專利名稱：從小體積的外周血產(chǎn)生誘導性多潛能干細胞的制作方法
從小體積的外周血產(chǎn)生誘導性多潛能干細胞
背景技術：
本申請要求2010年6月15日提交的美國專利申請No. 61/355，046和2010年10月I日提交的美國專利申請No. 61/388，949的優(yōu)先權，它們的全部公開內(nèi)容在不棄權的情況下通過引用以其整體明確地并入本文。本申請還與2009年6月5日提交的美國專利申請No. 61/184，546、2009年9月4日提交的美國專利申請No. 61/240，116，以及2010年6月4日提交的PCT申請PCT/US10/37376相關，它們的全部公開內(nèi)容在不棄權的情況下通過引用以其整體明確地并入本文。
1.發(fā)明領域本發(fā)明一般地涉及分子生物學和干細胞領域。更具體地，本發(fā)明涉及體細胞，尤其造血祖細胞的重編程。
2.相關領域的描述一般而言，干細胞是未分化細胞，其能夠產(chǎn)生成熟的功能細胞的演替。例如，造血干細胞可以產(chǎn)生任意的不同類型的末端分化的血細胞。胚胎干(ES)細胞來源于胚胎并且是多潛能的，因而具有發(fā)育成任何器官或組織類型或者至少潛在地發(fā)育成完整胚胎的能力。誘導性多潛能干細胞，通常簡寫為iPS細胞或iPSC，是一類人工地從非多潛能細胞，通常成年體細胞衍生而來的多潛能干細胞。據(jù)信，誘導性多潛能干細胞與天然多潛能干細胞如胚胎干細胞在許多方面，例如在某些干細胞基因和蛋白的表達、染色質(zhì)甲基化模式、倍增時間、擬胚體的形成、畸胎瘤的形成、活嵌合體的形成以及潛能和分化能力方面來說是相同的，但是它們與天然多潛能干細胞相關性的完整程度仍在評估。IPS細胞首先于2006年從小鼠細胞中產(chǎn)生(Takahashi等人，2006)以及于2007年從人細胞中產(chǎn)生(Takahashi等人，2007 ；Yu等人，2007)。這被認為是在干細胞研究中的重要進展，因為它可使研究人員能夠獲得在研究中具有重要意義并且潛在地具有治療應用的多潛能干細胞，而不必爭議性地使用胚胎。在人中，iPS細胞通常是從真皮成纖維細胞產(chǎn)生。然而，對于皮膚活組織檢查的需求和在體外擴展成纖維細胞數(shù)個傳代的需要使其成為用于產(chǎn)生患者特異性干細胞的麻煩的來源。而且，先前的用于重編程人體細胞的方法是不方便的，因為它們需要從人受試者直接獲取體細胞，或?qū)⒓毎S持于費力的細胞培養(yǎng)系統(tǒng)中。因此，需要開發(fā)用于從替代來源誘導多潛能干細胞的簡單、方便且易達的方法。在開發(fā)本發(fā)明時，本發(fā)明人考慮到血液細胞可以作為此種來源，因為血液可以從患者或健康個體中收集、儲存或轉(zhuǎn)移，例如，從中心分配單元轉(zhuǎn)移至一個或多個遠的地方。然而，仍然需要開發(fā)用于重編程血細胞，尤其外周血細胞的高效方法。
發(fā)明概要本發(fā)明的方面旨在增加重編程外周血細胞的全過程效率(血細胞輸入數(shù)iPS系輸出數(shù)的轉(zhuǎn)化效率)并減少例如從標準血液樣品(體積為約8-10ml)中獲取合理數(shù)量的iPS集落(例如，至少5個iPS集落)所需要的輸入血量的體積。本發(fā)明的某些實施方案是新穎的，其利用擴展來自外周血的CD34+起始細胞數(shù)量的能力來克服有關僅可從未動員的外周血中得到少量CD34+起始細胞的限制。本領域技術人員可能已想到，擴展CD34+細胞內(nèi)在地導致該細胞也分化，可能會使該細胞不太容易重編程。本發(fā)明的實施例證明擴展的細胞提供了足以進行重編程的數(shù)量并且獲得比未進行擴展的實質(zhì)上相同的情況高得多的出乎意料的好的全過程效率。有了這一進展，本發(fā)明的某些方面能夠從小體積的外周血，特別是從未動員的受試者產(chǎn)生iPS細胞。另一方面，本發(fā)明的某些方面具有這樣 的優(yōu)勢，即，在限定的細胞外基質(zhì)上從外周血細胞產(chǎn)生iPS細胞，從而避免來自未限定的飼養(yǎng)細胞的問題和潛在異種物質(zhì)污染。在進一步方面，本發(fā)明還克服了使用整合載體用于重編程的問題。因此，在第一實施方案中，提供了從造血祖細胞生產(chǎn)人iPS細胞的方法，該方法包括以下步驟中的一個或多個a)提供包含造血祖細胞的人外周血細胞的細胞群體；b)在用于促進造血祖細胞擴展的擴展條件下培養(yǎng)該細胞群體；c)將表達iPS重編程因子的外源性游離遺傳元件或外源性RNA遺傳元件導入擴展的造血祖細胞中；以及d)將含游離體的擴展的造血祖細胞在實質(zhì)上不含飼養(yǎng)細胞的培養(yǎng)物或飼養(yǎng)細胞條件化的培養(yǎng)基中，或在不含異種物質(zhì)的培養(yǎng)物中進行培養(yǎng)，由此從造血祖細胞產(chǎn)生人iPS細胞。在具體方面，利用一個或多個上述步驟可以從小體積，例如最多IOml的血液樣品產(chǎn)生iPS細胞。擴展步驟可能并不總是必需的，但是它以意想不到的方式，特別是在小的血液體積的情況下大大增加重編程效率。在某些方面，該細胞群體的來源是來自一個或多個其細胞沒有用從外部施加的粒細胞集落刺激因子(G-CSF)或粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)動員的受試者。該細胞群體的來源可以是血液樣品或血液組分。血液樣品的適宜體積可以為約Iml至約5ml、約 Iml 至 10ml、約 Iml 至 15ml,或更具體地，約 1ml、2ml、3ml、4ml、5ml、6ml、7ml、8ml、9ml、10ml、11ml、12ml、13ml、14ml、15ml、16ml、17ml、18ml、19ml、20ml、25ml、30ml、40ml、50ml 或可從其導出的任何范圍的體積。該細胞群體可以獲自冷凍保存的血液樣品，或者細胞群體來源或細胞群體可以經(jīng)過冷凍保存。例如，該細胞群體可以包含至少、約，或至多1x103、2x103、3x103、4x103、5x103、6x103、7x103、8x103、9x103、1x104、2x104、3x104、4x103、5x104、6x104、7x104、8x104、9x104、1叉105、2叉105、3叉105、4叉105、5叉105、6叉105、7叉105、8叉105、9叉105、1叉106、2叉106個或可從其導出的任何范圍的造血祖細胞。在某些方面，起始細胞在擴展或重編程之前可以包含至少或約103、IO4、105、106、107、108、IO9、1010、IOllUO12, IO13個或可從其導出的任何范圍的細胞。起始細胞群體可具有至少或約10、101、102、IO3,104、105、IO6, IO7, IO8個細胞/ml或可從其導出的任何范圍的接種密度。8ml至IOml的標準血液樣品可以具有6-12，000個⑶34+細胞，并且通常不足以用于重編程以產(chǎn)生iPS細胞集落。然而，本發(fā)明的一些方面提供了擴展祖細胞至足夠的數(shù)量并重編程擴展的細胞從而成功地產(chǎn)生iPS細胞的方法。在具體的方面，該細胞群體可以實質(zhì)上不含任何末端分化的血細胞如T細胞或B細胞，因此，來源于該細胞群體的iPS細胞可以具有不存在基因重排的全基因組。在本發(fā)明方法的步驟a)中可以采用可用于分離造血祖細胞的任何方法。例如，此種分離可以基于表面標記表達，其可以包含CD34表達的陽性選擇和/或譜系特異性標記表達的陰性選擇。選擇方法可以包括磁激活細胞分選術(MACS )或熒光激活細胞分選術(FACS ,即流式細胞術)。為了擴展造血祖細胞或在初始恢復階段培養(yǎng)重編程的造血祖細胞，可以在包含含有一種或多種細胞因子的擴展培養(yǎng)基的條件下培養(yǎng)該細胞，所述細胞因子包括干細胞因子(SCF)、Flt-3配體(Flt3L)、血小板生成素(TPO)、白細胞介素3 (IL-3)，或白細胞介素6 (IL-6) o擴展條件可以進一步包含Notch-1配體,如固定化的工程化Notch配體(Deltalext-1gG ；Delaney等人,2010),或者可以不包含此種Notch-1配體，因為它被證明對于該目的不重要。在重編程步驟之前，可以將細胞擴展例如約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25天或可從其導出的任何范圍的天數(shù)。例如，可以在約擴展階段的第3、4、5或6天將重編程元件導入細胞中。造血祖細胞的擴展條件可以實質(zhì)上不含任何基質(zhì)組分，或替代地，可以包括限定的或不含異種物質(zhì)的細胞外基質(zhì)，如人纖連蛋白片段如Refronectin 。 為了通過模擬造血祖細胞的體內(nèi)微環(huán)境來促進造血祖細胞的體外擴展，用于擴展造血祖細胞的條件或在初始恢復階段培養(yǎng)重編程的造血祖細胞的條件可以是低氧條件，例如，氧分壓為約1%至7%，特別地，氧分壓為約2-5%。在本發(fā)明的又一些進一步方面，可以采用任何方法如電穿孔或脂質(zhì)介導的基因遞送，將外源遺傳元件導入細胞中。在某些方面，游離遺傳元件可以包含復制起始點和一個或多個表達重編程因子的表達盒。這樣的一個或多個表達盒可以進一步包含編碼與復制起始點結合以復制染色體外模板的反式作用因子的核苷酸序列?；蛘?，外周血細胞可以表達此種反式作用因子。在示例性實施方案中，復制起始點可以是嗜淋巴細胞性皰疹病毒或Y皰疹病毒、腺病毒、SV40、牛乳頭瘤病毒，或酵母的復制起始點，如對應于EBV的oriP的嗜淋巴細胞性皰疹病毒或Y皰疹病毒的復制起始點。在進一步方面，嗜淋巴細胞性皰疹病毒可以是EB病毒(Epstein Barr virus) (EBV)、卡波希氏肉瘤(Kaposi' s sarcoma)抱疫病毒(KSHV)、松鼠猴皰疫病毒(Herpes virus saimiri) (HS),或馬立克氏病(Marek' s disease)病毒(MDV)。為了復制和短暫地維持外源性游離遺傳元件，反式作用因子可以是對應于EBV的EBNA-1 (EBV核抗原I)的野生型蛋白的多肽，或者是所述野生型蛋白的衍生物，優(yōu)選在對應于EBV的OriP的復制起始點的存在下。該衍生物可以具有與野生型EBNA-1相比降低的激活從整合模板的轉(zhuǎn)錄的能力，并因而具有降低的異位激活染色體基因?qū)е轮掳┺D(zhuǎn)化的機會。同時，在衍生物與復制起始點結合后，該衍生物可以激活至少5%相應野生型蛋白質(zhì)從染色體外模板的轉(zhuǎn)錄。為了重編程造血祖細胞，本發(fā)明方法的某些方面可以涉及使用重編程因子，所述重編程因子可包含選自由以下組成的組的一種或多種Sox、Oct、Nanog、Lin_28、Klf4,以及或C-myc或L-myc,或它們的組合,例如，Sox、Oct、Nanog和任選的Lin_28的集合，Sox、Oct、Klf4和任選的C-myc或L_myc的集合,或這六種因子的組合。在某些方面，為了降低C-myc表達的可能毒性作用，SV40大T基因(SV40LT)可以與C-myc —起被包括。在具體的方面，外源元件，DNA或RNA，可以包含一個或多個多順反子盒，如在相同的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件下的兩個或更多個重編程因子基因。在一些進一步方面，已導入外源重編程因子的造血祖細胞可以在不含異種物質(zhì)的細胞外基質(zhì)的存在下進行培養(yǎng)。對于人細胞，不含異種物質(zhì)的基質(zhì)被定義為實質(zhì)上不含動物組分的細胞外基質(zhì)，其中該動物不是人。在具體的方面，該基質(zhì)可以被定義為例如具有單一類型的細胞外基質(zhì)肽，如人纖連蛋白片段，例如Retronecti n 。此外，步驟d)在導入用于重編程的外源遺傳元件之后，可以在一種以上的不同條件下培養(yǎng)細胞。在緊接在導入重編程元件之后的第一子步驟中，可以在如上所述的造血祖細胞擴展培養(yǎng)基，或重編程培養(yǎng)基，或它們的組合或等同物中培養(yǎng)細胞。例如，可以在包含含有用于恢復造血祖細胞的一種或多種細胞因子的培養(yǎng)基的條件下培養(yǎng)細胞，所述細胞因子包括干細胞因子(SCF)、Flt-3配體(Flt3L)、血小板生成素(TPO)、白細胞間介素3(IL-3)，或白細胞間介素6(IL-6)。這個子步驟可以持續(xù)約、至少，或至多2、4、8、12、16、24、32、48、96小時或可從其導出的任何范圍的時間。在這個子步驟中，基質(zhì)組分可以是任選的。在這個子步驟之后，如果細胞不是已經(jīng)在一個基質(zhì)上，則將細胞轉(zhuǎn)移到基質(zhì)上。 可以在包含以下擴展培養(yǎng)基的條件下進一步培養(yǎng)細胞擴展培養(yǎng)基、重編程培養(yǎng)基，如包含GSK-3抑制劑、MEK抑制劑、TGF- ^受體抑制劑、肌球蛋白IIATP酶抑制劑，和/或Rho相關激酶(ROCK)信號傳導抑制劑從而有效地增強重編程的培養(yǎng)基；或它們的組合或它們的等同物，接著轉(zhuǎn)換到100%重編程培養(yǎng)基中。例如，GSK-3抑制劑可以是CHIR99021 ；MEK抑制劑可以是H)0325901 ；TGF-^受體抑制劑可以是A-83-01 ;肌球蛋白II ATP酶抑制劑可以是blebbistatin ;R0CK抑制劑可以是HA-100或H1152。這個子步驟可以持續(xù)約、至少，或至多 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20 天或可從其導出的任何范圍的時間。在一些方面，重編程培養(yǎng)基可以是化學限定的培養(yǎng)基，或者可以基于TeSR培養(yǎng)基、人胚胎細胞培養(yǎng)基，或N2B27培養(yǎng)基。在進一步方面，可以將細胞轉(zhuǎn)移，優(yōu)選逐漸轉(zhuǎn)移至實質(zhì)上不含外部施加的信號傳導抑制劑如GSK-3抑制劑、MEK抑制劑、肌球蛋白IIATP酶抑制劑和TGF-P受體抑制劑的培養(yǎng)基中。此種培養(yǎng)基可以是TeSR2或其他干細胞培養(yǎng)基并且可以優(yōu)選為化學限定的培養(yǎng)基。用于任何步驟或子步驟或在整個過程中的任何培養(yǎng)基、培養(yǎng)物或基質(zhì)可以是不含異種物質(zhì)或限定的培養(yǎng)基。培養(yǎng)基可以是化學限定的培養(yǎng)基，如TeSR 培養(yǎng)基。在某些方面，該方法可以進一步包括例如基于一種或多種胚胎細胞特性如ES細胞樣形態(tài)來選擇iPS細胞。在進一步方面，該方法可以包括在包含選自由以下組成的組的一種或多種物質(zhì)的iPS細胞擴展培養(yǎng)基中培養(yǎng)所選擇的iPS細胞GSK-3抑制劑、MEK抑制齊U、肌球蛋白II ATP酶抑制劑、TGF-P受體抑制劑、Rho相關激酶(ROCK)信號傳導抑制劑、任選的白血病抑制因子(LIF)，或其組合。還可以提供根據(jù)上述方法產(chǎn)生的iPS細胞群體。還可以提供細胞培養(yǎng)組合物，其包含含有造血祖細胞和其子代細胞的人外周血細胞的細胞群體、不含異種物質(zhì)的細胞外基質(zhì)，和培養(yǎng)基，其中造血祖細胞包含一種或多種表達重編程因子的外源性游離遺傳元件或外源性RNA遺傳元件。具體地，該基質(zhì)可以是限定基質(zhì)。例如，該基質(zhì)可以具有單一類型的細胞外基質(zhì)肽，如重組纖連蛋白片段。該重組纖連蛋白片段可以是RetroNectin 。在進一步方面，細胞培養(yǎng)組合物可以是不含異種物質(zhì)或限定的組合物。包含在培養(yǎng)組合物中的培養(yǎng)基可以是不含異種物質(zhì)或化學限定的培養(yǎng)基。此種培養(yǎng)基可以包含用于重編程的造血祖細胞的初始階段的一種或多種細胞因子，所述細胞因子包括干細胞因子(SCF)、Flt-3配體(Flt3L)、血小板生成素(TPO)、白細胞介素
3(IL-3)，或白細胞介素6 (IL-6)。這種培養(yǎng)組合物也可以包含Notch-1配體，如固定化的工程化Notch配體(Deltal ext-1gG ；Delaney等人,2010)。為了增強重編程效率,培養(yǎng)基可以包含GSK-3抑制劑、MEK抑制劑、TGF- ^受體抑制劑、肌球蛋白II ATP酶抑制劑，和/或Rho相關激酶(ROCK)信號傳導抑制劑。在細胞培養(yǎng)組合物中，人外周血細胞的細胞群體可以來自一個或多個其細胞沒有用從外部施加的粒細胞集落刺激因子(G-CSF)或粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)動員的受試者。該造血祖細胞可以已經(jīng)在體外，例如在一種或多種細胞因子的存在下進行擴展，所述細胞因子包括干細胞因子(SCF)、Flt-3配體(Flt3L)、血小板生成素(TPO)、白細胞介素3 (IL-3)，或白細胞介素6 (IL-6)。擴展培養(yǎng)物可以是懸浮細胞培養(yǎng)物并且可能不需要使用如本文描述的任何底物或基質(zhì)。細胞群體的來源可以是血液樣品或血液組分。血液樣品的適宜體積可以是約Iml至約5ml、約Iml至10ml、約Iml至15ml,或者更具體地,約3ml、4ml、5ml、6ml、7ml、8ml、9ml、IOml或可從其導出的任何范圍的體積。細胞群體可以獲自 冷凍保存的血液樣品，或者細胞群體來源或細胞群體可以經(jīng)過冷凍保存。在本發(fā)明方法和/或組合物的上下文中討論的實施方案可以相對于本文描述的任何其他方法或組合物使用。因而，與一種方法或組合物有關的實施方案也可以適用于本發(fā)明的其他方法和組合物。如本文使用的關于核酸的術語“編碼(encode)”或“編碼(encoding) ”用來使本發(fā)明容易被技術人員理解；然而，這些術語可以分別與“包含(comprise)”或“包含(comprising) ” 互換使用。如本文在說明書中使用的“一”或“一個(種)”可以指一個(種)或多個(種)。如本文在一條(多條)權利要求中結合詞語“包含”使用的詞語“一”或“一個(種)”可以指一個(種)或一個(種)以上。在權利要求書中使用的術語“或(或者)”用來指“和/或”，除非明確表示僅二者之一或者二者是相互排斥的，盡管本公開支持表示僅二者之一及“和/或”的定義。如本文使用的“另一個(種)”可以指至少第二個(種)或更多個(種)。在本申請全文中，術語“約”用于表示值包括測定該值所用的裝置、方法的誤差的內(nèi)在差異，或者存在于研究對象之間的差異。根據(jù)下面的詳細描述，本發(fā)明的其他目的、特征和優(yōu)勢將變得明顯。然而，應理解，詳細描述和具體實施例雖然指示本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，但僅以舉例說明的方式給出，因為在本發(fā)明精神和范圍內(nèi)的各種變化和修飾將根據(jù)該詳細描述對本領域技術人員而言變得明顯。附圖簡述以下附圖構成本說明書的一部分，且包括這些附圖的目的是進一步表現(xiàn)本發(fā)明的某些方面。通過參考這些附圖中的一個或多個附圖結合本文提供的具體實施方案的詳細描述可以更好地理解本發(fā)明。

