專利名稱：生產(chǎn)異源多聚體蛋白質(zhì)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于生產(chǎn)異源多聚體蛋白質(zhì)(heteromultimeric proteins)的方法。
背景技術(shù)：
IgG類單克隆抗體包含兩個相同的抗原結(jié)合臂和一個恒定區(qū)(Fe)。具有不同特異性的結(jié)合臂的抗體通常不天然存在，因此，必須利用化學工程(例如化學交聯(lián)等)、重組DNA和/或細胞融合技術(shù)來制備。 雙特異性抗體能夠同時結(jié)合兩個不同的抗原。該特性可以用于開發(fā)不能以常規(guī)單克隆抗體進行的治療策略。已經(jīng)開發(fā)的大量富于想象力的雙特異性抗體形式反映了對這些分子的強烈興趣。見 Berg J, Lotscher E, Steimer KS,等，“Bispecific antibodiesthat mediate killing of cells infectedwith human immunodeficiency virus of anystrain，” Proc Natl Acad SciUSA (1991) 88 (I I) : 4723-4727 以及 Fischer N 和 Leger 0·，iiBiospecificAntibodies:Molecules That Enable Novel Therapeutic Strategies, Tathobiology(2007)74:3-14o另一類多特異性分子是重組融合蛋白。由免疫調(diào)節(jié)蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域和免疫球蛋白(Ig)的恒定區(qū)(Fe)組成的重組融合蛋白代表了一類不斷增長的人類治療劑。免疫粘附素將蛋白質(zhì)序列的結(jié)合區(qū)域(具有所需特異性)與抗體的效應(yīng)結(jié)構(gòu)域組合在一起。免疫粘附素具有兩個對其作為治療劑的潛力而言有意義的重要特性靶標特異性和藥代動力學穩(wěn)定性(體內(nèi)半衰期和抗體的相當)。免疫粘附素可用作拮抗劑來抑制或阻斷有害的相互作用，或作為激動劑來模擬或增強生理反應(yīng)。見Chamow SM, Zhang DZ, Tan XY,等，“Ahumanized, bispecific immunoadhesin-antibody that retargetsCD3+effeetors tokill HIV-l-infected cells,”J Hematother 1995;4(5):439-446。其它文獻中討論了其它的多特異性分子。例子包括但不限于Fisher等，Pathobiology (2007) 74:3-14(對多種雙特異性形式的評論);美國專利號6，660，843，2003年12月9日授予Feige等(肽體p印tibodies);美國專利公開號2002-004587，2002年I月10日公開(多特異性抗體)；美國專利號7612181,2009年11月3日授予Wu 等(雙可變區(qū)形式)；美國專利號 6，534，628，Nord K 等，Prot Eng(1995)8:601-608，Nord K 等，Nat Biotech (1997) 15:772-777 和Griinwall等，Biotechnol Appl Biochem.(2008)Jun;50 (Pt 2):97-112(親合體(Affibodies)) ；Martens 等，Clin CancerRes (2006)，12:6144-6152 和 Jin 等，Cancer Res (2008) 68 (11) :4360-4368 (單臂抗體)；Bostrom等，Science (2009) 323:1610-1614 (雙功能Fab、aka混合價抗體)。其它形式為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知。對于上述多特異性分子，制備臨床級別的材料仍是一個挑戰(zhàn)。如以上所指出的，存在許多途徑可以生產(chǎn)具有混合結(jié)合臂(即互相不同的結(jié)合臂)的分子。這些方法每個都具有其自身的缺陷?；瘜W交聯(lián)是費力的，因為可能還需要將目的物從同二聚體和其它不需要的副產(chǎn)物中純化出來。此外，化學修飾步驟可以改變蛋白質(zhì)的完整性，從而導致差的穩(wěn)定性。因此，該方法常常是低效的并可能導致抗體活性的丟失。細胞融合技術(shù)(例如,雜種雜交瘤)表達兩種重鏈和兩種輕鏈,這兩條重鏈和兩條輕鏈隨機組裝，導致產(chǎn)生10種抗體組合。所需要的異源多聚體抗體僅占這樣產(chǎn)生的抗體的一小部分。對所需異源多聚體蛋白質(zhì)的純化顯著地降低了生產(chǎn)產(chǎn)量和增加制備成本。重組DNA技術(shù)已被用來產(chǎn)生多種異源多聚體形式，例如單鏈Fv、雙抗體(diabodies)等，它們不包含F(xiàn)e區(qū)。這類抗體分子的主要缺陷是缺乏Fe區(qū)和由此缺乏抗體引發(fā)效應(yīng)子功能(例如，補體激活、Fe受體結(jié)合等)的能力。因此，需要包含功能性Fe區(qū)的雙特異性抗體?！?br> 重組DNA技術(shù)也已被用來產(chǎn)生“knob into hole”雙特異性抗體。見美國專利申請20030078385 (Arathoon等-Genentech)。該策略的一個局限性是兩個親本抗體的輕鏈必須相同，以防止由于它們在相同的細胞中表達而錯配和形成不需要和/或無活性的分子。因此，仍然需要生產(chǎn)異源多聚體蛋白質(zhì)的可供選擇的方法。本文中描述的本發(fā)明提供了這樣的方法。從本文提供的對本發(fā)明的描述，本發(fā)明的這些和其它方面以及優(yōu)勢將是顯而易見的。發(fā)明簡述使用目前的技術(shù)生產(chǎn)異源多聚體蛋白質(zhì)(例如，多特異性抗體)具有缺陷，所述缺陷包括產(chǎn)生產(chǎn)品的混合物、降低的產(chǎn)量和效應(yīng)子功能的降低/消失等。因此，需要高效和高水平生產(chǎn)異源多聚體蛋白質(zhì)。通過各種手段生產(chǎn)抗體分子被廣泛熟知。例如，美國專利6331415 (Cabilly等)描述了重組生產(chǎn)免疫球蛋白的方法，其中重鏈和輕鏈從單個載體或從位于單個細胞中的兩個分開的載體同時表達。Wibbenmeyer 等(1999, Biochim Biophys Acta 1430 (2) : 191-202)以及Lee和Kwak (2003，J. Biotechnology 101:189-198)描述了使用在分開的大腸桿菌培養(yǎng)物中表達的質(zhì)粒，從分開產(chǎn)生的重鏈和輕鏈生產(chǎn)單克隆抗體。在例如Harlow等，ANTIBODIES:A LABORATORY MANUAL, Cold Spring HarborLaboratory 出版社，ColdSpring Harbor, N. Y.，(1988)和W02006028936中描述了多種其它關(guān)于抗體生產(chǎn)的技術(shù)。然而，這些方法的每一種都具有例如產(chǎn)量低、使用化學試劑等缺陷。本發(fā)明方法提供在分開的宿主細胞中表達包含鉸鏈的異源多聚體蛋白質(zhì)的每一個成分，例如抗體的一個臂，和在不添加還原劑的情況下組裝該含鉸鏈的異源多聚體蛋白質(zhì)，例如多特異性抗體。本發(fā)明提供了容易和高效的生產(chǎn)程序/方法，其允許經(jīng)濟地生產(chǎn)異源多聚體蛋白質(zhì)，例如多特異性抗體。本發(fā)明提供了生產(chǎn)多特異性免疫球蛋白復合物(例如多特異性抗體)和其它多聚體蛋白質(zhì)(在本文中統(tǒng)稱為異源多聚體蛋白質(zhì))的高效和新穎的方法，所述方法克服了傳統(tǒng)方法的局限性。根據(jù)本發(fā)明的方法，異源多聚體蛋白質(zhì)，例如雙特異性抗體，可以以高度同質(zhì)的異源多聚體多肽形式提供。此外，本文中提供的方法不依賴于添加還原劑來實現(xiàn)在異源多聚體蛋白質(zhì)中至少I個、至少2個、至少3個、至少4個鏈間二硫鍵的形成。在第一方面，本文中描述的方法允許制備異源多聚體蛋白質(zhì)，所述異源多聚體蛋白質(zhì)包含具有第一異源二聚化區(qū)域的第一含鉸鏈的多肽、和具有第二異源二聚化區(qū)域的第二含鉸鏈的多肽，其中第二異源二聚化區(qū)域與第一異源二聚化區(qū)域相互作用，且其中第一和第二含鉸鏈的多肽通過至少一個鏈間二硫鍵連接，所述方法包括以下步驟(a)培養(yǎng)包含編碼第一含鉸鏈的多肽的第一核酸的第一宿主細胞，其中在表達該含鉸鏈的多肽的條件下進行該培養(yǎng)；(b)培養(yǎng)包含編碼第二含鉸鏈的多肽的核酸的第二宿主細胞，其中在表達該含鉸鏈的多肽的條件下進行該培養(yǎng)；
(C)破壞細胞膜，以使第一和第二含鉸鏈的多肽釋放到胞外環(huán)境中，其中第一和第二宿主細胞已在單個懸浮液中組合在一起；和(d)回收異源多聚體蛋白質(zhì)，其中所述方法不需要添加還原劑。在第二方面，本發(fā)明涉及制備異源多聚體蛋白質(zhì)的方法，所述異源多聚體蛋白質(zhì)包含具有第一異源二聚化區(qū)域的第一含鉸鏈的多肽、和具有第二異源二聚化區(qū)域的第二含鉸鏈的多肽，其中第二異源二聚化區(qū)域與第一異源二聚化區(qū)域相互作用，且其中第一和第二含鉸鏈的多肽通過至少一個鏈間二硫鍵連接，所述方法包括以下步驟(a)提供純化的具有第一異源二聚化區(qū)域的第一含鉸鏈的多肽；(b)提供純化的具有第二異源二聚化區(qū)域的第二含鉸鏈的多肽；(C)將第一和第二含鉸鏈的多肽組合；(d)使第一含鉸鏈的多肽與第二含鉸鏈的多肽重折疊；和(e)回收異源多聚體蛋白質(zhì)復合物。在第三方面，本文中提供的方法涉及制備異源多聚體蛋白質(zhì)的方法，所述方法包括孵育第一對免疫球蛋白重鏈和輕鏈多肽和第二對免疫球蛋白重鏈和輕鏈多肽，其中孵育條件允許該第一對和第二對多肽多聚化以形成基本同質(zhì)的抗體群體，其中該條件不包括添加還原劑；其中第一對多肽能夠結(jié)合第一靶標；其中第二對多肽能夠結(jié)合第二靶標分子；其中第一重鏈多肽的Fe多肽與第二重鏈多肽的Fe多肽在交界面上相遇，第二 Fe多肽的界面包含突起，所述突起可置入第一 Fe多肽界面的腔洞中。在第四方面，本發(fā)明提供了產(chǎn)生異源多聚體蛋白質(zhì)的組合文庫的方法，所述異源多聚體蛋白質(zhì)包含具有第一異源二聚化區(qū)域的第一含鉸鏈的多肽、和具有第二異源二聚化區(qū)域的第二含鉸鏈的多肽，其中第二異源二聚化區(qū)域與第一異源二聚化區(qū)域相互作用，且其中第一和第二含鉸鏈的多肽通過至少一個鏈間二硫鍵連接，所述方法包括以下步驟(a)培養(yǎng)第一宿主細胞和至少兩種另外的宿主細胞，其中a.所述第一宿主細胞包含第一核酸，所述第一核酸編碼包含第一異源二聚化區(qū)域的多肽；和b.所述另外的宿主細胞包含核酸，所述核酸編碼包含第二異源二聚化區(qū)域的多肽，(b)將第一宿主細胞和該至少兩種另外的宿主細胞混合；(C)處理細胞，以使包含第一和第二異源二聚化區(qū)域的多肽釋放到胞外環(huán)境中；和(d)回收異源多聚體蛋白質(zhì)，其中所述方法不需要添加還原劑。在第五方面，本發(fā)明提供了通過本文中描述的方法產(chǎn)生的異源多聚體蛋白質(zhì)。應(yīng)理解的是，本發(fā)明的方法可以包括對起始和/或完成本文所描述的本發(fā)明方法所包括的步驟而言顯而易見的其它步驟，這些步驟通常是常規(guī)步驟。例如，在一個實施方案中，于本發(fā)明方法的步驟(a)之前加上一個步驟，在該步驟中，將編碼第一含鉸鏈的多肽的核酸引入到第一宿主細胞中，和將編碼第二含鉸鏈的多肽的核酸引入到第二宿主細胞中。在一個實施方案中，本發(fā)明的方法另外還包括純化異源多聚體蛋白質(zhì)的步驟，所述異源多聚體蛋白質(zhì)具有與至少兩個不同靶標的結(jié)合特異性。在一個實施方案中，在純化異源多聚 體蛋白質(zhì)步驟之前，不超過約10%、15%或20%的分離的多肽以單體或重鏈-輕鏈二聚體的形式存在。在一個實施方案中，第一和/或第二含鉸鏈的多肽是抗體重鏈。在另一個實施方案中，抗體重鏈與抗體輕鏈配對形成重鏈-輕鏈對。在一些實施方案中，重鏈-輕鏈對是共價連接的。在另一個實施方案中，重鏈-輕鏈對規(guī)定靶標結(jié)合臂。在一些實施方案中，靶標結(jié)合臂是相同的。在一些實施方案中，靶標結(jié)合臂各自識別兩個不同的靶標。在一些實施方案中，第一和/或第二含鉸鏈的多肽包含F(xiàn)e區(qū)。在另一個實施方案中，第一和/或第二含鉸鏈的多肽包含至少一個重鏈恒定區(qū)。在另一個實施方案中，第一和/或第二含鉸鏈的多肽包含重鏈可變區(qū)。在另一個實施方案中，第一和/或第二含鉸鏈的多肽包含受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域。在另一個實施方案中，第一和/或第二含鉸鏈的多肽是基本相同的(即，異源二聚化區(qū)域可以是不同的，而異源二聚化區(qū)域以外的區(qū)域是相同的)。在一些實施方案中，第一和/或第二含鉸鏈的多肽是不同的。在一些實施方案中，異源多聚體蛋白質(zhì)選自抗體、雙特異性抗體、多特異性抗體、單臂抗體、單特異性單價抗體、多特異性單價抗體、雙特異性maxibody、monobody、免疫粘附素、肽體(peptibody)、雙特異性肽體、單價肽體、親和體(affibody)和受體融合蛋白。在一些實施方案中，所述異源多聚體蛋白質(zhì)包含鉸鏈區(qū)，所述鉸鏈區(qū)具有通常能夠形成重鏈間二硫鍵的半胱氨酸殘基，該半胱氨酸殘基為至少I個、至少2個、至少3個、至少4個、或任何整數(shù)個(多達所有)。在一些實施方案中，鉸鏈區(qū)中已經(jīng)引入了額外的半胱氨酸。本發(fā)明的異源多聚體蛋白質(zhì)也可以是抗體片段，例如Fe或Fe融合多肽，只要其包含免疫球蛋白的鉸鏈區(qū)即可。Fe融合多肽通常包含與異源多肽序列(例如抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域)融合的Fe多肽(或其片段)，例如受體胞外結(jié)構(gòu)域(ECD)與免疫球蛋白Fe多肽融合(例如，F(xiàn)lt受體E⑶與IgG2Fc融合)。例如，在一個實施方案中，F(xiàn)e融合多肽包含VEGF結(jié)合結(jié)構(gòu)域，所述VEGF結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以是VEGF受體，包括flt、flk等。本發(fā)明的異源多聚體蛋白質(zhì)通常包含重鏈恒定區(qū)和輕鏈恒定區(qū)。在一個實施方案中，本發(fā)明的異源多聚體蛋白質(zhì)包含用于形成重鏈間二聚體化或多聚體化的修飾(例如但不限于，插入一個或多個氨基酸，以例如形成二聚體化序列例如亮氨酸拉鏈等)。在一些實施方案中，本發(fā)明的異源多聚體可以缺失Fe多肽的部分(但不是全部)，條件是其保留免疫球蛋白的鉸鏈區(qū)。在一些這樣的實施方案中，F(xiàn)e多肽的缺失序列是 2和/*CH3結(jié)構(gòu)域的部分或全部。在這樣的實施方案的一些中，異源多聚體蛋白質(zhì)包含，例如與重鏈片段的C末端融合的，二聚體化結(jié)構(gòu)域(例如亮氨酸拉鏈序列)。在這些實施方案的一些中，異源多聚體蛋白質(zhì)包含二聚體化結(jié)構(gòu)域，所述二聚體化結(jié)構(gòu)域包含突變以提供“knob into hole”二聚體化結(jié)構(gòu)域(下文中進一步定義)。在本發(fā)明的方法和異源多聚體蛋白質(zhì)的一些實施方案中，含鉸鏈的多肽具有至少一個這樣的特征，所述特征促進第一和第二含鉸鏈的多肽的異源多聚體化而最大程度降低同源二聚體化(例如，在重鏈的Fe多肽之間)。這樣的特征提高通過本文中描述的本發(fā)明方法可以得到的異源多聚體蛋白質(zhì)群體的產(chǎn)量和/或純度和/或同質(zhì)性。在一個實施方案中，第一含鉸鏈的多肽和第二含鉸鏈的多肽的Fe多肽在界面處相遇/相互作用。在一些實施方案中，其中第一和第二含鉸鏈的多肽的Fe多肽在界面上相遇，第二 Fe多肽的界面包含突起，所述突起可置入第一 Fe多肽界面的腔洞中。在一個實施方案中，第一 Fe多肽相對于模板/原始多肽已經(jīng)被改變以編碼腔洞，或第二 Fe多肽相對于模板/原始多肽已經(jīng)被改變以編碼突起，或者兩者均發(fā)生。在一個實施方案中，第一 Fe多肽相對于模板/原始多肽已經(jīng)被改變以編碼腔洞，且第二 Fe多肽相對于模板/原始多肽已經(jīng)被改變以編碼突起，或者 兩者均發(fā)生。在一個實施方案中，第二 Fe多肽的界面包含突起，所述突起可置入第一 Fe多肽界面的腔洞中，其中該腔洞或突起或兩者是分別已經(jīng)引入到第一和第二 Fe多肽的界面中的。在一些實施方案中，其中第一和第二 Fe多肽在界面上相遇，第一 Fe多肽的界面包含突起，所述突起可置入第二 Fe多肽界面的腔洞中。在一個實施方案中，第二 Fe多肽相對于模板/原始多肽已經(jīng)被改變以編碼腔洞，或第一 Fe多肽相對于模板/原始多肽已經(jīng)被改變以編碼突起，或兩者均發(fā)生。在一個實施方案中，第二 Fe多肽相對于模板/原始多肽已經(jīng)被改變以編碼腔洞，且第一 Fe多肽相對于模板/原始多肽已經(jīng)被改變以編碼突起，或兩者均發(fā)生。在一個實施方案中，第一 Fe多肽的界面包含突起，所述突起可置入第二 Fe多肽界面的腔洞中，其中該突起或腔洞或兩者是分別已經(jīng)引入到第一和第二 Fe多肽的界面中的。在一個實施方案中，突起和腔洞都包含天然存在的氨基酸殘基。在一個實施方案中，通過將模板/原始多肽界面的原始殘基替代為比原始殘基具有大的側(cè)鏈體積的輸入殘基，產(chǎn)生包含突起的Fe多肽。在一個實施方案中，通過包括以下步驟的方法來產(chǎn)生包含突起的Fe多肽，在所述步驟中，所述多肽界面的原始殘基的編碼核酸，用具有比原始殘基大的側(cè)鏈體積的輸入殘基的編碼核酸替代。在一個實施方案中，原始殘基是蘇氨酸。在一個實施方案中，輸入殘基是精氨酸(R)。在一個實施方案中，輸入殘基是苯丙氨酸(F)。在一個實施方案中，輸入殘基是酪氨酸(Y)。