專利名稱：抗ercc1 單克隆抗體4f9 及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及免疫學領(lǐng)域。具體地，本發(fā)明主要涉及可特異性識別和結(jié)合由切除修復交叉互補基因 I (excision repair cross-complement-action group I, ERCCI)編石馬的蛋白的單克隆抗體4F9,產(chǎn)生所述單克隆抗體的雜交瘤,包含所述單克隆抗體的組合物，以及所述單克隆抗體的使用方法和用途。
背景技術(shù)：
惡性腫瘤是嚴重威脅人類健康的疾病之一，鉬類藥物參與的化療是其重要的治療手段。以順鉬為代表的鉬類藥物是20世紀60年代開發(fā)的高效廣譜的無機抗腫瘤藥，其屬于破壞DNA結(jié)構(gòu)和功能的細胞毒藥物。經(jīng)過長期研究和發(fā)展，已相繼成功開發(fā)了順鉬 (Cisplatin)、卡鉬(Carboplatin)、奈達鉬(Nedaplatin)、奧沙利鉬(Oxaliplatin)、舒鉬(Sunpla)和洛鉬(Lobaplatin)等鉬類藥物,這些鉬類藥物常與其他抗腫瘤藥物聯(lián)合使用，用于卵巢癌、肺癌、胃癌、宮頸癌、頭頸部癌、惡性淋巴瘤等多種癌癥的臨床治療。然而，腫瘤對鉬類藥物的耐藥性嚴重影響了這些藥物的治療療效。產(chǎn)生耐藥性的原因很多,其中DNA損傷修復能力的增強是導致對鉬類藥物的耐藥性的主要原因。人體DNA受各種因素損傷后.其修復主要是通過核苷酸切除修復(Nueleotideexcision repair，NER)途徑來完成。在該途徑中起重要作用的核苷酸ERCC基因家族能對核苷酸進行切除和修復，以減少DNA的損傷。其中，切除修復交叉互補基因Uexcisionrepair cross-complement-action group 1，ERCC1)所編碼的蛋白參與 DNA 鏈的損傷識別和切割，在NER途徑中起著至關(guān)重要的作用，是ERCC基因家族和NER途徑的關(guān)鍵基因。ERCCl蛋白是核苷酸剪切修復復合體的5'核酸內(nèi)切酶，見于所有的腫瘤細胞中，其表達水平差異很大。順鉬主要是通過與作用靶點DNA形成鉬-DNA聚合物對腫瘤細胞發(fā)揮作用。它在腫瘤細胞中水解為雙氯雙氨鉬，然后與DNA形成聚合物，從而影響細胞的復制與轉(zhuǎn)錄，導致DNA損傷。研究顯示，ERCCl過表達可使損傷的DNA迅速修復，導致對順鉬的耐藥性。因此，NER過程增強是導致對順鉬的耐藥性的一個重要機制。2010年NCCN指南指出，ERCCl可以作為非小細胞肺癌(NSCLC)的預后判斷和療效預測的標記物。一方面，與低水平的ERCCl相比，高水平的ERCCl預示NSCLC患者的生存效果更佳(與治療無關(guān))，同時高水平的ERCCl還預示鉬類藥物的化療效果不佳。研究顯示，在完全切除的、未接受過圍手術(shù)期化療或放療的NSCLC患者中，ERCClmRNA的水平是生存預后指標。研究還顯示，高表達ERCCl的患者生存期顯著長于低表達者。另一方面，已有多項轉(zhuǎn)化型研究證明，ERCCl水平可用于預測鉬類藥物治療NSCLC的療效，高水平者耐藥，低水平者敏感。Olaussen等發(fā)現(xiàn)，在國際癌輔助化療研究(IALT)中，僅低表達ERCCl蛋白的腫瘤患者可從含順鉬的輔助化療中獲益。Bepler等報道，在前瞻性采集自一項基于社區(qū)的III期隨機臨床研究的腫瘤標本中，其原位ERCCl蛋白表達水平與卡鉬/吉西他濱治療或吉西他濱單藥治療后的疾病緩解成顯著負相關(guān)，即低表達ERCCl的患者緩解率更高。
因此，目前臨床上在進行腫瘤輔助化療之前，通常通過免疫組織化學(IHC)病理實驗確定腫瘤細胞中ERCCl的表達水平，以指導鉬類化療藥物的使用。IHC實驗的核心為特異性結(jié)合ERCCl的單克隆抗體，其性能的優(yōu)劣直接決定著整個檢測的靈敏度和特異性，決定著指導臨床用藥的有效性。當前，國內(nèi)外廣泛用于臨床病理一線的ERCCl單克隆抗體為8F1，但已有研究顯示，8F1在與ERCCl特異性結(jié)合的同時，還與非特異蛋白發(fā)生交叉反應，這直接影響了免疫組化結(jié)果的特異性和可靠性。因此，本領(lǐng)域迫切需要這樣的單克隆抗體，其不僅可與ERCCl特異性結(jié)合，而且與細胞內(nèi)的其他非特異蛋白不發(fā)生交叉反應，以顯著提高IHC實驗(例如，用于非小細胞肺癌、卵巢癌等腫瘤的病理診斷的IHC實驗)的特異性和可靠性，從而更有效和更精確地對使用鉬類化療藥物的輔助化療進行療效預測及預后判斷
