專利名稱：一種利用酶膜反應(yīng)器制備燕麥ace抑制肽的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用酶膜反應(yīng)器制備燕麥ACE抑制肽的方法。
背景技術(shù)：
高血壓是引起冠心病、心肌梗塞、腦卒中風(fēng)和腎功能衰竭等并發(fā)癥的主要原因，被喻為人類健康的“第一殺手”，血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(Angiotensin Converting Enzyme，簡稱 ACE)是使血壓升高的一個關(guān)鍵酶(OndettiMA，Rubin B, Cushman DW. Design of specific inhibitors of angiotensin converting enzyme :a new class of orally active antihypertensive agents [J] · Science, 1997 (196) :441-444.)，通過抑制 ACE 的活性就可達(dá)到預(yù)防和治療高血壓的目的。目前，治療高血壓的主要是ACE抑制劑類藥物，主要通過化學(xué)合成，其雖然具有高活性和特異性，但服用過程中會出現(xiàn)嚴(yán)重的毒副作用(Messerli F H.Combinations in the treatment of hypertension :ACE inhibitors and calcium antagonists [J]. American Journal of Hypertension，1999，(12) :86-90.)。因此，安全無毒副作用的ACE抑制劑類藥物將成為新型抗高血壓藥物的研究方向，而食物源ACE抑制肽正好符合這一要求，為研制新型抗高血壓藥物提供了一條新的途徑。酶解法是制備生物活性肽的最主要方法，因?yàn)樗膺^程僅使蛋白肽鍵斷裂產(chǎn)生特定序列的肽段，而氨基酸的結(jié)構(gòu)和構(gòu)型保持不變，不會產(chǎn)生有毒和有害物質(zhì)，具有安全性高、水解條件溫和、過程易控制及儀器設(shè)備簡單等獨(dú)特的優(yōu)勢(Messerli F H. Combinations in the treatment of hypertension :ACE inhibitors and calcium antagonists[J]. American Journal of Hypertension，1999，(12) :86-90.)。目前，工業(yè)化水解蛋白制備生物活性肽的方式幾乎都是間歇式生產(chǎn)，其存在很多不足之處，如酶的一次性使用、各批次產(chǎn)物性能不穩(wěn)定、生產(chǎn)周期長及勞動強(qiáng)度大等， 而酶膜反應(yīng)器的使用則能很好地克服這些不足之處。酶膜反應(yīng)器(Enzymatic Membrane Reactor，簡稱EMR)是把酶促反應(yīng)與膜的選擇性物質(zhì)傳遞有效地結(jié)合在一起，即采用適當(dāng)孔徑的膜將酶和底物與產(chǎn)物分開，并使產(chǎn)物不斷透過膜的一種反應(yīng)設(shè)備，創(chuàng)造出有利于過程的熱力學(xué)和動力學(xué)，實(shí)現(xiàn)了反應(yīng)與分離的同步進(jìn)行(Deeslie W D，Cheryan Μ. A CSTR-hollow fiber system for continuous hydrolysis of proteins !performance and kinetics[J]. Biotechnology and Bioengineering，1981，23(10) :2257-2271.)。