在一個實施方案中，輸入殘基是色氨酸(W)。在一個實施方案中，輸入殘基是R、F、Y或W。在一個實施方案中，通過置換模板/原始多肽中的兩個或更多個殘基來產(chǎn)生突起。在一個實施方案中，包含突起的Fe多肽包含以色氨酸對位置366的蘇氨酸的取代,氨基酸編號根據(jù)Kabat等(Sequences of proteins of immunologicalinterest,第 5 版，卷 I (1991;NIH, Bethesda, MD)中第 688-696 頁)的 EU 編號方案進行。在一些實施方案中，通過以比原始殘基具有小的側(cè)鏈體積的輸入殘基置換模板/原始多肽界面中的原始殘基，產(chǎn)生包含腔洞的Fe多肽。例如，可以通過包括這樣的步驟的方法來產(chǎn)生包含腔洞的Fe多肽，在所述步驟中，以比原始殘基具有小的側(cè)鏈體積的輸入殘基的編碼核酸，置換所述多肽界面的原始殘基的編碼核酸。在一個實施方案中，原始殘基是蘇氨酸。在一個實施方案中，原始殘基是亮氨酸。在一個實施方案中，原始殘基是酪氨酸。在一個實施方案中，輸入殘基不是半胱氨酸(C)。在一個實施方案中,輸入殘基是丙氨酸(A)。在一個實施方案中,輸入殘基是絲氨酸(S)。在一個實施方案中,輸入殘基是蘇氨酸(T)。在一個實施方案中，輸入殘基是纈氨酸(V)?？梢酝ㄟ^置換模板/原始多肽的一個或多個原始殘基來產(chǎn)生腔洞。例如，在一個實施方案中，包含腔洞的Fe多肽包含對兩個或更多個原始氨基酸的置換，所述原始氨基酸選自蘇氨酸、亮氨酸和酪氨酸。在一個實施方案中，包含腔洞的Fe多肽包含兩個或更多個輸入殘基，所述輸入殘基選自丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和纈氨酸。在一些實施方案中，包含腔洞的Fe多肽包含對兩個或更多個原始氨基酸的置換，所述原始氨基酸選自蘇氨酸、亮氨酸和酪氨酸，且其中以選自丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和纈氨酸的輸入殘基置換所述原始氨基酸。在一個實施方案中，包含腔洞的Fe多肽包含以絲氨酸對366位的蘇氨酸的置換，氨基酸編號根據(jù)Kabat等(同上引文)的EU編號方案進行。在一個實施方案中，包含腔洞的Fe多肽包含以丙氨酸對第368位的亮氨酸的置換，氨基酸編號根據(jù)Kabat等(同上)的EU編號方案進行。在一個實施方案中，包含腔洞的Fe多肽包含以纈氨酸對第407位的酪氨酸的置換，氨基酸編號根據(jù)Kabat等(同上)的EU編號方案進行。在一個實施方案中，包含腔洞的Fe多肽包含兩個或多個氨基酸置換，所述置換選自T366S、L368A和Y407V，氨基酸編號根據(jù)Kabat等(同上)的EU編號方案進行。在 這些抗體片段的一些實施方案中，包含突起的Fe多肽包含以色氨酸對第366位的蘇氨酸的置換，氨基酸編號根據(jù)Kabat等(同上)的EU編號方案進行。在多個實施方案中，第一和第二重鏈多肽的Fe多肽可以相同或可以不同，條件是它們能夠二聚體化形成Fe區(qū)域(如本文中定義的)。第一 Fe多肽通常在單個多肽中與免疫球蛋白重鏈的一個或多個結(jié)構(gòu)域毗鄰連接，例如與鉸鏈區(qū)、恒定區(qū)和/或可變區(qū)序列連接。在一個實施方案中，第一 Fe多肽包含鉸鏈序列的至少一部分(包括全部)、Ch2結(jié)構(gòu)域的至少一部分(包括全部)和/或Ch3結(jié)構(gòu)域的至少一部分(包括全部)。在一個實施方案中，第一 Fe多肽包含免疫球蛋白的鉸鏈序列以及Ch2和Ch3結(jié)構(gòu)域。在一個實施方案中，第二 Fe多肽包含鉸鏈序列的至少一部分(包括全部)、G2結(jié)構(gòu)域的至少一部分(包括全部)和/或Ch3結(jié)構(gòu)域的至少一部分(包括全部)。在一個實施方案中，第二 Fe多肽包含免疫球蛋白的鉸鏈序列以及Ch2和Ch3結(jié)構(gòu)域。在一個實施方案中，本發(fā)明的抗體包含第一和第二 Fe多肽，其各自包含至少一個抗體恒定區(qū)的至少一部分。在一個實施方案中，該抗體恒定區(qū)是Ch2和/或(^3結(jié)構(gòu)域。在包含恒定區(qū)的本發(fā)明抗體的任何實施方案中，抗體恒定區(qū)可以來自任何類型的免疫球蛋白，例如IgG。該免疫球蛋白來源可以為任何合適的物種來源(例如，IgG可以是人IgG1)或可以是合成的。在一個實施方案中，分別在本發(fā)明抗體的第一和第二靶標分子結(jié)合臂中的第一輕鏈多肽和第二輕鏈多肽包含不同/截然不同的抗原結(jié)合決定簇(例如，不同/截然不同的可變區(qū)序列)。在一個實施方案中，分別位于本發(fā)明抗體的第一和第二靶標分子結(jié)合臂中的第一輕鏈多肽和第二輕鏈多肽包含相同的(即，共同的)抗原結(jié)合決定簇(例如，相同的可變區(qū)序列)。本發(fā)明的方法能夠產(chǎn)生高同質(zhì)性的異源多聚體分子。據(jù)此，本發(fā)明提供了這樣的方法，其中至少約 40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%的多肽是包含第一重鏈和輕鏈多肽對和第二重鏈和輕鏈多肽對的復合物。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了這樣的方法，其中約60至99%、70至98%、75至97%、80至96%、85至96%、或90至95%的多肽是包含第一重鏈和輕鏈多肽對和第二重鏈和輕鏈多肽對的復合物。在一個實施方案中，本發(fā)明的抗體選自IgG、IgE、IgA、IgM和IgD。在一些實施方案中，本發(fā)明抗體的鉸鏈區(qū)優(yōu)選是選自IgG、IgA和IgD的免疫球蛋白的。例如，在一些實施方案中，抗體或抗體的鉸鏈區(qū)是IgG的，在一些實施方案中是IgGl或IgG2(例如IgG2a或IgG2b)。在一些實施方案中，本發(fā)明的抗體選自IgG、IgA和IgD。在一個實施方案中，抗體是人、人源化的、嵌合的或非人(例如鼠)來源的。本發(fā)明的異源多聚體蛋白質(zhì)通常能夠與抗原結(jié)合，優(yōu)選特異性結(jié)合。這樣的抗原包括例如腫瘤抗原、細胞存活調(diào)節(jié)因子、細胞增殖調(diào)節(jié)因子、與組織發(fā)育或分化相關(guān)(例如，已知或推測在功能上起作用)的分子、細胞表面分子、淋巴因子、細胞因子、涉及細胞周期調(diào)控的分子、涉及脈管發(fā)生的因子和與血管發(fā)生相關(guān)(例如，已知或推測在功能上起作用)的分子。能夠與本發(fā)明的異源多聚體蛋白質(zhì)結(jié)合的抗原可以是上述類別之一的子類的成員，其中所述類別的其它子類包括具有不同特征(相對于目的抗原而言)的其它分子/抗原。目的抗原也可以被認為屬于兩個或更多個類別。在一個實施方案中，本發(fā)明提·供了結(jié)合，優(yōu)選特異性結(jié)合，腫瘤抗原的異源多聚體蛋白質(zhì)，所述腫瘤抗原不是細胞表面分子。在一個實施方案中，腫瘤抗原是細胞表面分子，例如受體多肽。在另一個實例中，在一些實施方案中，本發(fā)明的異源多聚體蛋白質(zhì)結(jié)合，優(yōu)選特異性結(jié)合，腫瘤抗原，所述腫瘤抗原不是分化群因子。在另一個實例中，本發(fā)明的異源多聚體蛋白質(zhì)能夠結(jié)合，優(yōu)選特異性結(jié)合，分化群因子，所述分化群因子在一些實施方案中不是例如CD3或CD4。在一些實施方案中，本發(fā)明的異源多聚體蛋白質(zhì)是抗VEGF抗體。在一些實施方案中，本發(fā)明的異源多聚體蛋白質(zhì)是雙特異性抗體，選自 IL-I a/IL-I β、IL-12/IL-18 ;IL-13/IL_9 ;IL-13/IL_4 ；IL-13/IL-5 ；IL-5/IL-4 ;IL-13/IL_1β ;IL-13/IL_25 ;IL_13/TARC;IL_13/MDC ;IL_13/MEF ；IL-13/TGF-^ ;IL_13/LHR 激動劑；IL-12/TWEAK, IL-13/CL25 ;IL_13/SPRR2a ;IL_13/SPRR2b ;IL-13/ADAM8、IL-13/PED2、IL17A/IL17F、CD3/CD19、CD138/CD20 ；CD138/CD40 ；CD19/CD20 ;CD20/CD3 ;CD38/CD138 ;CD38/CD20 ;CD38/CD40 ;CD40/CD20 ;CD-8/IL_6 ；CD20/BR3、TNFa /TGF-β、TNFa /IL-I β ;TNFa /IL-2、TNFa /IL-3、TNFa /IL-4、TNFa /IL-5、TNFa /IL6、TNFa /IL8、TNFa /IL-9、TNFa /IL-10、TNFa /IL-IU TNFa /IL-12、TNF a /IL-13、TNF a /IL-14、TNF a /IL-15、TNF a /IL-16、TNF a /IL-17、TNF a /IL-18、TNF a /IL-19、TNF a /IL-20、TNF a /IL-23、TNF a /IFN a , TNF a /CD4、TNF a /VEGF、TNF a /MIF、TNF a /ICAM-I、TNF a /PGE4、TNF a /PEG2、TNF a /RANK 配體、TNF a /Te38 ；TNF a /BAFF ；TNF a /CD22 ;TNFa /CTLA-4 ；TNFa /GP130 ;TNF a /IL_12p40 ;VEGF/HER2、VEGF-A/HER2、VEGF-A/PDGF、HER1/HER2、VEGF-A/VEGF-C、VEGF-C/VEGF-D、HER2/DR5、VEGF/IL-8、VEGF/MET、VEGFR/MET 受體、VEGFR/EGFR、HER2/CD 64、HER2/CD3、HER2/CD16、HER2/HER3 ；EGFR/HER2、EGFR/HER3、EGFR/HER4、IL-13/CD40L、IL4/CD40L、TNFR1/IL-1R、TNFR1/IL-6R、TNFR1/IL-18R、EpCAM/CD3、MAPG/CD28、EGFR/CD64、CSPGs/RGM A ;CTLA_4/BTN02 ；IGF1/IGF2 ；IGFl/2/Erb2B ；MAG/RGM A ；NgR/RGM A ；NogoA/RGMA ；0MGp/RGM A ;PDL-I/CTLA_4 JPRGM A/RGM B、ILlβ /1L18,NRPI/VEGFA,VEGFA/NRP2,cMET/EGFR,ALKI/BMP9,VEGFA/a 5 β UHERl/HER3-BU和CMV。在一些實施方案中，本發(fā)明的異源多聚體蛋白質(zhì)與至少兩個靶標分子結(jié)合，所述靶標分子選自α 5β 1、ALK1、BMP9、IL-1 a ,IL-I β、TARC、MDC、MEF、TGF-β、LHR 激動劑、TWEAK、CL25、SPRR2a、SPRR2b、ADAM8、PED2、CD3、CD4、CD16、CD19、CD20、CD22、CD28、CD40、CD38、CD64、CD138、CD-8, BR3、TNFa、TGF-β、IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6、IL-8、IL-9、IL-10、IL-IU IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-17A、IL-17F、IL-18,IL-19、IL-20、IL-23、IL-25、IFN a、MIF、ICAM_1、PGE4、PEG2、RANK 配體、Te38、BAFF、CTLA_4、GP130、IL-12p40、VEGF、VEGF-A, PDGF, HER1、HER2、HER3、HER3-BU、HER4、VEGF-C, VEGF-D,DR5、cMET、MET、MET 受體、VEGFR、EGFR、CD40L、TNFRl、IL-1R、IL-6R、IL-18R、EpCAM、MAPG、CSPGs, BTN02、IGFl、IGF2、IGF1/2、Erb2B、MAG、NgR、NogoA、NRP1、NRP2、OMGp, PDL-I, RGMA和RGM B0在一些實施方案中，本發(fā)明的異源多聚體蛋白質(zhì)與⑶3和至少一個另外的靶標分子結(jié)合，所述另外的靶標分子選自BLR1、BR3、CD19、CD20、CD22、CD72、CD79A、CD79B、CD180 (RP105)、CR2、FcRHl、FcRH2、FcRH5、FCER2、FCRL4、HLA-DOB 和 NAG14。可以在任何允許目的多肽表達和分離的環(huán)境下培養(yǎng)本發(fā)明方法的第一和第二宿主細胞。例如，在一個實施方案中，本發(fā)明方法的第一宿主細胞和第二宿主細胞作為分開的細胞培養(yǎng)物來生長。在另一個實施方案中，本發(fā)明方法的第一宿主細胞和第二宿主細胞作為包含這兩種宿主細胞的混合培養(yǎng)物來生長。 在一些實施方案中，至少I種、至少2種、至少3種或更多種表達另外的含鉸鏈多肽的宿主細胞可以與第一和/或第二含鉸鏈的宿主細胞，在相同的或分開的培養(yǎng)物中生長。在一些實施方案中，另外的含鉸鏈多肽包含與第一含鉸鏈多肽相同的異源二聚化區(qū)域。在一些實施方案中，另外的含鉸鏈多肽包含與第二含鉸鏈多肽相同的異源二聚化區(qū)域?？梢詫Ξ愒炊嗑垠w蛋白質(zhì)進行修飾以增強和/或添加另外所需特性。這樣的特性包括生物學功能，例如免疫效應(yīng)子功能、期望的體內(nèi)半衰期/清除率、生物利用度、生物分布或其它藥代動力學特性。這樣的修飾在本領(lǐng)域公知，也可以憑經(jīng)驗來確定，其可以包括通過可以基于肽或不基于肽的結(jié)構(gòu)部分進行的修飾。例如，抗體可以是糖基化或非糖基化的，這通常至少部分取決于宿主細胞的性質(zhì)。優(yōu)選，本發(fā)明的抗體是非糖基化的。通過本發(fā)明方法產(chǎn)生的非糖基化抗體隨后可以例如使用本領(lǐng)域公知的體外糖基化方法進行糖基化。如上文所述，可以在原核細胞例如大腸桿菌中生產(chǎn)本發(fā)明的異源多聚體蛋白質(zhì)。大腸桿菌產(chǎn)生的異源多聚體蛋白質(zhì)通常是非糖基化的，缺乏與哺乳動物宿主細胞(例如CH0)產(chǎn)生的異源多聚體蛋白質(zhì)中的糖基化譜通常相關(guān)的生物學功能。本發(fā)明還提供了免疫綴合物，所述免疫綴合物包含與異源部分綴合的本發(fā)明的異源多聚體蛋白質(zhì)。任何異源部分，只要其與抗體的綴合不顯著降低抗體的所需功能和/或特性，都將是適宜的。例如，在一些實施方案中，免疫綴合物包含細胞毒性劑作為異源部分。在一些實施方案中，所述細胞毒性劑選自放射性同位素、化學治療劑和毒素。在一些實施方案中，所述毒素選自加利車霉素(calichemicin)、美登素(maytansine)和單端孢素(trichothene)。在一些實施方案中，免疫綴合物包含的異源部分是可檢測標記。在一些實施方案中，所述可檢測標記選自放射性同位素、配體-受體對的成員、酶-底物對的成員和熒光共振能量轉(zhuǎn)移對的成員。在一個方面，本發(fā)明提供了組合物，所述組合物包含本發(fā)明的異源多聚體蛋白質(zhì)和載體，所述載體在一些實施方案中是藥學上可接受的。在另一個方面，本發(fā)明提供了組合物，所述組合物包含本文中描述的免疫綴合物和載體，所述載體在一些實施方案中是藥學上可接受的。在一個方面，本發(fā)明提供了組合物，所述組合物包含本發(fā)明的多特異性異源多聚體蛋白質(zhì)群體。對本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，通常，這樣的組合物不會是完全(即100%)同質(zhì)的。然而，如本文中所描述的，本發(fā)明的方法能夠生產(chǎn)基本同質(zhì)的多特異性異源多聚體蛋白質(zhì)群。例如，本發(fā)明提供了組合物，所述組合物包含異源多聚體蛋白質(zhì)，其中所述異源多聚體蛋白質(zhì)的至少 40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%,99%是本文中描述的本發(fā)明的多特異性抗體(例如雙特異性抗體等)。在一個方面，本發(fā)明提供了細胞培養(yǎng)物，所述細胞培養(yǎng)物包含第一宿主細胞和第二宿主細胞的混合物，其中第一宿主細胞包含第一含鉸鏈多肽的編碼核酸，第二宿主細胞包含第二含鉸鏈多肽的編碼核酸，其中這兩對多肽具有不同的靶標結(jié)合特異性。在一個方面，本發(fā)明提供了細胞培養(yǎng)物，所述細胞培養(yǎng)物包含第一宿主細胞和第二宿主細胞的混合物，其中第一宿主細胞表達第一對重鏈和輕鏈多肽，第二宿主細胞表達第二對重鏈和輕鏈多肽，其中這兩對多肽具有不同的靶標結(jié)合特異性。在另一個方面，本發(fā)明提供了制品，所述制品包括容器和其中包含的組合物，其中 組合物包含本發(fā)明的異源多聚體蛋白質(zhì)(例如抗體)。在另一個方面，本發(fā)明提供了制品，所述制品包括容器和其中包含的組合物，其中組合物包含本文中描述的免疫綴合物。在一些實施方案中，這些制品還包括使用所述組合物的說明書。在另一個方面，本發(fā)明提供了多核苷酸，所述多核苷酸編碼本發(fā)明的異源多聚體蛋白質(zhì)。在另一個方面，本發(fā)明提供了多核苷酸，所述多核苷酸編碼本文中描述的免疫綴合物。在一個方面，本發(fā)明提供了用于表達本發(fā)明分子(例如抗體)的重組載體。在另一個方面，本發(fā)明提供了用于表達本發(fā)明的免疫綴合物的重組載體。多種宿主細胞都可以用于本發(fā)明方法中。這樣的宿主細胞在本領(lǐng)域已知(本文中描述了其中的一些)，或可以經(jīng)驗性地使用本領(lǐng)域已知的常規(guī)技術(shù)就其用于本發(fā)明方法的適宜性進行確定。在一個實施方案中，宿主細胞是原核的。在一些實施方案中，宿主細胞是革蘭氏陰性細菌細胞。在一個實施方案中，宿主細胞是大腸桿菌(E. coli)。在一些實施方案中，大腸桿菌是脂蛋白缺陷型(AlPP)菌株。在一些實施方案中，大腸桿菌宿主細胞的基因型缺乏degP和prc基因，攜帶突變spr基因。在一個實施方案中，宿主細胞是哺乳動物，例如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞。在一個方面，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明多核苷酸或重組載體的宿主細胞。