圖1-示例性重編程過程的示意圖。用標準方式加工8ml全血小瓶以獲取PBMCJf該PBMC冷凍或者新鮮純化以富集⑶34-表達細胞。然后為擴展期接種這些細胞以獲得最佳數(shù)量的用于轉(zhuǎn)染的細胞。然后將轉(zhuǎn)染的細胞重懸在100%新鮮擴展培養(yǎng)基中或者將其與和小分子復合的重編程培養(yǎng)基結合在一起。在至少48個小時內(nèi)，將細胞轉(zhuǎn)換到限定的不含飼養(yǎng)物的基質(zhì)中，并每隔一天用與小分子復合的100%重編程培養(yǎng)基喂養(yǎng)細胞。在約轉(zhuǎn)染后的9至14天(dpt)，給該培養(yǎng)物喂養(yǎng)不含小分子(即TeSR2)的限定多潛能干細胞培養(yǎng)基。然后在18-25dpt用Tral-81對集落進行染色以鑒定iPS克隆。圖2A-2E-造血祖細胞(HP)是可從未動員的血液供體擴展的。圖2A示出使用三種測試條件對來自單個未動員的血液供體的HP的擴展。每種條件均依賴于細胞因子富集的培養(yǎng)基，而基質(zhì)在從不含基質(zhì)、纖連蛋白包被(Notch-)，和纖連蛋白/DLL-1包被(Notch+)之間變化。圖2B示出隨著祖細胞逐漸轉(zhuǎn)向更分化的細胞類型而發(fā)生的CD34表達的自然下降。⑶45表達一般是造血細胞的指示器。在擴展期間的第10天從同一供體取樣的細胞表現(xiàn)出主要為髓系性質(zhì)的表達譜(圖2C)，其具有很小至不具有B、T和NK標記的表達(數(shù)據(jù)·未示出)。此外，在本文發(fā)現(xiàn)該擴展在多個供體間是一致的，但是該擴展的幅度在患者樣品之間變化(圖2D)。創(chuàng)建5個供體的匯集物以便為待執(zhí)行的多個重編程實驗確立較大數(shù)量的細胞。測定這個匯集物的擴展?jié)摿纱?重復I和2，Rl和R2)(圖2E)。圖3-供造血祖細胞(HP)轉(zhuǎn)染用的載體。為了成功地重編程細胞，通過電穿孔用表達GFP的對照質(zhì)粒或表達用于重編程的因子的質(zhì)粒組合轉(zhuǎn)染HP。有多個質(zhì)粒排列(permutation)可用來表達已被成功使用的各種重編程因子組合，并且本文示出此類質(zhì)粒的實例。每種質(zhì)粒均具有oriP和表達EBNAl的盒以確保轉(zhuǎn)染細胞內(nèi)的質(zhì)粒的保留。圖4-用于多順反子載體的載體圖-集合I和集合2。圖5A-5F-優(yōu)化用于重編程的輸入細胞數(shù)量和轉(zhuǎn)染效率。圖5A.將來自源于供體GG(leukopak來源)的PBMC的純化細胞擴展6天。用對照，表達GFP的基于oriP/EBNAl的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染一系列細胞數(shù)量。通過計算采用流式細胞術檢測的表達GFP的活細胞的百分比來確定轉(zhuǎn)染效率。圖5B.將來自PBMC (供體A2389)的純化細胞擴展3或6天，并用對照，表達GFP的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染6xl04至IxlO5個細胞。該圖描述了呈GFP-陽性的總群體的百分比和總細胞的絕對數(shù)量。圖5C.該圖代表當在擴展的第3天或第6天轉(zhuǎn)染時還共表達GFP和CD34的b中的細胞的分數(shù)。圖5D.使用用于轉(zhuǎn)染的組合質(zhì)粒集合2進行的來自新抽出的血液(供體3002)的代表性重編程試驗。示出6孔板的單個孔，其含有對堿性磷酸酶活性染色呈陽性的集落(i)。白色箭頭強調(diào)在組ii中放大的集落，其也對Tral-81表達染色呈陽性，組iii。圖5E.使用質(zhì)粒集合2對擴展6天的一系列輸入細胞數(shù)量(供體GG)執(zhí)行重編程試驗。圖5F.將從四種不同供體純化的⑶34表達細胞擴展6天并使用表達C-myc (集合I)或L-myc (集合2)的質(zhì)粒組合轉(zhuǎn)染以進行比較，并比較iPSC的總數(shù)量。圖6-在不存在含有BSA的補充物B27的情況下發(fā)生的iPSC的產(chǎn)生。圖7A-7B-⑶34表達量與重編程效率相關聯(lián)。圖7A.代表性重編程試驗，在該試驗中將純化之后的CD34陽性⑴和陰性(ii)級分都用于重編程。組⑴示出6孔板的I個孔，該孔含有基于其表達堿性磷酸酶(AP染色，藍色)的能力被成功重編程的來自供體2939的集落。當與純化的群體組ii平行執(zhí)行時，來自供體2939的CD34耗竭級分不能形成集落，如缺少AP染色指示的。組iii和iv放大組(i)中用白色箭頭標記的集落，并且展示Tral-81 (綠色)的表達。圖7B.將從四種不同血液供體純化的細胞擴展3天、6天、9天或13天。使用表達L-myc的質(zhì)粒DNA組合集合2，在不含飼養(yǎng)物的重編程方案中測試來自所有時間點或時間點子集的細胞群體。重編程效率計算為表現(xiàn)出ES細胞特有的形態(tài)特征和對Tral-81染色呈陽性的能力的iPSC的總數(shù)量除以用于轉(zhuǎn)染的細胞的總數(shù)量。黑方塊描述了在指示時間點時表達CD34的群體的百分比。圖8A-8B-使用完全限定的試劑(不含動物成分(animal-free))的血細胞來源的iPSC。圖8A.從多個供體匯集的⑶34表達細胞在標準(n = 13)和完全限定的不含動物成分的培養(yǎng)基(n = 2)中擴展6天后的擴展倍數(shù)。擴展倍數(shù)由第6天時的細胞總數(shù)量除以純化后一天的細胞數(shù)量來計算。百分比指示表達CD34的細胞在總群體中的分數(shù)。圖SB.該圖代表6孔板的I個孔，該孔含有在利用完全限定的不含動物成分的試劑重編程針對CD34表達富集的擴展細胞后，對堿性磷酸酶染色呈陽性的集落。示例性實施方案的描述1.緒論本發(fā)明涉及用于提高外周血細胞重編程的全過程效率的方法和組合物。此種重編程可以在不含異種物質(zhì)的或限定的條件下進行，并且可以實質(zhì)上不含外源性逆轉(zhuǎn)錄病毒遺傳元件，由此制得與臨床更加相關的iPS細胞。使用未明確限定的(ill-defined)系統(tǒng)和涉及依賴于染色體整合的基于病毒的方法的方法，iPS細胞的臨床相關性的全面評估受到它們的起源的阻礙。例如，小鼠胚胎成纖維細胞(MEF)與已經(jīng)在MEF的存在下條件化的重編程培養(yǎng)基一起經(jīng)常被用作用于促進iPS發(fā)育的支持層。本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)重編程效率部分地受在不同批次之間可以有所變化的所用MEF的質(zhì)量影響。因此很難控制和定量該差異性，因為MEF賦予重編程的貢獻未明確限定。因此，優(yōu)選建立易于操縱、獨立于MEF的較明確限定的系統(tǒng)，以便結果具有更高的可預測性。多個實驗室已經(jīng)在使用不含飼養(yǎng)物的底物如Matrigel (小鼠起源)或其衍生物產(chǎn)生iPS細胞方面取得成功(Aasen和Belmonte，2010 ；Sun等人，2009)，但是它們都沒有使用外周血細胞或不含異種物質(zhì)的基質(zhì)。 此外，基于病毒的重編程方法迄今為止已被證明比非整合方法更有效，因此更一致地用于產(chǎn)生iPS細胞。不幸地，攜帶編碼已知癌基因如C-myc和T-抗原的表達盒的整合DNA的存在因為至少兩個原因而不可接受。它們的存在總是造成在臨床應用的限制標準范圍內(nèi)不能被容忍的那些基因的重激活和表達的威脅。由基于病毒的方法引發(fā)的整合也發(fā)生在多個往往不可預測的位置，其可能會破壞存在于宿主DNA內(nèi)的內(nèi)源基因的表達，該表達對于控制增殖或?qū)е略谙掠畏治鲋羞@些細胞的性能存在差異性的重要細胞過程是至關重要的。因此，使用限定條件產(chǎn)生iPS細胞的非整合策略將減輕這種潛在差異性。為了提供患者特異性細胞以滿足要求高的臨床應用標準，iPS克隆必須從含有高分數(shù)的靶細胞的或者至少易于擴展的易處理的源物質(zhì)產(chǎn)生，從不含飼養(yǎng)物的條件或化學限定的條件產(chǎn)生，并且可經(jīng)由可跨越數(shù)百個樣品擴展的工藝重編程。血液是從世界各地的患者常規(guī)提取的極容易獲得的組織源，并且來自動員和未動員的血液供體的細胞已經(jīng)成功地被整合病毒載體重編程(Loh等人，2009 ；Ye等人，2009) (PloS,出版中)。特別地，針對CD34表達富集的細胞已被證明能比成纖維細胞更有效地重編程。然而，目前用于重編程CD34+細胞的方法不能滿足臨床應用所需的嚴格、不含異種物質(zhì)的標準。首先，CD34+細胞僅構成未動員的外周血(僅1000個細胞/ml血液)的一小部分(0. 1% )。其次，研究者依賴于基于病毒的方法，該方法需要整合到染色體DNA中的步驟。第三，公布的方法涉及MEF和條件化培養(yǎng)基，因此未明確限定并且含有異種污染物。
本發(fā)明部分地基于從外周血產(chǎn)生iPS細胞的完全限定的工藝的發(fā)現(xiàn)。如實施例中所示，提供了擴展來自少于IOml血液的⑶34表達細胞的群體以及在不含整合DNA且最終不含染色體外DNA的無飼養(yǎng)物條件下產(chǎn)生iPS細胞的方法。
下面描述了本發(fā)明的進一步的實施方案和優(yōu)勢。
I1.定義
“重編程”是這樣的過程其賦予細胞與沒有重編程的相同條件下相比，可測量的增加的形成至少一種新細胞類型的能力(無論是在培養(yǎng)物中還是在體內(nèi))。更具體地，重編程是賦予體細胞多潛能潛力的過程。這意味著，在足夠的增殖之后，可測量的比例的子代具有新細胞類型的表型特征(如果在重編程之前實質(zhì)上沒有此類子代能夠形成)；或者，具有新細胞類型的特征的比例比重編程之前是可測量的增加。在某些條件下，具有新細胞類型的特征的子代比例可以是至少約或更高，按次序以漸增為優(yōu)選。
當用于與培養(yǎng)基、細胞外基質(zhì)或培養(yǎng)條件相關時，術語“不含異種物質(zhì)(XF) ”或 “不含動物組分(ACF) ”或“不含動物成分”是指實質(zhì)上不含異質(zhì)的動物來源的組分的培養(yǎng)基、細胞外基質(zhì)或培養(yǎng)條件。為了培養(yǎng)人細胞，非人動物如小鼠的任何蛋白質(zhì)都是異種組分。在某些方面，不含異種物質(zhì)的基質(zhì)可以實質(zhì)上不含任何非人動物來源的組分， 因此排除了小鼠飼養(yǎng)細胞或Matrigel 。Matrigel 是一種溶解型基底膜制劑，其是從 Engelbreth-Holm-Swarm(EHS)小鼠肉瘤(一種富含細胞外基質(zhì)蛋白的腫瘤)中提取，從而包括層粘連蛋白(主要組分)、膠原蛋白IV、 硫酸肝素蛋白多糖和內(nèi)功素(entactin)/巢蛋白(nidogen)。
當用于與培養(yǎng)基、細胞外基質(zhì)或培養(yǎng)條件相關時，術語“限定的”是指其中幾乎所有組分的性質(zhì)和量都是已知的培養(yǎng)基、細胞外基質(zhì)或培養(yǎng)條件。
“化學限定的培養(yǎng)基”是指其中幾乎所有成分的化學性質(zhì)及它們的量都是已知的培養(yǎng)基。這些培養(yǎng)基也被稱為合成培養(yǎng)基?；瘜W限定的培養(yǎng)基的實例包括TeSR 。
當細胞具有少于10%的如本文使用的外源遺傳元件或載體元件時，所述細胞“基本上不含”所述的一種(多種)元件，而當細胞具有少于I %的外源遺傳元件或載體元件時， 所述細胞“實質(zhì)上不含”所述的一種(多種)元件。然而，其中少于O. 5%或少于O. 1%的總細胞群體包含外源遺傳元件或載體元件的細胞群體是甚至更合乎需要的。
當培養(yǎng)物、基質(zhì)或培養(yǎng)基所具有的某些試劑如信號傳導抑制劑、動物組分或飼養(yǎng)細胞的水平低于利用本領域普通技術人員已知的常規(guī)檢測方法可檢測的水平或者這些試劑沒有從外部添加到培養(yǎng)物、基質(zhì)或培養(yǎng)基中時，所述培養(yǎng)物、基質(zhì)或培養(yǎng)基“實質(zhì)上不含” 這些試劑。
“外周血細胞”是指血液的細胞組分，包括在血液循環(huán)池中發(fā)現(xiàn)的紅血細胞、白血細胞和血小板。
“造血祖細胞”或“造血前體細胞”是指定向于造血譜系但能夠進一步造血分化的細胞，其包括造血干細胞、多潛能造血干細胞(成血細胞)、髓樣祖細胞、巨核細胞祖細胞、 紅細胞祖細胞和淋巴樣祖細胞。造血干細胞(HSC)是多潛能干細胞，其產(chǎn)生所有的血細胞類型，包括髓樣(單核細胞和巨噬細胞、嗜中性粒細胞、嗜堿性粒細胞、嗜酸性粒細胞、紅細胞、巨核細胞/血小板、樹突細胞)和淋巴樣譜系(T細胞、B細胞、NK細胞)。造血祖細胞可以表達或可以不表達⑶34。造血祖細胞可以共表達⑶133并且對于⑶38的表達呈陰性。在某些實施方案中，某些人造血祖細胞可以不表達⑶34，但這些細胞仍可以通過本文公開的方法轉(zhuǎn)化為iPS細胞。造血前體細胞包括⑶34+/⑶45+造血前體細胞和⑶34+/⑶45+/ ⑶43+造血前體細胞。⑶34+/⑶43+/⑶45+造血前體細胞可以針對髓樣祖細胞高度富集。造血祖細胞的多個譜系，例如⑶34+/⑶43+/⑶45+造血前體細胞，可以通過本文公開的方法轉(zhuǎn)化為iPS細胞。造血祖細胞還包括原代造血細胞的多個子集，包括⑶347⑶133+/⑶38_(原代造血前體細胞)、CD43(+)CD235a(+)CD41a(+/_)(紅細胞-巨核細胞生成性的)、Iin (-) CD34 (+) CD43 (+) CD45 (_)(多潛能)，以及 I in (-) CD34 (+) CD43 (+) CD45 (+)(偏髓樣的)細胞、CD133+/ALDH+(醛脫氫酶)(例如，Hess等人2004 ；Christ等人，2007)。預想到可以如本文描述的那樣將這些原代造血細胞類型或造血前體細胞中的任一種轉(zhuǎn)化為iPS細胞。
“載體”或“構建體”(有時稱為基因遞送或基因轉(zhuǎn)移“媒介物”)是指大分子或分子復合物，其包含待在體外或體內(nèi)遞送到宿主細胞中的多核苷酸。載體可以是線性或環(huán)狀分子。
“質(zhì)粒”是常見類型的載體，是分離自染色體DNA的染色體外DNA分子，其能夠獨立于染色體DNA而復制。在某些情況下，它是環(huán)狀的和雙鏈的。
“表達構建體”或“表達盒”意思是能夠指導轉(zhuǎn)錄的核酸分子。表達構建體至少包括啟動子或功能上等同于啟動子的結構。還可以包括另外的元件，例如增強子和/或轉(zhuǎn)錄終止信號。
當用于與細胞或生物體中的蛋白質(zhì)、基因、核酸或多核苷酸相關時，術語“外源的” 是指通過人工方式被導入該細胞或生物體中的蛋白質(zhì)、基因、核酸或多核苷酸；或者當用于與細胞相關時，是指通過人工方式被分離并隨后被導入其他細胞或?qū)肷矬w中的細胞。 外源核酸可以來自不同的生物體或細胞，或者它可以是天然存在于生物體或細胞中的核酸的一個或多個另外的拷貝。外源細胞可以來自不同的生物體，或者它可以來自相同的生物體。通過非限制性舉例來講，外源核酸位于與天然細胞中的染色體位置不同的染色體位置上，或者其兩側是與在自然界發(fā)現(xiàn)的核酸序列不同的核酸序列。
術語“對應于”在本文中用于意指多核苷酸序列與參考多核苷酸序列的全部或一部分是同源的(即相同的，非嚴格進化相關)；或者多肽序列與參考多肽序列是相同的。與此對比，術語“互補于”在本文中用于意指互補序列與參考多核苷酸序列的全部或一部分是同源的。舉例說明核苷酸序列"TATAC"對應于參考序列"TATAC"并且互補于參考序列"GTATA"。
“編碼”特定蛋白的“基因”、“多核苷酸”、“編碼區(qū)”、“序列”、“區(qū)段”、“片段”或“轉(zhuǎn)基因”是指在體外或體內(nèi)時，當被置于合適的調(diào)節(jié)序列控制下時，轉(zhuǎn)錄并且還任選地被翻譯成基因產(chǎn)物例如多肽的核酸分子。編碼區(qū)可以以cDNA、基因組DNA或RNA形式存在。當以 DNA形式存在時，核酸分子可以是單鏈的(即正義鏈)或雙鏈的。編碼區(qū)的邊界由5'(氨基)末端的起始密碼子和3'(羧基)末端的翻譯終止密碼子來確定。基因可以包括但不限于，來自原核或真核mRNA的cDNA、來自原核或真核DNA的基因組DNA序列，以及合成的 DNA序列。轉(zhuǎn)錄終止序列通常位于基因序列的3'端。
術語“細胞”在本文中以其在本領域中最寬的含 義使用，是指活體，所述活體為多細胞生物體的組織的結構單元，被將其與外界隔離的膜結構環(huán)繞，具有自我復制的能力，并且具有遺傳信息和用于表達它的機制。本文使用的“細胞”可以是天然存在的細胞或人工修飾的細胞(例如，融合細胞、遺傳修飾的細胞等)。
如本文使用的術語“干細胞”是指能夠自我復制和具有多潛能性的細胞。通常，干細胞可以使損傷的組織再生。本文的干細胞可以是但不限于，胚胎干(ES)細胞或組織干細胞(也稱為組織特異性干細胞，或體干細胞)。任何可具有上述能力的人工產(chǎn)生的細胞(例如本文使用的融合細胞、重編程細胞等)都可以是干細胞。
“胚胎干(ES)細胞”是源自早期胚胎的多潛能干細胞。ES細胞首先于1981年建立，從1989年開始，其也被用于產(chǎn)生敲除小鼠。在1998年建立了人ES細胞，其目前正開始應用于再生醫(yī)學。
與ES細胞不同，組織干細胞具有有限的分化潛力。組織干細胞存在于組織中的特定位置，并且具有未分化的細胞內(nèi)結構。因此，組織干細胞的多潛能性通常低。組織干細胞具有較高的細胞核/細胞質(zhì)比并且具有很少的細胞內(nèi)細胞器。多數(shù)組織干細胞具有低的多潛能性、長的細胞周期和超出個體壽命的增殖能力?；诩毎鶃碓吹奈稽c，例如真皮系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、骨髓系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)等，組織干細胞被分成多個類別。真皮系統(tǒng)中的組織干細胞包括表皮干細胞、毛囊干細胞等。消化系統(tǒng)中的組織干細胞包括胰腺(普通)干細胞、肝臟干細胞等。骨髓系統(tǒng)中的組織干細胞包括造血干細胞、間質(zhì)干細胞等。神經(jīng)系統(tǒng)中的組織干細胞包括神經(jīng)干細胞、視網(wǎng)膜干細胞等。
“誘導性多潛能干細胞”通常簡寫為iPS細胞或iPSC，是指通過導入被稱為重編程因子的某些因子以人工方式從非多潛能細胞制備的一類多潛能干細胞，所述非多潛能細胞通常是成年體細胞或末端分化的細胞，例如成纖維細胞、造血細胞、肌細胞、神經(jīng)元、表皮細胞等。
“多潛能性”是指干細胞具有分化成構成一種或多種組織或器官或特別是三個胚層中的任一個胚層的所有細胞的潛力，所述三個胚層為內(nèi)胚層(胃內(nèi)襯、胃腸道、肺)、中胚層(肌肉、骨骼、血液、泌尿生殖道)或外胚層(表皮組織和神經(jīng)系統(tǒng))。如本文使用的 “多潛能干細胞”是指可以分化成來源于三個胚層中的任一個胚層的細胞的細胞，例如，全能細胞或誘導性多潛能細胞的直接后代。關于核酸分子的“可操作地連接”意指按照允許核酸分子轉(zhuǎn)錄的方式連接兩種或更多種核酸分子(例如待轉(zhuǎn)錄的核酸分子、啟動子和增強子元件)。關于肽和/或多肽分子的“可操作地連接”意指按照產(chǎn)生單一多肽鏈，即具有融合物的每種肽和/或多肽組分的至少一種性質(zhì)的融合多肽的方式連接兩種或更多種肽和/或多肽分子。特別地，融合多肽是嵌合的，即，由異源分子組成。
II1.血細胞的重編程
為了從目前本領域通常使用的真皮成纖維細胞之外的替代來源提供iPS細胞，可以提供用于重編程包含外周血細胞的細胞群體的方法。還非常希望重編程容易獲得并且暴露于環(huán)境誘變劑的可能性較小的血細胞。例如，收集并儲存在血庫中的外周血細胞可以用作自體或同種異體但組織相容的iPS細胞系的來源。更關鍵地，如果希望產(chǎn)生含有限制于血細胞并且僅在獲得性血液學病癥中被發(fā)現(xiàn)的體細胞突變的iPS細胞來調(diào)查它們的發(fā)病機理，那么重編程血細胞的能力是必需的。在某些實施方案中，擴展外周血細胞群體中的造血祖細胞以提供相當數(shù)量的用于進行重編程的起始細胞。因此，本發(fā)明中的從人血細胞的重編程代表一種從在培養(yǎng)時需要很少的操作時間的供體細胞建立iPS細胞的新方法。重編程來自人血液的細胞的能力將促進用于產(chǎn)生患者特異性干細胞的可靠方法的形成。
A.造血祖細胞