發(fā)明內(nèi)容

在本發(fā)明中，除非另有說明，否則本文中使用的科學和技術(shù)名詞具有本領(lǐng)域技術(shù)人員所通常理解的含義。并且，本文中所用的蛋白質(zhì)和核酸化學、分子生物學、細胞和組織培養(yǎng)、微生物學、免疫學相關(guān)術(shù)語和實驗室操作步驟均為相應領(lǐng)域內(nèi)廣泛使用的術(shù)語和常規(guī)步驟。同時，為了更好地理解本發(fā)明，下面提供相關(guān)術(shù)語的定義和解釋。如本文中所使用的，術(shù)語“切除修復交叉互補基因I (ERCCl) ”是本領(lǐng)域內(nèi)熟知的，其是ERCC基因家族和NER途徑的關(guān)鍵基因，參與DNA鏈的損傷識別和切割，在NER途徑中起著至關(guān)重要的作用。ERCCl蛋白是核苷酸剪切修復復合體的5'核酸內(nèi)切酶，見于所有的腫瘤細胞中，其表達水平差異很大。ERCCl蛋白的示例性編碼核苷酸序列如SEQID N0:1所
/Jn o如本文中所使用的，術(shù)語“抗體”是指通常由兩對相同的多肽鏈(每對具有一條“輕”(L)鏈和一條“重”(H)鏈)組成的免疫球蛋白分子?？贵w輕鏈可分類為K和\輕鏈。重鏈可分類為U、S、Y、a或e ,并且分別將抗體的同種型定義為IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在輕鏈和重鏈內(nèi)，可變區(qū)和恒定區(qū)通過大約12或更多個氨基酸的“J”區(qū)連接，重鏈還包含大約3個或更多個氨基酸的“D”區(qū)。各重鏈由重鏈可變區(qū)(Vh)和重鏈恒定區(qū)(Ch)組成。重鏈恒定區(qū)由3個結(jié)構(gòu)域((^、(^和^^)組成。各輕鏈由輕鏈可變區(qū)和輕鏈恒定區(qū)(Q)組成。輕鏈恒定區(qū)由一個結(jié)構(gòu)域Q組成。抗體的恒定區(qū)可介導免疫球蛋白與宿主組織或因子，包括免疫系統(tǒng)的各種細胞(例如，效應細胞)和經(jīng)典補體系統(tǒng)的第一組分(Clq)的結(jié)合。Vh和'區(qū)還可被細分為具有高變性的區(qū)域(稱為互補決定區(qū)(CDR))，其間散布有較保守的稱為構(gòu)架區(qū)(FR)的區(qū)域。各Vh和Vl由按下列順序FRU CDRU FR2、CDR2、FR3、⑶R3、FR4從氨基末端至羧基末端排列的3個⑶R和4個FR組成。各重鏈/輕鏈對的可變區(qū)(vh和vl)分別形成抗體結(jié)合部位。氨基酸至各區(qū)域或結(jié)構(gòu)域的分配遵循Kabat Sequencesof Proteins of Immuno logical Interest(National Institutes of Health,Bethesda,Md. (1987and 1991)),或 Chothia&Lesk(1987) J. Mol. Biol. 196 :901-917 ;Chothia 等人(1989)Nature 342 :878-883的定義。術(shù)語“抗體”不受任何特定的產(chǎn)生抗體的方法限制。例如，其包括，特別地，重組抗體、單克隆抗體和多克隆抗體?？贵w可以是不同同種型的抗體，例如，IgG(例如，IgGl, IgG2，IgG3 或 IgG4 亞型)，IgAl, IgA2，IgD, IgE 或 IgM 抗體。如本文中所使用的，術(shù)語抗體的“抗原結(jié)合部分”是指全長抗體的一個或多個部分，所述部分保持結(jié)合抗體所結(jié)合的相同抗原(例如，ERCC1)的能力，與完整抗體競爭對抗原的特異性結(jié)合。通常參見，F(xiàn)undamental Immunology, Ch. 7 (Paul, ff. , ed ,第 2 版，RavenPress,N. Y. (1989)，其以其全文通過引用合并入本文，用于所有目的。可通過重組DNA技術(shù)或通過完整抗體的酶促或化學斷裂產(chǎn)生抗原結(jié)合部分。在一些情況下，抗原結(jié)合部分包括Fab,Fab;、F(ab' )2、Fd、Fv、dAb和互補決定區(qū)(CDR)片段、單鏈抗體(例如，scFv)、嵌合抗體、雙抗體(diabody)和這樣的多肽，其包含足以賦予多肽特異性抗原結(jié)合能力的抗體的至少一部分。