在一個實施方案中，宿主細胞是哺乳動物細胞，例如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞。在一個實施方案中，宿主細胞是原核細胞。在一些實施方案中，宿主細胞是革蘭氏陰性細菌細胞，其在一些實施方案中是大腸桿菌。本發(fā)明的宿主細胞可以還包含編碼這樣的分子的多核苷酸或重組載體，所述分子在宿主細胞中的表達增強本發(fā)明方法中異源多聚體蛋白質(zhì)的產(chǎn)量。例如，這樣的分子可以是伴侶蛋白。在一個實施方案中，所述分子是原核多肽，其選自DsbA、DsbC、DsbG和FkpA。在一些實施方案中，所述多核苷酸或重組載體編碼DsbA和DsbC兩者。在一些實施方案中，大腸桿菌宿主細胞是內(nèi)源蛋白酶活性缺陷型菌株。在一些實施方案中，大腸桿菌宿主細胞的基因型是缺乏degP和prc基因并攜帶突變的spr基因的大腸桿菌菌株的基因型。在一些實施方案中，大腸桿菌宿主細胞的基因型是Λ1ΡΡ。本發(fā)明的異源多聚體蛋白質(zhì)具有用于多種情況中的多種用途。在一個實例中，本發(fā)明的異源多聚體蛋白質(zhì)是治療性抗體。在另一個實例中，本發(fā)明的異源多聚體蛋白質(zhì)是激動劑抗體。在另一個實例中，本發(fā)明的異源多聚體蛋白質(zhì)是拮抗劑抗體。本發(fā)明的異源多聚體蛋白質(zhì)也可以是診斷性抗體。在另一個實例中，本發(fā)明的異源多聚體蛋白質(zhì)是封閉抗體。在另一個實例中，本發(fā)明的異源多聚體蛋白質(zhì)是中和抗體。在一個方面，本發(fā)明提供了治療或延緩受試者疾病的方法，所述方法包括給所述受試者施用本發(fā)明的異源多聚體蛋白質(zhì)。在一個實施方案中，所述疾病是癌癥。在另一個實施方案中，所述疾病與血管發(fā)生的失調(diào)相關(guān)。在另一個實施方案中，所述疾病是免疫失調(diào)，例如類風濕性關(guān)節(jié)炎、免疫性血小板減少性紫癜、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等。在一個方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明的異源多聚體蛋白質(zhì)(例如，抗體)在制備藥物中的應(yīng)用，所述藥物用于疾病的治療和/或預(yù)防，所述疾病例如癌癥、腫瘤、細胞增殖失調(diào)、免疫(例如自身免疫)失調(diào)和/或血管發(fā)生相關(guān)失調(diào)。在一個方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明的核酸在制備藥物中的應(yīng)用，所述藥物用于疾病的治療和/或預(yù)防，所述疾病例如癌癥、腫瘤、細胞增殖失調(diào)、免疫(例如自身免疫)失調(diào)和/或血管發(fā)生相關(guān)失調(diào)。在一個方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明的表達載體在制備藥物中的應(yīng)用，所述藥物用于疾病的治療和/或預(yù)防，所述疾病例如癌癥、腫瘤、細胞增殖失調(diào)、免疫(例如自身免疫)失調(diào)和/或血管發(fā)生相關(guān)失調(diào)。在一個方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明的宿主細胞在制備藥物中的應(yīng)用，所述藥物用于疾病的治療和/或預(yù)防，所述疾病例如癌癥、腫瘤、細胞增殖失調(diào)、免疫(例如自身免疫)失調(diào)和/或血管發(fā)生相關(guān)失調(diào)。在一個方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明的制品在制備藥物中的應(yīng)用，所述藥物用于疾病的治療和/或預(yù)防，所述疾病例如癌癥、腫瘤、細胞增殖失調(diào)、免疫(例如自身免疫)失調(diào)和/或血管發(fā)生相關(guān)失調(diào)。在一個方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明的套盒在制備藥物中的應(yīng)用，所述藥物用于疾病的治療和/或預(yù)防，所述疾病例如癌癥、腫瘤、細胞增殖失調(diào)、免疫(例如自身免疫)失調(diào)和/或血管發(fā)生相關(guān)失調(diào)。 通過以下詳細描述，本發(fā)明的其它目的、特征和優(yōu)勢將變得顯而易見。然而，應(yīng)理解的是，該詳細描述和具體實例，盡管指出本發(fā)明的優(yōu)選實施方案)，但僅作為舉例說明性目的而提供，本領(lǐng)域技術(shù)人員從該詳細描述將明了落入本發(fā)明的范圍和精神內(nèi)的各種改變和變化。附圖簡述圖IA圖示完全氧化的半抗體。沒有顯示“鼓突”(knob)或“洞”(hole)或其它異源二聚化區(qū)域。該圖中描述的半抗體是IgGl同種型。本領(lǐng)域技術(shù)人員將明了，可以將其它免疫球蛋白同種型看成具有相應(yīng)的鏈間和鏈內(nèi)鍵的半抗體。在完整的Ab中，鉸鏈半胱氨酸將形成鏈間二硫鍵。圖IB圖示全長雙特異性抗體。沒有描繪鉸鏈區(qū)中重鏈間二硫鍵。圖2A和B分別圖示編碼鼓突和洞半抗體的質(zhì)粒。圖3A圖示使用共同輕鏈方法生產(chǎn)異源多聚體蛋白質(zhì)，例如雙特異性抗體。所生產(chǎn)的BsAb具有兩條不同的重鏈，每條重鏈分別與共同輕鏈配對。圖3B圖示使用分開構(gòu)建和表達的半抗體生產(chǎn)異源多聚體蛋白質(zhì)，例如雙特異性抗體。所生產(chǎn)的BsAb典型地具有兩條不同的重鏈，每條重鏈各自與其關(guān)聯(lián)(cognate)輕鏈配對。在該方法中，各半抗體的各輕鏈不必相同。圖4A是使用分開構(gòu)建和表達的半抗體生產(chǎn)雙特異性抗體的流程圖。在該方法中，使用了氧化還原化學。圖4B顯示了考馬斯染色的凝膠。通過SDS-PAGE在還原和非還原條件下分析兩個半抗體。在非還原條件下，主要級分是每個半抗體的75kD輕鏈-重鏈對。在還原條件下(例如，以DTT處理)，每條鏈作為分開的條帶可見。圖4C顯示，在用和不用ImM N-乙基馬來酰亞胺(NEM)處理時，半抗體的ESI-TOF質(zhì)譜結(jié)果。在用NEM處理后，沒有觀察到半抗體質(zhì)量的改變，表明所有的半胱氨酸被完全氧化。在所描述的氨基酸序列中，將氧化的鉸鏈半胱氨酸表示為環(huán)狀二硫鍵。半抗體的預(yù)期質(zhì)量是72，548道爾頓，這也是通過質(zhì)譜觀察到的，表示沒有共價加合物?！?br> 圖4D顯示抗EGFR/抗c_met雙特異性抗體產(chǎn)生的羧甲基(CM)色譜、SDS-PAGE凝膠照片和去褶合后的質(zhì)量。CM色譜產(chǎn)生單個峰，隨后以SDS-PAGE對該峰進行分析。凝膠上的主要條帶是全長(即，完整的)雙特異性抗體。在75kD處也可以看見弱帶。隨后以質(zhì)譜對主要條帶進行分析，表明該唯一的可檢測完整抗體產(chǎn)物與抗EGFR/抗c-met雙特異性抗體的理論麗一致。圖5A是使用分開構(gòu)建和表達的半抗體大規(guī)模生產(chǎn)雙特異性抗體的流程圖。圖5B是凝膠照片，其顯示純化的半抗體在非還原條件下主要是約75kD物質(zhì)。在還原條件下(即，以DTT處理)，每條鏈作為分開的條帶可見。圖5C顯示在去除聚集物后純化的雙特異性抗體的SDS-PAGE分析結(jié)果，表明主要物是在150kD的完整雙特異性抗體。也顯示了在還原條件下的相同樣品，其表明，所有分離的產(chǎn)物是抗體輕鏈或重鏈。圖6A圖示在TF-2細胞增殖試驗中抗體的生物學活性，所述試驗檢查對細胞因子IL-4和IL-13的中和作用。該圖顯示，雙特異性抗體具有與一起或分開添加的兩個由哺乳動物生產(chǎn)的全長抗體相同的活性。圖6B是一組3個圖，其顯示，對于野生型Fe和突變Fe，通過ELISA測定的食蟹猴(cynomologous monkey)中抗IL-4/抗IL-13雙特異性抗體的藥代動力學(PK)性質(zhì)。第一圖顯示，對于野生型Fe，在2mg/kg劑量的PK特性。中間的圖顯示在20mg/kg劑量的PK特性，也針對野生型Fe。最后一個圖顯示，對于突變Fe，在20mg/kg劑量的PK特性。在測試的動物中，雙特異性抗體表現(xiàn)出預(yù)期的雙室清除。封閉的符號表示雌性，開放的符號表示雄性。在三個動物中，觀察到了抗治療劑反應(yīng)，表現(xiàn)為在第21天血清中測量到的抗體的急劇降低。圖7是聚丙烯酰胺凝膠照片。在裂解前，以變化的比率混合全發(fā)酵肉湯。在裂解后，提取蛋白質(zhì)，并在非還原條件下上樣到凝膠上。在該過程中形成的純化的雙特異性抗體作為在凝膠頂部的條帶可見。圖8A是兩塊聚丙烯酰胺凝膠的照片，其比較了在將表達半抗體的細胞分開培養(yǎng)和共培養(yǎng)時雙特異性抗體的產(chǎn)生。在共培養(yǎng)條件下，完整的雙特異性抗體的形成水平要高得多。當將半抗體分別表達和純化后再混合時，半抗體形成低于5%的完整雙特異性抗體。在共培養(yǎng)條件下，使用Li-Core蛋白質(zhì)測定法，按照150kD/(150kD+75kD)進行測定，高于40%的是完整的雙特異性抗體。
圖8B是改變起始接種的細胞群體的共培養(yǎng)實驗示意圖。在圖的底部顯示了所使用的比率和全長雙特異性抗體的相對量。圖8C是針對I: I細胞比率的抗EGFR和抗c_Met的3個分開的10升發(fā)酵反應(yīng)的凝膠圖。每個反應(yīng)均產(chǎn)生全長雙特異性抗體作為主產(chǎn)物，表明該過程的可重復性。圖8D是用于生產(chǎn)異源多聚體蛋白質(zhì)例如雙特異性抗體的共培養(yǎng)方法的流程圖。圖8E是280nm處UV吸收色譜，其鑒定出了在滯留時間91. 79和102. 35處的兩個顯著的峰。隨后的質(zhì)譜分析表明，完整的雙特異性抗體與過量的半抗體有效地分開。圖8F顯示通過SDS-PAGE和質(zhì)譜對來自圖8E的峰91. 79進行的分析。質(zhì)譜數(shù)據(jù)的去褶合產(chǎn)生在146，051. 89道爾頓處的單個峰，這與雙特異性抗體的預(yù)期質(zhì)量一致。沒有檢測到污染的同二聚體種類。圖SG比較用于異源多聚體蛋白質(zhì)的獨立生產(chǎn)和共培養(yǎng)生產(chǎn)的工作流程。圖9A顯示3個色譜圖。頂部的色譜圖顯示在不含EDTA的樣品洗脫期間無吸收峰。中間的色譜圖顯示含EDTA的樣品具有明顯的洗脫峰，從該峰中回收了約I. 5mg蛋白質(zhì)。底部的色譜圖顯示以EDTA和Mg處理的樣品也表現(xiàn)出類似的洗脫峰，從該峰中回收了 I. Img蛋白質(zhì)。在還原和非還原條件下，以SDS-PAGE，分析了從EDTA樣品、EDTA加Mg樣品回收的蛋白質(zhì)、以及來自未EDTA處理的樣品的相同滯留時間的級分的合并物。圖9B是圖9A中所描述的SDS-PAGE凝膠的照片。以EDTA處理的樣品產(chǎn)生了完整的雙特異性抗體，所述抗體已經(jīng)被釋放到了培養(yǎng)基中。圖9C-1、圖9C-2和圖9C-3顯示圖9A中回收和描述的樣品的質(zhì)譜圖。含EDTA的樣品顯示出了雙特異性抗體的預(yù)期質(zhì)量和過量的半抗體的質(zhì)量。圖9D是所指條帶的SDS-PAGE凝膠圖和質(zhì)譜圖。第I泳道是MW標記，第2泳道是獨立表達的抗IL-13，第3泳道是獨立表達的抗IL-4，第4泳道是兩種細胞的共培養(yǎng)。所有三個樣品的質(zhì)譜分析顯示，共培養(yǎng)產(chǎn)生完整的雙特異性抗體和過量的一種半抗體，抗IL-4。這表明抗IL-13半抗體是化學計量限制性的。當將半抗體分別表達和純化后再混合，半抗體形成約2%(抗IL-13)和3%(抗IL-4)的完整雙特異性抗體。在共培養(yǎng)條件下，使用Li-Core蛋白質(zhì)測定法，以150kD/(150kD+75kD)測定，約60%為完整的雙特異性抗體。圖9E-1和圖9E-2顯示在起始發(fā)酵接種物中具有所示不同細胞比率的兩個共培養(yǎng)物的兩個HIC色譜。觀察到了產(chǎn)物的明顯不同，這反映了起始接種物的比率。使用該方法，顯而易見的是，可以通過改變起始接種物的比率來實現(xiàn)異源多聚體蛋白質(zhì)的最優(yōu)生產(chǎn)。圖9F是一組4個圖片，其顯示在還原和非還原條件下，對通過本文中描述的共培養(yǎng)方法生產(chǎn)的8個不同的雙特異性抗體，進行的SDS-PAGE分析。沒有顯示抗⑶3/抗⑶19異源多聚體蛋白質(zhì)在非還原條件下的凝膠。箭頭指示完整的雙特異性抗體。

圖10是篩選異源多聚體蛋白質(zhì)的矩陣方法的示意圖。圖11的兩個圖顯示使用本文中描述的方法生產(chǎn)的雙特異性抗體的體外活性。圖12圖示抗EGFR/抗c-met雙特異性抗體在KP4胰腺異種移植物體內(nèi)模型中擁有抗腫瘤活性。圖13圖示抗EGFR/抗c-met雙特異性抗體在A431鱗狀細胞癌異種移植物體內(nèi)模型中擁有抗腫瘤活性。
圖14顯示A)組裝前鼓突、B)組裝前洞、C)組裝后雙特異性抗體的HIC。圖14D是組裝前的每個臂的凝膠。圖15顯示組裝后物質(zhì)的電泳圖，表明86%的物質(zhì)是完全氧化的。圖16 :對組裝的雙特異性抗體的表征。A)退火的(annealed)雙特異性抗體的HIC色譜，其表明物質(zhì)中多于90. 5%的是雙特異性抗體，B)最終樣品的質(zhì)譜去褶合，C)純化后的物質(zhì)的凝膠圖，和D)理論質(zhì)量表。圖17是氧化還原程序(有加熱)的示意圖a)將樣品加熱I小時以允許二硫鍵環(huán)化，b)然后冷卻和使用2mM DTT還原半胱氨酸2小時，和c)然后濃縮和通過室溫進行透
析來空氣氧化半胱氨酸。圖18是氧化還原程序(無加熱)的示意圖a)將樣品混合2個小時，b)使用2mM DTT還原半胱氨酸2小時，和c)然后濃縮、和通過室溫進行透析來除去EDTA，同時空氣氧化
半胱氨酸。圖19 :對組裝的雙特異性抗體的分析，A)使用有加熱步驟的氧化還原程序的HIC色譜，B)使用無加熱步驟的氧化還原程序的HIC色譜?？s略詞ADCC=抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(Antibody-dependentcelInediatedcytotoxicity)API=抗病原體免疫粘附素(Anti-pathogen immunoadhesins)BPI=殺細菌/通透性增加蛋白(Bactericidal/permeability-increasingprotein)Clq=補體因子 Iq (Complement factor lq)CD=分化群 Cluster of Differentiation)CDC=補體依賴性細胞毒性 Complement-dependent cytotoxicity)CHl 或 ChI=重鏈第 I 恒定區(qū)(Heavy chain first constant domain)CH2 或 Ch2=重鏈第 2 恒定區(qū)(Heavy chain second constant domain)CH3 或 CH3=重鏈第 3 恒定區(qū)(Heavy chain third constant domain)CH4 或 CH4=重鏈第 4 恒定區(qū)(Heavy chain fourth constant domain)CL 或 C1=輕鏈恒定區(qū)(Light chain constant domain)CTLA=細胞毒性 T 淋巴細胞相關(guān)分子(Cytotoxic Tlymphocyte-associatedmolecule)Fc=可結(jié)晶片段(Fragment crystallizable)Fe γ R=IgG 的 Fe 部分的 Y 受體(Receptor gamma for the Fe portion of IgG)HIV=人類免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus)ICAM=細胞間粘附分子(Intercellular adhesion molecule)BsAb=雙特異性抗體(Bispecific antibody)BsDb=雙特異性雙抗體(Bispecific diabody)dsFv= 二硫鍵穩(wěn)定的 Fv(Disulde-stabilized Fv)Fc=抗體的恒定片段(Constant fragment of an antibody)Fd=抗體的 VH+CH1 (VH+CHlof an antibody)FcR=Fc 受體(Fe receptor)