由于造血干細胞和造血祖細胞的重要的醫(yī)學潛在意義，已經(jīng)進行了實質(zhì)性工作以試圖改善從胚胎干細胞分化造血祖細胞的方法。在成人中，主要存在于骨髓中的造血干細胞產(chǎn)生活躍分裂的造血(CD34+)祖細胞的異質(zhì)群體，所述祖細胞分化為血液系統(tǒng)的所有細胞。雖然預期到CD34+內(nèi)皮細胞可以被轉(zhuǎn)化為iPS細胞，但是在某些實施方案中，使用非內(nèi)皮細胞的造血細胞可能是理想的；例如，在一些情況下，使用不表達CD31或VE-鈣粘蛋白的造血祖細胞或造血前體細胞可能是理想的。其他標記，例如⑶43和/或⑶45標記，也可用于輔助鑒定造血祖細胞(例如，Kadaja-Saarepuu等人,2008 ；Vodyanik等人,2006)。造血祖細胞包括原代造血細胞的多個子集，包括⑶43(+)⑶235a (+)⑶41a (+/-)(紅細胞-巨核細胞生成性的)、lin(-)CD34(+)CD43(+)CD45(_)(多潛能)，和 Iin (-) CD34 (+) CD43 (+) CD45(+)(偏髓樣的)細胞。在成人中，造血祖細胞增殖并分化，導致每日產(chǎn)生數(shù)千億成熟血細胞。造血祖細胞也存在于臍帶血中。在體外，人胚胎干細胞可以分化為造血祖細胞。也可以從如下所述的外周血樣品擴展或富集造血祖細胞。造血細胞可以來源于人、鼠科動物或任何其他哺乳動物物種。
造血祖細胞的分離包括任何選擇方法，其包括細胞分選儀、使用抗體包被的磁珠進行的磁力分離、填充柱；親和色譜法；聯(lián)接至單克隆抗體或與單克隆抗體聯(lián)用的細胞毒性劑，包括但不限于補體和細胞毒素；以及利用附連至固體基質(zhì)例如板上的抗體進行的“淘選”，或任何其他常規(guī)技術。
分離和隔離技術的使用包括但不限于，基于物理性質(zhì)(密度梯度離心和反流離心淘洗)、細胞表面性質(zhì)(凝集素和抗體親和性)，以及活體染色性質(zhì)(線粒體結合染料rhol23和DNA結合染料H0echst33342)的差異的那些。提供準確分離的技術包括但不限于FACS (熒光激活細胞分選)或MACS (磁激活細胞分選)，其可以具有不同程度的混雜(sophistication)，例如，多個顏色通道、低角和遲鈍的光散射探測通道、阻抗 通道 (impedance channel)等。
在前述技術或用于評估細胞類型純度的技術(如流式細胞術)中使用的抗體可以綴合至可鑒定試劑，所述可鑒定試劑包括但不限于酶、磁珠、膠體磁珠、半抗原、熒光染料、金屬化合物、放射性化合物、藥物或半抗原?？删Y合至抗體的酶包括但不限于堿性磷酸酶、過氧化物酶、脲酶和半乳糖苷酶?？删Y合至抗體的熒光染料包括但不限于異硫氰酸熒光素、異硫氰酸四甲基羅丹明、藻紅蛋白、別藻藍蛋白和德克薩斯紅(Texas Red)。 對于可綴合至抗體的另外的突光染料，參見Haugland, Molecular Probes Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals (1992-1994)?？删Y合至抗體的金屬化合物包括但不限于鐵蛋白、膠體金，特別是膠體的超順磁性珠?？删Y合至抗體的半抗原包括但不限于，生物素、地高辛(digoxygenin)、oxazalone,和硝基苯酹?？删Y合或摻入到抗體中的放射性化合物是本領域已知的，包括但不限于锝99Hi(99TC)、1251和包含任何放射性核素的氨基酸，所述放射性核素包括但不限于14c、3h和35S。
可以采用允許準確分離的其他陽性選擇技術，如親和柱等。該方法應當允許除去非靶細胞群體的少于約20%，優(yōu)選少于約5%的殘余量。
可以基于光散射性質(zhì)及細胞對各種細胞表面抗原的表達來選擇細胞。根據(jù)FACS 分析，純化的干細胞具有低的側向散射分布和低至中等的正向散射分布。Cytospin (細胞離心涂片機)制劑顯示富集的干細胞具有介于成熟淋巴樣細胞和成熟粒細胞之間的尺寸。
還可以在培養(yǎng)之前，使用例如Sutherland等人(1992)和描述于美國專利 No. 4，714，680中的方法富集CD34+細胞的接種群體。例如，對細胞進行陰性選擇以除去表達譜系特異性標記的那些細胞。在示例性實施方案中，可以對細胞群體進行陰性選擇，以消除非CD34+造血細胞和/或特定造血細胞子集。陰性選擇可以基于多種分子的細胞表面表達進行，所述多種分子包括T細胞標記如⑶2、⑶4和⑶8 ；B細胞標記如⑶10、⑶19和⑶20 ； 單核細胞標記⑶14 ;NK細胞標記⑶2、⑶16和⑶56或任何譜系特異性標記。陰性選擇可以基于多種分子的細胞表面表達進行，所述多種分子為例如可以用于經(jīng)由MACS或柱分離來分離其他細胞類型的抗體混合物(例如，⑶2、⑶3、⑶lib、⑶14、⑶15、⑶16、⑶19、⑶56、 CDI23 和 CD235a)。
如本文使用的譜系陰性的(LIN_)是指缺少至少一種與譜系定向細胞相關的標記的細胞，所述標記為例如與T細胞(如CD2、3、4和8)、B細胞(如CD10、19和20)、髓樣細胞(如CD14、15、16和33)、自然殺傷("NK")細胞(如CD2、16和56)、RBC (如血型糖蛋白A)、巨核細胞(CD41)、肥大細胞、嗜酸性粒細胞或嗜堿性粒細胞相關的標記,或其他標記如⑶38、⑶71和HLA-DR。優(yōu)選譜系特異性標記包括但不限于，⑶2、⑶14、⑶15、⑶16、 ⑶19、⑶20、⑶33、⑶38、HLA-DR和CD71中的至少一種。更優(yōu)選地，LIN-將包括至少CD 14 和⑶15。進一步純化可以通過對例如c-kit+或Thy-Γ進行陽性選擇來實現(xiàn)。進一步富集可以通過本領域已知的方法，通過使用線粒體結合染料羅丹明123和針對羅丹明+細胞的選擇來獲得。高度富集的組合物可以通過選擇性分離作為⑶34+，優(yōu)選⑶34+LIN_，最優(yōu)選 CD34+Thy-1+LIN-的細胞獲得。干細胞高度富集的群體和獲取它們的方法是本領域技術人員熟知的，參見，例如，描述于 PCT/US94/09760、PCT/US94/08574 和 PCT/US94/10501 中的方法。
可以采用各種技術分離細胞，通過初始去除專用譜系的細胞進行。單克隆抗體對于鑒定與特定細胞譜系和/或分化階段相關的標記特別有用?？梢詫⒖贵w附連至固體支持物以允許粗分離。采用的分離技術應當將使收集部分的成活力的保留最大化?？梢圆捎镁哂胁煌πУ母鞣N技術來獲取“相對粗”的分離物。此類分離物是這樣的分離物，其中所存在的總細胞中的最多10%，通常不超過約5%，優(yōu)選不超過約I %是仍然與待保留細胞群體在一起的不期望細胞。采用的具體技術將取決于分離效率、相關的細胞毒性、執(zhí)行的容易性和速度，以及對先進設備和/或技術技能的需要。
造血祖細胞的選擇不必單獨地利用對細胞有特異性的標記來實現(xiàn)。通過使用陰性選擇和陽性選擇的組合，可以獲得富集的細胞群體。
B.血細胞來源
造血干細胞(HSC)通常產(chǎn)生于骨髓中，但可被迫使進入血液，該過程被稱為動員，在臨床上用于收獲外周血中的大量HSC。選定的一種動員劑是粒細胞集落刺激因子 (G-CSF)。
可以通過血液成分分離技術，在無擾狀態(tài)，或在從外部施用造血生長因子如G-CSF 后進彳丁動員之后，收集在外周血中循環(huán)的CD34造血干細胞或祖細胞。在動員之后收集的干細胞或祖細胞的數(shù)量大于在無擾狀態(tài)下在血液成分分離之后獲得的數(shù)量。在本發(fā)明的具體方面，細胞群體的來源是其細胞未經(jīng)外部施用的因子動員的受試者，因為無需在體內(nèi)富集造血干細胞或造血祖細胞。
用于本文描述的方法中的細胞群體可以是哺乳動物細胞，例如人細胞、非人靈長類動物細胞、嚙齒類動物細胞(例如小鼠或大鼠細胞)、牛科動物細胞、羊科動物細胞、豬科動物細胞、馬科動物細胞、羊細胞、犬科動物細胞，和貓科動物細胞，或其混合物。非人靈長類動物細胞包括獼猴細胞。細胞可以獲自動物，例如人患者，或者它們可以來自細胞系。如果細胞是獲自動物，則它們可以用作此類，例如，未分離的細胞(即，混合群體)；它們可能首先已經(jīng)例如通過轉(zhuǎn)化建立在培養(yǎng)物中；或者它們可能已經(jīng)經(jīng)受初步純化方法。例如，細胞群體可以基于細胞表面標記的表達通過陽性或陰性選擇進行操縱；在體外或在體內(nèi)用一種或多種抗原進行刺激；在體外或在體內(nèi)用一種或多種生物修飾劑進行處理；或這些中的任一種或全部的組合。
細胞群體包括外周血單核細胞(PBMC)、含有混合群體的全血或其級分、脾細胞、骨髓細胞、腫瘤浸潤性淋巴細胞、通過白細胞分離術獲得的細胞、活組織檢查組織、淋巴結，例如從腫瘤引流的淋巴結。合適的供體包括經(jīng)免疫的供體、非免疫的(首次接受試驗的)供體、經(jīng)處理的或未經(jīng)處理的供體。“經(jīng)處理的”供體是已經(jīng)暴露于一種或多種生物修飾劑的供體?！拔唇?jīng)處理的”供體是未暴露于一種或多種生物修飾劑的供體。
例如，可以如根據(jù)本領域已知的方法描述的那樣獲得外周血單核細胞(PBMC)。此類方法的實施例在Kim等人(1992) ;Biswas等人(1990) ;Biswas等人(1991)中有討論。
從細胞群體獲取造血前體細胞的方法也是本領域熟知的。可以使用各種細胞因子如hSCF、hFLT3和/或IL-3擴展造血前體細胞(Akkina等人，1996)，或者可以使用MACS或 FACS富集⑶34+細胞。如上所述，也可使用陰性選擇技術來富集⑶34+細胞。
也可以從受試者獲取細胞樣品，然后針對所需的細胞類型對它進行富集。例如， 可以如本文描述的那樣從血液 分離PBMC和/或CD34+造血細胞。也可以使用多種技術從其他細胞分離細胞，例如，使用結合至所需細胞類型的細胞表面上的表位的抗體來分離和/ 或激活。可以使用的另一種方法包括使用針對細胞表面標記的抗體進行陰性選擇，以選擇性富集特定細胞類型而不通過受體的介入激活細胞。
骨髓細胞可以獲自髂嵴、股骨、脛骨、脊骨、肋骨或其他骨髓腔?？梢詮幕颊呷〕龉撬璨⑼ㄟ^多種分離和洗滌程序分離。用于分離骨髓細胞的示例性程序包括以下步驟a) 將骨髓懸浮液離心分離為3個級分，并收集中間級分，或血沉棕黃層；b)在分離流體，通常 Ficoll (Pharmacia Fine Chemicals AB的商標)中再離心來自步驟a)的棕黃層級分I次， 并收集含有骨髓細胞的中間級分；以及c)洗滌所收集的來自步驟b)的級分以回收可再輸送的骨髓細胞。
IV.培養(yǎng)條件
人多潛能干細胞研究是在現(xiàn)代生物學中最具活力的領域之一。通常獲取人iPS細胞如人ES細胞并在小鼠胚胎成纖維細胞(MEF)的飼養(yǎng)層下進行培養(yǎng)。例如，人多潛能干細胞的治療潛力在于為由單個細胞類型的喪失或非功能喪失引起的病癥如帕金森氏癥和糖尿病移植分化的細胞類型。然而，這些臨床引用目前受到在體外獲取和繁殖階段期間的異種物質(zhì)污染影響。如傳統(tǒng)上使用的小鼠飼養(yǎng)物或條件培養(yǎng)基帶有引入非人病原體的風險，其將消除在將來移植的可能性。因而，縮小研究模型與臨床引用之間的差距需要設計和實施不含異種物質(zhì)的工藝。不含異種物質(zhì)(XF ;或不含動物組分，ACF;或不含動物成分)的培養(yǎng)條件，如不含異種物質(zhì)的培養(yǎng)基和不含異種物質(zhì)的細胞外基質(zhì)是開發(fā)需要在人中的植入的再生干細胞療法的基本要素。另外，重編程效率可能會受到所使用的MEF飼養(yǎng)細胞或任何動物來源的產(chǎn)品的差異性影響。
為了提高外周血中的造血祖細胞的總重編程效率并降低所述差異性，可以提供用于擴展造血祖細胞的各種不含飼養(yǎng)物、不含異種物質(zhì)或限定的培養(yǎng)條件、基質(zhì)或培養(yǎng)基，以及重編程此類細胞的方法。
A.造血祖細胞擴展條件
本發(fā)明的擴展方法可以包括將基本上富集于造血祖細胞中并且基本上不含基質(zhì)細胞的細胞群體接種到擴展容器中并且于一定體積的適宜培養(yǎng)基中，使得細胞密度為至少約5，000個細胞/mL培養(yǎng)基，優(yōu)選7，000至約200，000個細胞/mL培養(yǎng)基，更優(yōu)選約10，000 至約150,000個細胞/mL培養(yǎng)基，并且是在約I %至20%，優(yōu)選低于8%的初始氧濃度下接種的。在一個實施方案中，初始氧濃度范圍為約1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%，或從其導出的任意范圍。
在一方面，接種的細胞群體來源于成年骨髓并且具有約7，000個細胞/mL至約 20，000個細胞/mL，優(yōu)選約20，000個細胞/mL的細胞密度。在單獨的方面，接種的細胞群體來源于動員的外周血并且具有約20，000個細胞/mL至約50，000個細胞/mL，優(yōu)選50，000 個細胞/mL的細胞密度。在另一方面，接種的細胞群體來源于未動員的外周血并且具有約 7，000個細胞/mL至約50，000個細胞/mL，優(yōu)選約20，000個細胞/mL的細胞密度。
在本發(fā)明方法中可以使用任何適宜的擴展容器、燒瓶或合適的管，如24孔板、 12. 5cm2T燒瓶或透氣袋。此類培養(yǎng)容器可購自FalcoruCorning或Costar。如本文使用的 “擴展容器”還意圖包括任何用于擴展細胞的腔室或容器，不論所述用于擴展細胞的腔室或容器 是獨立式的，還是并入到擴展設備如本文描述的生物反應器中。在一個實施方案中，擴展容器是由凹面和剩余細胞支承表面朝向的平面形成的腔室的減小的體積空間。
多種培養(yǎng)基可以用于擴展造血祖細胞。示例性培養(yǎng)基包括Dulbecco' s MEM、MDM 以及可補充多種不同營養(yǎng)物、生長因子、細胞因子等的RPM1-1640。該培養(yǎng)基可以不含血清或補充有適量的血清如胎牛血清或自體血清。優(yōu)選地，為了用于人治療，該培養(yǎng)基不含血清或補充有自體血清。一種適宜的培養(yǎng)基是含有以下的培養(yǎng)基=MDM、有效量的蛋白胨、蛋白酶抑制劑和垂體提取物中的至少一種，以及有效量的人血清白蛋白或血漿蛋白質(zhì)級分、肝素、還原劑、胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白和乙醇胺中的至少一種。在進一步的實施方案中，適宜的擴展培養(yǎng)基含有至少MDM和1-15%的胎牛血清。其他適宜的培養(yǎng)基配方是本領域技術人員熟知的，參見例如美國專利No. 5，728，581。
不管在任何給定造血祖細胞擴展中使用何種特定培養(yǎng)基，所使用的培養(yǎng)基都優(yōu)選補充有濃度為約O.1ng/mL至約500ng/mL,更通常為10ng/mL至100ng/mL的至少一種細胞因子。適宜的細胞因子包括但不限于c-kit配體(KL)(也稱為青灰因子(StI)、肥大細胞生長因子(MGF)，和干細胞因子(SCF))、IL-6、G-CSF、IL-3、GM-CSF、IL-1 a、IL_llMIP_la、 LIF、c-mpl 配體 /TPO,和 flk2/flk3 配體(Flt2L 或 Flt3L)。(Nicola 等人，1979 ；Golde 等人，1980 ；Lusis, 1981 ；Abboud 等人，1981 ；0kabe, 1982 ；Fauser 等人，1981)。特別地，該培養(yǎng)物將包括SCF、Flt3L和TPO中的至少一種。更特別地，該培養(yǎng)物將包括SCF、Flt3L和 TPO。
在一個實施方案中，細胞因子包含在培養(yǎng)基中并且通過培養(yǎng)基灌注來加以補充。 或者，當使用生物反應器系統(tǒng)時，細胞因子可以作為濃縮溶液經(jīng)由單獨的入口單獨地添加， 而無需培養(yǎng)基灌注。當不經(jīng)灌注添加細胞因子時，該細胞因子通常將作為IOX至100X溶液以等于生物反應器中的體積的1/10至1/100的量添加，新鮮細胞因子約每2至4天添加。 進一步地，除了在灌注培養(yǎng)基中的細胞因子之外，還單獨添加新鮮的濃縮細胞因子。
然后在適宜條件下培養(yǎng)細胞，以便該細胞使培養(yǎng)基條件化。當直到培養(yǎng)前幾天之后才更換培養(yǎng)基，例如才開始灌注時，可以改善純化造血祖細胞的擴展。
在某些方面，適宜條件包含在33°C至39 °C，優(yōu)選在約37°C下培養(yǎng)(初始氧濃度優(yōu)選為4-8%，最優(yōu)選為約5% )至少6天，優(yōu)選約7至約10天，以允許自分泌因子從細胞釋放，而沒有釋放足夠多的廢物產(chǎn)品以至于大幅度抑制造血祖細胞擴展。在該時間之后，氧濃度可以在剩余的培養(yǎng)期內(nèi)分步或逐漸增加至約20%，培養(yǎng)期總共可為10-28天。可以讓骨髓干細胞、動員的外周血細胞或未動員的外周血細胞生長約I天、2天、3天、4天、5天、6 天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、 21天、22天、23天、24天、25天或從其導出的任意范圍的時間。
在未經(jīng)歷培養(yǎng)基更換的初始培養(yǎng)期后，可以以允許造血祖細胞擴展的速率更換培養(yǎng)基。在沒有使用可變?nèi)莘e的系統(tǒng)中，可以在第7天(對于動員的外周血干細胞而言)或第10天(對于骨髓細胞而言)更換培養(yǎng)基。在灌注系統(tǒng)中的新鮮培養(yǎng)基的更換可以例如是層流(laminar)。這種均勻的非擾動的流阻止“死空間”的形成，在所述死空間中細胞的碎片沒有暴露于培養(yǎng)基中。 可以以約O. 10/天至O. 50/天，或每天更換1/10體積至1/2體積的速率更換培養(yǎng)基。例如，灌注速率可以為約O. 25/天至O. 40/天。更優(yōu)選地，對于骨髓干細胞，灌注可以在約第14天開始以O. 27/天的速率進行，而對于動員或未動員的外周血細胞，灌注在約第10天時以O. 25/天的速率開始并在約第12天時增加至O. 40/天。
特別地，可以在整個擴展過程中保持細胞濃度為最佳。例如，與僅擴展 10-20倍的單核細胞(MNC)群體相比，祖細胞可擴展多達 1500倍。祖細胞具有大的增殖能力，因此，當在封閉系統(tǒng)中進行培養(yǎng)時，此種系統(tǒng)必須提供對于總細胞擴展足夠的體積。然而，祖細胞還可以具有相對高的接種密度。最佳的接種密度和增殖條件可以通過讓細胞在諸如美國專利No. 5，728，581中描述的生物反應器的生物反應器中生長來實現(xiàn)?？梢詫⒓毎院线m的細胞密度接種在凹陷部分處，并在達到合適的細胞密度時添加額外的培養(yǎng)基。該裝置的形狀可以允許培養(yǎng)基體積增加至多達三倍而沒有大幅度降低對細胞的氧轉(zhuǎn)移效率。
B.在重編程期間和之后的培養(yǎng)條件
起始細胞(意思是，待重編程的擴展的造血祖細胞)和終末重編程細胞一般對培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件具有不同的要求。為了實現(xiàn)此要求，同時還允許該細胞發(fā)生重編程，可能需要一種或多種轉(zhuǎn)換培養(yǎng)條件。為了啟動重編程過程，可以將擴展的造血祖細胞在接種后轉(zhuǎn)染至少、約或最多O天、I天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天或9天,更特別地在接種后轉(zhuǎn)染3天、4天、5或6天，并且在示例性實施方案中，在接種后轉(zhuǎn)染6天。在替代實施方案中，擴展步驟可能并不總是必需的。例如，如果直接從未動員的外周血的純化中獲得足夠的造血祖細胞，那么可以在不存在擴展步驟的情況下啟動重編程。然而，當處理小體積，例如最多IOml體積的外周血時，可使用擴展步驟來增加造血祖細胞的數(shù)量并由此增大重編程效率。
