋白(SCNlb-SCMb)。已描述了各種神經(jīng)細(xì)胞類型中(Llinas等人， J. Physiol. 305 :197-213(1980) ;Kostyuk 等人，Neuroscience 6:2423-2430(1981) ；Bossu 等人，Neurosci. Lett. 51 :241-246 (1984) 1981 ；Gilly 等人，Nature309 :448-450 (1984)； French 等人，Neurosci. Lett. 56 :289-294 (1985) ；Ikeda 等人，J. Neurophysiol. 55 527-539(1986) Jones 等人，J. Physiol. 389 :605-627 (1987) ；Alonso & Llinas, 1989 ； Gilly 等人，J. Neurosci. 9 :1362-1374(1989))及骨骼肌中(Gonoi 等人，J. Neurosci. 5 2559-2564(1985) ;Weiss 等人，Science233 :361-364(1986))那些同種型的不同功能活性。 NavL 5和NavL 4通道分別是心臟和肌肉組織中所表達(dá)的主要鈉通道同種型，而NavL 1，
I.2，I. 3，I. 6，I. 7，I. 8和I. 9在中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)中特異性地表達(dá)。使用天然存在的毒素河豚毒素(TTX)允許了基于它們對(duì)毒素的親和力而建立鈉通道同種型的藥理學(xué)分類。因此，將電壓門控鈉通道分類為TTX抗性(NavL 5，I. 8，I. 9)和TTX敏感性的。某些離子通道與疼痛的調(diào)節(jié)相關(guān)(見例如PNAS Nov 6,2001. vol 98ηο· 2313373-13378 和 The Journal of Neuroscience 22，200424(38)832_836)。離子通道NavL 7被認(rèn)為具有調(diào)節(jié)疼痛(例如神經(jīng)性疼痛)的能力，因此，其對(duì)于治療性干預(yù)而言是特別感興趣的靶標(biāo)。NavL 8和NavL 9也被認(rèn)為具有疼痛調(diào)節(jié)作用。NavL 7是電壓活化的、河豚毒素敏感性鈉通道，其由基因SCN9A編碼。NavL 7的獲得功能和失去功能的突變都引起人類中明顯的疼痛相關(guān)的異常。起初，通過連鎖分析將SCN9A中的獲得功能突變鑒別為紅斑性肢痛病(或原發(fā)性紅斑肢痛癥)和陣發(fā)性劇痛癥(以前稱為常見直腸痛)的原因。紅斑性肢痛病是罕見的常染色體顯性病癥，其與灼燒痛的發(fā)作以及四肢的發(fā)熱和發(fā)紅相關(guān)。其它方面健康的個(gè)體完全不能感知疼痛(沒有神經(jīng)病變)是非常罕見的表型。最近，由Cox等人(2006)和Goldberg 等人(2007)報(bào)道的兩個(gè)研究描述了這種表型，其作為常染色體隱性性狀被定位至染色體 2q24. 3上，此區(qū)域含有基因SCN9A。在兩個(gè)研究中，詳細(xì)的神經(jīng)學(xué)測(cè)試顯示出這些人能夠區(qū)分銳/鈍和熱/冷刺激，但是具有對(duì)痛覺的整體喪失。都通過咬自己而具有唇和/或舌的損傷。都具有經(jīng)常性的青腫和切口，且大多數(shù)遭受了骨折或骨髓炎。這些數(shù)據(jù)構(gòu)成強(qiáng)的證據(jù)表明在沒有神經(jīng)病變或認(rèn)知，情緒或神經(jīng)病癥的條件下， 引起離子通道NavL 7喪失功能的SCN9A通道病變與對(duì)于疼痛的不敏感相關(guān)，并且在臨床上證實(shí)了 NavL 7是疼痛相關(guān)的靶標(biāo)。此外，從KO研究和動(dòng)物疼痛模型將顯示，NavL 7在炎性疼痛中起主要作用。