Fv=抗體的可變片段(Variable fragment of an antibody)IgG=免疫球蛋白 G(Immunoglobulin G)mAb=單克隆抗體(Monoclonal antibody)PBL=外周血淋巴細胞(Peripheral blood lymphocyte)scDb=單鏈雙抗體(Single-chain diabody)scFv=單鏈 Fv (Single-chain Fv)(scFv) 2=scFv-scFv 串聯(lián)物(scFv-scFv tandem)Tandab=串聯(lián)雙抗體(Tandem diabody) VH 或 Vh =抗體重鏈的可變區(qū)(Variable domain of the heavy chain ofanantibody )VL 或 V1=抗體輕鏈的可變區(qū)(Variable domain of the light chain ofanantibody)發(fā)明詳述現(xiàn)使用以下定義和實施例，以舉例說明的方式，詳細描述本發(fā)明。通過參考引用的方式明確地并入本文所提及的所有專利和出版物，包括這些專利和出版物中公開的所有序列。除非在本文中另有定義，本文中使用的所有技術(shù)和科學術(shù)語均具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域中技術(shù)人員所通常理解的含義。Singleton等，Dictionary ofMicrobiology andMolecular Biology, 2d Ed. , John Wiley 和 Sons, NewYork (1994)，以及Hale和Marham, TheHarper Collins Dictionary ofBiology, Harper Perennial, NY(1991)為技術(shù)人員提供了有關(guān)本發(fā)明使用的許多術(shù)語的一般詞典。本文描述了優(yōu)選的方法和材料，但在實施或測試本發(fā)明中可以使用與本文中所描述的方法和材料類似或相同的任何方法和材料。數(shù)值范圍涵蓋定義該范圍的數(shù)值。除非另有說明，核酸按5’至3’方向從左到右書寫；氨基酸按氨基至羧基方向從左到右書寫。關(guān)于本領(lǐng)域的定義和術(shù)語，實施者尤其可以參考Samtoook等，1989，和Ausubel FM等，1993。應(yīng)理解的是，本發(fā)明不限于所描述的具體方法、操作程序和試劑，因為它們是可以改變的。數(shù)值范圍涵蓋定義該范圍的數(shù)值。除非另有說明，核酸按5’至3’方向從左到右書寫；氨基酸按氨基至羧基方向從左到右書寫。對于本發(fā)明的各個方面和實施方案，本文中提供的標題并不對其構(gòu)成限制，而是可以參考說明書整體而獲得。因此，以下定義的術(shù)語通過參考說明書整體，獲得更全面的定義。I.定義“異源多聚體”、“異源多聚體復合物”或“異源多聚體蛋白質(zhì)”指包含至少第一含鉸鏈的多肽和第二含鉸鏈的多肽的分子，其中第二含鉸鏈的多肽與第一含鉸鏈的多肽在氨基酸序列上至少有一個氨基酸殘基的不同。異源多聚體可以包括由第一和第二含鉸鏈的多肽形成的“異源二聚體”，或在除了第一和第二含鉸鏈的多肽之外還存在其它多肽時，可以形成更高級的三級結(jié)構(gòu)。異源多聚體的多肽可以通過非肽共價鍵(例如二硫鍵)和/或非共價相互作用(例如，氫鍵、離子鍵、范德華力和/或疏水性相互作用)而在彼此之間發(fā)生相互作用。本文中所使用的“異源多聚化結(jié)構(gòu)域”指，對生物學分子進行改變和添加，以促進異源多聚體的形成和阻礙同源多聚體的形成。具有強烈的形成異二聚體而非同二聚體的傾向的任何異源二聚化結(jié)構(gòu)域均涵蓋在本發(fā)明范圍內(nèi)。舉例說明性例子包括但不限于，例如美國專利申請20030078385 (Arathoon等-Genentech;描述了鼓突位于洞中)；W02007147901 (Kjaergaard等-Novo Nordisk:描述了離子相互作用)；WO 2009089004 (Kannan等-Amgen:描述了靜電引導效應(yīng))；美國臨時專利申請61/243, 105 (Christensen 等-Genentech;描述了卷曲螺旋)。也見，例如 Pa ck, P.和Plueckthun, A. , Biochemistry 31, 1579-1584 (1992)描述了亮氨酸拉鏈，或 Pack 等,Bio/Technology 11, 1271-1277(1993)描述了螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋基序。在本文中，表述“異源多聚化結(jié)構(gòu)域”和“異源二聚化結(jié)構(gòu)域”可互換使用。本文中使用的短語“含鉸鏈的多肽”指這樣的多肽，其包含相應(yīng)于本領(lǐng)域中所理解的免疫球蛋白鉸鏈區(qū)的區(qū)域，例如重鏈ChI和Ch2區(qū)之間的區(qū)域。本文中使用的“鉸鏈區(qū)”、“鉸鏈序列”和它們的變體包括本領(lǐng)域已知的含義，該含義在例如Janewayj s Immunobiology, (Garland Science,Taylor& Francis Group, LLC, NY)(第 7 版，2008);Bloom 等，Protein Science (1997), 6:407-415;Humphreys 等，J.Immunol. Methods (1997)，209:193-202 中進行了說明。也見，例如 Burton, Molec.Immunol. 22:161-206 (1985)以及 Papadea,C.和 I·J.Check (1989) “Humanimmunoglobulin Gand immunoglo bulin G su bclasses:biochemical, genetic,andclinicalaspects. 〃Crit Rev Clin Lab Sci 27(1):27_58。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道，氨基酸的數(shù)量以及可用于形成鏈間二硫鍵的半胱氨酸殘基的數(shù)量在不同類和同種型的免疫球蛋白之間是不同的。所有這些鉸鏈區(qū)均可以用于含鉸鏈的多肽中，落入本發(fā)明范圍內(nèi)。本文中的術(shù)語“抗體”按最廣義使用，指包含兩個重鏈和兩個輕鏈的任何免疫球蛋白(Ig)分子，以及其任何片段、突變體、變體或衍生物，只要該片段、突變體、變體或衍生物表現(xiàn)出所需要的生物學活性(例如，表位結(jié)合活性)即可?？贵w的例子包括本文中描述的單克隆抗體、多克隆抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)和抗體片段。抗體可以是人的、人源化的和/或親和力成熟的。作為一個參考，本文中使用的抗體指免疫球蛋白G(IgG)的結(jié)構(gòu)。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解/認識到，任何免疫球蛋白類別的抗體都可以用于本文中描述的本發(fā)明方法中。清楚地講，IgG分子包含一對相同的重鏈(HCs)和一對相同的輕鏈(LCs)。每個LC具有一個可變區(qū)(\)和一個恒定區(qū)(Cl)，而每個HC具有一個可變區(qū)(Vh)和3個恒定區(qū)(CH1, Ch2和Ch3)。ChI和Ch2區(qū)通過鉸鏈區(qū)相連接。該結(jié)構(gòu)在本領(lǐng)域公知。參見圖IB。本文中使用的“半抗體”指與一個免疫球蛋白輕鏈結(jié)合的一個免疫球蛋白重鏈。圖IA中描繪了示例性半抗體。本領(lǐng)域技術(shù)人員將容易理解，半抗體也可以具有由單個可變區(qū)組成的抗原結(jié)合區(qū)。術(shù)語“maxibody”指包含與Fe多肽融合的scFv的融合蛋白。參見W02009089004的圖8a。關(guān)于雙特異性maxibody，參見WO 2009089004的圖2。根據(jù)EU編號系統(tǒng)，術(shù)語人IgG Fe區(qū)的“Ch2區(qū)”通常從IgG的約231位殘基延伸到約340位殘基。該(^2區(qū)是獨特的，因為其不與別的區(qū)域緊密配對。相反地，兩個N連接的分支碳水化合物鏈介于完整的天然IgG分子的兩個CH2區(qū)之間。具推測，該碳水化合物可能提供對結(jié)構(gòu)域-結(jié)構(gòu)域配對的替代，和幫助穩(wěn)定Ch2區(qū)。Burton, Molec.Immunol. 22:161-206(1985)。術(shù)語“Ch3區(qū)”包括Fe區(qū)中位于Ch2區(qū)C端的該殘基鏈(即，根據(jù)EU編號系統(tǒng)，從IgG的約第341位氨基酸殘基至約第447位氨基酸殘基)。本文中使用的術(shù)語“Fe區(qū)”通常指包含免疫球蛋白重鏈C端多肽序列的二聚體復合物，其中C端多肽序列是可通過以木瓜蛋白酶消化完整的抗體而獲得的多肽序列。Fe區(qū)可以包含天然的或變異的Fe序列。盡管免疫球蛋白重鏈的Fe序列的界限可以變化，人IgG重鏈Fe序列通常被定義為從約位置Cys226或從約位置Pro230的氨基酸殘基延伸到Fe序列的羧基末端。除非本文另有說明，F(xiàn)e區(qū)或恒定區(qū)中的氨基酸殘基的編號是根據(jù)EU編號系統(tǒng)來進行的，EU編號系統(tǒng)也稱為EU索引，其描述于Kabat等，Sequences of Proteinsof Immunological Interest,第 5版.Public HealthService, National Institutes ofHealth, Bethesda, MD, 1991中。免疫球蛋白的Fe序列通常包含兩個恒定區(qū)，即CH2區(qū)和CH3 區(qū)，和可選地包含(^4區(qū)。本文中，“ Fe多肽”意指組成Fe區(qū)的多肽之一，例如單體Fe。Fe多肽可以從任何合適的免疫球蛋白例如IgGl、IgG2、IgG3或IgG4亞類，IgA、IgE、IgD或IgM獲得。Fe區(qū)包含通過二硫鍵而被抓在一起的兩個H鏈的羧基端部分?？贵w的效應(yīng)子功能由Fe區(qū)中的序列決定；該區(qū)也是存在于某些類型細胞中的Fe受體(FcR)所識別的部分。在一些實施方案中，F(xiàn)e多肽(通常在其N端)包含野生型鉸鏈序列的部分或全部。在一些實施方案中，F(xiàn)e多肽不包含功能性或野生型鉸鏈序列?！肮δ苄訤e區(qū)”擁有天然序列Fe區(qū)的“效應(yīng)子功能”。示例性“效應(yīng)子功能”包括Clq結(jié)合；CDC; Fe受體結(jié)合；ADCC;吞噬作用；細胞表面受體(例如B細胞受體；BCR)的下調(diào)，等。這樣的效應(yīng)子功能通常需要Fe區(qū)與結(jié)合區(qū)(例如抗體可變區(qū))組合，并可以使用例如在本文的定義中公開的多種測定試驗來進行評估?！疤烊恍蛄蠪e區(qū)”包含與天然發(fā)現(xiàn)的Fe區(qū)的氨基酸序列相同的氨基酸序列。天然序列人Fe區(qū)包括天然序列人IgG1Fc區(qū)(非A和A同種異型)；天然序列人IgG2Fc區(qū)；天然序列人IgG3Fc區(qū)；和天然序列人IgG4Fc區(qū)，以及它們的天然存在的變體?！白凅wFe區(qū)”包含由于至少一個氨基酸的改變，優(yōu)選一個或多個氨基酸置換，而與天然序列Fe區(qū)不同的氨基酸序列。優(yōu)選地，與天然序列Fe區(qū)或親本多肽的Fe區(qū)相比較，變體Fe區(qū)具有至少一個氨基酸置換，例如在天然序列Fe區(qū)或親本多肽的Fe區(qū)中約I個至約10個氨基酸置換，優(yōu)選約I個至5個氨基酸置換。本文中的變體Fe區(qū)與天然序列Fe區(qū)和/或與親本多肽的Fe區(qū)優(yōu)選具有至少約80%的同源性，和更優(yōu)選具有至少約90%的同源性，更優(yōu)選具有至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%的同源性。本文中使用的“Fe組分”指Fe區(qū)的鉸鏈區(qū)、Ch2區(qū)或CH3區(qū)。在某些實施方案中，含鉸鏈的多肽包含IgG Fe區(qū)，優(yōu)選來自野生型人IgG Fe區(qū)?！耙吧汀比薎gG Fe意指在人類群體內(nèi)天然存在的氨基酸序列。當然，正如Fe序列在個體間可以稍微不同一樣，對野生型序列可以進行一個或多個改變而仍然落入本發(fā)明的范圍內(nèi)。例如，F(xiàn)e區(qū)可以包含與本發(fā)明不相關(guān)的另外改變，例如糖基化位點的突變或非天然氨基酸的納入。術(shù)語“可變區(qū)”或“可變結(jié)構(gòu)域”指抗體重鏈或輕鏈中參與抗體與抗原結(jié)合的結(jié)構(gòu)域。天然抗體的重鏈和輕鏈的可變區(qū)(分別以％和'表示)通常具有相似的結(jié)構(gòu)，每個結(jié)構(gòu)域包含4個保守的構(gòu)架區(qū)(FRs)和3個超變區(qū)(HVRs)。見例如，Kindt等.KubyImmunology,第 6 版，W. H. Freeman andCo.，第 91 頁(2007)。單個 Vh 或 Vl 區(qū)足以賦予抗原結(jié)合特異性。此外，可以使用來自結(jié)合抗原的抗體的VH或VL區(qū)，分別篩選互補的VL或VH區(qū)的文庫,分離結(jié)合特定抗原的抗體。見例如,Portolano等，J. Immunol. 150:880-887 (1993);Clarkson 等，Nature 352:624-628 (1991)。本文中使用的術(shù)語“Fab”指抗體的抗原結(jié)合片段。如上所述，可以使用木瓜蛋白酶消化完整的抗體?？贵w經(jīng)木瓜蛋白酶消化后產(chǎn)生兩個相同的抗原結(jié)合片段，即“Fab”片段，和殘余的“Fe”片段(即Fe區(qū)，同上)。Fab片段由一條完整的L鏈與一條重鏈的可變區(qū)和該H鏈(Vh)的第一恒定區(qū)(ChI)組成。本文中使用的短語“抗原結(jié)合臂”、“靶標分子結(jié)合臂”、“靶標結(jié)合臂”以及它們的變體，指本發(fā)明的異源多聚體蛋白質(zhì)的組成部分，其具有特異性結(jié)合目的靶標的能力。通常和優(yōu)選地，抗原結(jié)合臂是免疫球蛋白多肽序列，例如免疫球蛋白輕鏈和重鏈的CDR和/或可變區(qū)序列，的復合物。·“靶標”或“靶標分子”指異源多聚體蛋白質(zhì)的結(jié)合臂所識別的結(jié)構(gòu)部分。例如，如果異源多聚體蛋白質(zhì)是抗體，則根據(jù)情況，靶標可以是單個分子上或不同分子上的表位、或病原體或腫瘤細胞。類似地，如果異源多聚體蛋白質(zhì)是受體-Fe融合蛋白，則靶標將是該受體的關(guān)聯(lián)結(jié)合配偶體。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道，靶標由靶標結(jié)合臂的結(jié)合特異性決定，不同的靶標結(jié)合臂可以識別不同的靶標。靶標優(yōu)選以高于IuM Kd的親和力(根據(jù)斯卡查德(scatchard)分析)，與本發(fā)明的異源多聚體蛋白質(zhì)結(jié)合。靶標分子的實例包括但不限于血清可溶性蛋白質(zhì)和/或它們的受體，例如細胞因子和/或細胞因子受體、粘附素、生長因子和/或它們的受體、激素、病毒顆粒(例如，RSV F蛋白、CMV、StaphA、流感病毒、C型肝炎病毒)、微生物(例如，細菌細胞蛋白、真菌細胞)、粘附素、CD蛋白和它們的受體?！巴暾被颉叭L”抗體的一個例子是包含抗原結(jié)合臂以及Q和至少重鏈恒定區(qū)
的抗體。這些恒定區(qū)可以是天然序列恒定區(qū)(例如人天然序列恒定區(qū))或其氨基酸序列變體。本文中使用的術(shù)語“偶聯(lián)”指，將第一和第二含鉸鏈的多肽彼此連接起來，例如形成共價鍵，所需要的步驟。這樣的步驟可以包括對第一和第二含鉸鏈的多肽中的半胱氨酸殘基進行的還原、退火和/或氧化，以形成鏈間二硫鍵。偶聯(lián)可以通過化學交聯(lián)或使用氧化還原體系來實現(xiàn)。見例如，Humphreys 等,J. Tmmunol. Methods (1998) 217:1-10 和 Zhu等，CancerLett.，(1994)86:127-134。術(shù)語“多特異性抗體”按其最廣義使用，尤其涵蓋具有多表位特異性的抗體。這樣的多特異性抗體包括但不限于包含重鏈可變區(qū)(Vh)和輕鏈可變區(qū)(')的抗體，其中該Vh'單元具有多表位特異性；具有兩個或多個\和Vh區(qū)的抗體，每個Vh'單元與不同的表位結(jié)合；具有兩個或更多個單可變區(qū)的抗體，每個單可變區(qū)與不同的表位結(jié)合；全長抗體，抗體片段，例如Fab、Fv、dsFv、scFv,雙抗體(diabodies),雙特異性雙抗體和三抗體(triabodies),已共價或非共價連接在一起的抗體片段?！岸啾砦惶禺愋浴敝概c相同或不同靶標上的兩個或更多個不同的表位特異性結(jié)合的能力?！皢翁禺愋浴敝竷H與一個表位結(jié)合的能力。根據(jù)一個實施方案，多特異性抗體是IgG抗體，其與每個表位以5μ M至O. OOlpM、3 μ M至 O. 001ρΜ、1 μ M 至 O. 001ρΜ、0· 5 μ M至 O. ΟΟΙρΜ、或 O. I μ M 至 O. OOlpM 的親和力結(jié)合。