轉(zhuǎn)染后立即以及作為在轉(zhuǎn)染后穩(wěn)定細胞的方式，將細胞培養(yǎng)在如上所述的造血祖細胞擴展培養(yǎng)基，或包含一種或多種有利于重編程細胞的培養(yǎng)的細胞因子和信號抑制劑的培養(yǎng)基，或該兩類條件的混合物(等量或以其他方式混合)中，所有這些培養(yǎng)基都最佳地為不含異種物質(zhì)的培養(yǎng)基。不管使用何種培養(yǎng)基，該條件都可以實質(zhì)上不含任何基質(zhì)組分或它可以包含基質(zhì)，該基質(zhì)優(yōu)選為不含異種物質(zhì)的基質(zhì)蛋白如纖連蛋白片段。此種培養(yǎng)條件可以處在轉(zhuǎn)染后的至少、約，或最多前O小時、I小時、2小時、4小時、6小時、8小時、10小時、 12小時、24小時或從其導出的任意范圍的時間段。然后，如果細胞尚未在基質(zhì)上，則可以將細胞轉(zhuǎn)換到基質(zhì)中，并在如上所述的造血祖細胞擴展培養(yǎng)基或有利于細胞重編程的培養(yǎng)基或這兩類條件的混合物(等量或以其他方式混合)中培養(yǎng)該細胞，所有這些培養(yǎng)基都最佳地為不含異種物質(zhì)的培養(yǎng)基。不管使用何種培養(yǎng)基，都在一天或兩天內(nèi)逐漸轉(zhuǎn)換細胞，將每種培養(yǎng)基更新成100%重編程培養(yǎng)基，此種重編程條件可以在轉(zhuǎn)染穩(wěn)定溫育之后持續(xù)至少、 約或最多I天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15 天。
在使用所公開的方法將重編程因子導入細胞中并如上面所述的那樣培養(yǎng)之后，可以將所得細胞轉(zhuǎn)移到足以維持細胞的多潛能性的培養(yǎng)基如TeSR2中。此種條件可以優(yōu)選地在重編程條件的后半部分期間通過在不去除培養(yǎng)基的情況下將TeSR2(或相似的多潛能細胞培養(yǎng)基)加入到重編程培養(yǎng)基中來逐漸獲得，接著完全替換，使得細胞培養(yǎng)在100%多潛能細胞培養(yǎng)基中。包括逐漸轉(zhuǎn)換期在內(nèi)的細胞在多潛能細胞培養(yǎng)基中的培養(yǎng)可以在100% 重編程條件之后持續(xù)至少、約或最多I天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天。 這種多潛能細胞培養(yǎng)條件可以包含細胞外基質(zhì)，因為多潛能干細胞是粘附細胞。
已經(jīng)使用在MEF飼養(yǎng)物上的傳統(tǒng)含血清培養(yǎng)基。在某些方面，本發(fā)明消除了對血清或MEF飼養(yǎng)細胞的需要，并且提供了用于重編程細胞的限定工藝和條件。
在本發(fā)明中產(chǎn)生的誘導性多潛能干(iPS)細胞的培養(yǎng)可以使用開發(fā)用于培養(yǎng)靈長類動物多潛能干細胞，更具體地，胚 胎干細胞的各種培養(yǎng)基和技術，如美國專利申請 20070238170和美國專利申請20030211603中描述的。應理解，如技術人員將會知曉的用于培養(yǎng)和維持人多潛能干細胞的另外的方法可以與本發(fā)明一起使用。
優(yōu)選可以不使用未限定的條件；例如，可以不在成纖維細胞飼養(yǎng)細胞或已暴露于成纖維細胞飼養(yǎng)細胞，尤其小鼠飼養(yǎng)細胞的培養(yǎng)基上培養(yǎng)重編程細胞。例如，可以使用限定的非飼養(yǎng)物依賴性培養(yǎng)系統(tǒng)如TeSR培養(yǎng)基，將多潛能細胞培養(yǎng)和維持在實質(zhì)上未分化的狀態(tài)(Ludwig等人，2006 ；Ludwig等人，2006)。可以使用非飼養(yǎng)物依賴性培養(yǎng)系統(tǒng)和培養(yǎng)基培養(yǎng)重編程細胞。這些設備允許重編程細胞在實質(zhì)上未分化的狀態(tài)上生長，而不需要小鼠成纖維細胞“飼養(yǎng)層”。如本文描述的，可以根據(jù)需要對這些方法做出各種修改以降低成本。
根據(jù)本發(fā)明某些方面的培養(yǎng)基可以使用用于培養(yǎng)動物細胞的培養(yǎng)基作為它的基礎培養(yǎng)基來制備，所述的用于培養(yǎng)動物細胞的培養(yǎng)基為例如TeSR、BME、BGJb, CMRL 1066、 Glasgow ΜΕΜλImproved MEM Zinc Option、IMDM、Medium 199、Eagle MEM、a MEM、DMEM、Ham、 RPMI1640和Fischer' s培養(yǎng)基以及其任何組合中的任一種，但是該培養(yǎng)基并不特別局限于此，只要它可以用于培養(yǎng)動物細胞即可。特別地，該培養(yǎng)基可以是不含異種物質(zhì)或化學限定的培養(yǎng)基。
根據(jù)本發(fā)明的培養(yǎng)基可以是含有血清的培養(yǎng)基或不含血清的培養(yǎng)基。不含血清的培養(yǎng)基是指不含未經(jīng)加工或未經(jīng)純化的血清的培養(yǎng)基，并且因此可以包括含有純化的血液來源的組分或動物組織來源的組分(如生長因子)的培養(yǎng)基。從阻止被異質(zhì)的動物來源的組分污染的角度而言，血清可以來源于與一種(多種)干細胞的動物相同的動物。
根據(jù)本發(fā)明的培養(yǎng)基可以含有或可以不含任何血清替代品。血清替代品可以包括適當?shù)睾幸韵挛镔|(zhì)的材料白蛋白(如富含脂質(zhì)的白蛋白、白蛋白代用品如重組白蛋白、植物淀粉、葡聚糖和蛋白水解物)、轉(zhuǎn)鐵蛋白(或其他鐵轉(zhuǎn)運體)、脂肪酸、胰島素、膠原蛋白前體、微量元素、2_巰基乙醇、3'-硫醇甘油，或其等同物。血清替代品可以通過例如國際公開No. 98/30679中公開的方法制備。或者，為了更方便，可以使用任何市售材料。市售材料包括敲除血清替代物(knockout Serum Replacement) (KSR)、化學限定的濃縮脂質(zhì) (Chemically-defined Lipid concentrated) (Gibco),和 Glutamax(Gibco)。
本發(fā)明的培養(yǎng)基還可以含有脂肪酸或脂質(zhì)、氨基酸(如非必需氨基酸)、一種(多種)維生素、生長因子、細胞因子、抗氧化物質(zhì)、2-巰基乙醇、丙酮酸、緩沖劑和無機鹽。2-巰基乙醇的濃度可以為，例如，約O. 05mM至1. OmM,更特別地為約O.1mM至O. 5mM,但是該濃度并不特別局限于此，只要它適合于培養(yǎng)一種(多種)干細胞即可。
用于培養(yǎng)一個(多個)細胞的培養(yǎng)器皿可以包括，但不特別局限于瓶、組織培養(yǎng)瓶、皿、皮氏培養(yǎng)皿、組織培養(yǎng)皿、多皿(multi dish)、微板、微孔板、多板(multi plate)、多孔板、微玻片、腔室玻片、管、盤、CellSTACK Chamber、培養(yǎng)袋，和轉(zhuǎn)瓶，只要它能夠培養(yǎng)其中的干細胞即可?？梢栽谥辽倩蚣sO. 2ml、0. 5ml、lml、2ml、5ml、10ml、20ml、30ml、40ml、 50ml、100ml、I50ml、200ml、250ml、300ml、350ml、400ml、450ml、500ml、550ml、600ml、800ml、 1000ml、1500ml，或從其導出的任意范圍的體積中培養(yǎng)細胞，這取決于培養(yǎng)需要。在某個實施方案中，培養(yǎng)器皿可以是生物反應器，該生物反應器可以指支持生物活性環(huán)境的任何裝置或系統(tǒng)。生物反應器可以具有至少或約2升、4升、5升、6升、8升、10升、15升、20升、25 升、50升、75升、100升、150升、200升、500升、I立方米、2立方米、4立方米、6立方米、8立方米、10立方米、15立方米，或從其導出的任意范圍的體積。
培養(yǎng)器皿可以是細胞粘附性或非粘附性培養(yǎng)器皿，根據(jù)目的來選擇。可以使用任何用于細胞粘附的底物例如細胞外基質(zhì)(ECM)來包被細胞粘附性培養(yǎng)器皿以改善器皿表面對細胞的粘附。用于細胞粘附的底物可以是旨在附著細胞的任何材料。用于細胞粘附的底物包括膠原蛋白、明膠、聚-L-賴氨酸、聚-D-賴氨酸、層粘連蛋白和纖連蛋白，以及它們的片段或混合物。
其他培養(yǎng)條件可以被適當?shù)叵薅ā＠?，培養(yǎng)溫度可以是約30°C至40°C，例如，至少或約 31°〇、321、331、341、351、361、371、381、391，但不特別限定于這些。CO2 的濃度可以是約1%至10%，例如約2%至5%，或從其導出的任意范圍的濃度。氧分壓可以是至少、最多或約1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、20%，或從其導出的任意范圍的氧分壓。
本發(fā)明的方法也可用于諸如重編程細胞或干細胞的細胞的懸浮培養(yǎng)，包括在載體上的懸浮培養(yǎng)(Fernandes等人，2004)或凝膠/生物聚合物封裝的懸浮培養(yǎng)(美國專利公開2007/0116680)。術語細胞的懸浮培養(yǎng)意指就培養(yǎng)器皿或培養(yǎng)基中的飼養(yǎng)細胞(如果使用的話)而言，在非粘附條件下培養(yǎng)細胞。細胞的懸浮培養(yǎng)包括細胞的解離培養(yǎng)和細胞的聚集體懸浮培養(yǎng)。術語細胞的解離培養(yǎng)意指培養(yǎng)懸浮的干細胞，干細胞的解離培養(yǎng)包括單一細胞或由多個細胞(例如，約2至400個細胞)組成的小細胞聚集體的解離培養(yǎng)。當前述解離培養(yǎng)繼續(xù)進行時，培養(yǎng)的、解離的干細胞可以形成較大的細胞聚集體，此后可以進行聚集體懸浮培養(yǎng)。聚集體懸浮培養(yǎng)包括類胚體培養(yǎng)方法(參見Keller等人，1995)和SFEB 方法(Watanabe 等人，2005 ;國際公開 No. 2005/123902)。
C.基質(zhì)組分
各種限定的基質(zhì)組分可以用于重編程外周血細胞以用作用于粘附細胞培養(yǎng)的底物。例如，重組膠原蛋白IV、纖連蛋白，層粘連蛋白和玻連蛋白的組合可以用于包被培養(yǎng)表面，作為提供供多潛能細胞生長用的固體支持物，如Ludwig等人(2006a ；2006b)中描述的， 該文獻通過引用完整地并入。
可以將基質(zhì)組合物固定在表面上以提供細胞支持物?；|(zhì)組合物可以包括一種或多種細胞外基質(zhì)(ECM)蛋白·和水性溶劑。術語“細胞外基質(zhì)”是本領域中認可的。它的組分包括下列蛋白中的一種或多種纖連蛋白、層粘連蛋白、玻連蛋白、肌腱蛋白、內(nèi)功素、血小板反應蛋白、彈性蛋白、明膠、膠原蛋白、原纖蛋白、分區(qū)蛋白、錨定蛋白、軟骨粘連蛋白、連接蛋白、骨涎蛋白、骨I丐蛋白、骨橋蛋白、外連蛋白(epinectin)、透明質(zhì)粘連蛋白 (hyaluronectin)、粗纖維調(diào)節(jié)素(undulin)、表皮整聯(lián)配體蛋白(epiligrin),以及韁蛋白。其他細胞外基質(zhì)蛋白描述于Kleinman等人，(1993)中，該文獻通過引用并入本文。意圖術語“細胞外基質(zhì)”包括可能在將來被發(fā)現(xiàn)的目前未知的細胞外基質(zhì)，因為它的作為細胞外基質(zhì)的表征可容易地被本領域技術人員確定。
在一些方面，基質(zhì)組合物中的總蛋白濃度可以為約Ing/mL至約lmg/mL。在一些優(yōu)選的實施方案中，基質(zhì)組合物中的總蛋白濃度為約I μ g/mL至約300 μ g/mL。在更優(yōu)選的實施方案中，基質(zhì)組合物中的總蛋白濃度為約5 μ g/mL至約200 μ g/mL。
細胞外基質(zhì)(ECM)蛋白可以是天然來源的，并且可以從人或動物組織中純化出來。或者，ECM蛋白可以是基因工程化重組蛋白或者在性質(zhì)上是合成的。ECM蛋白可以是全蛋白或者原態(tài)或工程化的肽片段形式?？捎糜诩毎囵B(yǎng)基質(zhì)中的ECM蛋白的實例包括層粘連蛋白、I型膠原蛋白、IV型膠原蛋白、纖連蛋白和玻連蛋白。在一些實施方案中，基質(zhì)組合物包括合成產(chǎn)生的纖連蛋白或重組纖連蛋白的肽片段。
在又一些進一步實施方案中，基質(zhì)組合物包括至少纖連蛋白和玻連蛋白的混合物。
在一些其他實施方案中，基質(zhì)組合物優(yōu)選包括層粘連蛋白。
基質(zhì)組合物優(yōu)選包括單一類型的細胞外基質(zhì)蛋白。在一些優(yōu)選的實施方案中， 基質(zhì)組合物包括纖連蛋白，特別是用于與培養(yǎng)重編程細胞或造血祖細胞一起使用的纖連蛋白。例如，合適的基質(zhì)組合物可以通過將人纖連蛋白如由Becton, Dickinson&Co. of Franklin Lakes, N.J. (BD)銷售的人纖連蛋白(Cat#354008)在杜氏磷酸鹽緩沖鹽水 (Dulbecco1 s phosphate buffered saline) (DPBS)中稀釋至蛋白濃度為 5 μ g/mL 至約 200 μ g/mL來制備。在特定實施例中，基質(zhì)組合物包括纖連蛋白片段，如RetroNectin 。 RetroNectin 是 63kDa蛋白質(zhì)(574個氨基酸)，其含有中央細胞結合結構域(III型重復，8、9、10)、高親和性的肝素結合結構域11(111型重復，12、13、14)，以及在人纖連蛋白的選擇性剪接IIICS區(qū)內(nèi)的CSl位點。
在一些其他實施方案中，基質(zhì)組合物優(yōu)選包括層粘連蛋白。例如，合適的基質(zhì)組合物可以通過將層粘連蛋白(Sigma-Aldrich (St. Louis,Mo.) ;Cat#L6274和L2020)在杜氏憐酸鹽緩沖鹽水(DPBS)中稀釋至蛋白質(zhì)濃度為5 μ g/ml至約200 μ g/ml來制備。
在一些實施方案中，基質(zhì)組合物不含異種物質(zhì)，因為基質(zhì)或它的組分蛋白僅來源于人。這可能是某些研究應用所需要的。例如在用于培養(yǎng)人細胞的不含異種物質(zhì)的基質(zhì)中，可以使用人來源的基質(zhì)組分，其中任何非人動物組分可被排除。在某些方面，可以不將 Matrigel 作為用于重編程為人iPS細胞的底物。Matrigel 是由小鼠腫瘤細胞分泌的膠質(zhì)蛋白混合物，并且可商購自BD Biosciences (New Jersey,USA)。這種混合物與在許多組織中被發(fā)現(xiàn)的復雜的細胞外環(huán)境相似，并且經(jīng)常被細胞生物學家用作細胞培養(yǎng)底物，但是它可能會引起不希望的異種抗原或污染物。
D.用于重編程的信號傳導抑制劑
在本發(fā)明的某些方面，在至少一部分重編程過程中，可以在存在或不存在一種或多種信號傳導抑制劑的情況下維持細胞，所述信號傳導抑制劑抑制信號傳導級聯(lián)中所涉及的信號轉(zhuǎn)導子，例如，在MEK抑制劑、GSK3抑制劑、TGF- β受體抑制劑，和/或肌球蛋白II ATP酶抑制劑，或這些相同通路內(nèi)的其他信號轉(zhuǎn)導子的抑制劑的存在下維持細胞。在某些方面，ROCK抑制劑如ΗΑ-100或Hl 152可用于促進重編程細胞和所得到的iPS細胞的克隆擴展。高濃度的FGF與特定重編程培養(yǎng)基如條件化的人ES細胞培養(yǎng)基或不含血清的N2B27 培養(yǎng)基的組合也可用于增大重編程效率。在優(yōu)選的方面，該培養(yǎng)基是限定培養(yǎng)基或不含異種物質(zhì)的培養(yǎng)基。在某些實施方案中，除了通過外源性游離遺傳元件向細胞中導入重編程因子(例如2種、3種或更多種，如本文所描述)之外，用包含MEK抑制劑、TGF-β受體抑制劑、GSK3 抑制劑、肌球蛋白IIATP酶抑制劑，和/或LIF的重編程培養(yǎng)基處理細胞，其優(yōu)點在于，例如，改善重編程效率和動力學，并促進原代重編程培養(yǎng)物中iPS細胞的鑒定，從而保存iPS 細胞的克隆形成能力(clonality)。
應理解，在這些方面和實施方案中，可以視需要用抑制相同信號傳導通路(例如 ERKl或ERK2級聯(lián))的信號傳導組分的其他信號傳導抑制劑替換MEK抑制劑。這可以包括抑制MAPK通路的上游刺激物，特別是通過FGF受體抑制MAPK通路的上游刺激物(Ying， 2008)。同樣，可以視需要將GSK3抑制劑替換為GSK3相關的信號傳導通路如胰島素合成和 Wnt/ β -連環(huán)蛋白信號傳導的其他抑制劑；可以視需要將LIF替換為Stat3或gpl30信號傳導的其他激活子。
此種信號傳導抑制劑，例如MEK抑制劑、GSK3抑制劑、TGF-β受體抑制劑可以以至少或約 O. 02 μ Μ、0· 05 μ Μ、0· I μ Μ、0· 2 μ Μ、0· 5 μ Μ、I μ Μ、2 μ Μ、3 μ Μ、4 μ Μ、5 μ Μ、10 μ Μ、 15 μ Μ、20 μ Μ、25 μ Μ、30 μ Μ、35 μ Μ、40 μ Μ、45 μ Μ、50 μ Μ、100 μ Μ、150 μ Μ、200 μ Μ、500 μ M 至約1000 μ M的有效濃度或從其導出的任意范圍的有效濃度使用。
本領域技術人員可以通過常規(guī)方式或從常規(guī)來源提供或獲得抑制劑(另參見 W02007113505)。
1.糖原合酶激酶3抑制劑
糖原合酶激酶3 (GSK-3)是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，其介導磷酸分子被添加至特定細胞底物中的某些絲氨酸和蘇氨酸氨基酸上。GSK-3對這些其他蛋白的磷酸化通常會抑制靶蛋白(也稱為“底物”)。如所提及的，已知GSK-3磷酸化糖原合酶并因此使其滅活。它還參與控制針對受損DNA的細胞反應和Wnt信號傳導。GSK-3還在Hedgehog (Hh)通路中使 Ci磷酸化，使它靶向于蛋白水解為無活性形式。除了糖原合酶之外，GSK-3還具有許多其他底物。然而，GSK-3在激酶中與眾不同之處在于，它通常需要“引發(fā)激酶(priming kinase)” 以首先使底物磷酸化。
GSK-3磷酸化的后果通常是抑制底物。例如，當GSK-3使它的另一底物，轉(zhuǎn)錄因子的NFAT家族，磷酸化時，這些轉(zhuǎn)錄因子不能轉(zhuǎn)位至細胞核，并因此被抑制。除了它在Wnt信號傳導通路中的重要作用(這對于在發(fā)育過程中建立組織式樣是必需的)以外，GSK-3對于在諸如骨骼肌肥大的環(huán)境中被誘導的蛋白合成也是關鍵性的。它作為NFAT激酶的作用也使它成為分化和細胞增殖兩者的關鍵調(diào)節(jié)器。
GSK3抑制可以指對一種或多種GSK3酶的抑制。GSK3酶家族是熟知的，并且許多變體已被描述(參見，例如，Schaffer等人，2003)。在具體實施方案中，GSK3-0被抑制。GSK3-a抑制劑也是適宜的，并且在某些方面，用于本發(fā)明的抑制劑抑制GSK3-a和 GSK3- β 二者。
GSK3的抑制劑可以包括結合GSK3的抗體、GSK3的顯性陰性變體，以及靶向GSK3 的siRNA和反義核酸。GSK3抑制劑的實例描述于Bennett等人(2002)和Ring等人(2003)。