如本文中所使用的，術(shù)語“Fd片段”意指由VdP ChI結(jié)構(gòu)域組成的抗體片段；術(shù)語"Fv片段”意指由抗體的單臂的\和Vh結(jié)構(gòu)域組成的抗體片段；術(shù)語“dAb片段”意指由Vh結(jié)構(gòu)域組成的抗體片段(Ward等人,Nature 341 :544-546(1989));術(shù)語“Fab片段”意指由'、VH、(^和ChI結(jié)構(gòu)域組成的抗體片段；術(shù)語“F(ab' )2片段”意指包含通過鉸鏈區(qū)上的二硫橋連接的兩個Fab片段的抗體片段。在一些情況下，抗體的抗原結(jié)合部分是單鏈抗體(例如，scFv),其中Vlj和Vh結(jié)構(gòu)域通過使其能夠產(chǎn)生為單個多肽鏈的連接體配對形成單價分子(參見，例如，Bird等人，Science 242:423-426(1988)和 Huston 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883 (1988))。此類 scFv 分子可具有一般結(jié)構(gòu)=NH2-Vf 接頭-Vh-COOH 或 NH2-Vh-接頭-'-C00H。合適的現(xiàn)有技術(shù)接頭由重復的GGGGS氨基酸序列或其變體組成。例如，可使用具有氨基酸序列(GGGGS)4的接頭，但也可使用其變體(Holliger等人(1993)，Proc.Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448)。可用于本發(fā)明的其他接頭由 Alfthan 等人(1995)，Protein Eng. 8 :725-731，Choi 等人(2001)，Eur J. Immunol. 31 :94-106, Hu 等人(1996)，Cancer Res. 56 :3055-3061，Kipriyanov 等人(1999)，J. Mol. Biol. 293 :41-56 和 Roovers等人(2001), Cancer Immunol.描述。在一些情況下，抗體是雙抗體，即，雙價抗體，其中V1^P \結(jié)構(gòu)域在單個多肽鏈上表達，但使用太短的連接體以致不允許在相同鏈的兩個結(jié)構(gòu)域之間配對，從而迫使結(jié)構(gòu)域與另一條鏈的互補結(jié)構(gòu)域配對并且產(chǎn)生兩個抗原結(jié)合部位(參見，例如，Holliger P.等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 :6444-6448 (1993),和 Pol jak R. J.等人，Structure 2:1121-1123(1994))?？墒褂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)技術(shù)(例如，重組DNA技術(shù)或酶促或化學斷裂法)從給定的抗體(例如單克隆抗體4F9)獲得抗體的抗原結(jié)合部分(例如，上述抗體片段)，并且以與對于完整抗體的方式相同的方式就特異性篩選抗體的抗原結(jié)合部分。如本文中所使用的，以編號提及的抗體與從相同編號的雜交瘤獲得的單克隆抗體相同。例如，單克隆抗體4F9是與從雜交瘤細胞株4F9或其亞克隆或后代細胞獲得的抗體相同的抗體。如本文中所使用的，術(shù)語“表位”是指，抗原上被免疫球蛋白或抗體特異性結(jié)合的部位?！氨砦弧痹诒绢I(lǐng)域內(nèi)也稱為“抗原決定簇”。表位或抗原決定簇通常由分子的化學活性表面基團例如氨基酸或碳水化合物或糖側(cè)鏈組成并且通常具有特定的三維結(jié)構(gòu)特征以及特定的電荷特征。例如，表位通常以獨特的空間構(gòu)象包括至少3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14或15個連續(xù)或非連續(xù)的氨基酸，其可以是“線性的”或“構(gòu)象的”。參見，例如，EpitopeMapping Protocols in Methods in Molecular Biology,第66卷，G. E. Morris, Ed. (1996)。、在線性表位中，蛋白質(zhì)與相互作用分子(例如抗體)之間的所有相互作用的點沿著蛋白質(zhì)的一級氨基酸序列線性存在。在構(gòu)象表位中，相互作用的點跨越彼此分開的蛋白質(zhì)氨基酸殘基而存在?？墒褂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)技術(shù)，就與相同表位的結(jié)合競爭性篩選抗體。