同傳統(tǒng)的化學(xué)反應(yīng)器或其他酶反應(yīng)器(如間歇反應(yīng)器)等相比，酶膜反應(yīng)器在結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)和操作流程上的優(yōu)點(diǎn)是比較明顯的，如可連續(xù)操作、反應(yīng)-分離相耦合、酶的循環(huán)再生及有效富集產(chǎn)物等(Giorno L, Drioli. Biocatalytic membrane reactors !applications perspectives [J], Trends in Biotechnology, 2000,18(8) :339-349) 隨著基因工程以及材料科學(xué)的發(fā)展，酶的催化性能及膜的性能均得到逐步的改善和提高，再加上高效固定化技術(shù)的開發(fā)以及過程設(shè)計(jì)的不斷優(yōu)化，已使得酶膜反應(yīng)器在生物、醫(yī)藥、化工、環(huán)保、食品工業(yè)等領(lǐng)域得到了越來越廣泛的應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種利用酶膜反應(yīng)器制備燕麥ACE抑制肽的方法。本發(fā)明所提供的制備燕麥ACE抑制肽的方法，是在酶膜反應(yīng)器中進(jìn)行制備的，包括下述步驟1)將燕麥蛋白溶液加入到所述酶膜反應(yīng)器的酶解罐中，調(diào)節(jié)所述燕麥蛋白溶液的PH值為7. 0 8. 0，并加熱至55°C 65°C ；然后將堿性蛋白酶(Alcalase)加入到所述酶解罐中，使燕麥蛋白與堿性蛋白酶在攪拌狀態(tài)下反應(yīng)2 ^iin ；其中，所述燕麥蛋白溶液的質(zhì)量濃度為2.5% _3%，所加入的堿性蛋白酶與所述燕麥蛋白溶液中燕麥蛋白的配比為(11250-19900)U/g燕麥蛋白；2)關(guān)閉所述酶膜反應(yīng)器中超濾循環(huán)裝置的超濾膜透過液出口，同時打開蠕動泵， 使酶解液以45 50L/h的料液流量常壓循環(huán)2 ^iin ；3)開啟所述超濾膜透過液出口，使酶解液仍以45 50L/h的料液流量循環(huán)，調(diào)節(jié)超濾膜的操作壓力為0. 05 0. 07MPa,進(jìn)行酶解-膜分離耦聯(lián)反應(yīng)，反應(yīng)過程中每隔30min 向所述酶解罐中補(bǔ)加燕麥蛋白溶液維持反應(yīng)體系體積和蛋白濃度恒定，同時保持反應(yīng)體系的PH值為7. 0 8. 0、溫度為55°C 65°C，反應(yīng)結(jié)束將收集的超濾液干燥，即得到所述燕麥 ACE抑制肽。為了降低蠕動泵運(yùn)轉(zhuǎn)過程對酶造成的破壞，步驟幻中所述蠕動泵的轉(zhuǎn)速可選擇 M0-300rpm。同時，為了減少超濾膜對酶的吸附，可在使用前，用燕麥蛋白溶液對超濾膜進(jìn)行預(yù)吸附處理，即加酶之前關(guān)閉所述酶膜反應(yīng)器中超濾循環(huán)裝置的超濾膜透過液出口，同時打開蠕動泵，使燕麥蛋白溶液以45 50L/h的料液流量常壓循環(huán)2 ^iin達(dá)到預(yù)吸附處理的目的。上述所用的超濾膜具體可為中空纖維膜，其截留分子量為6000 lOOOODa。步驟3)中所述酶解-膜分離耦聯(lián)反應(yīng)的反應(yīng)時間可為3-6小時。在反應(yīng)過程中，當(dāng)超濾膜的膜通量下降至初始膜通量的30%或30%以下時停止反應(yīng)，利用反沖系統(tǒng)恢復(fù)膜通量繼續(xù)反應(yīng)。步驟幻中反應(yīng)過程中向所述酶解罐中補(bǔ)加燕麥蛋白溶液的量是通過測定每小時收集的超濾液的量來確定的，補(bǔ)料濃度則是通過測定超濾液中的多肽含量確定的，即出多少產(chǎn)物補(bǔ)多少量。本發(fā)明對堿性蛋白酶酶活定義Ig固體酶粉(或Iml液體酶)在酶最適條件下 (600C、pH值8. 0的條件下)，每分鐘降解酪蛋白釋放1 μ g酪氨酸所需要的酶量為一個酶活單位U，以U/g(U/ml)表示。本發(fā)明通過研究酶膜反應(yīng)器系統(tǒng)對酶活的影響，可知酶膜反應(yīng)器系統(tǒng)對Alcalase 具有很好的保留效果，其中蠕動泵運(yùn)轉(zhuǎn)過程對酶造成的破壞和超濾膜對酶的吸附是導(dǎo)致 Alcalase酶活損失的主要原因，通過選擇適當(dāng)?shù)娜鋭颖棉D(zhuǎn)速以及超濾膜對底物的預(yù)吸附可降低Alcalase酶活損失。然后以酶活保留率和多肽生產(chǎn)效率為指標(biāo)，考察了底物濃度、加酶量、料液流量、 操作壓力、溫度和PH值六因素對酶活保留率和多肽生產(chǎn)效率的影響，通過DPS軟件設(shè)計(jì)均勻試驗(yàn)方案和SPSS軟件處理試驗(yàn)數(shù)據(jù)，求得在利用酶膜反應(yīng)器酶解燕麥麩蛋白制備ACE抑制肽過程中，酶活保留率和多肽生產(chǎn)效率均取較大值時各因素的水平條件為底物質(zhì)量濃度 (即燕麥蛋白溶液濃度)3%、加酶量3% (17000U/g)、料液流量45L/h、操作壓力0. 