GSK3抑制劑的具體實例包括但不限于Kenpaullone、1-Azakenpaullone、 CHIR99021、CHIR98014、AR-A014418 (參見例如，Gould 等人，2004)、CT 99021(參見例如， Wagman, 2004)、CT20026 (參見，Wagman,見上文)、SB415286、SB216763 (參見例如，Martin 等人，2005) ,AR-AO14418 (參見例如，Noble等人，2005)、鋰(參見例如，Gould等人，2003)、 SB 415286(參見例如，F(xiàn)rame等人，2001)和TDZD-8 (參見例如，Chin等人，2005)。可從 Calbiochem獲得的進一步示例性GSK3抑制劑(參見例如，Dalton等人，W02008/094 597，通過引用并入本文)，包括但不限于BI0(2' Z,3' ￡)-6-bromomdirubm-3'-月虧(GSK3抑制劑IX)、BIO-丙酮肟(2' Z，3' E) -6-溴代靛玉紅_3'-丙酮肟(GSK3抑制劑X)、(5-甲基-1H-吡唑-3-基)-(2-苯基喹唑啉-4-基)胺(GSK3-抑制劑XIII)、吡啶卡巴唑-環(huán)戊二烯基釕復合物(GSK3抑制劑XV)、TDZD-84-芐基-2-甲基-1，2，4-噻二唑烷_3，5- 二酮(GSK30抑制劑1)、2_硫代(3-碘芐基)-5-(1-吡啶基)-[1，3，4]_噁二唑(GSK3 β抑制劑II)、OTDZT 2，4-二芐基-5-氧代噻二唑烷-3-硫酮(GSK3 β抑制劑III)、α-4-二溴乙酰苯(GSK3 0抑制劑VII)、AR-AO 14418 Ν_(4_甲氧基芐基)-N ' _(5_硝基-1， 3-噻唑-2-基)脲(GSK-3 0抑制劑VIII)、3_(1-(3-羥基丙基)-1H-吡咯并[2，3_b]吡啶-3-基]-4-吡嗪-2-基-吡咯-2，5- 二酮(GSK-3 β抑制劑XI)、TffSl 19吡咯并嘧啶化合物(GSK3 0抑制劑XII)、L803H-KEAPPAPPQSpP-NH2或其肉豆蘧?；问?GSK3 β抑制劑 XIII)、2-氯-1-(4,5- 二溴-噻吩-2-基)-乙酮(GSK3 β 抑制劑 VI)、AR_A0144_18、 SB216763，和 SB415286。
GSK3抑制劑可以激活例如Wnt/β -連環(huán)蛋白通路。許多β -連環(huán)蛋白下游基因共調(diào)節(jié)多潛能性基因網(wǎng)絡。例如，GSK抑制劑激活cMyc表達并增強它的蛋白穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)錄活性。因此，在一些實施方案中，GSK3抑制劑可用于刺激細胞中的內(nèi)源性Myc多肽的表達，由此消除誘導多潛能性對于Myc表達的需求。
另外，已經(jīng)表征了 GSK3_i3的活性位點的結構，并鑒定了與特異性和非特異性抑制劑相互作用的關鍵殘基(Bertrand等人，2003)。這種結構表征使得另外的GSK抑制劑能夠容易鑒定。
本文使用的抑制劑優(yōu)選對所要靶向的激酶有特異性。某些實施方案的抑制劑對 GSK3- β和GSK3-a有特異性，基本上不抑制erk2，并且基本上不抑制cdc2。優(yōu)選地，相對于小鼠erk2和/或人cdc2，所述抑制劑對于人GSK3具有至少100倍、更優(yōu)選至少200倍、 非常優(yōu)選至少400倍的選擇性，如通過IC5tl值的比率測得的；此處，所提及的GSK3 IC50值是指對于人GSK3- β和GSK3- a的平均值。已經(jīng)使用對GSK3有特異性的CHIR99021獲得了良好的結果。使用CHIR99021的適宜的濃度范圍是O. 01微摩爾至100微摩爾，優(yōu)選O.1 微摩爾至20微摩爾，更優(yōu)選O. 3微摩爾至10微摩爾。
2. MEK 抑制劑
MEK抑制劑，包括有絲分裂原激活的蛋白激酶激酶(MAPK/ERK激酶或MEK)或其相關信號傳導通路如MAPK級聯(lián)的抑制劑，可用于本發(fā)明的某些方面。有絲分裂原激活的蛋白激酶激酶(sic)是使有絲分裂原激活的蛋白激酶磷酸化的激酶。它也被稱為MAP2K。細胞外刺激物導致MAP激酶通過信號傳導級聯(lián)(“MAPK級聯(lián)”)被激活，所述級聯(lián)由以下組成 MAP激酶、MAP激酶激酶(MEK、MKK、MEKK或MAP2K)和MAP激酶激酶激酶(MKKK或MAP3K)。
本文中的MEK抑制劑一般是指MEK抑制劑。因此，MEK抑制劑是指蛋白激酶的MEK 家族的成員的任何 抑制劑，所述MEK家族的成員包括MEK1、MEK2和MEK5。還提及了 MEK1、 MEK2和MEK5抑制劑。適宜的MEK抑制劑的本領域已知的實例包括MEK1抑制劑TO184352 和PD98059、MEKl和MEK2的抑制劑UO126和SL327,以及如Davies等人(2000)中所討論的那些。
特別地，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)TO184352和PD0325901與其他已知的MEK抑制劑相比具有高度的特異性和效價(Bain等人，2007)。其他MEK抑制劑和MEK抑制劑的類別描述于Zhang等人(2000)。
MEK的抑制劑可以包括MEK的抗體、MEK的顯性陰性變體，以及抑制MEK表達的 siRNA和反義核酸。MEK抑制劑的具體實例包括但不限于Η)0325901(參見，例如，Rinehart 等人，2004)、PD98059(可以獲自例如 Cell Signaling Technology)、U0126(可以獲自例如 Cell Signaling Technology)、SL327 (可獲自例如 Sigma-Aldrich)、ARRY-162 (可獲自例如 Array Biopharma)、PD184161 (參見，例如，Klein 等人，2006)、PD184352 (C1-1040) (參見，例如，Mattingly等人，2006)、舒尼替尼(sunitinib)(參見，例如，Voss,等人， US2008004287，通過引用并入本文)、索拉非尼(sorafenib)(參見，Voss，見上文)、凡德他尼(Vandetanib)(參見,Voss見上文)、帕唑帕尼(pazopanib)(參見,例如,Voss見上文)、 阿西替尼(Axitinib)(參見，Voss見上文)和PTK787 (參見，Voss見上文)。
目前，有幾種MEK抑制劑正處于臨床試驗評價中。C1-1040已在針對癌癥的I期和II期臨床試驗中進行評價(參見,例如Rinehart等人,2004)。處于臨床試驗評價中的其他MEK抑制劑包括Η)184352(參見，例如，English等人，2002)、BAY 43-9006(參見，例如，Chow 等人，2001)、PD-32590K 也稱為 PD0325901)、GSK1120212、ARRY-438162、RDEAl 19、AZD6244 (也稱為 ARRY-142886 或 ARRY-886)、R05126766、XL518 和 AZD8330 (也稱為ARRY-704)。
可以使用RNA介導的干擾(RNAi)方便地實現(xiàn)MEK的抑制。通常，將互補于全部或部分MEK基因的雙鏈RNA分子導入多潛能細胞中，由此促進編碼MEK的mRNA分子的特異性降解。這種轉(zhuǎn)錄后機制導致所靶向的MEK基因的表達減少或消除。使用RNAi實現(xiàn)MEK抑制的適宜技術和方案是已知的。
用于鑒定激酶抑制劑(包括GSK3抑制劑和MEK抑制劑)的許多測定法是已知的。 例如，Davies等人(2000)描述了這樣的激酶測定法其中在存在肽底物和放射性標記的 ATP的情況下溫育激酶。激酶引起的底物磷酸化導致標記被摻入底物中。將等分的每種反應液固定于磷酸纖維素紙上并在磷酸中洗滌以除掉游離ATP。然后測量溫育之后的底物活性并提供激酶活性的指示。使用此類測定法可以容易地確定在存在和不存在候選激酶抑制劑的情況下的相對激酶活性。Downey等人(1996)還描述了可用于鑒定激酶抑制劑的激酶活性測定法。
3. TGF- β受體抑制劑
TGF-β受體抑制劑可以包括一般性的TGF信號傳導的任何抑制劑或?qū)GF-β 受體(例如ALK5)有特異性的抑制劑，其可以包括針對TGF-β受體(例如ALK5)的抗體、TGF-β受體(例如ALK5)的顯性陰性變體，和抑制TGF-β受體(例如ALK5)的表達的siRNA和反義核酸。示例性TGF β受體/ALK5抑制劑包括但不限于SB431542 (參見，例如，Inman等人，2002)、也被稱為3-(6-甲基-2-吡啶基)_N_苯基-4-(4-喹啉基)_1Η_吡唑-1-硫代甲酰胺的A-83-01 (參見,例如,Tojo等人,2005,可從例如Toicris Bioscience 購得)、2- (3- (6-甲基吡啶-2-基)-1H-吡唑-4-基)-1，5-萘啶、Wnt3a/BI0 (參見，例如，Dalton，等人，W02008/094597，通過引用并入本文)、BMP4 (參見，Dalton，見上文)、 GW788388(-(4-[3-(吡啶-2-基)_1H_ 吡唑 4-基]吡啶-2-基}_N_ (四氫-2H-吡喃-4-基)苯甲酰胺)(參見，例如，Gellibert等人，2006)、SM16(參見，例如，Suzuki等人，2007)、IN-1130 (3- ((5- (6-甲基吡啶 _2_ 基)_4_ (喹噁啉-6-基)-1H-咪唑 _2_ 基)甲基)苯甲酰胺)(參見，例如，Kim等人，2008)、GW6604 (2-苯基-4- (3-吡啶-2-基-1H-吡唑-4-基)吡啶)(參見，例如，de Gouville 等人，2006)、SB-505124(2-(5-苯并[1,3] 二噁唑-5-基-2-叔丁基-3H-咪唑-4-基)-6-甲基吡啶鹽酸鹽)(參見，例如，DaCosta等人，2004)和嘧啶衍生物(參見，例如，在Stiefl等人，W02008/006583中列出的那些，其通過引用并入本文)。
進一步地，雖然“ALK5抑制劑”不意圖包括非特異性激酶抑制劑，但是“ALK5抑制劑”應被理解為包括除了抑制ALK5之外，還抑制ALK4和/或ALK7的抑制劑，例如 SB-431542 (參見，例如Inman等人，2002)。不希望限制本發(fā)明的范圍，據(jù)信ALK5抑制劑會影響間充質(zhì)至上皮的轉(zhuǎn)化/轉(zhuǎn)換(MET)過程。TGFii/活化素通路是上皮至間充質(zhì)轉(zhuǎn)換(EMT) 的驅(qū)動器。本發(fā)明人考慮到抑制TGFii/活化素通路可以促進MET(即重編程)過程。
據(jù)信抑制TGF3 /活化素通路將具有相似的效應。因此，TGF3 /活化素通路(例如，上游或下游)的任何抑制劑可與如本文描述的TGF- β /ALK5抑制劑聯(lián)合使用或替代所述TGF- β /ALK5抑制劑。示例性TGF β /活化素通路抑制劑包括但不限于TGF β受體抑制劑、SMAD 2/3磷酸化抑制劑、SMAD 2/3和SMAD 4相互作用的抑制劑，以及SMAD6和SMAD7 的激活劑/激動劑。此外，本文描述的類別僅是為了組編目的，本領域技術人員將知曉化合物可以影響通路內(nèi)的一個或多個點，因此，化合物可能按照不止一個所定義的類別來發(fā)揮作用。
TGF^受體抑制劑可以包括針對TGFP受體的抗體、TGF0受體的顯性陰性變體，以及祀向TGFP受體的siRNA或反義核酸。抑制劑的具體實例包括但不限于 SU5416、2-(5-苯并[1，3] 二噁唑_5_基-2-叔丁基-3H-咪唑-4-基)-6-甲基吡啶鹽酸鹽(SB-505124)、樂德木單抗(Ierdelimumb) (CAT-152)、美替木單抗(meteIimumab) (CAT-192)、GC-1008、IDl1、AP-12009、AP-11014、LY550410、LY580276、LY364947、 LY2109761、SB-505124、SB-431542、SD-208、SM16、NPC-30345、Ki26894、SB-203580、SD-093、 Gleevec、3，5，7，2’，4’-五羥基黃酮(Morin)、活化素 _M108A、P144、可溶性的 TBR2_Fc，以及革巴向TGFP受體的反義轉(zhuǎn)染的腫瘤細胞(參見,例如Wrzesinski等人,2007 ;Kaminska等人，2005 ;和 Chang 等人，2007)。
4. ROCK 抑制劑
多潛能干細胞，尤其是人ES細胞和iPS細胞，在細胞脫附和解離之后易于發(fā)生凋亡，這對于克隆分離或擴展和分化誘導具有重要意義。最近已發(fā)現(xiàn)一小類分子可增加解離的多潛能干細胞的克隆效率和存活，例如Rho相關激酶(ROCK)抑制劑，其為ROCK相關的信號傳導通路的抑制劑，例如Rho特異性抑制劑、ROCK特異性抑制劑，或肌球蛋白II特異性抑制劑。在本發(fā)明的某些方面，ROCK抑制劑可用于多潛能干細胞的培養(yǎng)和傳代和/或干細胞的分化。因此，ROCK抑制劑可存在于多潛能干細胞在其中生長、解離、形成聚集體或經(jīng)歷分化的任何細胞培養(yǎng)基中，例如粘附培養(yǎng)物或懸浮培養(yǎng)物。
ROCK信號傳導通路可以包括Rho家族GTP酶；R0CK，Rho下游的主要效應子激酶； 肌球蛋白II，ROCK下游的主導效應子(Harb等人，2008);以及任何中間體、上游或下游信號處理器。ROCK可以使肌球蛋白磷酸酶靶亞基I(MYPTl)磷酸化和失活，肌球蛋白磷酸酶靶亞基I (MYPTl)是通過肌球蛋白調(diào)節(jié)輕鏈(MRLC)的去磷酸化來陰性地調(diào)節(jié)肌球蛋白功能的 ROCK的主要下游靶標之一。
ROCK是絲氨酸/蘇氨酸激酶，其充當Rho (其具有三種同種型_RhoA、RhoB和RhoC) 的靶蛋白。這些激酶最初被當作RhoA誘導的應激纖維和局灶性粘連的形成的介導子。兩種ROCK同種型-ROCKl (pl60R0CK，也稱為ROK β )和R0CK2 (R0K α )-由N-末端激酶結構域及接在其后的卷曲螺旋結構域(含有Rho結合結構域和pleckstrin (血小板-白細胞C激酶底物)同源性結構域(PH))組成。這兩種ROCK都是介導RhoA對應激纖維形成、平滑肌收縮、細胞粘附、膜起皺和細胞運動的效應的細胞骨架調(diào)節(jié)器。ROCK可以通過靶向下游分子， 如肌球蛋白I1、肌球蛋白輕鏈(MLC)、MLC磷酸酶(MLCP)及磷酸酶和緊張素同源物(PTEN) 而發(fā)揮它們的生物學活性。
ROCK抑制劑的非限制性實例包括HA-100, Y-27632、H-1152、Fasudil(也稱為 HA1077)、Y-30141 (描述于美國專利 5，478，838)、Wf-536、HA-1077,羥基-HA-1077、 GSK269962A、SB-772077-B、它們的衍生物，以及針對ROCK的反義核酸、RNA干擾誘導核酸 (例如，siRNA)、競爭性肽、拮抗劑肽、抑制性抗體、抗體-ScFV片段、它們的顯性陰性變體和表達載體。進一步地，由于已知其他小分子化合物為ROCK抑制劑，因此此類化合物或其衍生物也可用于實施方案中(例如，參考美國專利公開No. 20050209261、20050192304、 20040014755,20040002508,20040002507,20030125344 和 20030087919，以及國際專利公開 No. 2003/062227、2003/059913、2003/062225、2002/076976 和 2004/039796，其通過引用并入本文)。在本發(fā)明的某些方面，也可以使用該ROCK抑制劑中的一種或兩種或更多種的組合。
在本發(fā)明的某些方面，Rho特異性抑制劑，例如肉毒梭菌(clostridium botulinum) C3胞外酶,和/或肌球蛋白(Myosin) II特異性抑制劑也可用作ROCK抑制劑。
E.低氧條件
可以在重編程之前的整個擴展階段中使用低氧，以利于類似于祖細胞的狀態(tài)的維持并有可能利于至少一部分重編程階段。首先，當細胞擴展時，它們往往從較類似于祖細胞的狀態(tài)逐漸偏離而變得更加分化(即，CD34表達水平隨著時間的推移而降低)。低氧條件模擬造血祖細胞(HP)特有的微環(huán)境并且似乎減慢祖細胞的分化(Eliasson和Jonsson， 2010)。本文中使用的低氧可以為約2%的水平或者可以在約1-7%的范圍內(nèi)。在進一步方面，也可以在重編程階段中使用低O2以促進iPS形成(Yoshida等人，2009)。
V.游離遺傳兀件(Episomal genetic element)
在本發(fā)明的某些方面，從包含在一種或多種外源性游離遺傳元件中的表達盒表達重編程因子(參見美國專利公開No. 2010/0003757和美國專利申請No. 61/258，120，其通過引用并入本文)。
已經(jīng)使用用于異位表達重編程基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒或慢病毒載體實現(xiàn)從人體細胞對多潛能干細胞的誘導。重組逆轉(zhuǎn)錄病毒如莫洛尼鼠白血病病毒具有以穩(wěn)定方式整合到宿主基因組中的能力。它們含有逆轉(zhuǎn)錄酶，該酶允許整合到宿主基因組中。慢病毒是逆轉(zhuǎn)錄病毒的亞 類。由于它們具有整合到非分裂細胞和分裂細胞的基因組中的能力，因此它們廣泛地適合用作載體。當病毒進入細胞時，RNA形式的病毒基因組被逆轉(zhuǎn)錄以產(chǎn)生DNA，然后 DNA通過病毒整合酶被插入基因組的隨機位置。因此，目前的成功重編程技術依賴于基于整合的病毒途徑。
然而，使用目前的技術，靶向整合仍然不是常規(guī)的(Bode等人，2000)，常規(guī)替代方式，即隨機整合，可能會在誘導性多潛能干細胞中導致插入誘變，其具有不可預測的后果。 由于相同的原因，轉(zhuǎn)基因的表達不能被控制，因為它依賴于整合位點的染色質(zhì)環(huán)境(Baer 等人，2000)。只能在有利的基因座實現(xiàn)聞水平表達，但是存在以下危險整合到聞表達位點中會干擾誘導性多潛能干細胞的極其重要的細胞功能。
此外，越來越多的證據(jù)表明存在針對外源DNA的細胞防御機制，該機制通過在伴隨著DNA甲基化的過程中下調(diào)轉(zhuǎn)基因而發(fā)揮作用(Bingham, 1997, Garrick等人，1998)。此外，病毒組分可能與其他因子一起作用以轉(zhuǎn)化細胞。伴隨著從許多病毒基因的持續(xù)表達，至少部分病毒基因組在細胞中的持續(xù)存在可能會引起細胞轉(zhuǎn)化。這些基因可能會干擾細胞的信號傳導通路，導致所觀察到的細胞的表型變化，產(chǎn)生轉(zhuǎn)化的細胞，該轉(zhuǎn)化的細胞顯示出增加的細胞分裂，這對于病毒是有利的。
因此，在某些實施方案中，本發(fā)明開發(fā)了用于產(chǎn)生誘導性多潛能干細胞的新方法， 所述誘導性多潛能干細胞實質(zhì)上不含外源性遺傳元件，如來自先前方法中所使用的逆轉(zhuǎn)錄病毒或慢病毒載體元件的外源性遺傳元件。本發(fā)明中的這些方法利用染色體外復制載體， 或能夠游離復制的載體(參見美國專利申請No. 12/478，154，通過引用并入本文)，聯(lián)合在存在細胞信號傳導抑制劑的情況下培養(yǎng)重編程細胞，從而實現(xiàn)最佳的重編程效率和動力學。
許多DNA病毒，如腺病毒、猴空泡病毒40 (SV40)、牛乳頭瘤病毒(BPV)，或含有出芽酵母ARS(自主復制序列)的質(zhì)粒在哺乳動物細胞中在染色體外復制。這些游離質(zhì)粒內(nèi)在地不具有與整合載體相關的所有這些缺點(Bode等人，2001)。包括EB病毒(EBV)的基于嗜淋巴細胞性皰疹病毒的系統(tǒng)也可在染色體外復制并輔助遞送重編程基因至體細胞。
例如，本發(fā)明中使用的基于游離型載體的途徑提取用于成功復制和維持基于EBV 元件的系統(tǒng)而不破壞系統(tǒng)在臨床環(huán)境中的易處理性能所必需的穩(wěn)健元件，如下文所詳述。 有用的EBV元件是OriP和EBNA-1，或它們的變體或功能等同物。這個系統(tǒng)的另外的優(yōu)點是這些外源元件在被導入細胞之后將隨著時間喪失，從而產(chǎn)生實質(zhì)上不含這些元件的自我持續(xù)的iPS細胞。
A.游離型載體
這些重編程方法可以利用染色體外復制載體(即游離型載體)，該載體是能夠游離地復制以使iPS細胞實質(zhì)上不含外源載體或病毒元件的載體(參見，美國專利申請 No. 61/058，858，通過引用并入本文；Yu等人，2009)。許多DNA病毒，如腺病毒、猿猴空泡病毒40(SV40)或牛乳頭瘤病毒(BPV)，或含有出芽酵母ARS (自主復制序列)的質(zhì)粒在哺乳動物細胞中在染色體外或游離地復制。這些游離質(zhì)粒內(nèi)在地不具有與整合載體相關的所有那些缺點(Bode等人，2001)。例如，包括如上文定義的EB病毒(EBV)的基于嗜淋巴細胞性皰疹病毒的系統(tǒng)，或如上文定義的EB病毒(EBV)可以在染色體外復制并輔助遞送重編程基因至體細胞。