例如，可進行競爭和交叉競爭研究，以獲得彼此競爭或交叉競爭與抗原(例如，ERCC1)的結(jié)合的抗體?；谒鼈兊慕徊娓偁巵慝@得結(jié)合相同表位的抗體的高通量方法描述于國際專利申請W003/48731中。因此，可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)技術(shù)，獲得與單克隆抗體4F9競爭結(jié)合ERCCl蛋白上的相同表位的抗體及其抗原結(jié)合部分。如本文中所使用的，術(shù)語“特異性結(jié)合”是指抗體對預先確定的抗原上的表位的結(jié)合。通常，抗體以小于大約10_7M，例如小于大約10_8M、10_9M或KTkiM或更小的親和力(Kd)結(jié)合抗原表位。如本文中所使用的，術(shù)語“KD”是指特定抗體-抗原相互作用的解離平衡常數(shù)，其用 于描述抗體與抗原之間的結(jié)合親和力。平衡解離常數(shù)越小，抗體-抗原結(jié)合越緊密，抗體與抗原之間的親和力越高。通常，抗體(例如，本發(fā)明的單克隆抗體4F9)以小于大約10_7M，例如小于大約10_8M、10_9M或KTwM或更小的解離平衡常數(shù)(Kd)結(jié)合抗原(例如，ERCCl蛋白)，例如，如使用表面等離子體共振術(shù)(SPR)在BIAC0RE儀中測定的。如本文中所使用的，術(shù)語“雜交瘤”和“雜交瘤細胞株”可互換使用，并且當提及術(shù)語“雜交瘤”和“雜交瘤細胞株”時，其還包括雜交瘤的亞克隆和后代細胞。例如，當提及雜交瘤細胞株4F9時，其還指雜交瘤細胞株4F9的亞克隆和后代細胞。如本文中所使用的，術(shù)語“患者”是指哺乳動物，例如人。如本文中所使用的，術(shù)語“鉬類藥物”是指含有鉬的藥物(例如化療藥物)，其包括但不限于，順鉬(Cisplatin)、卡鉬(Carboplatin)、奈達鉬(Nedaplatin)、奧沙利鉬(Oxaliplatin)、舒鉬(Sunpla)和洛鉬(Lobaplatin)。如本文中所使用的，20種常規(guī)氨基酸和其縮寫遵從常規(guī)用法。參見Immunology-ASynthesis (第 2版，E. S. Golub 和D. R. Gren,Eds. , Sinauer Associates, Sunderland,Mass.(1991))，其通過引用合并入本文。因此，在一個方面，本發(fā)明提供了特異性結(jié)合ERCCl蛋白的單克隆抗體4F9或其抗原結(jié)合部分，所述單克隆抗體4F9由保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(China General Microbiological Culture Collection Center, CGMCC),具有保藏號CGMCC5196的雜交瘤產(chǎn)生。在另一個方面，本發(fā)明提供了特異性結(jié)合ERCCl蛋白的抗體或其抗原結(jié)合部分，其與單克隆抗體4F9競爭結(jié)合ERCCl蛋白上的相同表位，所述單克隆抗體4F9由保藏在CGMCC，具有保藏號CGMCC5196的雜交瘤產(chǎn)生。在另一個方面，本發(fā)明提供了一種雜交瘤，其以保藏號CGMCC5196保藏在CGMCC。在另一個方面，本發(fā)明提供了一種組合物，其包含根據(jù)本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合部分。在另一個方面，本發(fā)明提供了檢測ERCCl蛋白在樣品中的存在或其表達水平的方法，其包括使用根據(jù)本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合部分。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述樣品是組織樣品，例如癌組織樣品(例如肺癌組織，卵巢癌組織和結(jié)腸腺癌組織)。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述樣品是細胞樣品，例如細胞裂解液。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述抗體或其抗原結(jié)合部分還包括可檢測的標記。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述方法還包括使用攜帶可檢測的標記的第二抗體來檢測根據(jù)本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合部分。