圖2a是離子通道(例如NavL 7)的圖示，其包含四個(gè)結(jié)構(gòu)域A，B，C和D (也稱為結(jié)構(gòu)域I，II，III和IV)。每個(gè)結(jié)構(gòu)域包含6個(gè)跨膜蛋白螺旋51，52，53，54，55和56。每個(gè)跨膜蛋白的確切氨基酸數(shù)目取決于所采用的數(shù)據(jù)庫錄入而變化，但是UniProtKB/Swiss-Prot 提供了下列關(guān)于NavL 7的信息在結(jié)構(gòu)域A中，跨膜蛋白SI，S2，S 3，S4，S5和S6分別被指定了氨基酸122-145， 154-173，187-205，212-231，248-271 和 379-404 ；在結(jié)構(gòu)域B中，跨膜蛋白SI，S2，S 3，S4，S5和S6分別被指定了氨基酸739-763， 775-798，807-826，833-852，869-889 和 943—968 ；
在結(jié)構(gòu)域C中，跨膜蛋白S1，S2，S 3，S4，S5和S6分別被指定了氨基酸1188-1211， 1225-1250，1257-1278，1283-1304，1324-1351 和 1431-1457 ;以及在結(jié)構(gòu)域D中，跨膜蛋白S1，S2，S 3，S4，S5和S6分別被指定了氨基酸1511-1534， 1546-1569，1576-1599，1610-1631，1647-1669 和 1736-1760。在公共數(shù)據(jù)庫中可獲得許多序列的天然變化，例如見UniProtKB/Swi ss-Prot Q15858。在本公開中，SI，S2，S 3，S4，S5和S6是指上面所描述的實(shí)體或備選離子通道中的相應(yīng)實(shí)體，包括向其給予了不同的氨基酸指定且包括天然或非天然變體中的相應(yīng)實(shí)體， 以及它們的不同同種型。每個(gè)結(jié)構(gòu)域還含有細(xì)胞外親水性環(huán)E1，E2和E3。每個(gè)結(jié)構(gòu)域中El的氨基酸序列在跨膜區(qū)域SI之后開始且在S2處結(jié)束。每個(gè)結(jié)構(gòu)域中的El區(qū)別于其它結(jié)構(gòu)域中的El。 每個(gè)結(jié)構(gòu)域中E2的氨基酸序列在跨膜區(qū)域S3之后開始且在S4處結(jié)束。每個(gè)結(jié)構(gòu)域中的 E2區(qū)別于其它結(jié)構(gòu)域中的E2。每個(gè)結(jié)構(gòu)域中E3的氨基酸序列在跨膜區(qū)域S5之后開始且在S6處結(jié)束。每個(gè)結(jié)構(gòu)域中的E3也區(qū)別于其它結(jié)構(gòu)域中的E3。雖然Nav和Cav離子通道包含四個(gè)結(jié)構(gòu)域A，B，C和D (每個(gè)結(jié)構(gòu)域含有六個(gè)跨膜蛋白螺旋)，其它的離子通道(例如Kv離子通道，HCN離子通道和TRP離子通道)含有一個(gè)結(jié)構(gòu)域。對(duì)于Nav和Cav離子通道中的每個(gè)結(jié)構(gòu)域，Kv離子通道，HCN離子通道和TRP離子通道包含6個(gè)跨膜蛋白螺旋SI，S2，S3，S4，S5和S6以及三個(gè)細(xì)胞外親水性環(huán)El，E2和E3， 如上文所述。在NavL 7離子通道中，細(xì)胞外環(huán)(E環(huán))是圖2c中SEQ ID NO :105的如下氨基酸
殘基
權(quán)利要求
1.抗El離子通道抗體或其結(jié)合片段，其結(jié)合所述離子通道的El細(xì)胞外環(huán)，其中所述離子通道在疼痛調(diào)節(jié)中有功能，并且所述抗體或片段在與所述離子通道結(jié)合后功能性地修飾所述離子通道。