例如，本發(fā)明中使用的基于質(zhì)粒的方法可以提取用于成功復制和維持基于EBV元件的系統(tǒng)而不破壞系統(tǒng)在臨床環(huán)境中的易處理性能所必需的穩(wěn)健元件，如下文詳細描述。 必需的EBV元件是OriP和EBNA-1或它們的變體或功能等同物。這個系統(tǒng)的另一個優(yōu)點是， 這些外 源元件在被導入細胞之后將隨著時間喪失，從而產(chǎn)生實質(zhì)上不含外源元件的自我持續(xù)的iPS細胞。
基于質(zhì)?；蚧谥|(zhì)體的染色體外載體，例如基于oriP的載體，和/或編碼 EBNA-1的衍生物的載體的使用，允許大的DNA片段被導入細胞并維持在染色體外，每個細胞周期復制一次，有效地在子代細胞中分配，并且基本上不引發(fā)免疫反應。特別地，EBNA-1， 基于oriP的表達載體的復制所需的唯一病毒蛋白，不引發(fā)細胞免疫反應，因為它已形成用于繞過在I類MHC分子上呈遞其抗原所需的加工的有效機制(Levitskaya等人，1997)。進一步地，在一些細胞系中，EBNA-1可以反式作用以增強所克隆的基因的表達，誘導所克隆的基因的表達多達100倍(Langle-Rouault等人，1998 ;Evans等人，1997)。最后，此類基于 oriP的表達載體的制備是價廉的。
其他染色體外載體包括其他基于嗜淋巴細胞性皰疹病毒的載體。嗜淋巴細胞性皰疹病毒是在淋巴母細胞(例如，人B淋巴母細胞)中復制并在其一部分自然生命周期內(nèi)變?yōu)橘|(zhì)粒的皰疹病毒。單純皰疹病毒(HSV)不是“嗜淋巴細胞性”皰疹病毒。示例性嗜淋巴細胞性皰疹病毒包括但不限于EBV、卡波希氏肉瘤皰疹病毒(KSHV)、松鼠猴皰疹病毒(HS) 和馬立克氏病病毒(MDV)。還考慮到基于游離體的載體的其他來源，例如酵母ARS、腺病毒、 SV40 或 BPV。
B. EB 病毒
EB病毒(EBV)，也被稱為人皰疹病毒4 (HHV-4)，是皰疹家族(包括單純皰疹病毒和巨細胞病毒)的病毒，是人類中最常見的病毒之一。EBV維持其基因組在染色體外并與宿主細胞機構合作進行有效復制和維持(Lindner和Sugden，2007)，從而僅依賴于針對其復制和其在細胞分裂過程中在細胞內(nèi)的保留的兩個本質(zhì)特征(Yates等人1985 ;Yates等人 1984)。一種通常被稱為oriP的元件，以順式存在并充當復制起始點。另一種因子EBNA-1 通過結合至oriP內(nèi)的序列而以反式發(fā)揮作用，從而促進質(zhì)粒DNA的復制和維持。作為非限制性實例，本發(fā)明的某些方面提取這兩個特征并在載體的環(huán)境下使用它們以運送重編程體細胞所需要的基因，從而相對于常規(guī)質(zhì)粒促進這些基因的復制和持續(xù)表達。
C.復制起始點
在某些方面，可以使用EBV的復制起始點OriP。OriP是在DNA復制啟動處或其附近的位點，通常由間隔約I千堿基對的兩個順式作用序列組成，所述的兩個順式作用序列被稱為重復家族(FR)和二重對稱(DS)。
FR由21個不完美拷貝的30bp重復序列組成，并含有20個高親和性的EBNA-1 結合位點。當FR與EBNA-1結合時，它既充當相距多達IOkb的順式啟動子的轉(zhuǎn)錄增強子 (Reisman 和 Sugden, 1986 ；Yates,1988 ；Sugden 和 Warren, 1989 ；ffysokenski 和 Yates, 1989 ；Gahn 和 Sugden, 1995 ；Kennedy 和 Sugden, 2003 ；Altmann 等人， 2006)，并促成細胞核保持和含有FR的質(zhì)粒的可靠維持(Langle-Rouault等人，1998 ；Kirchmaier和Sugden, 1995 ;Wang等人，2006 ;Nanbo和Sugden，2007)。oriP質(zhì)粒的有效分配也可能歸因于FR。 雖然病毒已經(jīng)進化為維持FR中的20個EBNA-1結合位點，但是有效的質(zhì)粒維持僅需要這些位點中的7個，并且可以被總共具有12個EBNA-1結合位點的3個拷貝的DS的聚合物重構 (Wysokenski 和 Yates, 1989)。
二重對稱元件(DS)對于在存在EBNA-1的情況下啟動DNA合成是足夠的(Aiyar 等人，1998 ；Yates等人,2000)，啟動發(fā)生于DS處或其附近(Gahn和Schildkraut, 1989 ； Niller等人，1995)。據(jù)認為，病毒DNA合成的終止發(fā)生于FR處，因為當FR被EBNA-1結合時，它起到復制叉屏障的作用，如通過2D凝膠電泳所觀察到的(Gahn和Schildkraut, 1989 ； Ermakova等人，1996 ；ffang等人,2006)。DS對DNA合成的啟動經(jīng)許可為每個細胞周期一次(Adams, 1987 ；Yates和Guan, 1991),并且被細胞復制系統(tǒng)的組分調(diào)控(Chaudhuri等人， 2001 ；Ritzi 等人，2003 ；Dhar 等人，2001 ；Schepers 等人，2001 ；Zhou 等人，2005 ； Julien 等人，2004)。DS含有4個EBNA-1結合位點，雖然其親和性比在FR中被發(fā)現(xiàn)的EBNA-1結合位點的親和性低(Reisman等人，1985)。DS的拓撲學使得4個結合位點被布置成2對位點，每對之間有21bp的中心至中心的間隔，2個非配對內(nèi)部結合位點之間有33bp的中心至中心的間隔(Baer 等人，1984 ；Rawl ins 等人，1985)。
已經(jīng)通過研究被稱為R印*的EBV基因組的另一區(qū)域確認了 DS內(nèi)的元件的功能作用，Rep *被鑒定為可無效率地替代DS的元件(Kirchmaier和Sugden, 1998)。使Rep *聚合 8次產(chǎn)生在支持復制上與DS —樣有效的元件(Wang等人，2006)。R印*的生化解剖鑒定出對于其復制功能具有關鍵意義的具有21bp的中心至中心間隔的一對EBNA-1結合位點(出處同上)。發(fā)現(xiàn)Rep *的最小復制子是這對EBNA-1結合位點，因為即使將聚合物中所有的側翼序列都替換為衍生自λ噬菌體的序列之后復制功能仍然得到保持。DS與Rep *的對比已經(jīng)揭示了共同的機理這些復制子通過經(jīng)由被EBNA-1彎曲和結合的一對適當間隔的位點募集細胞復制機構而支持DNA合成的啟動。
存在其他的染色體外的得到許可的質(zhì)粒，其在與EBV無關的哺乳動物細胞內(nèi)復制并且在某些方面似乎與EBV的Raji株系內(nèi)的啟動區(qū)域相似。Hans Lipps及其同事已經(jīng)開發(fā)并研究了含有“細胞核支架/基質(zhì)附著區(qū)域”(S/MAR)和穩(wěn)健轉(zhuǎn)錄單元的質(zhì)粒(Piechaczek 等人，1999 Jenke等人，2004)。它們的S/MAR源自人干擾素-β基因，富含Α/Τ，并且通過其與細胞核基質(zhì)的結合及其在低離子強度下或包埋在超螺旋DNA中時的優(yōu)先解開而被操作地限定(Bode等人，1992)。這些質(zhì)粒半保留地復制，結合ORC蛋白，并在整個它們的DNA 中有效地隨機地支持DNA合成的啟動(Schaarschmidt等人，2004)。它們被有效地維持于增殖的倉鼠和人細胞中，無需藥物選擇，并且當被導入豬胚胎時，能夠支持GFP在動物胎兒的多數(shù)組織中的表達(Manzini等人,2006)。
D.反式作用因子
反式作用因子的具體實例可以是EB細胞核抗原I (EBNA-1)，EB細胞核抗原I是 DNA結合蛋白，該DNA結合蛋白與oriP的FR和DS或者Rep *結合，從而在每次細胞分裂期間，獨立于細胞染色體，但與其相協(xié)調(diào)地促進基于EBV的載體的復制和基于EBV的載體至子代細胞的可靠分配。
已經(jīng)通過突變和缺失分析將EBNA-1的641種氨基酸(AA)歸類為與其不同功能相關的結構域。在AA40-89和AA329-378之間的兩個區(qū)域當被EBNA-1結合時，能夠以順式或反式連接2種DNA元件，因此被稱為連接區(qū)I和2 (LRl，LR2) (Middleton和Sugden, 1992 ； Frappier 和 O' Dormell, 1991 ；Su 等人，1991 ；Mackey 等人，1995)。將 EBNA-1 的這些結構域與GFP融合會使GFP歸巢至有絲分裂的染色體(Marechal等人，1999 ;Kanda等人，2001)。 LRl和LR2對于復制是功能上冗余的；任一個的缺失都會產(chǎn)生能夠支持DNA復制的EBNA-1 的衍生物(Mackey和Sugden，1999 ；Sears等人，2004)。LRl和LR2富含精氨酸和甘氨酸殘基，并且類似于結合富含A/T的DNA的AT鉤基序(AT-hook motif) (Aravind和L andsman, 1998)，(Sears等人，2004)。EBNA-1的LRl和LR2的體外分析已經(jīng)證明了它們與富含A/T的 DNA結合的能力(Sears等人，2004)。當含有一個此種AT鉤的LRl與EBNA-1的DNA結合和二聚化結構域融合時，發(fā)現(xiàn)它對于oriP質(zhì)粒的DNA復制是足夠的，雖然不如野生型EBNA-1 效率高(出處同上)。
但是LRl和LR2確有不同。LRl的C末端的一半由除N末端的一半的重復Arg-Gly 以外的氨基酸組成，并且被稱為獨特區(qū)域I (URl)。URl對于EBNA-1從含有FR的轉(zhuǎn)染和整合報告子DNA有效激活轉(zhuǎn)錄是必需的(Wu等人,2002 !Kennedy和Sugden,2003 ；Altmann 等人，2006)。URl對于被EBV感染的B細胞的有效轉(zhuǎn)化也是必需的。當缺少這種結構域的 EBNA-1衍生物替代完整病毒環(huán)境下的野生型蛋白時，這些衍生病毒具有0.1 %的野生型病毒的轉(zhuǎn)化能力(Altmann等人,2006)。
LR2不是EBNA-1對oirP復制的支持所需要的(Shire等人，1999 ；Mackey和 Sugden，1999 ;Sears等人，2004)。另外，EBNA-1的N末端的一半可以被含有AT鉤基序如HMGAla的細胞蛋白替代，并且仍然保持復制功能(Hung等人，2001 ;Sears等人，2003 ； Altmann等人，2006)。這些發(fā)現(xiàn)表明LR1和LR2的AT鉤活性可能是人細胞中oriP的維持所需要的。
EBNA-1殘基的第三結構域(AA91-328)由甘氨酸-甘氨酸-丙氨酸(GGA)重復序列組成，并與EBNA-1的通過抑制蛋白體降解和呈現(xiàn)而規(guī)避宿主免疫反應的能力有關 (Levitskaya等人，1995 ;Levitskaya等人，1997)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)這些重復序列在體外和體內(nèi)抑制EBNA-1的翻譯(Yin等人，2003)。然而，這個結構域的大部分的缺失對于EBNA-1在細胞培養(yǎng)中的功能無明顯影響，這使得這個結構域的功能難以被闡釋。
AA379-386編碼細胞核定位信號(NLS)，其也與細胞核輸入機構相關(Kim等人， 1997 ；Fischer等人，1997)。由于它們的高度堿性含量，LRl和LR2的富含Arg-Gly的區(qū)域內(nèi)的序列也可以作為NLS發(fā)揮作用。
最后，C末端(AA458-607)編碼EBNA-1的重疊的DNA結合和二聚化結構域。已經(jīng)通過X-射線晶體學解析與DNA結合的這些結構域的結構，發(fā)現(xiàn)該結構類似于乳頭瘤病毒的 E2蛋白的DNA結合結構域(Hegde等人，1992 ；Kim等人，2000 ；Bochkarev等人，1996)。
在本發(fā)明的具體實施方案中，重編程載體將含有oriP和編碼有能力支持質(zhì)粒復制及其在細胞分裂過程中的適當?shù)木S持的EBNA-1形式的簡短序列。野生型EBNA-1的氨基末端1/3內(nèi)的高度重復序列和被證明在多種細胞中具有毒性的25個氨基酸的區(qū)域的去除對于EBNA-1的與oriP相關的反式作用功能是可有可無的(Yates等人1985 ;Kennedy等人 2003)。因此，在一個實施方案中，被稱為AURl的簡短形式的EBNA-1可與oriP —起用于基于這個游離型載體的系統(tǒng)。
在某些方面，可用于本發(fā)明中的EBNA-1的衍生物是相對于對應的野生型多肽而言具有修飾的氨基酸序列的多肽。所述修飾包括在與EBNA-1中的LRl (約40至約89個的殘基)的獨特區(qū)域(約65至約89個的殘基)對應的區(qū)域中刪除、插入或替換至少一個氨基酸殘基，并且可以包括在與EBNA-1的其他殘基對應的區(qū)域中刪除、插入和/或替換一個或多個氨基酸殘基，所述的其他殘基為例如約I位至約40個的殘基、約90位至約328個的殘基(“Gly-Gly-Ala”重復區(qū)域)、約329至約377個的殘基(LR2)、約379至約386個的殘基(NLS)、約451至約608個的殘基(DNA結合和二聚化)，或約609至約641個的殘基， 只要得到的衍生物具有所需的性質(zhì)，例如使含有對應于oriP的ori的DNA 二聚化并與所述 DNA結合，定位于細胞核，無毒性，并從染色體外激活轉(zhuǎn)錄但幾乎不從整合的模板激活轉(zhuǎn)錄。
E.無殘余特征
重要的是，基于oriP的游離型載體的復制和維持是不完美的，并且在其被導入細胞的前2周內(nèi)從細胞迅速喪失(每次細胞分裂25%);然而，它在保留質(zhì)粒的那些細胞中喪失較慢(每次細胞分裂3% ) (Leight和Sugden，2001 ;Nanbo和Sugden，2007)。一旦對具有質(zhì)粒的細胞的選擇性被去除，質(zhì)粒將在每次細胞分裂中喪失，直至它們隨著時間全部被消除，而沒有在得到的子代細胞中留下其之前存在的痕跡。本發(fā)明的某些方面利用基于oriP 的系統(tǒng)的這種無痕跡特征作為目前用于遞送基因以產(chǎn)生iPS細胞的病毒相關性途徑的替代。其他染色體外載體也將在宿主細胞復制和繁殖過程中喪失，并且也可用于本發(fā)明。在某些方面，可以使用用于除去外源游離型載體元件或選擇實質(zhì)上不含外源遺傳元件的iPS 細胞的方法。
V1.載體構建和遞送
在某些實施方案中，重編程載體可以被構建為除了細胞中的如 上所述的編碼重編程因子的核酸序列之外，還包含另外的元件。以下公開了這些載體組分和遞送方法的細節(jié)。
A.載體
本領域技術人員將完全具備通過標準重組技術(參見，例如Maniatis等人，1988 及Ausubel等人，1994, 二者通過引用并入本文)構建載體的能力。
載體還可以包含其他組分或功能，它們進一步調(diào)節(jié)基因遞送和/或基因表達，或以其他方式為靶向的細胞提供有益特性。此類其他組分包括例如，影響與細胞的結合或影響革巴向細胞的組分(包括介導細胞類型或組織特異性結合的組分)；影響細胞對載體核酸的攝取的組分；影響攝取之后多核苷酸在細胞內(nèi)的定位的組分(例如介導細胞核定位的試劑)；以及影響多核苷酸表達的組分。
此類組分也可以包括標記，例如可檢測標記和/或選擇標記，其可用于檢測或選擇那些已被攝取并正表達被載體遞送的核酸的細胞。此類組分可以作為載體的天然特征提供(例如使用某些病毒載體，其具有介導結合和攝取的組分或功能)，或者可以修飾載體以提供此類功能。大量的此類載體是本領域已知的，并且通?？色@得。當載體被維持在宿主細胞中時，載體可以作為自主結構在有絲分裂過程中被細胞穩(wěn)定復制，并入宿主細胞的基因組中，或維持在宿主細胞的細胞核或細胞質(zhì)中。
B.調(diào)節(jié)元件
載體中包括的真核表達盒特別包含(以5'至3'的方向)與蛋白編碼序列可操作地連接的真核轉(zhuǎn)錄啟動子、包括間插序列的剪接信號，以及轉(zhuǎn)錄終止/多腺苷化序列。
1.啟動子/增強子“啟動子”是控制序列，其為核酸序列的區(qū)域，在該區(qū)域轉(zhuǎn)錄的啟動和速率受到控制。它可以含有可與調(diào)節(jié)性蛋白和分子例如RNA聚合酶和其他轉(zhuǎn)錄因子結合的遺傳元件，以啟動核酸序列的特定轉(zhuǎn)錄。措辭“可操作地定位”、“可操作地連接”、“在......控制下”和“在......轉(zhuǎn)錄控制下”意指啟動子相對于核酸序列而言處于正確的功能位置和/或方向，以控制該序列的轉(zhuǎn)錄啟動和/或表達。
適合用于本發(fā)明的編碼EBNA I的載體中的啟動子是這樣的啟動子其指導編碼 EBNA I蛋白的表達盒的表達，以產(chǎn)生足夠穩(wěn)定水平的EBNA I蛋白，以穩(wěn)定維持含有EBV oriP的載體。啟動子也用于有效表達編碼重編程因子的表達盒。
啟動子一般包含這樣的序列其作用是定位RNA合成的起始位點。這種序列的最有名的實例是TATA盒，但是在缺少TATA盒的一些啟動子，例如哺乳動物末端脫氧核苷酸基轉(zhuǎn)移酶基因的啟動子和SV40晚期基因的啟動子中，覆蓋起始位點本身的離散元件輔助固定啟動位置。另外的啟動子元件調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄啟動的頻率。通常，這些元件位于起始位點上游 30-1 IObp的區(qū)域，雖然許多啟動子已被證明也含有位于起始位點下游的功能元件。為了使編碼序列“在啟動子的控制之下”，人們將轉(zhuǎn)錄閱讀框的轉(zhuǎn)錄啟動位點的5'端置于所選啟動子的“下游”(即置于所選啟動子的3'端)?！吧嫌巍眴幼哟碳NA的轉(zhuǎn)錄并促進所編碼的RNA的表達。
啟動子元件之間的間隔經(jīng)常是靈活可變的，所以，當元件被倒置或相對于彼此發(fā)生移動時，能夠保持啟動子的功能。在tk啟動子中，啟動子元件之間的間隔可以增至相隔 50bp，此后活性開始下降。取決于啟動子，似乎單個元件可以合作地或獨立地發(fā)揮激活轉(zhuǎn)錄的作用。啟動子可以與“增強子”聯(lián)用或者不與之聯(lián)用，增強子是指參與核酸序列的轉(zhuǎn)錄激活的順式作用調(diào)節(jié)序列。
啟動子可以是與核酸序列天然締合的啟動子，如可以通過分離位于編碼區(qū)段和/或外顯子上游的5'非編碼序列獲得。此種啟動子可以被稱為“內(nèi)源性的”。類似地，增強子可以是與核酸序列天然締合、位于該序列的下游或上游的增強子。或者，通過將編碼核酸區(qū)段置于重組或異源啟動子控制下將會產(chǎn)生某些益處，所述重組或異源啟動子是指在其天然環(huán)境中通常不與核酸序列締合的啟動子。重組或異源增強子是指在其天然環(huán)境中通常不與核酸序列結合的增強子。此類啟動子或增強子可以包括其他基因的啟動子或增強子，以及從任何其他病毒或原核或真核細胞中分離的啟動子或增強子，以及不是“天然存在”的啟動子或增強子，即，含有不同轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)的不同元件，和/或改變表達的突變的啟動子或增強子。例如，在構建重組DNA時最常使用的啟動子包括β_內(nèi)酰胺酶(青霉素酶)、乳糖和色氨酸(trp)啟動子系統(tǒng)。除了通過合成方式產(chǎn)生啟動子和增強子的核酸序列之外，還可以使用包括PCR 的重組克隆和/或核酸擴展技術，聯(lián)合本文公開的組合物來產(chǎn)生序列(參見美國專利No. 4，683，202和5，928，906，每篇均通過引用并入本文)。此外考慮到，也可以使用指導非細胞核細胞器如線粒體、葉綠體等內(nèi)的序列轉(zhuǎn)錄和/或表達的控制序列。