圖IB提供了雙特異性的示意圖?！翱贵w片段”包括完整抗體的部分，優(yōu)選完整抗體的抗原結(jié)合區(qū)或可變區(qū)。抗體片段的實例包括Fab、Fab’、F(ab’ )jPFv片段；雙抗體(Db);串聯(lián)雙抗體(taDb);線性抗體(例如美國專利號 5，641，870; Zapata 等，Protein Eng. 8 (10) : 1057-1062 (1995));單臂抗體；單可變區(qū)抗體；微型抗體；單鏈抗體分子；以及從抗體片段形成的多特異性抗體(例如，包括但不限于 Db-Fc、taDb-Fc、taDb_CH3 和(scFV) 4_Fc)。表述“單域抗體”(sdAbs)或“單可變區(qū)(SVD)抗體”通常指其中的單個可變區(qū)(Vh或')能夠賦予抗原結(jié)合的抗體。換句話說，單可變區(qū)不需要通過與另一個可變區(qū)相互作用來識別靶標抗原。單域抗體由每個抗原結(jié)合臂上的單個單體可變抗體區(qū)(％或\)組成。單域抗體的實例包括那些源自駝科動物(美洲駝和駱駝)和軟骨魚(例如護士鯊)的抗體和那些通過重組方法來自人和小鼠抗體的抗體(Ward等，Nature (1989) 341:544-546; Dooley 和 Flajnik,Dev Comp Immunol(2006) 30:43-56;MuyIdermans 等,TrendBiochemSci(2001) 26:230-235;Holt 等，Trends Biotechnol (2003) :21 :484-490;WO2005/035572; WO 03/035694; Davies 和 Riechmann, Febs Lett (1994) 339:285-290; W000/29004;WO 02/051870)。單可變區(qū)抗體可以和其它不是單域抗體的可變區(qū)或可變結(jié)構(gòu)域一起存在于抗原結(jié)合臂中(例如，同源或異源多聚體)。表述“線性抗體”通常指描述于 Zapata 等，Protein Eng. 8 (10) : 1057-1062 (1995)中的抗體。簡單地說，這些抗體包含一對串聯(lián)的Fd片段(VH-CH1-VH-CH1)，其與互補的輕鏈多肽一起形成一對抗原結(jié)合區(qū)。線性抗體可以是雙特異性的或單特異性的。本文中所提及的術(shù)語“鼓突入洞”(“knob-into-hole”)或“KnH”技術(shù)指，在體外或體內(nèi)引導兩個多肽配對到一起的技術(shù)，其通過在兩多肽相互作用的界面上，將突起(鼓突)弓丨入到一個多肽中和將腔(洞)引入到另一多肽中而實現(xiàn)。例如，已經(jīng)將KnHs引入到了抗體的Fe:Fe 結(jié)合界面、Cl:ChI 界面或 Vh/\界面中(例如，US2007/0178552, WO 96/027011, WO98/050431 和 Zhu 等·(1997)Protein Science 6:781-788)。這對于在多特異性抗體的制備過程中促使兩個不同的重鏈配對到一起特別有用。例如，在其Fe區(qū)具有KnH的多特異性抗體可以進一步包括與每個Fe區(qū)連接的單可變區(qū)，或進一步包括與類似的或不同的輕鏈可變區(qū)配對的不同重鏈可變區(qū)。KnH技術(shù)也可以用于將兩個不同的受體胞外區(qū)配對到一起或使包含不同靶標識別序列的任何其它多肽序列(例如，包括親和體、肽體和其它Fe融合體)配對?！癋v”為一個重鏈可變區(qū)和一個輕鏈可變區(qū)以緊密、非共價結(jié)合的方式形成的二聚體。由這兩個區(qū)域的折疊生出6個超變環(huán)(3個環(huán)來自H鏈，3個環(huán)來自L鏈)，所述超變環(huán)貢獻用于抗原結(jié)合的氨基酸殘基和賦予抗體對抗原的結(jié)合特異性。然而，即使是單可變區(qū)(或包含僅3個對抗原特異的CDRs的Fv的一半，)也具有識別和結(jié)合抗原的能力，盡管其通常以比完整結(jié)合位點低的親和力進行結(jié)合?！皢捂淔v”(也縮寫為“sFv”或“scFv”)是包含連接到單個多肽鏈中的Vh和Vl抗體區(qū)的抗體片段。優(yōu)選地，sFv多肽還包含VH和VL區(qū)之間的多肽接頭，所述接頭使sFv形成用于抗原結(jié)合所需的結(jié)構(gòu)。關(guān)于sFv的綜述,參見Pluckthun, The Pharmacology ofMonoclonal Antibodies,第 113 卷,Rosenburg 和 Moore 編輯,Springer-Verlag, NewYork,第 269-315 頁(1994) ;Malmborg 等，J. Immunol. Methods 183:7-13,1995。術(shù)語“雙抗體”(“diabodies”)指小的抗體片段，其通過構(gòu)建在VH和VL區(qū)之間具有短接頭(約5-10個殘基)的sFv片段(見上述段落)來制備，其中該短接頭使得所述V區(qū)發(fā)生鏈間而不是鏈內(nèi)配對，從而形成二價片段，即具有兩個抗原結(jié)合位點。雙特異性雙抗體是兩個“交叉” sFv片段的異二聚體，其中兩個抗體的VH和VL區(qū)存在于不同的多肽鏈上。雙抗體更詳細地描述于例如EP 404, 097; WO 93/11161;和Hollinger等，Proc. Natl.Acad. Sci. USA 90:6444-6448(1993)中。術(shù)語“單臂抗體”指這樣的抗體，其包含(I)通過肽鍵與包含CH2區(qū)、CH3區(qū)或CH2-CH3區(qū)的多肽連接的可變區(qū)，和⑵第二 CH2、CH3或CH2-CH3區(qū)，其中可變區(qū)與包含第二CH2XH3或CH2-CH3區(qū)的多肽不通過肽鍵連接。在一個實施方案中，單臂抗體包含3個多肽(I)包含可變區(qū)(例如VH)、CH1, CH2和CH3的第一多肽，⑵包含可變區(qū)(例如Vl)和Q區(qū)的第二多肽，以及(3)包含CH2和CH3區(qū)的第三多肽。在另一個實施方案中，單臂抗體具有部分鉸鏈區(qū)，所述鉸鏈區(qū)包含兩個半胱氨酸殘基，它們形成連接恒定重鏈的二硫鍵。在一個 實施方案中，單臂抗體的可變區(qū)形成抗原結(jié)合區(qū)。在另一個實施方案中，單臂抗體的可變區(qū)是單可變區(qū)，其中每個單可變區(qū)都是抗原結(jié)合區(qū)。在另一個實施方案中，單臂抗體是單可變區(qū)抗體。本發(fā)明的抗體可以是“嵌合”抗體，其中重鏈和/或輕鏈的一部分與來自特定物種或?qū)儆谔囟贵w類別或亞類的抗體中的對應(yīng)序列相同或同源，而鏈的其余部分與來自另一個物種或?qū)儆诹硪粋€抗體類別或亞類的抗體中的對應(yīng)序列相同或同源；本發(fā)明的抗體可以是這樣的嵌合抗體的片段，只有它們表現(xiàn)出所需的生物學活性(美國專利號4，816，567;和Morrison 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984))。本文中有用的嵌合抗體包括含有來自非人靈長類動物(例如，舊大陸猴、猿等)的可變區(qū)抗原結(jié)合序列和人恒定區(qū)序列的靈長類化抗體。非人(例如嚙齒類動物)抗體的“人源化”形式是包含來自非人抗體的最小量序列的嵌合抗體。就大部分而言，人源化抗體是人免疫球蛋白(受體抗體)，其中受體的超變區(qū)的殘基被具有所需抗體特異性、親和力和能力的來自小鼠、大鼠、兔子或非人靈長類動物等非人物種的抗體(供體抗體)的超變區(qū)的殘基置換。在一些例子中，人免疫球蛋白的構(gòu)架區(qū)(FR)殘基被相應(yīng)的非人殘基置換。此外，人源化抗體可以包含受體抗體和供體抗體中沒有的殘基。進行這些改變以進一步精細化抗體的性能。一般來說，人源化抗體將包含至少一個和通常兩個可變區(qū)的基本上全部，其中所有或基本上所有的超變環(huán)對應(yīng)于非人免疫球蛋白的，而所有或基本上所有的FRs是人免疫球蛋白序列的。人源化抗體可選地還可以包含至少一部分免疫球蛋白恒定區(qū)(Fe)，通常是人免疫球蛋白的恒定區(qū)。更多詳情見Jones等，Nature321:522-525(1986);Riechmann 等,Nature 332:323-329 (1988);和 Presta, Curr.Op.Struct.Biol. 2:593-596(1992)?！半捏w”指隨機產(chǎn)生的肽與Fe區(qū)的融合體。見美國專利號6，660，843，2003年12月9日授予Feige等(就其全部內(nèi)容通過參考引用的方式并入本文)。它們包括一個或多個肽連接到N末端、C末端、氨基酸側(cè)鏈或這些位點的多個上。肽體技術(shù)使得能夠設(shè)計并入了靶向一個或多個配體或受體的肽、腫瘤導航肽(tumor-homing peptide)、膜轉(zhuǎn)運肽等的治療齊U。已證明肽體技術(shù)在許多這樣的分子的設(shè)計中有用，包括線性和二硫鍵約束的肽、“串聯(lián)肽多聚體”(即，多個肽在Fe區(qū)的單鏈上)。見例如，美國專利號6，660，843;美國專利申請?zhí)?003/0195156, 2003 年 10 月 16 日公布(對應(yīng)于 W002/092620, 2002 年 11 月 21 日公布)；美國專利申請?zhí)?003/0176352，2003年9月18日公布(對應(yīng)于WO 03/031589，2003年4月17日公布);美國系列號09/422，838，1999年10月22日串請(對應(yīng)于WO 00/24770，2000年5月4日公布);美國專利申請?zhí)?003/0229023，2003年12月11日公布；W003/057134, 2003年7月17日公布；美國專利申請?zhí)?003/0236193，2003年12月25日公布(對應(yīng)于PCT/US04/010989，2004年4月8日申請)；美國系列號10/666，480, 2003年9月18日申請(對應(yīng)于WO 04/026329，2004年4月I日公布)，其每一項均就其全部內(nèi)容通過參考引用的方式并入本文。“親和體”指使用通過肽鍵與Fe區(qū)連接的蛋白質(zhì)，其中蛋白質(zhì)用作支架以提供靶標分子的結(jié)合表面。所述蛋白質(zhì)通常是天然存在的蛋白質(zhì)，例如葡萄球菌A蛋白或IgG結(jié)合性B結(jié)構(gòu)域，或來自它們的Z蛋白(見Nilsson等(1987), Prot Eng I, 107-133,和美國專利號5，143，844)或它們的片段或衍生物。例如，可以從具有改變的靶標分子結(jié)合親和力的Z蛋白變體來產(chǎn)生親和體，其中通過隨機誘變，對Z蛋白的一段進行突變，以產(chǎn)生能夠結(jié)合靶標分子的變體的文庫。親和體的實例包括美國專利號6，534，628，Nord K等，Prot·Eng 8:601-608(1995)和 Nord K 等，Nat Biotech 15:772-777 (1997) · Biotechnol ApplBiochem. 2008Jun;50(Pt 2):97_112。本文中使用的術(shù)語“免疫粘附素”指這樣的分子，其組合了異源蛋白質(zhì)(“粘附素”)的結(jié)合特異性和免疫球蛋白恒定區(qū)的效應(yīng)子功能。在結(jié)構(gòu)上，免疫粘附素包含具有所需結(jié)合特異性的氨基酸序列與免疫球蛋白恒定區(qū)序列(例如，IgG的CH2和/或CH3序列)的融合，其中所述氨基酸序列不是抗體的抗原識別和結(jié)合位點(即，其與抗體的恒定區(qū)是“異源的”)。示例性粘附素序列包括這樣的連續(xù)氨基酸序列，所述氨基酸序列包含與目的蛋白質(zhì)結(jié)合的受體或配體的一部分。粘附素序列也可以是與目的蛋白質(zhì)結(jié)合的序列但不是受體或配體序列(例如，肽體中的粘附素序列)?？梢酝ㄟ^多種方法選擇或鑒定這樣的多肽序列，所述方法包括噬菌體展示技術(shù)和高通量分選技術(shù)。免疫粘附素中的免疫球蛋白恒定區(qū)可以獲自任何免疫球蛋白，例如IgGU IgG2、IgG3或IgG4亞類，IgA(包括IgAl和IgA2)、IgE、IgD 或 IgM0本文中使用的“復合物”或“復合的”指兩個或更多個分子的締合，其中這些分子通過不是肽鍵的鍵和/或作用力(例如，范德華力、疏水作用力、親水作用力)彼此發(fā)生相互作用。在一個實施方案中，復合物是異源多聚體。應(yīng)理解的是，本文中使用的術(shù)語“蛋白質(zhì)復合物”或“多肽復合物”包括這樣的復合物，在該蛋白質(zhì)復合物中具有與蛋白質(zhì)綴合的非蛋白質(zhì)實體(例如，包括但不限于，化學分子，例如毒素或檢測試劑)。“與目的抗原結(jié)合”的本發(fā)明異源多聚體蛋白質(zhì)是這樣的蛋白質(zhì)，其與靶標以足夠的親和力結(jié)合，以致于該異源多聚體蛋白質(zhì)可以用作診斷和/或治療劑以靶向蛋白質(zhì)或表達該靶標的細胞或組織，而不顯著地與其它蛋白質(zhì)交叉反應(yīng)。在這樣的實施方案中，在通過熒光激活細胞分選(FACS)分析或放射免疫沉淀法(RIA)或ELISA進行測定時，異源多聚體蛋白質(zhì)與“非靶標”蛋白質(zhì)結(jié)合的程度將低于抗體與其特定靶標蛋白質(zhì)的結(jié)合的大約10%。關(guān)于異源多聚體蛋白質(zhì)與靶標分子的結(jié)合，術(shù)語“特異性結(jié)合”、“特異地結(jié)合至”、或“特異于”特定多肽或特定多肽靶標上的表位，是指該結(jié)合與非特異相互作用(例如，非特異性相互作用可以是與牛血清白蛋白或酪蛋白的結(jié)合)具有測量上的差異?？梢岳缤ㄟ^測定分子的結(jié)合并與對照分子的結(jié)合相比較來測定特異性結(jié)合。例如，可以通過與類似靶標的對照分子(例如過量的非標記靶標)的競爭來測定特異性結(jié)合。在這樣的情況下，如果標記的靶標與探針的結(jié)合被過量的非標記靶標競爭性抑制，則表明特異性結(jié)合。本文中使用的術(shù)語“特異性結(jié)合”、“特異地結(jié)合至”、或“特異于”特定多肽或特定多肽靶標上的表位，可以例如表現(xiàn)為分子對靶標具有至少約200nM的KcU或者至少約150nM、或者至少約ΙΟΟηΜ、或者至少約60nM、或者至少約50nM、或者至少約40nM、或者至少約30nM、或者至少約20nM、或者至少約ΙΟηΜ、或者至少約8nM、或者至少約6nM、或者至少約4nM、或者至少約2nM、或者至少約InM或更高的KcL在一個實施方案中，術(shù)語“特異性結(jié)合”指這樣的結(jié)合，其中異源多聚體蛋白質(zhì)與特定多肽或特定多肽上的表位結(jié)合，而基本上不與任何其它多肽或多肽表位結(jié)合。“結(jié)合親和力”通常指分子(例如抗體)的單個結(jié)合位點和其結(jié)合配偶體(例如抗原)之間非共價相互作用的總和力量。除非另有說明，本文中使用的“結(jié)合親和力”指內(nèi)在的結(jié)合親和力，其反映了結(jié)合對(例如抗體和抗原)成員之間1:1的相互作用。通常可以 用解離常數(shù)(Kd)來表示分子X與其配偶體Y的親和力。例如，Kd可以是約200nM、150nM、ΙΟΟηΜ、60nM、50nM、40nM、30nM、20nM、10nM、8nM、6nM、4nM、2nM、InM、或更強?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域已知的普通方法來測定親和力，所述方法包括本文中描述的那些方法。低親和力的抗體通常與抗原結(jié)合緩慢并傾向于易于解離，而高親和力的抗體通常與抗原結(jié)合更快并傾向于較長時間保持結(jié)合。本領(lǐng)域已知多種測量結(jié)合親和力的方法，為本發(fā)明目的，可以使用任何這些方法。在一個實施方案中，使用BIAcore -2000 或 BIAcore -3000 (BIAcore, Inc. , Piscataway, NJ)，利用表面等離子體共振測定法，以約10個反應(yīng)單位(RU)，以固定的靶標(例如抗原)CM5芯片，在25° C測定根據(jù)本發(fā)明的“Kd”或Kd值。簡言之，根據(jù)供應(yīng)商的說明書，以N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)活化羧甲基化的葡聚糖生物傳感器芯片(CM5，BIAcore公司)。以IOmM乙酸鈉(pH 4. 8)將抗原稀釋到5 μ g/ml (約O. 2 μ Μ)后以5 μ 1/min的流速進行注射，以獲得約10個反應(yīng)單位(RU)的偶聯(lián)蛋白質(zhì)。在注射抗原后，注射IM乙醇胺以封閉未反應(yīng)的基團。為了進行動力學測量，在25° C，以約25 μ 1/min的流速，注射在含O. 05%吐溫20的PBS (PBST)中兩倍系列稀釋的Fab (例如，0. 78nM至500nM)。通過同時擬合結(jié)合和解離傳感圖，使用簡單的一對一Langmuir結(jié)合模型(BIAcore評估軟件第3. 2版)，計算結(jié)合速率(km)和解離速率(Iitff)。平衡解離常數(shù)(Kd)計算為 koff/kon。見例如 Chen 等，J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999)。如果通過以上表面等離子體共振測定法測得的結(jié)合速率超過IO6M4S'則可以使用熒光淬滅技術(shù)來測定結(jié)合速率，所述熒光淬滅技術(shù)是在25。C，在存在遞增濃度的抗原時，以分光計測量于PBS (pH7. 2)中的20nM抗抗原抗體(Fab形式)的熒光發(fā)射強度(激發(fā)=295nm;發(fā)射=340nm, 16nm帶通)的增加或降低,所述分光計例如裝備了停流(stop-flow)的分光光度計(Aviv Instruments)或具有攬拌比色杯(stirredcuvette)的 8000 系列 SLM-Aminco分光光度計(ThermoSpectronic)。除非另有說明，就本發(fā)明的異源多聚體蛋白質(zhì)例如抗體、其片段或衍生物而言，“生物學活性的”、“生物學活性”和“生物學特性”，意指具有與生物分子結(jié)合的能力。