此類第二抗體是本領(lǐng)域公知的，例如但不限于可識別抗體4F9的抗小鼠IgG抗體。在一個優(yōu)選的實施方案中,所述方法包括但不限于,Western印跡法、ELISA法和免疫組織化學法。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述方法不是疾病的診斷方法。在另一個方面，還提供了根據(jù)本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合部分的用途，其用于檢測ERCCl蛋白在樣品中的存在或其表達水平，或者用于制備試劑盒，所述試劑盒用于檢測ERCCl蛋白在樣品中的存在或其表達水平。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述樣品包括但不限于，組織樣品，例如癌組織樣品(例如肺癌組織，卵巢癌組織和結(jié)腸腺癌組織)，以及細胞樣品，例如細胞裂解液。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述抗體或其抗原結(jié)合部分還包括可檢測的標記。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述試劑盒還包含第二抗體，其特異性識別根據(jù)本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合部分，例 如但不限于可特異性識別抗體4F9的抗小鼠IgG抗體。在進一步優(yōu)選的實施方案中，所述第二抗體還包括可檢測的標記。之前已報道，ERCCl蛋白可用作標志物，用于對患有癌癥的患者進行預后判斷，以及用于預測對患者施用鉬類藥物的輔助治療的療效(Bhagwat, et al. Immunodetectionof DNA Repair EndonucleaseERCCl-XPF in Human Tissue.Cancer Res 2009 ；69 6831-6838 ;01aussen,et al. DNA Repair by ERCCl in Non-Small-Cell Lung Cancer andCisplatin-Based Adjuvant Chemotherapy. N Engl J Med, vol. 355, no. 10,September 7,2006 :983-991 ；Arbogast et al. Automated ERCCl Immunohistochemistry in Non-smallCell Lung Cancer-Comparison of anti-ERCCI Antibodies 8F1, D-10,and FL-297. ApplImmunohistochem Mol MorphoI-VoIume 19, Number 2, March 2011;和，李建旺.切除修復交叉互補基因I與鉬類耐藥的研究進展.Jian-xi Medieal Jouma] jun 2009. Vo. 44, No. 6 625-628)。因此，在另一個方面，本發(fā)明提供了對患有癌癥的患者進行預后判斷的方法，其包括使用根據(jù)本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合部分檢測來自所述患者的癌組織中ERCCl的表達水平。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述癌癥包括但不限于，肺癌(例如非小細胞肺癌)，卵巢癌和結(jié)腸腺癌。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述抗體是單克隆抗體4F9。在一個優(yōu)選的實施方案中，與對照相比，所述癌組織中更高水平的ERCCl預示著，所述患者的預后結(jié)果更佳(與治療無關(guān))。此類對照可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員容易地確定。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述抗體或其抗原結(jié)合部分還包括可檢測的標記。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述方法還包括使用攜帶可檢測的標記的第二抗體來檢測根據(jù)本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合部分。