專利名稱：vMIP-II蛋白的固相合成方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及多肽的化學(xué)合成方法，具體涉及蛋白質(zhì)VMIP-II的固相合成方法。
背景技術(shù)：
病毒巨 B·細(xì)胞炎癥蛋白 II (viral macrophage inflammatory protein-II, vMIP-II)是由卡波氏肉瘤病毒(又稱人皰疹病毒8)編碼的病毒基因產(chǎn)物。vMIP-II全基因編碼94個氨基酸，成熟蛋白為74氨基酸，與人的MIP同源性高達(dá)41 %，其中8種非極性氨基酸占40 %，具有較強(qiáng)的疏水性。vMIP-II蛋白不僅能夠通過與趨化因子受體結(jié)合在免疫炎癥病理反應(yīng)中發(fā)揮作用，而且還可以作用于免疫細(xì)胞上的趨化因子受體，通過激動或拮抗受體來調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的功能，在HIV感染/艾滋病和移植排斥反應(yīng)等方面有更多的研究應(yīng)用價值。申請人:已成功運(yùn)用大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)來表達(dá)vMIP-II，但由于需要經(jīng)過 vMIP-II包涵體變性、復(fù)性的過程，純化周期較長，制備成本也較高，工業(yè)化生產(chǎn)及產(chǎn)品應(yīng)用受到限制。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的上述問題，提供一種vMIP-II蛋白的固相合成方法。本發(fā)明通過以下技術(shù)手段實(shí)現(xiàn)上述目的 一種vMIP-II蛋白的固相合成方法，包括以下步驟
(1)固相合成儀的反應(yīng)瓶清洗后加入二甲基二氯硅烷，通風(fēng)過夜使反應(yīng)瓶硅烷化，清洗后在-80°c冷卻反應(yīng)瓶，再次清洗，烘干備用；
(2)稱取Wang’s樹脂置于反應(yīng)瓶中，加入3倍于樹脂體積的DCM溶液，溶脹后排空液體，然后在多肽合成儀上按偶連氨基酸、茚三酮反應(yīng)檢測和α -氨基脫保護(hù)的循環(huán)從C端到 N端進(jìn)行，直到全部氨基酸殘基都偶連上去；
(3)偶連完成后，取下反應(yīng)瓶用DCM清洗，抽干樹脂后用預(yù)冷的切割液切割，切割下來的多肽進(jìn)行純化后得到產(chǎn)品。步驟(1)中所述清洗是用100%乙醇充分清洗；所述二甲基二氯硅烷的濃度為5%， 在此濃度下能使反應(yīng)瓶達(dá)到最佳的硅烷化效果。步驟(2)中所述溶脹為溶脹30min。溶脹30min能使樹脂達(dá)到充分溶脹。步驟(3)中所述切割液為切割液為1-羥基苯并三氮唑(HOBt)。Fmoc脫保護(hù)所使用的切割液以往常用的為堿性試劑如哌啶等，其親核性會在一定程度上會引起多肽二硫鍵的解離，從而導(dǎo)致合成的目的肽純度下降，以及合成效率的降低。但是，我們使用“ ι-羥基苯并三氮唑(HOBt)”作為Fmoc脫保護(hù)切割液，能有效抑制多肽二硫鍵的解離，從而提高了合成的目的肽純度以及合成效率。所述純化是用HPLC進(jìn)行純化。
多肽純化在Waters600E高壓液相色譜儀上，用Kromasil 100-5C18柱子進(jìn)行高壓反相色譜。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的制備方法具有以下有益效果
我們通過這種化學(xué)合成方法，獲得了具有活性的vMIP-II，提高了蛋白的純度，縮短了生產(chǎn)周期，為將來生產(chǎn)vMIP-II開辟了新的途徑。主要由于Fmoc脫保護(hù)所使用的切割液以往常用的為堿性試劑如哌啶等，其親核性會在一定程度上會引起多肽二硫鍵的解離，從而導(dǎo)致合成的目的肽純度下降，以及合成效率的降低。我們使用“1-羥基苯并三氮唑(HOBt)” 作為Fmoc脫保護(hù)切割液，能有效抑制多肽二硫鍵的解離，從而提高了合成的目的肽純度以及合成效率。


圖1.實(shí)施例1中得到的vMIP-II蛋白用API2000 LC/MS/MS進(jìn)行質(zhì)譜分析的結(jié)果圖。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 vMIP-II多肽合成與純化 (l)vMIP-II多肽合成