06MPa、溫度60°C、pH值=7 ；經(jīng)過驗(yàn)證，在該條件下酶膜反應(yīng)器對Alcalase酶活的保留率達(dá) 92. 86%、多肽生產(chǎn)效率為 1896. 5mg/ (m2 · h)。同時，以ACE抑制率為指標(biāo)，利用Design Expert 6. 0. 5設(shè)計(jì)四因素三水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)，求得酶膜反應(yīng)器制備燕麥ACE抑制肽的最佳工藝為底物濃度3%、加酶量 3. 5% (19900U/g)、料液流量45L/h、操作壓力0. 07MPa、溫度61 °C、pH值=8，經(jīng)過驗(yàn)證，在該條件下產(chǎn)物的ACE抑制率可達(dá)67. 86%,多肽生產(chǎn)效率為1896. 5mg/(m2 · h)。綜上所述，本發(fā)明以優(yōu)質(zhì)燕麥蛋白質(zhì)為原料，在最佳工藝條件下利用酶膜反應(yīng)器酶解燕麥蛋白制備燕麥ACE抑制肽。所得產(chǎn)物的ACE抑制率可達(dá)67. 86%，多肽生產(chǎn)效率可達(dá)1896. 5mg/(m2 · h)。該方法具有良好的應(yīng)用前景。


圖1為本發(fā)明所用的分體式酶膜反應(yīng)器的結(jié)構(gòu)示意圖；其中，1-反應(yīng)罐；2-恒溫水浴加熱套；3-恒溫原料罐；4-堿液罐；5-攪拌器；6-溫度計(jì)；7-pH計(jì)；8-蠕動泵；9、 12-壓力表；10-超濾膜；11、13、14_控制閥；15-流量計(jì)；16-產(chǎn)物儲液罐。圖2為酶活保留率和截留液于^Onm處吸光度隨超濾時間的變化。圖3為酶活泄漏率和透過液于^Onm處吸光度隨超濾時間的變化。圖4為酶活損失率隨超濾時間的變化。圖5為蠕動泵、攪拌器、壓力表及硅膠管對Alcalase酶活的影響。圖6為超濾膜對Alcalase酶活的影響。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所述實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法；所述試劑和生物材料，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑獲得。燕麥麩皮(蛋白質(zhì)含量17. 8% )河北省康?？h翔龍食品有限公司；UE0S503中空纖維膜天津膜天膜工程技術(shù)有限公司，截留分子量6000Da ；血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)、 馬尿酰-組氨酰-亮氨酸(HHL) =Sigma公司；堿性蛋白酶(Alcalase) :N0V0ZymeS公司； R)lin-酚試劑=Sigma公司；酪蛋白北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；其他試劑均為分析純。燕麥蛋白質(zhì)是按照下述方法制備得到的首先，稱取一定量的燕麥麩皮置于反應(yīng)罐中，以料液比1 8&/1111)加入去離子水，將？!1值調(diào)至4.5，并加入1.5(% (w/w)糖化酶， 反應(yīng)罐升溫至55°C，恒溫?cái)嚢杳附?0min;接著，將提取液的pH值調(diào)至6，加入(w/w) 淀粉酶，反應(yīng)罐升溫至85°C，酶解，直至無淀粉為止；然后，再將提取液的溫度降至55°C，pH 值調(diào)至4.5，加入(w/w)糖化酶，酶解60min;最后，將提取液pH值調(diào)至10，在55°C恒溫條件下攪拌浸提90min，離心GOOOr/min)，將上清液pH值調(diào)至燕麥麩蛋白等電點(diǎn)處(pi =4. 0)，室溫靜置12h，離心GOOOr/min)，將燕麥麩蛋白沉淀物置于真空干燥箱中烘干，粉碎，即得燕麥麩蛋白粉，備用。下述實(shí)施例中利用R)lin_酚法測酶活力的方法對蛋白酶活力進(jìn)行測定，具體測定過程如下1)酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制過程，見表1所示。表1酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