此類第二抗體是本領(lǐng)域公知的，例如但不限于可識別抗體4F9的抗小鼠IgG抗體。在另一個方面，本發(fā)明提供了預測對患有癌癥的患者施用鉬類藥物的輔助治療的療效的方法，其包括使用根據(jù)本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合部分檢測來自所述患者的癌組織中ERCCl的表達水平。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述癌癥包括但不限于，肺癌(例如非小細胞肺癌)，卵巢癌和結(jié)腸腺癌。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述抗體是單克隆抗體4F9。在一個優(yōu)選的實施方案中，與對照相比，所述癌組織中更低水平的ERCCl預示著，所述輔助治療對于該患者的療效更好。此類對照可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員容易地確定。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述抗體或其抗原結(jié)合部分還包括可檢測的標記。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述方法還包括使用攜帶可檢測的標記的第二抗體來檢測根據(jù)本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合部分。此類第二抗體是本領(lǐng)域公知的，例如但不限于可識別抗體4F9的抗小鼠IgG抗體。在另一個方面，還提供了根據(jù)本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合部分在制備試劑盒中的用途，所述試劑盒用于對患有癌癥的患者進行預后判斷和/或用于預測對患有癌癥的患者 施用鉬類藥物的輔助治療的療效。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述癌癥包括但不限于，肺癌(例如非小細胞肺癌)，卵巢癌和結(jié)腸腺癌。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述抗體或其抗原結(jié)合部分還包括可檢測的標記。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述抗體是單克隆抗體4F9。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述試劑盒還包含第二抗體，其特異性識別根據(jù)本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合部分，例如但不限于可特異性識別抗體4F9的抗小鼠IgG抗體。在進一步優(yōu)選的實施方案中，所述第二抗體還包括可檢測的標記。在另一個方面，本發(fā)明提供了試劑盒，其包含根據(jù)本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合部分。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述抗體或其抗原結(jié)合部分還包含可檢測的標記。在另一個優(yōu)選的實施方案中，所述抗體是單克隆抗體4F9。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述試劑盒還包含第二抗體，其特異性識別根據(jù)本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合部分，例如但不限于可特異性識別抗體4F9的抗小鼠IgG抗體。在進一步優(yōu)選的實施方案中,所述第二抗體還包括可檢測的標記。在其他優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的試劑盒可用于檢測ERCCl蛋白在樣品中的存在或其表達水平，用于對患有癌癥的患者進行預后判斷和/或用于預測對患有癌癥的患者施用鉬類藥物的輔助治療的療效。發(fā)明的有益效果目前國內(nèi)外廣泛用于臨床病理檢測及科學研究實踐的ERCCl單克隆抗體是8F1。研究顯示，8F1在與ERCCl特異性結(jié)合的同時，還與細胞內(nèi)除ERCCl蛋白外的非特異蛋白發(fā)生交叉反應，這直接影響了免疫組化結(jié)果的特異性和可靠性。相比之下，本發(fā)明提供了一種特異性針對ERCCl的單克隆抗體4F9，其不僅可與ERCCl特異性結(jié)合，而且與細胞內(nèi)其他非特異蛋白不發(fā)生非特異反應。因此，本發(fā)明的單克隆抗體4F9特異性更好，可有效提高IHC實驗的特異性、準確性和可靠性，達到真實反映腫瘤細胞內(nèi)ERCCl表達水平的目的。本發(fā)明的單克隆抗體4F9有效克服了目前廣泛使用的ERCCl單抗8F1的非特異性問題，其可用于非小細胞肺癌、卵巢癌等腫瘤的病理診斷的免疫組化檢測，從而有效且精確地對使用鉬類化療藥物的輔助化療進行療效預測及預后判斷。