多肽采用Fmoc —固相合成法在多肽合成儀上合成，將反應(yīng)瓶用100%乙醇充分清洗后，加入約40ml的5%的二甲基二氯硅烷放置通風(fēng)櫥中過夜使反應(yīng)瓶硅烷化，經(jīng)乙醇粗洗后，置于-80°C冰箱30min冷卻反應(yīng)瓶，再次用乙醇洗滌，烘干備用；稱取0. 5mmol Wang’ s resin (Wang’ s樹脂)0. 7130g置于反應(yīng)瓶中，加入3倍于樹脂體積的DCM (二氯甲烷)溶液， 溶脹30min后排空液體。然后在多肽合成儀上按偶連氨基酸、茚三酮反應(yīng)檢測和α-氨基脫保護(hù)的循環(huán)從C端到N端進(jìn)行，直到全部氨基酸殘基都偶連上去。偶連完成后，取下反應(yīng)瓶用DCM清洗，抽干樹脂后用預(yù)冷的切割液，切割液為1-羥基苯并三氮唑(HOBt)。切割下來的多肽用HPLC進(jìn)行純化。多肽純化在WaterS600E高壓液相色譜儀上，用Kromasil 100-5C18柱子進(jìn)行高壓反相色譜，將收集的目的峰多肽凍干保存。(2)vMIP-II多肽純度的檢測
HPLC檢測多肽vMIP-II的純度取微量實(shí)施例1方法制備的多肽vMIP-II的凍干粉溶于體積百分比為50%甲醇與50%雙蒸水的混合液中溶解，使終濃度小于0. lmg/ml。用 HPLC的微量上樣器按25 μ 1上樣到Kromasil 100-5C18柱子中，用0. 5ml/min的流速按體積百分比為90%乙腈 10%乙腈做線形梯度洗脫，用220nm波長檢測。取多肽vMIP-II成品，加入雙蒸水配成溶液，用API2000 LC/MS/MS進(jìn)行質(zhì)譜分析。分析結(jié)果如圖1，合成純化后的多肽VMIP-II峰面積占總面積的98. 20%，也即是多肽VMIP-II的純度為98. 20%。實(shí)施例2多肽活性測定-vMIP-II對HIV-I IIIB誘導(dǎo)的細(xì)胞合胞體形成的抑制將對數(shù)生長期MT4細(xì)胞(由廣東省疾病預(yù)防控制中心提供)用RPMI-1640培養(yǎng)液調(diào)至每
毫升8 X IO6個，取Iml離心棄上清，加入500μ1細(xì)胞培養(yǎng)液重懸細(xì)胞。96孔板中每孔加入 80μ1 MT4細(xì)胞懸液，加入HIV-Iiiib病毒(人類艾滋病毒-Iiiib型)(由廣東省疾病預(yù)防控制中心提供)[約1000 TCID5tl/(IO6ceIl) ]20μ1，分別在不同孔內(nèi)加入不同濃度的VMIP-II (600、 60、6 ng/ml) ΙΟΟμΙ，每個濃度設(shè)3個復(fù)孔(加vMIP-II的為實(shí)驗(yàn)孔)。同時設(shè)置空白對照組和陽性對照組?？瞻讓φ战M只加正常MT4細(xì)胞和重組蛋白 vMIP-II (實(shí)施例1方法制備)，不加HIV-IIIIB病毒；陽性對照組加MT4細(xì)胞及HIV-IIIIB病毒，不加藥物。置于37°C、0. 5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)第3天觀察樣品對合胞體形成的影響，在倒置顯微鏡下計數(shù)HIV-I■誘導(dǎo)MT4 細(xì)胞形成的合胞體數(shù)。計算vMIP-II對HIV-IIIIB誘導(dǎo)MT4細(xì)胞形成合胞體的抑制率，按照 Reed- Muench方法求出其IC5tl (半數(shù)抑制濃度)，確定蛋白抑制50%的感染細(xì)胞形成合胞體的IC5tl值。計算公式如下
八敝碰陽性對照孔合胞體數(shù)-實(shí)驗(yàn)孔合胞體數(shù)u, 口胞體開,成的抑制華(%戶-,團(tuán)性對照孔合胞體數(shù)-Xl00%
IC50 = Ig"1 [Xm-i (Σ P-0. 5)]
注Xm 設(shè)計的最大濃度的對數(shù)值；i 各濃度稀釋倍數(shù)的對數(shù)值；ΣΡ 各組合胞體形成抑制率之和；0. 5 經(jīng)驗(yàn)常數(shù)。 不同濃度的蛋白vMIP-II，與感染HIV-IIIIB病毒的M4細(xì)胞共培養(yǎng)，培養(yǎng)至第3天， 在倒置顯微鏡下計數(shù)HIV-Iiiib誘導(dǎo)MT4細(xì)胞形成的合胞體數(shù)。用SPSS 12. 0統(tǒng)計軟件進(jìn)行 ANOVA分析各組合胞體數(shù)，vMIP-II組和陽性對照組比較采用Durmett-t檢驗(yàn)法。
表1數(shù)據(jù)表明，不同濃度的蛋白vMIP- 11(600,60,6 ng/ml)對合胞體形成的抑制率均與陽性對照組有差異，顯示出較強(qiáng)的抑制病毒合胞體形成的活性，其IC5tl為1.02 ng/