自然，使用有效指導DNA區(qū)段在所選的用于表達的細胞器、細胞類型、組織、器官或生物中的表達的啟動子和/或增強子具有重要意義。分子生物學領域技術人員一般知曉用于蛋白表達的啟動子、增強子和細胞類型組合的使用，(參見例如Sambrook等人1989,通過引用并入本文)。所使用的啟動子可以是組成型啟動子、組織特異性啟動子、誘導型啟動子和/或可用于在合適條件下指導所導入的DNA區(qū)段的高水平表達，如在大規(guī)模生產(chǎn)重組蛋白和/或肽中具有優(yōu)勢的啟動子。啟動子可以是異源的或內(nèi)源的。
另外，任何啟動子/增強子組合(按照例如真核啟動子數(shù)據(jù)庫ETOB，通過印d.1sb-sib. ch/訪問互聯(lián)網(wǎng))也可用于驅(qū)動表達。使用T3、T7或SP6細胞質(zhì)表達系統(tǒng)是另一種可能的實施方案。如果提供合適的細菌聚合酶作為遞送復合物的一部分或作為另外的遺傳表達構建體，那么真核細胞可以支持從某些細菌啟動子進行細胞質(zhì)轉(zhuǎn)錄。
啟動子的非限制性實例包括早期或晚期病毒啟動子，如SV40早期或晚期啟動子、 細胞巨化病毒(CMV)即刻早期啟 動子、勞斯肉瘤病毒(RSV)早期啟動子；真核細胞啟動子， 如β肌動蛋白啟動子(Ng, 1989 ;Quitsche等人，1989)、GADPH啟動子(Alexander等人, 1988, Ercolani 等人，1988)、金屬硫蛋白啟動子(Karin 等人，1989 ；Richards 等人，1984)； 以及級聯(lián)應答元件啟動子，如環(huán)狀AMP應答元件啟動子(ere)、血清應答元件啟動子(sre)、 佛波酯啟動子(TPA)和最小TATA盒附近的應答元件啟動子(tre)。還可以使用人生長激素啟動子序列(例如，描述于Genbank的人生長激素最小啟動子，登記號X05244,核苷酸 283-341)或小鼠乳腺腫瘤啟動子(可以從ATCC獲得，Cat. No. ATCC 45007)。具體實例可以是磷酸甘油酸激酶(PGK)啟動子。
i1.蛋白酶切割位點/自我切割肽和內(nèi)部核糖體結合位點
在某些方面，根據(jù)本發(fā)明，編碼標記或重編程蛋白的基因可以通過編碼蛋白酶切割位點(即，包含蛋白酶識別位點的序列)的序列(可能存在多于一個序列)或至少一個自我切割肽而彼此連接。例如，包含至少兩個重編程因子基因的多順反子信息可以用在本發(fā)明的某些方面(參見美國系列號12/539，366，通過引用并入本文)。
根據(jù)本發(fā)明的某些實施方案，能夠切割由連接構成多順反子信息的基因的一個 (多個)序列編碼的切割位點的一種(多種)蛋白酶是由本發(fā)明的多核苷酸編碼的。更特別地，編碼該一種(多種)蛋白酶的一個(多個)基因是至少一個多順反子信息的一部分。
適宜的蛋白酶切割位點和自我切割肽是技術人員已知的(參見，例如，Ryan等人， 1997 ;SCymCzak等人，2004)。蛋白酶切割位點的優(yōu)選實例是馬鈴薯Y病毒組NIa蛋白酶(例如，煙草蝕紋病毒蛋白酶)、馬鈴薯Y病毒組HC蛋白酶、馬鈴薯Y病毒組Pl (P35)蛋白酶、 byovirus Nla蛋白酶、byovirus RNA-2-編碼的蛋白酶、口蹄疫病毒屬L蛋白酶、腸道病毒屬2A蛋白酶、鼻病毒屬2A蛋白酶、微小核醣核酸3C蛋白酶、豇豆花葉病毒組24K蛋白酶、 線蟲傳多面體病毒屬24K蛋白酶、RTSV(水稻東格魯球狀病毒)3C樣蛋白酶、PY\IF(歐防風黃點病毒)3C-樣蛋白酶、凝血酶、因子Xa和腸激酶的切割位點。由于其高切割嚴格性，可以使用TEV(煙草蝕紋病毒)蛋白酶切割位點。
示例性自我切割肽(也稱為“順式作用水解元件”，CHYSEL ;參見deFelipe (2002)) 源自馬鈴薯Y病毒組和心病毒屬2A肽。具體的自我切割肽可以選自衍生自FMDV( 口蹄疫病毒)的2A妝、馬鼻炎A病毒、Thosea asigna病毒和豬捷申病毒(porcine tescho virus)。
特定起始信號也可用于多順反子信息中的編碼序列的有效翻譯。這些信號包括 ATG起始密碼子或鄰近序列?？赡苄枰峁┩庠捶g控制信號，包括ATG起始密碼子。本領域普通技術人員將容易能夠確定這一點并提供必要的信號。熟知的是，起始密碼子必須與所需的編碼序列的閱讀框在同一框內(nèi)，以確保整體插入序列的翻譯。外源翻譯控制信號和起始密碼子可以是天然的或合成的。可以通過引入合適的轉(zhuǎn)錄增強元件來增強表達效率。
在本發(fā)明的某些實施方案中，使用內(nèi)部核糖體進入位點(IRES)元件產(chǎn)生多基因信息或多順反子信息。IRES元件能夠繞過5'甲基化Cap依賴性翻譯的核糖體掃描模式， 并在內(nèi)部位點處開始翻譯(Pelletier和Sonenberg, 1988)。已經(jīng)描述了來自微小核醣核酸病毒家族的兩個成員(脊髓灰質(zhì)炎和腦心肌炎)的IRES元件(Pelletier和Sonenberg, 1988)，以及來自哺乳動物信息的IRES (Macejak和Sarnow, 1991)。IRES元件可以連接至異源開放閱讀框。多個開放閱讀框可以一起被轉(zhuǎn)錄，每個開放閱讀框之間均以IRES隔開， 產(chǎn)生多順反子信息。借助IRES元件，每個開放閱讀框可靠近核糖體以進行有效翻譯。使用用于轉(zhuǎn)錄單一信息的單個啟動子/增強子可以有效表達多個基因(參見，例如美國專利 No. 5，925，565和5，935， 819，均通過引用并入本文)。
ii1.多克隆位點
載體可以包括多克隆位點(MCS)，其是含有多個限制性酶位點的核酸區(qū)域，所述多個限制性酶位點中的任一個均可用于根據(jù)標準重組技術來消化該載體(參見，例如 Carbonelli等人，1999, Levenson等人，1998,和Cocea, 1997,通過引用并入本文)?！跋拗菩悦赶笔侵赣脙H在核酸分子的特定位置處發(fā)揮作用的酶催化性切割核酸分子。這些限制性酶中的許多是可購得的。本領域技術人員普遍理解此類酶的使用。經(jīng)常使用在MCS 內(nèi)切割的限制性酶將載體線性化或片段化，以使外源序列能被接合至載體?！敖雍稀笔侵冈趦蓚€核酸片段之間形成磷酸二酯鍵的過程，所述兩個核酸片段可以是彼此連續(xù)的或不連續(xù)的。涉及限制性酶和接合反應的技術是重組技術領域技術人員熟知的。
iv.剪接位點
多數(shù)經(jīng)轉(zhuǎn)錄的真核RNA分子將經(jīng)歷RNA剪接從而從初級轉(zhuǎn)錄物中去除內(nèi)含子。含有基因組真核序列的載體可能需要供體和/或受體剪接位點以確保適當?shù)丶庸まD(zhuǎn)錄物用于蛋白表達(參見，例如Chandler等人，1997,通過引用并入本文)。
V.終止信號
本發(fā)明的載體或構建體一般將包含至少一個終止信號。“終止信號”或“終止子” 由參與RNA聚合酶對RNA轉(zhuǎn)錄物的特異性終止的DNA序列構成。因此，在某些實施方案中考慮了結束RNA轉(zhuǎn)錄物的產(chǎn)生的終止信號。終止子可能是實現(xiàn)想要的信息水平所體內(nèi)必需的。
在真核系統(tǒng)中，終止子區(qū)域還可以包含特定的DNA序列，其允許新轉(zhuǎn)錄物的位點特異性切割，以便暴露多腺苷化位點。這會向?qū)Ｂ毜膬?nèi)源聚合酶發(fā)出信號，使其將一串約 200個殘基A(多聚A)添加到轉(zhuǎn)錄物的3'端。經(jīng)這種多聚A尾巴修飾的RNA分子似乎更加穩(wěn)定并且更有效地被翻譯。因此，在其他涉及真核細胞的實施方案中，優(yōu)選終止子包含用于RNA切割的信號，更優(yōu)選終止子信號促進信使的多聚腺苷化。終止子和/或多聚腺苷化位點元件可用于增強信使水平，并使從盒讀入其他序列的讀取最小化。
考慮用于本發(fā)明的終止子包括如本文描述的或本領域普通技術人員已知的任何已知的轉(zhuǎn)錄終止子，包括但不限于，例如，基因的終止序列，例如牛生長激素終止子或病毒終止序列，例如SV40終止子。在某些實施方案中，終止信號可以是可轉(zhuǎn)錄或可翻譯序列的·缺乏，例如由于序列截短所造成的。
v1.多腺苷化信號
在表達時，尤其是真核表達時，人們通常會引入多腺苷化信號來進行轉(zhuǎn)錄物的適當?shù)亩嘞佘栈?jù)信，多腺苷化信號的性質(zhì)對于本發(fā)明的成功實踐不是關鍵性的，可以使用任何此類序列。優(yōu)選的實施方案包括SV40多腺苷化信號或牛生長激素多腺苷化信號，所述信號是方便的并且已知它們在多種靶細胞中的作用是很好的。多腺苷化可以增強轉(zhuǎn)錄物的穩(wěn)定性或者可以促進細胞質(zhì)轉(zhuǎn)運。
vi1.復制起始點
為了在宿主細胞中繁殖載體，載體可以含有一個或多個復制起始位點(通常稱為 “ori”)，例如，與如上所述的EBV的oriP，或在分化重編程中具有相似或提高的功能的遺傳工程化的oriP對應的核酸序列是特定的核酸序列，在該核酸序列處，復制被啟動。或者，可以使用如上所述的其他染色體外復制性病毒的復制起始點或自主復制序列(ARS)。
vii1.選擇和可篩選標記
在本發(fā)明的某些實施方案中，可以通過在表達載體中弓丨入標記而在體外或體內(nèi)鑒定含有本發(fā)明核酸構建體的細胞。此類標記將賦予細胞可鑒定的變化，從而允許容易地鑒定含有表達載體的細胞。一般地，選擇標記是賦予允許進行選擇的性質(zhì)的標記。陽性選擇標記是這樣的標記它的存在允許針對其進行選擇，而陰性選擇標記是這樣的標記它的存在阻止針對其進行選擇。陽性選擇標記的實例是藥物抗性標記。
通常，引入藥物選擇標記會輔助轉(zhuǎn)化子的克隆和鑒定，例如，賦予對新霉素、嘌吟霉素、潮霉素、DHFR、GPT、zeocin和組氣醇抗性的基因是有用的選擇標記。除了賦予允許基于條件的施用來區(qū)分轉(zhuǎn)化子的表型的標記以外，也考慮到其他類型的標記，包括可篩選標記，例如GFP，其基礎是顯色反應?；蛘?，可以使用可篩選的酶作為陰性選擇標記，如單純皰疹病毒胸苷激酶(tk)或氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)。本領域技術人員也將知曉如何使用免疫標記，可能要聯(lián)合FACS分析。所用的標記不被認為是重要的，只要它能夠與編碼基因產(chǎn)物的核酸同時被表達即可。選擇和可篩選標記的另外的實例是本領域技術人員熟知的。本發(fā)明的一個特征包括在分化重編程因子已經(jīng)在那些細胞中執(zhí)行所需的改變的分化狀態(tài)之后使用選擇和可篩選標記以選擇不含載體的細胞。
C.載體遞送
在本發(fā)明中，將重編程載體導入體細胞中可以使用任何合適的用于核酸遞送以轉(zhuǎn)化細胞的方法，如本文所描述或如本領域普通技術人員已知的。此類方法包括但不限于，DNA的直接遞送，例如通過離體轉(zhuǎn)染(Wilson等人，1989, Nabel等人，1989),通過注射(美國專利 No. 5，994，624,5, 981，274,5, 945，100,5, 780，448,5, 736，524,5, 702，932、 5，656，610,5, 589，466和5，580，859，每篇均通過引用并入本文)，包括微注射(Harland和 Weintraub, 1985 ;美國專利No. 5，789，215，通過引用并入本文)；通過電穿孔(美國專利 No. 5，384，253,通過引用并入本文；Tur_Kaspa等人，1986 ;Potter等人，1984);通過磷酸隹丐沉淀(Graham 和 Van Der Eb, 1973 ；Chen 和 Okayama, 1987 ；Rippe 等人，1990);通過使用 DEAE-葡聚糖,接著使用聚乙二醇(Gopal,1985);通過直接的聲波載入(sonic loading) (Fechheimer等人，1987);通過脂質(zhì)體介導的轉(zhuǎn)染(Nicolau和Sene, 1982 ；Fraley等人， 1979 ；Nicolau 等人，1987 ；ffong 等人，1980 ；Kaneda 等人，1989 ；Kato 等人，1991)和受體介導的轉(zhuǎn)染(Wu和Wu，1987 ;Wu和Wu，1988);通過微粒轟擊(PCT申請?zhí)朩O 94/09699 和 95/06128 ;美國專利 No. 5，610，042,5, 322，783,5, 563，055,5, 550，318,5, 538，877 和 5，538，880,每篇均通過引用并入本文)；通過用碳化娃纖維攪拌(Kaeppler等人，1990 ;美國專利No. 5，302，523和5，464，765，每篇均通過引用并入本文)；通過農(nóng)桿菌介導的轉(zhuǎn)化 (美國專利No. 5，591，616和5，563，055，每篇均通過引用并入本文);通過PEG介導的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(Omirulleh等人，1993 ;美國專利No. 4，684，611和4，952，500，每篇均通過引用并入 本文)；通過干燥/抑制介導的DNA攝取(Potrykus等人，1985),以及此類方法的任何組合。通過應用諸如此類的技術，可以穩(wěn)定地或瞬間地轉(zhuǎn)化一個(多個)細胞器、一個(多個)細胞、一個(多個)組織或一個(多個)生物體。
1.脂質(zhì)體介導的轉(zhuǎn)染
在本發(fā)明的某些實施方案中，核酸可以包埋在脂質(zhì)復合物例如脂質(zhì)體中。脂質(zhì)體是囊泡結構，其特征在于磷脂雙層膜和內(nèi)部水性介質(zhì)。多層脂質(zhì)體具有被水性介質(zhì)分開的多個脂質(zhì)層。當磷脂懸浮在過量的水溶液中時，它們會自發(fā)形成。在形成封閉結構并將水和溶解的溶質(zhì)包埋在脂質(zhì)雙層之間以前，脂質(zhì)組分會經(jīng)歷自我重排(Ghosh和Bachhawat, 1991) ο 還考慮到核酸與 Lipofectamine (Gibco BRL)或 Superfect (Qiagen)的復合。所使用的脂質(zhì)體的量可以根據(jù)脂質(zhì)體的性質(zhì)以及所使用的細胞而變化，例如，可以考慮約5μ g 至約20μ g載體DNA/1-10X106個細胞。
在體外進行脂質(zhì)體介導的核酸遞送和外源DNA的表達已經(jīng)是非常成功的 (Nicolau 和 Sene, 1982 ；Fraley 等人，1979 ；Nicolau 等人，1987)。也已經(jīng)證明了脂質(zhì)體介導的外源DNA在培養(yǎng)的雞胚胎、HeLa和肝癌細胞中的遞送和表達的可行性(Wong等人， 1980)。
在本發(fā)明的某些實施方案中，脂質(zhì)體可以與血凝病毒(HVJ)復合。已經(jīng)證明這會促進與細胞膜的融合并促進脂質(zhì)體包封的DNA進入細胞(Kaneda等人，1989)。在其他實施方案中，脂質(zhì)體可以與細胞核非組蛋白染色體蛋白(HMG-1)復合或與之結合使用(Kato等人，1991)。在又一些進一步實施方案中，脂質(zhì)體可以與HVJ和HMG-1 二者復合或與之結合使用。在其他實施方案中，遞送媒介物可以包含配體和脂質(zhì)體。
i1.電穿孔
在本發(fā)明的某些實施方案中，通過電穿孔法將核酸導入細胞。電穿孔涉及使細胞懸浮液和DNA暴露于高壓放電。可以通過機械損傷使受體細胞變得更易于轉(zhuǎn)化。同樣，所使用的載體量可以根據(jù)所使用的細胞的性質(zhì)而變化，例如，可有考慮約5μ g至約20μ g載體 DNA/1-lOxlO6 個細胞。
使用電穿孔法轉(zhuǎn)染真核細胞已經(jīng)取得相當大的成功。已經(jīng)用人K -免疫球蛋白基因轉(zhuǎn)染了小鼠前B淋巴細胞(Potter等人，1984)，也已經(jīng)以這種方式用氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因轉(zhuǎn)染大鼠肝細胞(Tur Kaspa等人，1986)。
ii1.磷酸鈣法
在本發(fā)明的其他實施方案中，使用磷酸鈣沉淀法將核酸導入細胞中。已經(jīng)使用這種技術用腺病毒5DNA轉(zhuǎn)染人KB細胞(Graham和Van Der Eb, 1973) 0同樣，用這種方式，已經(jīng)用新霉素標記基因轉(zhuǎn)染小鼠L(A9)、小鼠C127、CH0、CV-1、BHK、NIH3T3和HeLa細胞(Chen 和Okayama，1987)，并且用多種標記基因轉(zhuǎn)染了大鼠肝細胞(Rippe等人，1990)。
iv. DEAE-葡聚糖
在另一個實施方案中，使用DEAE-葡聚糖，然后使用聚乙二醇將核酸遞送到細胞中。用這種方式，已將報告分子質(zhì)粒導入小鼠骨髓瘤和紅白血病細胞(Gopal，1985)。
VI1.重編程因子
iPS細胞的產(chǎn)生對于用于誘導的重編程因子是關鍵的。以下因子或其組合可用于本發(fā)明公開的方法中。在某些方面，編碼Sox和0ct(特別是0ct3/4)的核酸將被引入到重編程載體中。例如，一個或多個重編程載體可以包含編碼Sox2、0ct4、Nanog和任選的Lin28 的表達盒，或編碼Sox2、0ct4、Klf4以及任選的C-myc或L_myc的表達盒,或編碼Sox2、0ct4 和任選的Esrrb的表達盒,或編碼Sox2、0ct4、Nanog、Lin28、Klf4、或Ciyc或L_myc,以及任選的SV40大T抗原的表達盒。編碼這些重編程因子的核酸可以包含在同一表達盒中、不同表達盒中、同一重編程載體中，或不同重編程載體中。
0ct4和Sox基因家族的某些成員(Soxl、Sox2、Sox3和Soxl5)已經(jīng)被鑒定為參與誘導過程的關鍵性轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子，它的缺乏會使誘導不能進行。然而，另外的基因，包括Klf 家族的某些成員0(1€1、1(1€2、1(1€4和1(1€5)、Myc家族的某些成員(C-myc、L-myc和N_myc)、 Nanog和Lin28已經(jīng)被鑒定為增強誘導效率。
0ct4(Pou5fl)是八聚體(“Oct”)轉(zhuǎn)錄因子家族之一，并且在維持多潛能性方面起到關鍵作用。0ct4+細胞例如卵裂球和胚胎干細胞中0ct4的缺乏會導致自發(fā)的滋養(yǎng)層分化，0ct4的存在因而會產(chǎn)生胚胎干細胞的多潛能性和分化潛力?！癘ct”家族中的各種其他基因，包括0ct4的近親Octl和0ct6，不能引發(fā)誘導，因此證明了 Oct-4在誘導過程中的專有性。
與0ct4類似，Sox基因家族與維持多潛能性相關，但是它與多潛能和單潛能干細胞相關，而0ct4與此相反，0ct4專有性地在多潛能干細胞中表達。雖然Sox2是用于重編程誘導的最初基因，但是發(fā)現(xiàn)Sox家族中的其他基因也在誘導過程中起作用。Soxl以類似于Sox2的效率產(chǎn)生iPS細胞，并且基因Sox3、Soxl5和Soxl8也產(chǎn)生iPS細胞，但效率低。
在胚胎干細胞中，Nanog以及0ct4和Sox2是促進多潛能性所需的。因此，當 Yamanaka等人報道Nanog對于誘導不是必需的,但Thomson等人已報道可以使用Nanog作為因子之一來產(chǎn)生iPS細胞時，是令人驚訝的。
Lin28是一種在胚胎干細胞和胚胎癌細胞中表達、與分化和增殖相關的mRNA結合蛋白。Thomson等人證明它是產(chǎn)生iPS的一個因子,但是它不是必需的。
Klf基因家族的Klf4最初由Yamanaka等人鑒定，由Jaenisch等人確認為用于產(chǎn)生小鼠iPS細胞的因子,并且由Yamanaka等人證明為用于產(chǎn)生人iPS細胞的因子。然而， Thompson等人報道Klf4對于人iPS細胞的產(chǎn)生不是必需的，事實上它未能產(chǎn)生人iPS細胞。發(fā)現(xiàn)Klf2和Klf4是能夠產(chǎn)生iPS細胞的因子，相關的基因Klf I和Klf5同樣也是， 但是效率低。