下面將結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明的實施方案進行詳細描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，下列附圖和實施例僅用于說明本發(fā)明，而不是對本發(fā)明的范圍的限定。根據(jù)附圖和優(yōu)選實施方案的下列詳細描述，本發(fā)明的各種目的和有利方面對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說將變得顯然。


圖I展示了包含ERCCl開放閱讀框(open reading frame, 0RF)的構(gòu)建體的核苷酸序列。其中，粗體表示ERCCl 0RF;斜體+單下劃線表示酶切位點；雙下劃線表示C末端Myc-DDK 標簽。 圖2展示了表達ERCCl的重組質(zhì)粒的構(gòu)建設計。其中，在ERCCl ORF的兩側(cè)具有多個酶切位點，并且在ORF的上游具有核糖體結(jié)合位點(RBS)和Kozac共有序列，在ORF的下游具有Myc標簽和Flag標簽。圖3展示了使用Western印跡法檢測細胞中表達的ERCCl蛋白的結(jié)果。其中，左側(cè)泳道轉(zhuǎn)染了空載體pCMV6-Entry的HEK293T細胞的裂解液；右側(cè)泳道轉(zhuǎn)染了重組質(zhì)粒PCMV6-ERCC1的HEK293T細胞的裂解液。Western印跡法所使用的一抗為anti-DDK (ABM公司生產(chǎn))，使用的二抗為Jackson公司生產(chǎn)的羊抗鼠抗體。結(jié)果顯示，用重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞后，ERCCl蛋白在HEK293T細胞中高表達。圖4展示了使用SDS-PAGE檢測經(jīng)純化的ERCCl蛋白的結(jié)果。結(jié)果顯示，經(jīng)親和層析純化后，ERCCl蛋白的純度達到90%以上。圖5展示了使用單克隆抗體4F9通過Western印跡法檢測9種不同細胞系的結(jié)果。所使用的 9 種細胞系如下HepG2, HeLa, HT29, A549, C0S7, Jurkat, MDCK, PC12 和 MCF7 (這9種細胞系均來源于ATCC)。Western印跡法所使用的二抗為Jackson公司生產(chǎn)的羊抗鼠抗體。結(jié)果顯示，本發(fā)明的單克隆抗體4F9能夠特異性識別并結(jié)合ERCCl蛋白，并且ERCCl蛋白在 HeLa，HT29, Jurkat 和 MCF7 中表達。圖6展示了使用抗ERCCl單克隆抗體4F9通過免疫組化方法檢測結(jié)腸腺癌組織的結(jié)果。圖7展示了使用抗ERCCl單克隆抗體4F9通過免疫組化方法檢測卵巢癌組織的結(jié)果。圖8展示了使用抗ERCCl單克隆抗體4F9通過免疫組化方法檢測肺癌組織的結(jié)果。圖9展示了使用origene蛋白芯片分析單克隆抗體8F1的結(jié)合特異性的結(jié)果。結(jié)果顯示，單克隆抗體8F1不僅特異性結(jié)合ERCCl蛋白，還非特異性結(jié)合蛋白Protein X (即，PCYT1A，登錄號為 NM_005017)。圖10展示了使用origene蛋白芯片分析單克隆抗體4F9的結(jié)合特異性的結(jié)果。結(jié)果顯示，單克隆抗體4F9僅特異性結(jié)合ERCCl蛋白，而不與任何其他蛋白發(fā)生非特異性反應。圖11展示了使用Western印跡法分析單克隆抗體8F1和4F9的結(jié)合特異性的結(jié)果。結(jié)果顯示，單克隆抗體8F1不僅特異性結(jié)合ERCCl蛋白，還非特異性結(jié)合蛋白ProteinX(即，PCYT1A，登錄號為NM_005017);單克隆抗體4F9僅特異性結(jié)合ERCCl蛋白，而不與其他蛋白發(fā)生非特異性反應。該結(jié)果與origene蛋白芯片的結(jié)果完全一致，其表明單克隆抗體4F9的結(jié)合特異性比單克隆抗體8F1更好。序列信息本發(fā)明涉及的序列的信息提供于下面的表I中。