ml ο 表1重組蛋白vMIP-II對HIV-Iiiib誘導(dǎo)的合胞體形成的抑制作用CT 士S，《=3)
組別藥物濃度(ng/ml)合胞體數(shù)(個)合胞體形成抑制率(%)IC50 (ng/ml)陰性對照6000. 00 土 0. 00——陽性對照—110. 02 土 20. 14——vMIP-II1. 02vMIP-II60036. 09 土 5. 34**68. 25vMIP-II6048. 23 土 8. 12林57. 31vMIP-II669. 30 土 5. 41林37. 29
注代表vMIP-II各組的合胞體數(shù)與陽性對照組相比，廣< 0.05。結(jié)論
申請人先前已成功運(yùn)用大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)來表達(dá)vMIP-II，但由于需要經(jīng)過 vMIP-I I包涵體變性、復(fù)性的過程，純化周期較長，制備成本也較高。在本發(fā)明中，我們通過化學(xué)合成方法，獲得具有活性的vMIP-II，提高了蛋白的純度，縮短了生產(chǎn)周期，為將來生產(chǎn) vMIP-I I開辟了新的途徑。
權(quán)利要求
1.VMIP-II蛋白的固相合成方法，步驟如下(1)固相合成儀的反應(yīng)瓶清洗后加入二甲基二氯硅烷，通風(fēng)過夜使反應(yīng)瓶硅烷化，清洗后在-80°c冷卻反應(yīng)瓶，再次清洗，烘干備用；(2)稱取Wang’s樹脂置于反應(yīng)瓶中，加入3倍于樹脂體積的DCM溶液，溶脹后排空液體，然后在多肽合成儀上按偶連氨基酸、茚三酮反應(yīng)檢測和α -氨基脫保護(hù)的循環(huán)從C端到 N端進(jìn)行，直到全部氨基酸殘基都偶連上去；(3)偶連完成后，取下反應(yīng)瓶用DCM清洗，抽干樹脂后用預(yù)冷的切割液切割，切割下來的多肽進(jìn)行純化后得到產(chǎn)品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的vMIP-II蛋白的固相合成方法，其特征在于步驟(1)中所述清洗是用100%乙醇充分清洗。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的vMIP-II蛋白的固相合成方法，其特征在于步驟(1)中所述二甲基二氯硅烷的濃度為5%。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的vMIP-II蛋白的固相合成方法，其特征在于步驟(2)中所述溶脹為溶脹30min。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的vMIP-II蛋白的固相合成方法，其特征在于步驟(3)中所述切割液為1-羥基苯并三氮唑。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的vMIP-II蛋白的固相合成方法，其特征在于步驟(3)中所述純化是用HPLC進(jìn)行純化。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的vMIP-II蛋白的固相合成方法，其特征在于HPLC純化在 Waters600E高壓液相色譜儀上，用Kromasil 100-5C18柱子進(jìn)行高壓反相色譜。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種vMIP-II蛋白的固相合成方法，其步驟為反應(yīng)瓶加入二甲基二氯硅烷通風(fēng)過夜使反應(yīng)瓶硅烷化，乙醇粗洗后置于-80℃冷卻，再次洗滌烘干，稱取樹脂置于反應(yīng)瓶中，加入3倍于樹脂體積的DCM(二氯甲烷)溶液，溶脹30min后排空液體，然后在多肽合成儀上按偶連氨基酸、茚三酮反應(yīng)檢測和α-氨基脫保護(hù)的循環(huán)從C端到N端進(jìn)行，直到全部氨基酸殘基都偶連上去。偶連完成后，取下反應(yīng)瓶用DCM清洗，抽干樹脂后用預(yù)冷的切割液切割，切割下來的多肽用HPLC進(jìn)行純化。多肽純化在Waters600E高壓液相色譜儀上，用Kromasil100-5C18柱子進(jìn)行高壓反相色譜，收集的目的峰多肽即為vMIP-II蛋白。
文檔編號C07K14/03GK102241749SQ201110112488
公開日2011年11月16日 申請日期2011年5月3日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月3日
發(fā)明者孫晗笑, 張光, 李秀英, 莫雪梅 申請人:暨南大學(xué)