權(quán)利要求
1.一種制備燕麥ACE抑制肽的方法，是在酶膜反應(yīng)器中進(jìn)行制備的，包括下述步驟1)將燕麥蛋白溶液加入到所述酶膜反應(yīng)器的酶解罐中，調(diào)節(jié)所述燕麥蛋白溶液的 PH值為7.0 8. 0，并加熱至55°C 65°C ；然后再將堿性蛋白酶加入到所述酶解罐中， 使燕麥蛋白與堿性蛋白酶在攪拌狀態(tài)下反應(yīng)2 ^iin;其中，所述燕麥蛋白溶液的質(zhì)量濃度為2.5% -3%，所加入的堿性蛋白酶與所述燕麥蛋白溶液中燕麥蛋白的配比為 (11250-19900)U/g燕麥蛋白；2)關(guān)閉所述酶膜反應(yīng)器中超濾循環(huán)裝置的超濾膜透過液出口，同時打開蠕動泵，使酶解液以45 50L/h的料液流量常壓循環(huán)2 ^iin ；3)開啟所述超濾膜透過液出口，酶解液仍以45 50L/h的料液流量循環(huán)，調(diào)節(jié)超濾膜的操作壓力為0. 05 0. 07MPa，進(jìn)行酶解-膜分離耦聯(lián)反應(yīng)，反應(yīng)過程中每隔一定時間向所述酶解罐中補(bǔ)加燕麥蛋白溶液維持反應(yīng)體系體積和蛋白濃度恒定，同時保持反應(yīng)體系的PH 值為7. 0 8. 0、溫度為55°C 65°C，反應(yīng)結(jié)束將收集的超濾液干燥，即得到所述燕麥ACE 抑制肽。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟幻中所述蠕動泵的轉(zhuǎn)速為 240-300rpmo
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于步驟幻中超濾循環(huán)裝置的超濾膜在使用前用燕麥蛋白溶液進(jìn)行預(yù)吸附處理。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于步驟幻中超濾循環(huán)裝置的超濾膜為中空纖維膜，其截留分子量為6000 lOOOODa。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于步驟3)中所述酶解-膜分離耦聯(lián)反應(yīng)的反應(yīng)時間為3-6小時。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于步驟幻中每隔一定時間的時間間隔為30分鐘。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于步驟1)中所述燕麥蛋白溶液的質(zhì)量濃度為3%，所加入的堿性蛋白酶與所述燕麥蛋白溶液中燕麥蛋白的配比為 19900U/g si5e ；步驟；3)中所述酶解液以45L/h的料液流量循環(huán)，超濾膜的操作壓力為 0. 07MPa,所述酶解-膜分離耦聯(lián)反應(yīng)的反應(yīng)體系的pH值為8. 0、溫度為61°C。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種制備燕麥ACE抑制肽的方法。通過研究酶膜反應(yīng)器系統(tǒng)對酶活的影響，可知酶膜反應(yīng)器系統(tǒng)對Alcalase具有很好的保留效果，其中蠕動泵運(yùn)轉(zhuǎn)過程對酶造成的破壞和超濾膜對酶的吸附是導(dǎo)致Alcalase酶活損失的主要原因。通過利用Design Expert 6.0.5設(shè)計(jì)四因素三水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)，求得酶膜反應(yīng)器制備燕麥ACE抑制肽的最佳工藝條件為底物濃度3％、加酶量19900U/g燕麥蛋白、料液流量45L/h、操作壓力0.07MPa、溫度61℃、pH值＝8，在該條件下產(chǎn)物的ACE抑制率可達(dá)67.86％。
文檔編號C07K1/34GK102212599SQ20111011251
公開日2011年10月12日 申請日期2011年4月29日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月29日
發(fā)明者任清, 張曉平, 郭項(xiàng)雨 申請人:北京工商大學(xué)