權(quán)利要求
1.特異性結(jié)合ERCCl蛋白的單克隆抗體4F9或其抗原結(jié)合部分，所述單克隆抗體4F9由保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，具有保藏號CGMCC5196的雜交瘤產(chǎn)生。
2.特異性結(jié)合ERCCl蛋白的抗體或其抗原結(jié)合部分，其與單克隆抗體4F9競爭結(jié)合ERCCl蛋白上的相同表位，所述單克隆抗體4F9由保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，具有保藏號CGMCC5196的雜交瘤產(chǎn)生。
3.一種雜交瘤，其以保藏號CGMCC5196保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)。
4.一種組合物，其包含權(quán)利要求I或2的抗體或其抗原結(jié)合部分。
5.檢測ERCCl蛋白在樣品中的存在或其表達水平的方法，其包括使用權(quán)利要求I或2的抗體或其抗原結(jié)合部分， 例如，所述樣品包括但不限于，組織樣品和細胞樣品； 例如，所述抗體或其抗原結(jié)合部分還可包括可檢測的標記； 例如，所述方法還可包括，使用攜帶可檢測的標記的第二抗體來檢測所述抗體或其抗原結(jié)合部分。
6.權(quán)利要求I或2的抗體或其抗原結(jié)合部分的用途，其用于檢測ERCCl蛋白在樣品中的存在或其表達水平，或者用于制備試劑盒，所述試劑盒用于檢測ERCCl蛋白在樣品中的存在或其表達水平， 例如，所述樣品包括但不限于，組織樣品和細胞樣品； 例如，所述抗體或其抗原結(jié)合部分還可包括可檢測的標記； 例如，所述試劑盒還可包含第二抗體，其特異性識別所述抗體或其抗原結(jié)合部分， 例如，所述第二抗體還可包括可檢測的標記。
7.用于對患有癌癥的患者進行預后判斷或用于預測對患有癌癥的患者施用鉬類藥物的輔助治療的療效的方法，其包括使用權(quán)利要求I或2的抗體或其抗原結(jié)合部分檢測來自所述患者的癌組織中ERCCl的表達水平， 例如，所述癌癥包括但不限于，肺癌，卵巢癌和結(jié)腸腺癌； 例如，所述抗體或其抗原結(jié)合部分還可包括可檢測的標記； 例如，所述方法還可包括，使用攜帶可檢測的標記的第二抗體來檢測所述抗體或其抗原結(jié)合部分； 例如，與對照相比，所述癌組織中更高水平的ERCCl預示著，所述患者的預后結(jié)果更佳； 例如，與對照相比，所述癌組織中更低水平的ERCCl預示著，所述輔助治療對于該患者的療效更好。
8.權(quán)利要求I或2的抗體或其抗原結(jié)合部分在制備試劑盒中的用途，所述試劑盒用于對患有癌癥的患者進行預后判斷和/或用于預測對患有癌癥的患者施用鉬類藥物的輔助治療的療效， 例如，所述癌癥包括但不限于，肺癌，卵巢癌和結(jié)腸腺癌； 例如，所述抗體或其抗原結(jié)合部分還可包括可檢測的標記； 例如，所述試劑盒還可包含第二抗體，其特異性識別所述抗體或其抗原結(jié)合部分，例如，所述第二抗體還可包括可檢測的標記。
9.一種試劑盒，其包含權(quán)利要求I或2的抗體或其抗原結(jié)合部分，例如，所述抗體或其抗原結(jié)合部分還可包含可檢測的標記；例如，所述抗體是單克隆抗體4F9 ；例如，所述試劑盒還可包含第二抗體，其特異性識別所述抗體或其抗原結(jié)合部分；例如，所述第二抗體還可包括可檢測的標記。
全文摘要
本發(fā)明主要涉及可特異性識別和結(jié)合由切除修復交叉互補基因1(excision repair cross-complement-action group 1，ERCC1)編碼的蛋白的單克隆抗體4F9，產(chǎn)生所述單克隆抗體的雜交瘤，包含所述單克隆抗體的組合物，以及所述單克隆抗體的使用方法和用途。
文檔編號C07K16/40GK102786598SQ20111027447
公開日2012年11月21日 申請日期2011年9月16日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月16日
發(fā)明者何為無, 汪芳迅, 王超, 袁麗, 袁克湖, 隋璐, 馬東輝 申請人:無錫傲銳東源生物科技有限公司