當用來描述各種異源多聚體多肽時，“分離的”意指異源多聚體已從表達它的細胞或細胞培養(yǎng)物中分離和/或回收。其天然環(huán)境中的污染成分是干擾異源多聚體的診斷或治療用途的物質(zhì)，可以包括酶、激素和其它蛋白質(zhì)性或非蛋白質(zhì)性的溶質(zhì)。在某些實施方案中，異源多聚體將被純化至(I)以Lowry方法測量，蛋白質(zhì)的95%以上重量，最優(yōu)選99%以上重量，(2)足以通過旋杯測序儀獲得N末端或內(nèi)部氨基酸序列的至少15個殘基的程度，或(3)在還原或非還原條件下通過SDS-PAGE、使用考馬斯藍或優(yōu)選地銀染確定的同質(zhì)。然而，通常，通過至少一個純化步驟來制備分離的多肽。通常，本發(fā)明的異源多聚體被純化至基本上同質(zhì)。短語“基本上同質(zhì)”、“基本上同質(zhì)的形式”用來表示，產(chǎn)物基本上沒有源自不需要的多肽組合的副產(chǎn)物(例如同源多聚體)。以純度來表述，基本上同質(zhì)意指副產(chǎn)物的量按重量計不超過10%、9%、8%、7%、6%、4%、3%、2%或1%，或按重量計低于1%。在一個實施方案中，副產(chǎn)物低于5%?！吧锓肿印敝负怂?、蛋白質(zhì)、碳水化合物及其組合。在一個實施方案中，生物分子 天然存在。本文中使用的“連接”意指第一和第二氨基酸序列之間直接的肽鍵連接，或涉及第三氨基酸序列的連接，所述第三氨基酸序列是位于第一和第二氨基酸序列之間并與它們鍵接的肽。例如，與一個氨基酸序列的C末端以及另一個氨基酸序列的N末端鍵接的接頭肽。本文中使用的“接頭”意指兩個或更多個氨基酸長度的氨基酸序列。接頭可以由不帶電荷的極性氨基酸或非極性氨基酸組成。接頭可以長例如2至100個氨基酸，例如長2至50個氨基酸，例如長3、5、10、15、20、25、30、35、40、45或50個氨基酸。接頭可以是“可切割的”，例如自我切割或酶促或化學切割。氨基酸序列中的切割位點、以及在這樣的位點上切割的酶和化學試劑在本領(lǐng)域公知并也描述于本文中。本文中使用的“系鏈”(tether)意指連接兩個其它氨基酸序列的氨基酸接頭。本文中描述的系鏈可以將免疫球蛋白重鏈可變區(qū)的N端和免疫球蛋白輕鏈恒定區(qū)的C端連接起來。在特定的實施方案中，系鏈長約15至50個氨基酸，例如長約20至26個氨基酸(例如長20、21、22、23、24、25或26個氨基酸)。系鏈可以是“可切割的”，例如自我切割，或使用本領(lǐng)域的標準方法和試劑進行酶促或化學切割。“接頭”或“系鏈”的酶促切割可以涉及使用內(nèi)肽酶，例如Lys-C、Asp-N, Arg-C,V8、Glu-C、胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、凝血酶、Genenase、Xa因子、TEV(煙草蝕刻病毒半胱氨酸蛋白酶)、腸激酶、HRV C3(人鼻病毒C3蛋白酶)、激肽原酶以及枯草桿菌蛋白酶樣蛋白原轉(zhuǎn)化酶(例如Furin (PCl)、PC2或PC3) /或N-精氨酸二元轉(zhuǎn)化酶(N-arginine dibasic convertase)?；瘜W切割可以涉及使用例如輕胺、N-氯代琥拍酰亞胺、N-溴代琥珀酰亞胺或溴化氰。本文中使用的“Lys-C內(nèi)肽酶切割位點”是可以在C端一側(cè)被Lys-C內(nèi)肽酶切割的氨基酸序列中的賴氨酸殘基。Lys-C內(nèi)肽酶在賴氨酸殘基的C端一側(cè)進行切割?！半x液劑”意指這樣的水溶性物質(zhì)，其通過干擾起穩(wěn)定作用的分子內(nèi)相互作用(例如，氫鍵、范德華作用力或疏水效應(yīng))，破壞蛋白質(zhì)(例如抗體)的三維結(jié)構(gòu)。示例性離液劑包括但不限于尿素、胍-HC1、高氯酸鋰、組氨酸和精氨酸?！皽睾拖礈靹币庵高@樣的水溶性物質(zhì)，其通過干擾起穩(wěn)定作用的分子內(nèi)相互作用(例如，氫鍵、范德華作用力或疏水效應(yīng))，破壞蛋白質(zhì)(例如抗體)的三維結(jié)構(gòu)，但其不永久地破壞蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)以導致生物學活性丟失(即，不變性蛋白質(zhì))。示例性溫和洗滌劑包括但不限于，吐溫(Tween)(例如吐溫20)、Triton (例如Triton X-100)、NP-40 (壬基酹聚氧乙烯醚)、Nonidet P-40 (辛基酹聚氧乙烯醚)和十二燒基硫酸鈉(SDS)?？贵w“效應(yīng)子功能”指歸因于抗體的Fe區(qū)(天然序列Fe區(qū)或氨基酸序列變體Fe區(qū))的生物學活性，其隨抗體同種型而變化。抗體效應(yīng)子功能的實例包括Clq結(jié)合和補體依賴性細胞毒性；Fc受體結(jié)合；抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC);吞噬作用；細胞表面受體(例如，B細胞受體)的下調(diào)；以及B細胞活化?！翱贵w依賴性細胞介導的細胞毒性”或“ADCC”指一種形式的細胞毒性，其中分泌的Ig與存在于某些細胞毒性細胞(例如，自然殺傷(NK)細胞、嗜中性粒細胞和巨噬細胞)上的Fe受體(FcRs)結(jié)合，使這些細胞毒性效應(yīng)細胞能特異地與攜帶抗原的靶細胞結(jié)合，并隨后以細胞毒性物殺死該靶細胞。抗體“武裝”細胞毒性細胞，其對于這種殺傷作 用是絕對需要的。用于介導ADCC的原代細胞、NK細胞僅表達Fe Y RIII，而單核細胞表達Fe Y RI> Fe Y RII和Fe y RIII FcR在造血細胞上的表達概述于Ravetch和Kinet, Annu.Rev. Immunol. 9:457-92(1991)第464頁的表3中。為了評估目的分子的ADCC活性，可以進行例如美國專利號5，500, 362或5，821，337中描述的體外ADCC測定。用于這樣的測定的有用效應(yīng)細胞包括外周血單個核細胞(PBMC)和自然殺傷(NK)細胞?？蛇x地或此外，可以在例如 Clynes 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:652-656(1998)中公開的動物模型中，對目的分子的ADCC活性進行體內(nèi)評估?！癋e受體”或“FcR”指與抗體的Fe區(qū)結(jié)合的受體。優(yōu)選的FcR是人FcR。此夕卜，優(yōu)選的FcR是結(jié)合IgG抗體的FcRU受體)，其包括Fe yRI、FcyRII和FcyRIII亞類的受體，包括這些受體的等位基因變體和可變剪接形式。Fe Y RII受體包括Fe Y RIIA( “激活性受體”)和FcyRIIB( “抑制性受體”)，它們具有類似的氨基酸序列，主要差異在于其胞質(zhì)區(qū)。激活性受體Fe Y RIIA在其胞質(zhì)區(qū)包含免疫受體酪氨酸激活基序(ITAM)。抑制性受體Fe Y RIIB在其胞質(zhì)區(qū)包含免疫受體酪氨酸抑制基序(Ι Μ)(見M. DaerOIl, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234(1997)的綜述)。Ravetch 和 Kinet, Annu.Rev. Immunol. 9:457-492(1991);Capel 等，Immunomethods 4:25-34(1994);和 de Haas等,J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995)中對 FcRs 進行了綜述。本文中的術(shù)語“FcR”涵蓋其它FcRs，包括以后將被鑒定出的FcRs。該術(shù)語也包括新生兒受體FcRn，其負責將母體的IgGs轉(zhuǎn)運到胎兒中(Guyer等,J. Immunol. 117:587 (1976)和Kim等,J.Immunol. 24:249(1994))?！叭诵?yīng)細胞”是表達一個或多個FcRs和執(zhí)行效應(yīng)子功能的白細胞。優(yōu)選地，該細胞表達至少Fe Y RIII和執(zhí)行ADCC效應(yīng)子功能。介導ADCC的人白細胞的實例包括外周血單核細胞(PBMC)、自然殺傷(NK)細胞、單個核細胞、細胞毒性T細胞和嗜中性粒細胞；優(yōu)選PBMCs和NK細胞?？梢詮奶烊粊碓蠢缪褐蟹蛛x效應(yīng)細胞?！把a體依賴性細胞毒性”或“CDC”指靶細胞在補體存在時的裂解。經(jīng)典補體途徑的活化起始于補體系統(tǒng)的第一成分(Clq)與結(jié)合到關(guān)聯(lián)抗原上的抗體(適當?shù)膩嗩?的結(jié)合。為了評估補體的激活，可以進行例如Gazzano-Santoro等，J. Immunol. Methods202:163(1996)中描述的CDC測定試驗。
術(shù)語“治療有效量”指可以治療受試者的疾病或失調(diào)的抗體、抗體片段或衍生物的量。在腫瘤(例如，癌性腫瘤)的情況下，抗體或抗體片段(例如，多特異性抗體或抗體片段)的治療有效量可以減少癌細胞的數(shù)量；縮小原發(fā)瘤的大??；抑制(即在一定程度上減緩和優(yōu)選停止)癌細胞浸潤到周圍器官中；抑制(即在一定程度上減緩和優(yōu)選停止)腫瘤轉(zhuǎn)移；在一定程度上抑制腫瘤生長；和/或在一定程度上減輕與失調(diào)相關(guān)的一個或多個癥狀。如果抗體或抗體片段可以阻止已存在的癌細胞的生長和/或?qū)⑵錃⑺溃瑒t其可以是細胞抑制性的和/或細胞毒性的。對于癌癥治療，可以例如通過評價存活持續(xù)時間，到達疾病進展的時間(TTP)、反應(yīng)率(RR)、反應(yīng)持續(xù)時間和/或生活質(zhì)量,測量體內(nèi)功效?！皽p少或抑制”意指，導致優(yōu)選20%或更高、更優(yōu)選50%或更高、和最優(yōu)選75%、85%、90%、95%或更高的總體降低的能力。減少或抑制可以針對所治療的失調(diào)的癥狀、轉(zhuǎn)移灶的存在或大小、原發(fā)瘤的大小、或血管發(fā)生失調(diào)中血管的大小或數(shù)量。術(shù)語“癌”和“癌性”指或描述哺乳動物的生理狀況，其典型地具有不受控制的細胞生長/增殖的特征。該定義包括良性和惡性癌。癌(cancer)的實例包括但不限于上皮 癌(carcinoma)、淋巴瘤、胚細胞瘤、肉瘤和白血病。這些癌癥的更具體實例包括，鱗狀細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌、肺鱗狀細胞癌、腹膜癌、肝細胞癌、胃癌，包括腸胃癌、胰腺癌、成膠質(zhì)細胞瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、宮頸癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝癌、乳房癌、結(jié)腸癌、結(jié)腸直腸癌、子宮內(nèi)膜或子宮癌、唾液腺癌、腎癌(例如，腎細胞癌)、肝癌、前列腺癌、夕卜陰癌、甲狀腺癌、肝癌、肛門癌、陰莖癌、黑素瘤，以及各種類型的頭頸癌?！霸缙诎┌Y”意指不具侵略性或轉(zhuǎn)移性的癌癥或分類為第0、1或II階段的癌癥。術(shù)語“癌前”指典型地在癌癥之前或發(fā)展為癌癥的狀況或生長?！胺寝D(zhuǎn)移性的”意指癌是良性的或保留在原發(fā)位置而沒有透入淋巴或血管系統(tǒng)或除了原發(fā)位置以外的其它組織中。通常，非轉(zhuǎn)移性癌是任何第O、I或II階段的癌癥，和偶爾是第III階段的癌癥。本文中，“變應(yīng)性或炎性疾病”是由個體的免疫系統(tǒng)過度激活引起的疾病或失調(diào)。示例性變應(yīng)性或炎性疾病包括但不限于，哮喘、銀屑病、類風濕性關(guān)節(jié)炎、特應(yīng)性皮炎、多發(fā)性硬化、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、濕疹、器官移植、年齡相關(guān)性黃斑變性、克羅恩氏病、潰瘍性結(jié)腸炎、嗜酸細胞性食管炎、和與炎癥相關(guān)的自身免疫性疾病。本文中，“自身免疫病”是指，由個體自身組織引起并對抗該組織的疾病或失調(diào)、或與其共分離的狀況或其表現(xiàn)形式、或由其導致的狀況。自身免疫疾病或失調(diào)的實例包括但不限于關(guān)節(jié)炎(類風濕性關(guān)節(jié)炎，例如急性關(guān)節(jié)炎、慢性類風濕性關(guān)節(jié)炎、痛風性關(guān)節(jié)炎、急性痛風性關(guān)節(jié)炎、慢性炎癥性關(guān)節(jié)炎、退行性關(guān)節(jié)炎、感染性關(guān)節(jié)炎、萊姆關(guān)節(jié)炎、增生性關(guān)節(jié)炎、銀屑病關(guān)節(jié)炎、脊椎關(guān)節(jié)炎、和少年發(fā)病類風濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、慢性進行性關(guān)節(jié)炎、關(guān)節(jié)炎畸形、原發(fā)性慢性多關(guān)節(jié)炎、反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎和強直性脊柱炎)，炎性過度增生性皮膚病，銀屑病例如斑塊狀銀屑病、滴狀銀屑病、膿皰性銀屑病和指甲銀屑病，皮炎包括接觸性皮炎、慢性接觸性皮炎、變應(yīng)性皮炎、變應(yīng)性接觸性皮炎、皰疹樣皮炎和特應(yīng)性皮炎，X-連鎖高IgM綜合癥，蕁麻疹例如慢性變應(yīng)性蕁麻疹和慢性特發(fā)性蕁麻疹，包括慢性自身免疫性蕁麻疹，多肌炎/皮肌炎，幼年型皮肌炎，中毒性表皮壞死松解，硬皮病(包括系統(tǒng)性硬皮病)，硬化癥例如系統(tǒng)性硬化病，多發(fā)性硬化(MS)例如spino-optical MS、原發(fā)進行性MS (PPMS)和復發(fā)緩解型MS (RRMS)，進行性系統(tǒng)性硬化病，動脈粥樣硬化，動脈硬化，彌漫性硬化(sclerosis disseminate)和共濟失調(diào)硬化(ataxic sclerosis),炎性腸病(IBD)(例如，克羅恩氏病、自身免疫介導性胃腸疾病，結(jié)腸炎例如潰瘍性結(jié)腸炎、colitis ulcerosa,顯微鏡性結(jié)腸炎、膠原性結(jié)腸炎、息肉狀結(jié)腸炎、壞死性小腸結(jié)腸炎、透壁性結(jié)腸炎和自身免疫性炎癥性腸病)，壞疽性膿皮癥，結(jié)節(jié)性紅斑，原發(fā)性硬化性膽管炎，鞏膜外層炎，呼吸窘迫綜合征，包括成人或急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)，腦膜炎，葡萄膜的全部或部分的炎癥，虹膜炎，脈絡(luò)膜炎，自身免疫血液學紊亂，類風濕性脊柱炎，突發(fā)性耳聾，IgE介導的疾病例如過敏反應(yīng)、變應(yīng)性和特異反應(yīng)性鼻炎，腦炎例如Rasmussen腦炎和邊緣性腦炎和/或腦干腦炎，眼色素層炎例如前葡萄膜炎、急性前葡萄膜炎、肉芽腫性葡萄膜炎、非肉芽腫性葡萄膜炎、晶狀體抗原性葡萄膜炎、后葡萄膜炎或自身免疫葡萄膜炎，伴有和無腎病綜合征的腎小球腎炎(GN)，例如慢性或急性腎小球腎炎例如原發(fā)性GN、免疫介導的GN、膜性GN(膜性腎病)、特發(fā)性膜性GN或特發(fā)性膜性腎病、膜性增生性GN(MPGN)，包括I型和II型，和急進性GN，變應(yīng)性病狀，變應(yīng)性反應(yīng)，濕疹，包括變應(yīng)性或特應(yīng)性濕疹，哮喘，例如支氣管哮喘、自身免疫哮喘，涉及T細胞浸潤和慢性炎癥反應(yīng)的病狀，慢性肺炎疾病，自身免疫心肌炎，白細胞粘附缺陷病，系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)例如皮膚型SLE、亞急性皮膚型紅斑狼瘡、新生兒期狼瘡綜合征(NLE)、播散性紅斑狼瘡，狼瘡(包括腎炎、腦炎、小兒、非腎性、腎外、盤狀、脫發(fā))，幼年型(I型)糖尿病，包括小兒胰島素依賴型糖尿病(IDDM)、成人型糖尿病(II 型糖尿病)、自身免疫性糖尿病，特發(fā)性尿崩癥，與細胞因子和T淋巴細胞介導的急性和遲發(fā)型超敏反應(yīng)相關(guān)的免疫反應(yīng)，結(jié)核，結(jié)節(jié)病，肉芽腫病，包括淋巴瘤樣肉芽腫病、韋格納肉芽腫病，粒細胞缺乏癥，血管炎病，包括脈管炎(大血管的血管炎(包括風濕性多肌痛和巨細胞(Takayasu’ s)動脈炎)、中型血管的血管炎(包括Kawasaki病和結(jié)節(jié)性多動脈炎)、顯微型多動脈炎、CNS脈管炎，壞死性、皮膚性或超敏性脈管炎，系統(tǒng)性壞死性血管炎，和ANCA相關(guān)血管炎例如Churg-Strauss血管炎或綜合征(CSS)，顳動脈炎,再生障礙性貧血，自身免疫性再生障礙性貧血，庫氏試驗陽性貧血，Diamond Blackfan貧血，溶血性貧血，或免疫性溶血性貧血，包括自身免疫性溶血性貧血(AIHA)，惡性貧血(anemia perniciosa)，Addison病，純紅細胞貧血或再生障礙(PRCA)，VIII因子缺乏癥，血友病A，自身免疫性中性粒細胞減少，全血細胞減少癥，白細胞減少癥，涉及白細胞滲出的疾病，中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥疾病，多臟器損傷綜合征例如繼發(fā)于敗血癥、創(chuàng)傷或大出血的那些，抗原-抗體復合物介導的疾病，抗腎小球基底膜病，抗磷脂抗體綜合征，變應(yīng)性神經(jīng)炎，Bechef s或Behcet’ s病，Castleman，s 綜合征，Goodpasture’ s 綜合征，ReynaudJ s 綜合征，Sjogren’ s 綜合征，Stevens-Johnson綜合征,類天皰瘡例如大皰性類天皰瘡和皮膚類天皰瘡,天皰瘡(包括尋常性天皰瘡、落葉性天皰瘡、天皰瘡黏膜類天皰瘡、和紅斑性天皰瘡)，自身免疫多內(nèi)分泌腺病，Reiter’s病或綜合征，免疫復合物性腎炎，抗體介導的腎炎，視神經(jīng)脊髓炎，多發(fā)性神經(jīng)病，慢性神經(jīng)病例如IgM多發(fā)性神經(jīng)病或IgM介導的神經(jīng)病，血小板減少癥(例如，心肌梗死患者產(chǎn)生的)，包括血栓性血小板減少性紫癜(TTP)和自身免疫性或免疫性血小板減少癥，例如特發(fā)性血小板減少性紫癜(ITP)，包括慢性或急性ITP，睪丸和卵巢自身免疫性疾病，包括自身免疫性睪丸炎和卵巢炎，原發(fā)性甲狀腺功能減退，甲狀旁腺機能減退，自身免疫性內(nèi)分泌疾病，包括甲狀腺炎例如自身免疫性甲狀腺炎、Hashimoto’ s病、慢性甲狀腺炎(Hashimoto’ s甲狀腺炎)或亞急性甲狀腺炎，自身免疫性甲狀腺病，特發(fā)性甲狀腺機能減退，Grave’ s病，多腺體綜合征例如自身免疫性多腺體綜合征(或多腺體內(nèi)分泌病綜合征)，副腫瘤綜合征，包括神經(jīng)學副腫瘤綜合征，例如Lambert-Eaton肌無力綜合征或Eaton-Lambert綜合征，僵人綜合征，腦脊髓炎例如變態(tài)反應(yīng)性腦脊髓炎或變應(yīng)性脊髓炎和試驗性變應(yīng)性腦脊髓炎(EAE)，重癥肌無力例如胸腺瘤相關(guān)重癥肌無力，小腦退化，神經(jīng)性肌強直，視性眼陣攣或視性眼陣攣肌陣攣綜合征(OMS)和感覺神經(jīng)病，多灶性運動神經(jīng)病，Sheehan’ s綜合征，自身免疫性肝炎，慢性肝炎，狼瘡樣肝炎，巨細胞性肝炎，慢性活動性肝炎或自身免疫性慢性活動性肝炎，淋巴間質(zhì)性肺炎，閉塞性細支氣管炎(非移植)對NSIP，Guillain-Barre綜合征,Berger’s病(IgA腎病),特發(fā)性IgA腎病,線性IgA皮膚病,原發(fā)性膽汁性肝硬化，肺硬化，自身免疫性腸病綜合征，乳糜瀉，乳糜泄，口炎性腹瀉(麩質(zhì)性腸病)，難治性口炎性腹瀉，特發(fā)性口炎性腹瀉，冷球蛋白血癥，肌萎縮性側(cè)索硬化癥(ALS; LouGehrig’ s病)，冠心病，自身免疫性耳病例如自身免疫性內(nèi)耳病(AIED)，自身免疫性聽力損失，視性眼陣攣肌陣攣綜合征(OMS)，多軟骨炎例如頑固性或復發(fā)性多軟骨炎，肺泡蛋白沉著癥，淀粉樣變性，鞏膜炎，非癌性淋巴細胞增多，原發(fā)性淋巴細胞增多，包括單克隆B細胞淋巴細胞增多(例如，良性單克隆丙種球蛋白病和意義不明性單克隆丙種球蛋白病，MGUS),周圍神經(jīng)病，副腫瘤綜合征,通道病(channelopathy)例如癲癇、偏頭痛、心律失常、肌疾病、耳聾、目盲、周期性癱瘓、和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的通道病，孤獨癥，炎性肌病，局灶性節(jié)段性腎小球硬化癥(FSGS)，內(nèi)分泌性眼病，葡萄膜視網(wǎng)膜炎，脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜炎，自身免疫性肝失調(diào)，纖維性肌痛(fibromyalgia),多內(nèi)分泌功能衰竭，Schmidt’ s綜合征，腎上腺炎，胃萎 縮，早老性癡呆，脫髓鞘疾病例如自身免疫性脫髓鞘疾病，糖尿病性腎病，Dressier’ s綜合征，斑秀，CREST綜合征(韓質(zhì)沉著癥、Raynaud’ s現(xiàn)象，食道運動功能障礙、指端硬化和毛細血管擴張)，男性和女性自身免疫性不孕，混合性結(jié)締組織病，Chagas ^病，風濕熱，習慣性流產(chǎn)，農(nóng)民肺，多形紅斑，心切開術(shù)后綜合征，Cushing’ s綜合征，養(yǎng)鳥者肺，變應(yīng)性肉芽腫性血管炎，良性淋巴細胞血管炎，Alport’ s綜合征，肺泡炎例如變應(yīng)性肺泡炎和纖維化肺泡炎，間質(zhì)性肺病，輸血反應(yīng)，麻風病，痕疾，利什曼病，kypanosomiasis,血吸蟲病,蛔蟲病，曲霉病，Sampterj s綜合征，Caplan’ s綜合征,登革熱,心內(nèi)膜炎,心內(nèi)膜心肌纖維化，彌漫性肺間質(zhì)纖維化，間質(zhì)性肺纖維化，特發(fā)性肺纖維化，囊性纖維化，眼內(nèi)炎，持久性隆起性紅斑，胎兒成紅細胞增多，嗜酸性筋膜炎，ShulmanJ s綜合征，F(xiàn)eltyj s綜合征,絲蟲病(flariasis)，睫狀體炎(cyclitis)，例如慢性睫狀體炎、異色性睫狀體炎、虹膜睫狀體炎或Fuch’ s睫狀體炎,過敏性紫癜(Henoch-Schonlein purpura),人類免疫缺陷病毒(HIV)感染，艾柯病毒感染，心肌病，Alzheimer’ s病，細小病毒感染，風疹病毒感染，免疫接種后綜合征，先天性風疫感染，Epstein-Barr病毒感染,腿腺炎，Evan’ s綜合征，自身免疫性性腺衰竭，Sydenham舞蹈癥,鏈球菌感染后腎炎，閉塞性血栓性血管炎(thromboangitisubiterans)、甲狀腺毒癥，脊髓癆，脈絡(luò)膜炎，巨細胞多肌痛，內(nèi)分泌性眼病，慢性超敏性肺炎，干燥性角結(jié)膜炎，流行性角結(jié)膜炎，特發(fā)性腎炎綜合征，微小病變性腎病，良性家族性和缺血再灌注損傷，視網(wǎng)膜自身免疫，關(guān)節(jié)炎癥，支氣管炎，慢性阻塞性氣道疾病，硅肺病，口瘡，口瘡性口炎，動脈硬化病，aspermiogenese,自身免疫性溶血，Boeck’ s病，冷球蛋白血癥，DupuytrenJ s 攣縮，晶狀體過敏性眼內(nèi)炎(endophthalmia phacoanaphylactica),變應(yīng)性小腸炎，麻風結(jié)節(jié)性紅斑，特發(fā)性面癱，慢性疲勞綜合征，風濕熱(febrisrheumatica),Ha_an-Rich’ s病，感覺神經(jīng)性耳聾，陣發(fā)性血紅蛋白尿，性腺機能減退，區(qū)域性回腸炎，白細胞減少癥，傳染性單核細胞增多癥，橫貫性脊髓炎，原發(fā)性特發(fā)性粘液性水腫，腎變病，交感性眼炎(ophthalmiasymphatica),肉芽腫性睪丸炎、胰腺炎，急性多神經(jīng)根炎(polyradiculitisacuta),壞疽性膿皮癥，QuervainJ s甲狀腺炎,獲得性脾萎縮，由抗精子抗體引起的不育，非惡性的胸腺瘤，白癜風，SCID和Epstein-Barr病毒相關(guān)的疾病，獲得性免疫缺損綜合征(AIDS)，寄生蟲病例如利什曼原蟲，中毒性休克綜合征，食物中毒，涉及T細胞浸潤的疾病，白細胞粘附缺陷病，與細胞因子和T淋巴細胞介導的急性和遲發(fā)型超敏反應(yīng)相關(guān)的免疫反應(yīng)，涉及白細胞滲出的疾病，多器官損傷綜合征，抗原-抗體復合物介導的疾病，抗腎小球基底膜病，變應(yīng)性神經(jīng)炎，自身免疫性多內(nèi)分泌腺病，卵巢炎，原發(fā)性黏液水腫，自身免疫性萎縮性胃炎，交感性眼炎，風濕性疾病，混合性結(jié)締組織病，腎病綜合征，胰島炎，多內(nèi)分泌缺陷，周圍神經(jīng)病，I類自身免疫性多腺體綜合征，成人發(fā)作特發(fā)性甲狀旁腺機能減退(AOIH)，全禿，擴張性心肌病，獲得性大皰性表皮松解(EBA)，血色沉著病，心肌炎，腎病綜合征，原發(fā)性硬化性膽管炎，膿性或非膿性鼻竇炎，急性或慢性鼻竇炎，篩竇炎，額竇炎、上頜竇炎、或蝶竇炎，嗜酸性粒細胞相關(guān)疾病例如嗜酸性粒細胞增多、嗜酸性粒細胞增多性肺浸潤，嗜酸性粒細胞增多-肌痛綜合征，Loffler’ s綜合征，慢性嗜酸性肺炎，熱帶肺嗜酸細胞增多癥，支氣管肺炎曲霉病，曲霉腫，或包含嗜酸性粒細胞的肉芽腫，過敏反應(yīng),血清陰性脊柱關(guān)節(jié)病(seronegative spondy loarthr it ides),多內(nèi)分泌自身免疫病，硬化性膽管炎，鞏膜炎、鞏膜外層炎，慢性皮膚粘膜念珠菌病，Bruton’ s綜合征，嬰兒期短暫性低丙種球蛋白血癥，Wiskott-Aldrich綜合征，共濟失調(diào)性毛細血管擴張癥，與膠原病 相關(guān)的自身免疫性疾病，風濕病，神經(jīng)病，缺血再灌注障礙，血壓降低反應(yīng)，血管功能障礙，antgiectasis，組織損傷，心血管缺血，痛覺過敏，腦缺血，伴隨血管化的疾病，變應(yīng)性超敏疾病，腎小球腎炎，再灌注損傷，心肌或其它組織的再灌注損傷，具有急性炎癥成分的皮膚病，急性化膿性腦膜炎或其他中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥疾病，眼及眼眶炎性疾病，粒細胞輸血相關(guān)綜合征，細胞因子誘導的毒性，急性嚴重炎癥，慢性頑固性炎癥，腎盂炎，肺硬化，糖尿病視網(wǎng)膜病，糖尿病大動脈障礙，動脈內(nèi)膜增生(endarterialhyperplasia),胃潰瘍,心瓣炎以及子宮內(nèi)膜異位。本文中使用的術(shù)語“細胞毒性劑”指抑制或阻止細胞的功能和/或?qū)е录毎茐牡奈镔|(zhì)。該術(shù)語旨在包括放射性同位素(例如At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、Ra223、P32,和Lu的放射性同位素)，化療劑例如甲氨蝶呤、阿霉素(adriamicin)、長春花生物堿(長春花新堿、長春花堿、依托泊式)，阿霉素(doxorubicin),美法侖,絲裂霉素C,苯丁酸氮芥，柔紅霉素(daunorubicin)或其它嵌入劑，酶和其片段例如核溶解酶，抗生素，以及毒素，例如細菌、真菌、植物或動物來源的小分子毒素或酶促激活毒素，包括其片段和/或變體，和本文中公開的各種抗腫瘤、抗癌和化療試劑。本文描述了其它細胞毒性劑。殺腫瘤劑導致腫瘤細胞破壞?！盎焺笔怯糜谥委煱┌Y的化合物?；焺┑膶嵗ㄍ榛瘎?，例如噻替派和CYTOXAN 環(huán)磷酰胺；烷基磺酸鹽例如白消安、英丙舒凡(impiOsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan);氮丙唳類例如benzodopa、卡波醌、meturedopa和uredopa ；乙烯亞胺類和甲基蜜胺類(methylamelamines)，包括六甲蜜胺、三乙撐蜜胺、三乙撐磷酰胺(triethyIenephosphoramide)、乙胺硫磷和三輕甲蜜胺；番蒸枝內(nèi)酯類(acetogenins)(特別是布拉它辛(bullatacin)和布拉它辛酮(bullatacinone)) ； δ-9-四氫大麻醇(屈大麻酹(Dronabinol XjVlARUNOL. ) ;β-拉帕醌(β-lapachone);拉帕醇(Iapachol)；秋水仙素類；樺木酸；喜樹堿(包括合成的類似物拓撲替康(HYCAMTIN )，CPT-Il (依立替康，CAMPTOSAR )，乙?；矘鋲A，莨菪亭(scopolectin)和9-氨基喜樹堿；苔蘚抑制素；callystatin ;CC_1065(包括其阿多來新(adozelesin)、卡折來新(carzelesi n)和比折來新(bizelesin)合成類似物)；鬼白毒素；鬼白酸；替尼泊苷(Teniposide);念珠藻環(huán)肽類(cryptophycins)(特別是念珠藻環(huán)肽I和念珠藻環(huán)肽8);多拉司他汀(dolastatin);倍癌霉素(包括合成的類似物、KW-2189和CB1-TM1);軟珊瑚醇；水鬼蕉堿(pancratistatin);葡枝珊瑚醇；海綿抑制素；氮芥例如苯丁酸氣芥，蔡氣芥(Chlornaphazine), cholophosphamide，雌莫司汀(estramustine)，異環(huán)磷酰胺(ifosfamide)，氮芥，鹽酸氧化氮芥，美法侖，新氮芥(novembichin)、苯芥膽留醇(phenesterine)、潑尼莫司汀(prednimustine)、曲憐胺(trofosfamide)、尿啼P定氮芥(uracil mustard);亞硝基服類(nitrosureas)，例如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(Iomustine)、尼莫司汀(nimustine)、雷莫司汀(ranimnustine);抗生素，例如烯二炔類抗生素(例如，加利車霉素(calicheamicin)，尤其是加利車霉素Y I (見例如Agnew，Chem Intl.Ed. Engl. 33:183-186(1994));達內(nèi)霉素(dynemicin),包括達內(nèi)霉素A ;埃斯波霉素(esperamicin);以及新抑癌蛋白生色團(neocarzinostatin chromophore)和相關(guān)的生色蛋白烯二炔抗生素生色團類)；阿克拉霉素(aclacinomysins)，放線菌素(actinomycin)，authramycin，偶氮絲氨酸(azaserine)、博來霉素(bleomycins)、cactinomycin、卡柔 t匕星(carabicin)、洋紅霉素(carminomycin)、口譽癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycinis)、放線菌素 D (dactinomycin)、柔紅霉素(daunorubicin)、地托比星(detOTubicin)、6_重氮基-5-氧代-L-正亮氨酸、ADRIAMYCIN 多柔比星(包括嗎啉代-多柔比星，氰基嗎啉代-多柔比星，2-吡咯啉代-多柔比星和脫氧多柔比星)，表柔比星(epirubicin)，依索比星(esorubicin)、伊達比星(idarubicin)、馬賽羅霉素(marcel Iomycin)、絲裂霉素例如絲裂霉素C，麥考酌■酸(mycophenolicacid)、nogalarnycin、橄欖霉素(olivomycins)、培洛霉素(peplomycin)、泊非霉素(potfiromycin)、P票羅霉素(puromycin)、三鐵阿霉素(quelamycin)、羅多比星(rodorubicin)、鏈黑霉素(streptonigrin)、鏈佐星(streptozocin)、殺結(jié)核菌素(tubercidin)、烏苯美司(ubenimex)、凈司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代謝物類，例如，甲氨蝶呤(Methotrexate)和5_氟尿嘧啶(5-FU);葉酸類似物，例如二甲葉酸(denopterin),甲氨蝶呤、蝶羅呤(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate);P票呤類似物，例如氟達拉濱(fludarabine)、6_巰票呤、硫咪票呤(thiamiprine)、硫鳥_呤(thioguanine);啼卩定類似物，例如安西他濱(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮雜尿苷(6-azauridine)、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、二脫氧尿苷、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依諾他濱(enocitabine)、氟尿苷(fIoxuridine);雄激素類，例如，卡魯睪酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)、環(huán)硫雄醇(epitiostanol)、美雄焼(mepitiostane)、睪內(nèi)酉旨(testolactone);抗腎上腺素類(anti-adrenals)，例如，氨魯米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane);葉酸補充物，例如，亞葉酸(frolinicacid);醋葡醒內(nèi)酯(aceglatone);醒憐酸胺糖苷(aldophosphamideglycoside);氨基乙酸丙酸(aminolevulinic acid);恩尿啼 P定(eniluracil);安卩丫 P定(amsacrine) jbestrabucil;比生群(bisantrene) ; edatraxate; defofamine;秋水仙胺(demecolcine);地口丫酉昆(diaziquone);依氟鳥氨酸(elfornithine);依利醋銨(elliptinium acetate);埃博霉素(epothilone)；依托格魯(etoglucid);硝酸鎵；輕基脲；香燕多糖；氯尼達明(Ionidainine);美登木素生物堿，例如美登素和美坦西醇類；米托胍腙(mitoguazone);米托蒽醌；莫哌達醇(mopidanmol) ; 二胺硝 B丫唆(nitraerine);噴司他丁 (pentostatin);蛋氨氮芥(phenamet);卩比柔比星(pirarubicin);洛索蒽醌(Iosoxantrone) ;2_乙基酰肼；丙卡巴餅(procarbazine); PSK 多糖復合物(JHS Natureal Products, Eugene, OR);雷佐生(razoxane);利索新(rhizoxin);西佐喃(sizofiran);錯螺胺(spriogermanium);細交鏈孢菌酮酸(tenuazonic acid);三亞胺醌(triaziquone) ; 2，2’，2”-三氯三乙胺；單端孢霉烯類(尤其是T-2毒素，verracurin A,桿孢菌素A和蛇形菌素(anguidine));烏拉坦(urethan);長春地辛(vindesine) (ELDISINE , FILDESIN );達卡巴嚷(DACARBAZINE);甘露莫司汀(mannomustine) ; 二漠甘露醇(mitobronitol) ; 二漠衛(wèi)矛醇(mitolactol);哌泊溴燒(pipobroman) ; gacytosine;阿拉伯糖苷("Ara-C ");噻替派(thiotepa);紫杉燒類(taxoids)例如 TAXOL· 紫杉醇(Bristol-MyersSquibb Oncology, Princeton, NJ), ABRAXANETM Cremophor-free,紫杉醇的白蛋白改造納·米粒(AmericanPharmaceutical Partners, Schaumberg, IL),和 TAXOTERE 紫杉職(Rhone -Poulenc Rorer, Antony,法國)；苯丁酸氮芥；吉西他濱(GEMZAR );6-硫鳥嘌呤；巰嘌呤；甲氨蝶呤；鉬類似物，例如順鉬和卡鉬；長春堿(VELBAN );鉬；依托泊苷(VP-16);異環(huán)磷酰胺；米托蒽醌；長春新堿(ONCOVIN );奧沙利鉬；亞葉酸(Ieucovovin);長春瑞濱(NAVELrBINE );諾安托(novantrone);依達曲沙(edatrexate);柔紅霉素；氨基蝶呤；伊班膦酸鹽；拓撲異構(gòu)酶抑制劑RFS 2000 ;二氟甲基鳥氨酸(DMFO);類視黃醇例如視黃酸；卡培他濱(XELODA );以上任何物質(zhì)的藥學可接受的鹽、酸或衍生物；以及以上兩個或多個的組合，例如CHOP(環(huán)磷酰胺、阿霉素、長春新堿、潑尼松龍組合療法的縮寫)，和FOLFOX (奧沙利鉬(ELOXATINTM)結(jié)合5-FU和Ieucovovin的治療方案的縮寫)。該定義還包括抗激素劑，其通過調(diào)節(jié)、降低、阻礙或抑制能夠促進癌生長的激素的效應(yīng)來起作用，并常為系統(tǒng)性或全身性治療形式。它們可以自身就是激素。實例包括抗雌激素類和選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑(SERMs)，包括，例如它莫西芬(包括NOLVADEX 它莫西芬)，EVISTA 雷洛西芬(raloxifene)，屈洛昔芬(droloxifene)，4-羥基它莫昔芬，曲沃昔芬(trioxifene), keoxifene, LY117018,奧那司麗(onapristone)和FARESTON 托瑞米芬(toremifene);抗孕酮類(anti-progesterones);雌激素受體下調(diào)劑(ERDs);起作用而抑制或關(guān)閉卵巢的藥物，例如黃體生成素釋放激素(LHRH)激動劑，例如；LUPRON 和 ELIGARD 醋酸亮丙瑞林(leuprolide acetate),醋酸性瑞林(goserelin acetate),醋酸布舍瑞林(buserelin acetate)和曲普瑞林(tripterelin);其它抗雄激素類例如氟他米特(fIutamide),尼魯米特(niIutamide)和比卡魯胺(bicalutamide);和抑制芳化酶的芳化酶抑制劑，其調(diào)節(jié)腎上腺中雌激素的產(chǎn)生，例如4(5)-咪唑類，氨魯米特，MEGASE 醋酸甲地孕酮，AROMASIN 依西美坦，formestanie,法倔唑(fadrozole), RIVISOR 伏氯唑(vorozole),FEMARA 來曲唑(Ietrozole)和ARIMIDEX 阿納托挫(anastrozole)。