Myc基因家族是牽涉于癌癥的原癌基因。Yamanaka等人和Jaenisch等人證明 C-myc是牽涉于小鼠iPS細胞的產(chǎn)生的因子，Yamanaka等人證明它是牽涉于人iPS細胞的產(chǎn)生的因子。然而,Thomson等人和Yamanaka等人報道C-myc對于人iPS細胞的產(chǎn)生不是必需的。將“Myc”基因家族用于誘導iPS細胞，這會給iPS細胞最終作為臨床治療造成麻煩，因為25%的移植有C-myc誘導的iPS細胞的小鼠形成致命性畸胎瘤。Niyc和Liyc 已經(jīng)被鑒定為替代C-my以類似的效率進行誘導。
SV40大抗原可用于減少或防止當表達C-myc時可能發(fā)生的細胞毒性。
本發(fā)明中使用的重編程蛋白可以被具有約相同的重編程功能的蛋白同源物替代。 編碼這些同源物的核酸也可用于重編程。保守性氨基酸置換是優(yōu)選的，即，例如，作為極性酸性氨基酸的天冬氨酸-谷氨酸；作為極性堿性氨基酸的賴氨酸/精氨酸/組氨酸；作為非 極性或疏水性氨基酸的亮氨酸/異亮氨酸/甲硫氨酸/纈氨酸/丙氨酸/甘氨酸/脯氨酸；作為極性或不帶電的親水性氨基酸的絲氨酸/蘇氨酸。保守性氨基酸置換還包括基于側鏈的分組。例如，具有脂肪族側鏈的一組氨基酸是甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸；具有脂肪族-羥基側鏈的一組氨基酸是絲氨酸和蘇氨酸；具有含酰胺側鏈的一組氨基酸是天冬酰胺和谷氨酰胺；具有芳香族側鏈的一組氨基酸是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸; 具有堿性側鏈的一組氨基酸是賴氨酸、精氨酸和組氨酸；具有含硫側鏈的一組氨基酸是半胱氨酸和甲硫氨酸。例如，可以合理預期將亮氨酸替換為異亮氨酸或纈氨酸、將天冬氨酸替換為谷氨酸、將蘇氨酸替換為絲氨酸、或類似地將氨基酸替換為結構上相關的氨基酸將不會對得到的多肽的性質(zhì)產(chǎn)生大的影響。可以通過測定多肽的比活性容易地確定氨基酸替換是否產(chǎn)生功能性多肽。
VII1.1PS細胞的選擇和分化
在本發(fā)明的某些方面，在將重編程因子導入造血祖細胞中后，如上所述的那樣培養(yǎng)細胞(任選地針對載體元件如陽性選擇或可篩選標記的存在來進行選擇，以富集轉(zhuǎn)染的細胞)。重編程載體可以在這些細胞中表達重編程因子，并隨著細胞分裂而復制和分割?；蛘?，通過補充含有重編程蛋白的培養(yǎng)基，重編程蛋白可以進入這些細胞及其子代。這些重編程因子將重編程體細胞基因組以建立自我持續(xù)的多潛能狀態(tài)，并且在去除針對載體的存在的陽性選擇之后，隨著時間的推移，外源遺傳元件將逐漸喪失，而無需增加補充的重編程蛋白。
可以基于胚胎干細胞特性從源自這些外周血細胞的子代選擇這些誘導性多潛能干細胞，因為預期它們與多潛能胚胎干細胞是基本上相同的。也可以使用另外的陰性選擇步驟以加速或輔助選擇實質(zhì)上不含外源遺傳元件的iPS細胞，這是通過測試重編程載體DNA的缺乏或使用選擇標記如報告分子進行的。
A.針對胚胎干細胞特性的選擇
先前的研究中成功產(chǎn)生的iPSC在以下方面與天然分離的多潛能干細胞(如小鼠和人胚胎干細胞，分別是mESC和hESC)是顯著相似的，由此確認了 iPSC相對于天然分離的多潛能干細胞的性質(zhì)、真實性和多潛能性。因此，可以基于以下胚胎干細胞特性中的一種或多種來選擇由本發(fā)明公開的方法產(chǎn)生的誘導性多潛能干細胞。
1.細胞生物學性質(zhì)
形態(tài)學iPSC在形態(tài)上類似于ESC。每個細胞可以具有圓形、雙核仁或大核仁和貧乏的細胞質(zhì)。iPSC的集落也可以與ESC的集落類似。人iPSC形成與hESC的集落類似的邊界清晰、扁平、緊密堆積的集落，而小鼠iPSC形成與mESC的集落類似的集落，該集落不如 hESC的集落扁平，比hESC的集落聚集度更高。
生長性質(zhì)倍增時間和有絲分裂活性是ESC的基石，因為干細胞作為其定義的一部分而必須自我更新。iPSC在有絲分裂活性、自我更新活性、增殖和分裂的速率方面可以與 ESC相同。
干細胞標記iPSC可以表達在ESC上表達的細胞表面抗原性標記。人iPSC表達對 hESC 有特異性的標記，包括但不限于 SSEA-3、SSEA-4、TRA-l-60、TRA-l-81、TRA-2-49/6E 和Nanog。小鼠iPSC表達SSEA-1但不表達SSEA-3也不表達SSEA-4，這與mESC是類似的。
干細胞基因iPSC可以表達在未分化的ESC中表達的基因，包括0ct4、Sox2、 Nanog、⑶F3、REX1、FGF4、ESG1、DPPA2、DPPA4 和 hTERT。
端粒酶活性端粒酶是維持細胞分裂不受Hayflick極限(一SO次細胞分裂)限制所必需的。hESC表達高端粒酶活性，以維持自我更新和增殖，iPSC也顯示出高端粒酶活性并表達hTERT (人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶)，其為端粒酶蛋白復合物中的必要組分。
多潛能性iPSC將能夠以類似于ESC的方式分化為完全分化的組織。
神經(jīng)分化iPSC可以分化為表達β II1-微管蛋白的神經(jīng)元、酪氨酸羥化酶、AADC、 DAT,ChAT,LMXlB和MAP2。兒茶酚胺相關的酶的存在可以指示iPSC類似于hESC，可以分化成為多巴胺能神經(jīng)元。在分化之后，干細胞相關的基因?qū)幌抡{(diào)。
心臟分化iPSC可以分化為心肌細胞，其自發(fā)開始跳動。心肌細胞表達cTnT、 MEF2C、MYL2A、MYHC0和NKX2. 5。在分化之后，干細胞相關的基因?qū)幌抡{(diào)。
畸胎瘤形成注射到免疫缺陷型小鼠中的iPSC可能在一定時間如9周之后自發(fā)形成畸胎瘤?；チ鍪呛性醋匀齻€胚層即內(nèi)胚層、中胚層和外胚層的組織的多譜系腫瘤；這與其他腫瘤不同，其他腫瘤通常僅是一種細胞類型。畸胎瘤形成是多潛能性的標志性測試。
擬胚體培養(yǎng)中的hESC自發(fā)形成球狀胚胎樣結構，其被稱為“擬胚體”，其由具有有絲分裂活性的分化中的hESC的核心和來自所有三個胚層的完全分化的細胞的外圍組成。iPSC也可以形成擬胚體并具有外周分化的細胞。
胚泡注射hESC天然地存在于胚泡的內(nèi)細胞群(成胚區(qū))內(nèi)，且在成胚區(qū)中分化為胚胎；而胚泡的殼(滋養(yǎng)層)分化為胚胎外組織。中空的滋養(yǎng)層不能形成活胚胎，因此， 成胚區(qū)中的胚胎干細胞必須分化并形成胚胎。通過微量吸液管將iPSC注射到滋養(yǎng)層中以產(chǎn)生被轉(zhuǎn)移到雌性受體中的胚泡，這可能會導致產(chǎn)生嵌合的活小鼠幼崽具有10% -90% 的嵌合性并且遍布其身體摻入了 iPSC衍生物的小鼠。
i1.表觀遺傳學的重編程
啟動子去甲基化甲基化是甲基被轉(zhuǎn)移至DNA堿基，通常是甲基被轉(zhuǎn)移至CpG位點 (鄰近的胞嘧啶/鳥嘌吟序列)中的胞嘧啶分子。基因的廣泛甲基化會通過阻止表達蛋白的活性或募集干擾表達的酶來對表達產(chǎn)生干擾。因此，基因的甲基化會通過阻止轉(zhuǎn)錄而有效地使基因沉默。包括0ct4、ReXl和Nanog在內(nèi)的多潛能性相關基因的啟動子可能在iPSC 中被去甲基化，顯示出它們的啟動子活性以及多潛能性相關基因在iPSC中的活性啟動和表達。
組蛋白去甲基化組蛋白是在結構上定位于DNA序列的緊湊蛋白，其可以通過多種染色質(zhì)相關的修飾發(fā)揮其活性。與0ct/4、Sox2和Nanog相關的H3組蛋白可以被去甲基化以激活0ct4、Sox2和Nanog的表達。
B.針對無殘余特征的選擇
本發(fā)明中的重編程載體如基于oriP的載體可以在染色體外復制，并且在數(shù)代之后在宿主細胞中不再存在。然而，針對實質(zhì)上不含外源載體元件的子代細胞的另外的選擇步驟可以促進這個過程。例如，可以提取 子代細胞樣品以測試外源載體元件的存在或喪失， 如本領域已知的(Leight和Sugden, 2001)。
重編程載體可以進一步包含選擇標記，更具體地，陰性選擇標記，如編碼胸苷激酶的基因，以選擇實質(zhì)上不含此種選擇標記的子代細胞。人單純皰疹病毒胸苷激酶I型基因 (HSVtk)用作哺乳動物細胞中的條件致死標記。HSVtk編碼的酶能夠?qū)⒛承┖塑疹愃莆?例如更昔洛韋，一種抗皰疹藥物)磷酸化，由此將它們轉(zhuǎn)化為有毒性的DNA復制抑制劑。替代或互補途徑是測試外源遺傳元件在子代細胞中的不存在，使用常規(guī)方法進行，例如RT-PCR、 PCR, FISH(熒光原位雜交)、基因陣列，或雜交(例如Southern印跡)。
C.1PS細胞的分化
多種途徑可以與本發(fā)明一起使用以使iPS細胞分化為細胞譜系，包括但不限于 造血細胞、單核細胞(例如心肌細胞)、神經(jīng)元、成纖維細胞和表皮細胞，以及源自其中的組織或器官。iPS細胞的造血分化的示例性方法可以包括，例如，均通過引用完整地并入本文的美國申請No. 61/088，054和No. 61/156,304中公開的方法，或基于擬胚體(EB)的方法(Chadwick等人,2003 ;Ng等人,2005)。纖連蛋白分化方法也可用于血液譜系分化,如 Wang等人，2007中所列舉的。iPS細胞的心臟分化的示例性方法可以包括擬胚體(EB)方法(Zhang，等人，2009)、0P9基質(zhì)細胞方法(Narazaki，等人，2008)，或生長因子/化學方法 (參見美國專利公開 No. 20080038820,20080226558,20080254003 和 20090047739，都通過引用完整地并入本文)。IX.實施例
包括了以下實施例以說明本發(fā)明的優(yōu)選實施方案。本領域技術人員應該認識到， 以下實施例中公開的技術代表本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)的在實踐本發(fā)明時效果良好的技術，因此可以被認為是構成本發(fā)明的實踐的優(yōu)選模式。但是，根據(jù)本公開，本領域技術人員應該認識到， 可以在不脫離本發(fā)明的精神和范圍的情況下對所公開的具體實施方案作出許多改變，并且仍然獲得相同或相似的結果。
實施例1
從造血祖細胞產(chǎn)生iPS細胞
如圖1所示，對來自患者的正常未動員的外周血進行加工以收集PBMC，并純化以富集表達⑶34的細胞。然后接種這些細胞以允許擴展，并在接種后約I周內(nèi)進行轉(zhuǎn)染。然后將這些細胞進行一天的轉(zhuǎn)染后溫育，此后是約1-2天的恢復期，并轉(zhuǎn)換到100%重編程培養(yǎng)基中。隨著粘附的細胞和松散的集落變得明顯，將培養(yǎng)基逐漸轉(zhuǎn)換到TESR2中以支持iPS 細胞的形成。
在vacutainer中收集人全血(此處要包括的體積范圍為l_50ml)。
從人全血中分離出PBMC并且要么冷凍，要么立即加工以分離⑶34細胞。
將針對⑶34的抗體施加到從外周血加工并且經(jīng)手動或自動分離的PBMC中。
用流式細胞儀(Accuri ；Ann Arbor，MI USA)測定純度，以檢測表達CD34和更一般的標記CD45的細胞百分比，從而檢測所有造血祖細胞。所分離的級分的純度對于CD34表達呈陽性的范圍為20-96%。
要么冷凍針對⑶34表達富集的細胞，要么立即將其與DNAseI (20U/ml) —起在 37°C下溫育10分鐘。這個步驟確保除去當細胞在融化、純化等促進的應力下裂解時釋放的 DNA，并限制細胞聚叢。旋轉(zhuǎn)細胞，去除含有DNA酶的上清液。然后讓細胞恢復過夜。
CD34表達細胞可使用富含細胞因子的培養(yǎng)基擴展。在這個實施例中發(fā)現(xiàn)，單獨的富含細胞因子的培養(yǎng)基足以在至少3種獨立的情況下擴展總細胞數(shù)量。
富含細胞因子的培養(yǎng)基300ng/ml的以下每種物質(zhì)血小板生成素(TPO)、Flt3 和干細胞因子(SCF)。100ng/ml的白細胞介素6(IL6)和10ng/ml的白細胞介素3(IL3)。 基礎培養(yǎng)基由牛血清白蛋白(BSA)、重組人膜島素、鐵飽和人轉(zhuǎn)鐵蛋白、2_疏基乙醇、 Iscove/ sMDM，和另外的補充物組成(在圖2A-2C中指定為不含基質(zhì))。在優(yōu)選的實施方案中，BSA可以完全省去。此外，在這種培養(yǎng)基中利用完全限定 的組分?；蛘?，可以利用補充有上面詳述的濃度的不含動物成分的TPO、Flt3、SCF、IL6和IL3的StemSpan H3000 (Stem CellTechnologies,目錄號 9850)。
CD34表汰細胞可使用與纖連蛋白片段結合的富含細胞因子的培養(yǎng)基擴展。在這個實施例中發(fā)現(xiàn)，CD34+細胞可以在纖連蛋白的重組人片段的存在下進一步擴展。所述纖連蛋白的重組人片段是574個氨基酸(63kDa)并且含有中央細胞結合結構域(III型重復，8、 9、10)、高親和性的肝素結合結構域11(111型重復，12、13、14)，以及在人纖連蛋白的選擇性剪接IIICS區(qū)內(nèi)的CSl位點(得自RetroNectin , Takara)。將纖連蛋白片段與PBS以 5ug/ml混合并置于未經(jīng)處理的組織培養(yǎng)板(在圖2A-2C中指定為Notch-)上。
⑶34表汰細胞可使用與纖連蛋白片段和固定化的工稈化Notch-1配體 (DeltaP^, DLLI)結合的富含細胞因子的培養(yǎng)基擴展.Delaney等人證明使用Notch-1 配體從臍帶血擴展出高于100倍的⑶34+細胞(Delaney等人，2010)。在這個實施例中發(fā)現(xiàn)，來源于外周血的⑶34+細胞也可以在Notch-1配體的存在下使用類似途徑擴展。(在圖 2A-2C中指定為Notch+)。該配體是人肽，其代表在C-末端與免疫球蛋白G的Fe部分融合的重組δ樣蛋白1(DLL1 ；aal-545)的細胞外結構域。
⑶3妒細胞在不存在基質(zhì)或Notch-1配體的情況下的擴展?；旧习?xl03個細胞/孔(24孔板)或IxlO5個細胞/孔出孔板)接種細胞，4天后進行喂養(yǎng)，并在擴展后第 6天進行轉(zhuǎn)染。圖2A-2C示出隨時間流逝的擴展倍數(shù)、總群體的生長速率，以及在該時間范圍內(nèi)的⑶34表達的自然下降。
在擴展后第6天，從不含基質(zhì)的條件收集細胞并用含有oriP-復制子的質(zhì)粒組合轉(zhuǎn)染細胞。從這些質(zhì)粒表達的重編程因子可以包括以下的任何組合0ct4、Sox2、 Nanog、Lin28、C-myc或L_myc、klf4,和SV40大T抗原(圖3)。使用用于單比色皿轉(zhuǎn)染的 LonzaNucleofector裝置或96孔穿梭形式轉(zhuǎn)染2. 5xl04至1. 5xl06個細胞。下表I給出在使用編碼eGFP的基于oriP的質(zhì)粒對包括CD34+細胞在內(nèi)的血液來源的造血祖細胞轉(zhuǎn)染后的代表性結果。該表反映出使用增加數(shù)量的從外周血擴展的輸入HP進行樣品轉(zhuǎn)染的結果。 用缺少重編程因子的表達盒的對照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞。通過計算對于碘化丙啶(PI)染色不呈陽性的群體百分比來確定轉(zhuǎn)染效率(GFP+% )。
表1-轉(zhuǎn)染結果
權利要求
1.一種從造血祖細胞生產(chǎn)人iPS細胞的體外方法，所述方法包括以下步驟a)提供包含造血祖細胞的人外周血細胞的細胞群體；b)在用于促進所述造血祖細胞擴展的擴展條件下培養(yǎng)所述群體；c)將表達iPS重編程因子的外源性游離遺傳元件或外源性RNA遺傳元件導入所述擴展的造血祖細胞中；以及d)將所述擴展的造血祖細胞在不含異種物質(zhì)的培養(yǎng)物中進行培養(yǎng)，由此從所述造血祖細胞產(chǎn)生人iPS細胞。
2.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中所述細胞群體是來自一個或多個其細胞沒有用從外部施加的粒細胞集落刺激因子(G-CSF)或粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)動員的受試者。
3.根據(jù)前述權利要求中的任一項所述的方法，其中所述細胞群體包含在最多約IOml 體積的血液樣品中。
4.根據(jù)前述權利要求中的任一項所述的方法，其中所述擴展條件包含含有一種或多種細胞因子的擴展培養(yǎng)基，所述細胞因子包括干細胞因子(SCF)、Flt-3配體(Flt3L)、血小板生成素(TPO)、白細胞介素3 (IL-3)，或白細胞介素6 (IL-6)。
5.根據(jù)前述權利要求中的任一項所述的方法，其中所述擴展條件不包含Notch-1配體。
6.根據(jù)前述權利要求中的任一項所述的方法，其中在步驟b)中的擴展條件包含限定的細胞外基質(zhì)。
7.根據(jù)權利要求1至5中的任一項所述的方法，其中在步驟b)中的擴展條件不包含基質(zhì)。
8.根據(jù)前述權利要求中的任一項所述的方法，其中在步驟b)中的條件或在步驟d)中的培養(yǎng)物具有最高7%的氧分壓。
9.根據(jù)前述權利要求中的任一項所述的方法，其中所述重編程因子為Sox、Oct、 Nanog、Lin-28、Klf4、C-myc (或 L_myc)、SV40 大 T 抗原，或它們的組合。
10.根據(jù)前述權利要求中的任一項所述的方法，其中所述外源性游離遺傳元件或外源性RNA遺傳元件具有一個或多個多順反子盒。
11.根據(jù)前述權利要求中的任一項所述的方法，其中所述步驟c)在所述擴展步驟b)的約第3、4、5或6天進行。
12.根據(jù)前述權利要求中的任一項所述的方法，其中在所述步驟c)中所述擴展的造血祖細胞的起始數(shù)量為約IO4至約IO5個。
13.根據(jù)前述權利要求中的任一項所述的方法，其中在步驟d)中的培養(yǎng)物包含限定的細胞外基質(zhì)。
14.根據(jù)前述權利要求中的任一項所述的方法，其中所述限定的細胞外基質(zhì)具有單一類型的細胞外基質(zhì)肽。
15.根據(jù)前述權利要求中的任一項所述的方法，其中所述限定的細胞外基質(zhì)是人纖連蛋白片段。
16.根據(jù)前述權利要求中的任一項所述的方法，其中在所述步驟中的一個或多個中的培養(yǎng)基是化學限定的培養(yǎng)基。
17.根據(jù)前述權利要求中的任一項所述的方法，其進一步包括e)針對iPS細胞進行選擇。
18.—種從外周血樣品生產(chǎn)人iPS細胞的體外方法，所述方法包括以下步驟a)提供包含造血祖細胞的外周血樣品，其中所述外周血樣品的體積最多為IOml；b)將表達iPS重編程因子的外源性游離遺傳元件或外源性RNA遺傳元件導入所述造血祖細胞中；以及c)將所述造血祖細胞在不含異種物質(zhì)的培養(yǎng)物中進行培養(yǎng)，由此從所述外周血樣品產(chǎn)生人iPS細胞。
19.根據(jù)權利要求18所述的方法，其進一步包括在所述步驟b)之前，在用于促進所述造血祖細胞擴展的擴展條件下培養(yǎng)所述造血祖細胞。
20.—種體外細胞培養(yǎng)組合物，其包含含有造血祖細胞和其子代細胞的人外周血細胞的細胞群體、不含異種物質(zhì)的細胞外基質(zhì)，和不含異種物質(zhì)的培養(yǎng)基，其中所述造血祖細胞包含一種或多種表達重編程因子的外源性游離遺傳元件或外源性RNA遺傳元件。
全文摘要
公開了涉及生產(chǎn)誘導性多潛能干細胞(iPS細胞)的方法和組合物。例如，可以使用游離重編程和不含飼養(yǎng)物或不含異種物質(zhì)的條件從外周血細胞如人血液祖細胞產(chǎn)生誘導性多潛能干細胞。在某些實施方案中，本發(fā)明提供了以低數(shù)量的血液祖細胞提高整個重編程效率的新方法。
文檔編號C07K14/475GK103003416SQ201180029389
公開日2013年3月27日 申請日期2011年6月14日 優(yōu)先權日2010年6月15日
發(fā)明者阿曼達·麥克 申請人:細胞動力學國際有限公司