2.根據(jù)權(quán)利要求I的抗El離子通道抗體或其結(jié)合片段，其中所述離子通道是選自下組的鈉離子通道Navl. 3，I. 6，I. 7，I. 8 和 I. 9。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的抗El離子通道抗體或其結(jié)合片段，其中所述抗體結(jié)合所述離子通道的結(jié)構(gòu)域A，結(jié)構(gòu)域B，結(jié)構(gòu)域C或結(jié)構(gòu)域D中的El環(huán)。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或權(quán)利要求3的抗El離子通道抗體或其結(jié)合片段，其中所述抗體或片段是抗NavL 7抗體或片段。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的抗El離子通道抗體或其結(jié)合片段，其中所述抗體或其片段結(jié)合選自下組的氨基酸序列SEQ ID NO 107至130。
6.根據(jù)權(quán)利要求2或權(quán)利要求3的抗El離子通道抗體或其結(jié)合片段，其中所述抗體或其片段結(jié)合具有選自下列的氨基酸序列的NavL 3肽SEQ ID NO 131至134。
7.根據(jù)權(quán)利要求2或權(quán)利要求3的抗El離子通道抗體或其結(jié)合片段，其中所述抗體或其片段結(jié)合具有選自下列的氨基酸序列的NavL 6肽SEQ ID NO 135至138。
8.根據(jù)權(quán)利要求2或權(quán)利要求3的抗El離子通道抗體或其結(jié)合片段，其中所述抗體或其片段結(jié)合具有選自下列的氨基酸序列的NavL 8肽SEQ ID NO 139至145。
9.根據(jù)權(quán)利要求2或權(quán)利要求3的抗El離子通道抗體或其結(jié)合片段，其中所述抗體或其片段結(jié)合具有選自下列的氨基酸序列的NavL 9肽SEQ ID NO 146至149。
10.根據(jù)權(quán)利要求I的抗El離子通道抗體或其結(jié)合片段，其中所述抗體或其片段結(jié)合選自下組的鉀離子通道KV2. 1，Κν2. 2和Κν7. χ。
11.根據(jù)權(quán)利要求I的抗El離子通道抗體或其結(jié)合片段，其中所述抗體或其片段結(jié)合選自下列的可超極化的離子通道=HCNl和HCN2。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的抗El離子通道抗體或其結(jié)合片段，其中所述抗體或其片段結(jié)合具有氨基酸序列SEQ ID NO :150或151的肽。
13.根據(jù)權(quán)利要求I的抗El離子通道抗體或其結(jié)合片段，其中所述抗體或其片段結(jié)合選自下組的鈣離子通道Cav3. 1，Cav3. 2，Cav3. 3，Cav2. 1，Cav2. 2 和 Cav2. 3。
14.根據(jù)權(quán)利要求I的抗El離子通道抗體或其結(jié)合片段，其中所述抗體或其片段結(jié)合選自下列的非門控離子通道TRPV1，TRPAl，AS ICl，TRPM8, TRPV3和TRP4。
15.根據(jù)權(quán)利要求I至14中任一項(xiàng)的抗體或片段，其中在體外膜片鉗測(cè)定中，所述抗體以至少5%抑制其所特異于的相關(guān)離子通道的功能。
全文摘要
抗E1離子通道抗體或其結(jié)合片段，包含所述抗體的藥物組合物，所述抗體和包含其的組合物在治療、例如治療/調(diào)節(jié)疼痛中的用途，以及用于產(chǎn)生和制備所述抗體的方法。
文檔編號(hào)C07K16/28GK102597002SQ201080048573
公開日2012年7月18日 申請(qǐng)日期2010年10月27日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月27日
發(fā)明者A·D·G·勞森, C·G·J·沃爾夫, H·M·菲尼, K·M·米勒, M·R·德里克, T·S·巴克 申請(qǐng)人:Ucb醫(yī)藥有限公司