此外，化療劑的該定義包括二膦酸鹽，例如氯屈膦酸鹽(clodronate)(例如BONEFOS 或OSTAC )，DIDROCAL 依替膦酸鈉(etidronate)，NE-58095, ZOMETA 唑來勝酸(zoledronic acid/zoledronate) , FOSAMAX 阿侖唑奈(alendronate),AREDIA 帕米膦酸(pamidronate), SKEUD 替魯膦酸鹽(ti Iudronate)或ACTONEL 利塞膦酸鹽(risedronate);以及曲沙他濱(troxacitabine) (1，3_ 二氧戊環(huán)核苷胞嘧啶類似物)；反義寡核苷酸，特別是那些抑制異常細胞增殖所涉及的信號途徑中的基因，例如PKC-a、Raf、H-Ras和表皮生長因子受體(EGF-R)，表達的反義寡核苷酸；疫苗例如THERATOPE 疫苗和基因治療疫苗，例如ALLOVECTIN 疫苗，LEUVECTIN 疫苗和VAXID 疫苗；LURTOTECAN 拓撲異構(gòu)酶I抑制劑；ABARELIX rmRH ;二甲苯磺酸拉帕替尼(lapatinib ditosylate) (ErbB-2 和 EGFR 雙酪氨酸激酶小分子抑制劑，也稱為GW572016);和以上任何的藥學可接受鹽、酸或衍生物。當在本文中使用時，“生長抑制劑”指在體外或體內(nèi)抑制細胞生長的化合物或組合物。因此，生長抑制劑可以是顯著減少S期細胞的百分比的藥劑。生長抑制劑的實例包括(在S期以外的位置)阻礙細胞周期進程的試劑，例如誘導Gl停滯和M-期停滯的 試劑。典型的M-期阻滯劑包括長春花生物堿(例如長春新堿和長春堿)，紫杉烷類和拓撲異構(gòu)酶II抑制劑例如阿霉素，表柔比星，柔紅霉素，依托泊甙和博來霉素。停滯Gl的試劑也可以溢出到S-期停滯，例如DNA烷化劑，例如它莫西芬，潑尼松，達卡巴嗪，氮芥，順鉬，氨甲蝶呤，5-氟尿卩密唳和ara-C。更多信息可見于The MolecularBasis of Cancer中，Mendelsohn 和 Israel 編輯，第 I 章，標題為 〃Cell cycleregulation, oncogenes, andantineoplastic drugs", Murakami 等著(WBSaunders:Philadelphia, 1995),特別是第 13頁。紫杉烷類(紫杉醇和多西他賽)是都源自紫杉樹的抗癌藥物。來自歐洲紫杉的多西他賽(TAXOTERE , Rhone-Poulenc Rorer)是紫杉醇的半合成類似物(TAXCXL ,Bristol-Myers Squibb)。紫杉醇和多西他賽促進自微管蛋白二聚體組裝成微管和通過阻止解聚來穩(wěn)定微管，這導致抑制細胞有絲分裂。本文中使用的“抗癌療法”指減輕或抑制受試者癌癥的治療?？拱┋煼ǖ膶嵗毎拘苑派浏煼ㄒ约敖o受試者施用治療有效量的細胞毒性劑、化療劑、生長抑制劑、癌癥疫苗、血管發(fā)生抑制劑、前體藥物、細胞因子、細胞因子拮抗劑、皮質(zhì)類固醇、免疫抑制劑、鎮(zhèn)吐藥、抗體或抗體片段、或鎮(zhèn)痛劑。本申請中使用的術(shù)語“前體藥物”指，藥學上有效物質(zhì)的前體或衍生物形式，與母體藥物相比，其對腫瘤細胞的毒性較低，能夠被酶促激活或被轉(zhuǎn)化為更活躍的母體形式。見例如，Wilman, “Prodrugs in CancerChemotherapy^BiochemicalSociety Transactions, 14,第 375-382 頁，615th Meeting Belfast(1986)和 Stella等,“Prodrugs:A Chemical Approachto Targeted Drug Delivery,，，Directed DrugDelivery, Borchardt 等,(ed.),第 247-267 頁,Humana Press (1985)。前體藥物包括但并不限于，含磷酸鹽的前體藥物、含硫代磷酸鹽的前體藥物、含硫酸鹽的前體藥物、含肽的前體藥物、經(jīng)D-氨基酸修飾的前體藥物、糖基化的前體藥物、含β-內(nèi)酰胺的前體藥物、含可選取代的苯氧基乙酰胺的前體藥物、或含可選取代的苯乙酰胺的前體藥物、可以被轉(zhuǎn)化為更活躍的無細胞毒性藥物的5-氟胞嘧啶和其它5-氟尿嘧啶前體藥物。能夠被衍生為用于本發(fā)明的前體藥物形式的細胞毒性藥物的例子，包括但不限于上述那些化療劑。
術(shù)語“細胞因子”是由一個細胞群體釋放并作為細胞間調(diào)節(jié)物對另一個細胞起作用的蛋白質(zhì)的通稱。這樣的細胞因子的實例有淋巴因子、單核因子和傳統(tǒng)的多肽激素。細胞因子包括生長激素例如人生長激素(HGH)、N-甲硫氨酰人生長激素，和牛生長激素；甲狀旁腺素；甲狀腺素；胰島素；胰島素原；松弛素；松弛素原；糖蛋白激素，例如促濾泡激素(FSH)、促甲狀腺激素(TSH)和促黃體生成素(LH);表皮生長因子(EGF);肝細胞生長因子；成纖維細胞生長因子(FGF);催乳素；胎盤催乳素；腫瘤壞死因子α和β ;苗勒抑制物質(zhì)(mullerian-inhibiting substance);小鼠促性腺激素相關(guān)肽；抑制素；活化素；血管內(nèi)皮生長因子；整聯(lián)蛋白；促血小板生成素(TPO);神經(jīng)生長因子例如NGF- α ;血小板生長因子；轉(zhuǎn)化生長因子(TG Fs)例如TGF-α和TGF-β ;胰島素樣生長因子I和II ;紅細胞生成素(EPO);骨誘導因子；干擾素例如干擾素α、β和γ ;集落刺激因子(CSFs)例如巨噬細胞CSF(M-CSF)、粒細胞-巨噬細胞CSF(GM-CSF)和粒細胞CSF(G-CSF);白細胞介素(ILs)例如 IL-UIL-I α、IL-I β、IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7、IL-8, IL-9, IL-10, IL-IUIL-12、IL-18 ;腫瘤壞死因子例如TNF- α或TNF- β ；以及其它多肽因子包括LIF和kit配體(KL)。本文中使用的術(shù)語細胞因子包括，來自天然來源或來自重組細胞培養(yǎng)物的蛋白質(zhì)和天然序列細胞因子的生物學活性等效物?！凹毎蜃愚卓箘币庵覆糠只蛲耆钄唷⒁种苹蛑泻椭辽僖环N細胞因子的生物學活性的分子。例如，細胞因子拮抗劑可以通過抑制細胞因子的表達和/分泌，或通過與細胞因子或細胞因子受體結(jié)合，從而抑制細胞因子的活性。細胞因子拮抗劑包括抗體、合成的或天然序列的肽、免疫粘附素、和與細胞因子或細胞因子受體結(jié)合的小分子拮抗劑。細胞因子拮抗劑可選地與細胞毒性劑綴合或融合。示例性TNF拮抗劑有依那西普(ENBREL )、英夫利昔單抗(REMICADE )和阿達木單抗(humiratm)。本文中使用的術(shù)語“免疫抑制劑”指，起抑制或遮蔽所治療的受試者的免疫系統(tǒng)的作用的物質(zhì)。這包括抑制細胞因子產(chǎn)生、下調(diào)或抑制自體抗原表達、或遮蔽MHC抗原的物質(zhì)。免疫抑制劑的實例包括2-氨基-6-芳基-5-取代的嘧啶(見美國專利號4，665，077)；霉酌·酸酯(mycophenolate mofetil)例如CEI^LCEPT㊣;硫唑嘌呤(azathioprine)(IMURAN 、AZASAN ); 6-疏基嘌呤；溴隱亭(bromocriptine);達那唑(danazol);氨苯砜(dapsone);戍二醒(其遮蔽MHC抗原，如美國專利號4，120，649中所描述)；MHC抗原和MHC片段的抗獨特型抗體；環(huán)孢菌素A (cyclosporin A);類固醇,例如皮質(zhì)類固醇和糖皮質(zhì)類固醇，例如潑尼松(prednisone),潑尼松龍(prednisolone),例如PEDIAPRED (潑尼松龍磷酸鈉)或ORAPRED (潑尼松龍磷酸鈉口服液)，甲基潑尼松龍和地塞米松；甲氨蝶呤(口服或皮下)(RHEUMATREX 、TREXALL )；輕氯喹/氯喹；柳氮磺卩比唳；來氟洛米(Ieflunomide);細胞因子或細胞因子受體拮抗劑，包括抗干擾素Y、β或α抗體，抗腫瘤壞死因子α抗體(英夫利昔單抗或阿達木單抗)，抗TNFa免疫粘附素(ENBREL 、依那西普)，抗腫瘤壞死因子β抗體，抗白細胞介素2抗體和抗IL-2受體抗體；抗LFA-I抗體，包括抗⑶I Ia和抗⑶18抗體；抗L3T4抗體；異源抗淋巴細胞球蛋白；多克隆或pan-T抗體,或單克隆抗CD3或抗CD4/CD4a抗體；包含LFA-3結(jié)合結(jié)構(gòu)域的可溶性肽(W0 90/08187);鏈激酶；TGF-β ;鏈道酶；來自宿主的RNA或DNA;FK506 ;RS_61443 ;脫氧精胍菌素；雷帕霉素^細胞受體(Cohen等，美國專利號 5，114，721) ;T 細胞受體片段(Offner 等· Science 251:430-432(1991) ;W090/11294;Ianeway, Nature 341:482(1989);和 WO 91/01133) ;T 細胞受體抗體(EP340，109)例如Τ10Β9 ;環(huán)磷酰胺(CYTOXAN );氨苯砜；青霉胺(CUPRIMINE );血
漿更換；或靜脈免疫球蛋白(IVIG)。這些物質(zhì)可以單獨或互相組合使用，特別是類固醇和另一種免疫抑制劑的組合，或在這樣的組合后給予維持劑量的非類固醇藥，以降低對類固
醇的需要?！版?zhèn)痛劑”指起抑制或壓制受試者疼痛的作用的藥物。示例性鎮(zhèn)痛劑包括非類固醇抗炎藥(NSAIDs),包括布洛芬(MOTRIN ),萘普生(NAPROSYN ),乙酰水楊酸，吲哚美辛，舒林酸(sulindac)和托美汀(tolmetin)，包括它們的鹽和衍生物，以及各種用于減輕可能發(fā)生的刺痛的其它藥物，包括抗驚厥藥物(加巴噴丁(gabapentin),苯妥英(phenyloin),酰胺咪嗪(carbamazepine))或三環(huán)抗抑郁藥。具體實例包括醋氨酹(acetaminophen),阿司匹林(aspirin),阿密曲替林(amitriptyline) (ELAVIL )，酸胺咪嗪(TEGRETOL )，苯妥英(phenyltoin) (DILANTIN ),加巴噴丁(NEURONTIN ), (E)-N-香草基-8-甲基-6-壬烯酰胺(CAPSAICIN )，或神經(jīng)阻斷劑?！捌べ|(zhì)類固醇”指幾種合成的或天然存在的具有類固醇通用化學結(jié)構(gòu)的物質(zhì)之任一，其模擬或放大天然存在的皮質(zhì)類固醇的效應(yīng)。合成的皮質(zhì)類固醇的實例包括潑尼松，潑尼松龍(包括甲基潑尼松龍)，地塞米松，曲安西龍(triamcinolone)和倍他米松(betamethasone)。本文中使用的“癌癥疫苗”是刺激受試者的抗癌免疫反應(yīng)的組合物。癌癥疫苗的組成典型地是與癌癥相關(guān)的物質(zhì)或細胞(抗原)的來源(其對受試者可以是自體的(來自其自身)或同種異體的(來自別人)、以及其它組分(例如免疫佐劑)(以進一步刺激和提升對抗原的免疫反應(yīng))。癌癥疫苗可以導致刺激受試者的免疫系統(tǒng)，以產(chǎn)生抗一種或幾種特定抗原的抗體、和/或產(chǎn)生殺傷T細胞而攻擊具有這些抗原的癌細胞。本文中使用的“細胞毒性放射性治療”指抑制或阻止細胞的功能和/或?qū)е录毎茐牡姆派湫灾委?。放射性治療可以包括，例如體外射束照射或以放射性標記的試劑例如抗體進行治療。該術(shù)語旨在包括使用放射線同位素(例如At211、I131、I125、Y' Re186、Re188、Sm153、Bi212、Ra223、P32 和 Lu 的放射性同位素)?！笆茉囌摺笔羌棺祫游?，例如哺乳動物，例如人。哺乳動物包括但不限于農(nóng)畜(例如母牛)、運動動物、寵物(例如貓、狗和馬)、靈長類動物、小鼠和大鼠。除非上下文另有說明，否則術(shù)語“第一”多肽和“第二”多肽及其變體只是通用表述，其不應(yīng)被理解為標識本發(fā)明抗體的具體的或特定的多肽或組分。除非另有說明，按生產(chǎn)商的用法說明使用實施例中提及的商業(yè)獲取的試劑。在以下實施例中和整個說明書中通過ATCC保藏號標識的細胞來源于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection)，Manassas, VA。除非另有說明，本發(fā)明使用重組DNA技術(shù)的標準程序，例如上文和以下教科書中描述的程序Sambrook等，同上；Ausubel等,Current Protocols in Molecular Biology(Green Publishing Associatesandffiley Interscience, NY, 1989);Innis 等,PCR Protocols:A Guide toMethods andApplications(Academic Press, Inc. ,NY, 1990);Harlow 等,Antibodies:A LaboratoryManual(Cold Spring Harbor Press, ColdSpring Harbor, 1988);Gait, Oligonucleotide Synthesis(IRL Press, Oxford, 1984);Freshneyj Animal Cell Culture, 1987;Coligan等，Current Protocolsin Immunology，1991。在整個本說明書和權(quán)利要求中，表述“包含”或其變體應(yīng)被理解為暗指包括所述及的整體或整體組，但不排除任何其它整體或整體組。II.異源多聚體蛋白質(zhì)的構(gòu)建典型地，本文中描述的異源多聚體蛋白質(zhì)將包含抗體Fe區(qū)的顯著部分。然而，在其它方面，重鏈包含CH1、Ch2和/或Ch3區(qū)的僅一部分。異源多聚化區(qū)域異源多聚體蛋白質(zhì)包含異源多聚化區(qū)域。為了產(chǎn)生基本上同質(zhì)的異源二聚體分子群體，異源二聚化區(qū)域必須具有形成異源二聚體超過同源二聚體的強烈偏向。盡管本文中 示例的異源多聚體蛋白質(zhì)使用鼓突入洞技術(shù)來促進異源多聚化，但本領(lǐng)域技術(shù)人員將明了可以用于本發(fā)明的其它異源多聚化區(qū)域。鼓突入洞使用鼓突入洞作為生產(chǎn)多特異性抗體的方法在本領(lǐng)域公知。見美國專利號5，731，168，1998 年3 月 24 日授予并轉(zhuǎn)讓給 Genentech ；PCT 公布號 W02009089004，2009年7月16日公布，轉(zhuǎn)讓給Amgen ;和美國專利公開號20090182127，2009年7月16 日公布，轉(zhuǎn)讓給 Novo Nordisk Α/S。也見 Marvin 和 Zhu, Acta PharmacologicaSincia (2005) 26 (6) : 649-658 和 Kontermann (2005) Acta Pharacol. Sin. , 26:1-9。在此提供簡單討論?！巴黄稹敝笍牡谝欢嚯牡慕缑嫔斐霾⒁虼丝梢灾萌胂噜徑缑?即第二多肽的界面)中的互補性洞腔中的至少一個氨基酸側(cè)鏈，該置入使得可以例如穩(wěn)定異源多聚體化、和由此相對于同源多聚體的形成更利于異源多聚體的形成。突起可以存在于原始界面中或可以通過合成引入(例如，通過改變編碼界面的核酸)。通常，對編碼第一多肽的界面的核酸進行改變以編碼突起。為了達到該目的，以至少一個“輸入”氨基酸殘基的編碼核酸，置換第一多肽界面中的至少一個“原始”氨基酸殘基的編碼核酸，所述“輸入”氨基酸具有比原始氨基酸殘基大的側(cè)鏈體積。應(yīng)理解的是，可以有一個以上的原始和對應(yīng)輸入殘基。可以被置換的原始殘基的數(shù)量的上限是第一多肽界面中殘基的總數(shù)。各種氨基酸的側(cè)鏈體積顯示于下表中。表I、氨基酸殘基的特性
SII單字母縮寫|MASSa (道爾頓) I體積b(埃3)I可及表面積°(埃2)
丙氨酸(Ala) A71.0888 6Τ 5
精氨酸(Arg) R156.20173.4225
天冬酰胺(Asn)~N114. 11117. 7160
天冬氨酸(Asp)~ D115. 09111. I150
權(quán)利要求
1.制備異源多聚體蛋白質(zhì)的方法，所述異源多聚體蛋白質(zhì)包含具有第一異源二聚化區(qū)域的第一含鉸鏈的多肽、和具有第二異源二聚化區(qū)域的第二含鉸鏈的多肽，其中第二異源二聚化區(qū)域與第一異源二聚化區(qū)域相互作用，且其中第一和第二含鉸鏈的多肽通過至少一個鏈間二硫鍵連接，所述方法包括步驟 (a)培養(yǎng)包含編碼第一含鉸鏈的多肽的第一核酸的第一宿主細胞，其中在表達該含鉸鏈的多肽的條件下進行該培養(yǎng)； (b)培養(yǎng)包含編碼第二含鉸鏈的多肽的核酸的第二宿主細胞，其中在表達該含鉸鏈的多肽的條件下進行該培養(yǎng)； (C)破壞第一和第二宿主細胞的細胞膜，其中第一和第二宿主細胞已在單個懸浮液中組合在一起；和 (d)回收異源多聚體蛋白質(zhì)， 其中所述方法不需要添加還原劑。
2.制備異源多聚體蛋白質(zhì)的方法，所述異源多聚體蛋白質(zhì)包含具有第一異源二聚化區(qū)域的第一含鉸鏈的多肽、和具有第二異源二聚化區(qū)域的第二含鉸鏈的多肽，其中第二異源二聚化區(qū)域與第一異源二聚化區(qū)域相互作用，且其中第一和第二含鉸鏈的多肽通過至少一個鏈間二硫鍵連接，所述方法包括步驟 (a)提供純化的具有第一異源二聚化區(qū)域的第一含鉸鏈的多肽； (b)提供純化的具有第二異源二聚化區(qū)域的第二含鉸鏈的多肽； (C)將第一和第二含鉸鏈的多肽組合； (d)在體外在允許該分離的第一含鉸鏈的多肽與第二含鉸鏈的多肽多聚化的條件下，使第一含鉸鏈的多肽與第二含鉸鏈的多肽重折疊；和 (e)回收異源多聚體蛋白質(zhì)復合物。
3.權(quán)利要求I或2的方法，其中第一異源二聚化區(qū)域和第二異源二聚化區(qū)域在界面相遇，第二異源二聚化區(qū)域的界面部分包含突起，所述突起可置入第一異源二聚化區(qū)域的界面部分中的腔洞中。
4.權(quán)利要求I或2的方法，其中第二異源二聚化區(qū)域是包含突起的Fe多肽或第一異源二聚化區(qū)域是包含腔洞的Fe多肽，或同時兩者。
5.權(quán)利要求I或2的方法，其中第一Fe多肽和第二 Fe多肽在界面相遇，其中第二 Fe多肽的界面包含突起，所述突起可置入第一 Fe多肽的界面中的腔洞中，其中該腔洞或突起或兩者是之前已經(jīng)被引入到第一和第二 Fe多肽的界面中的。
6.權(quán)利要求I或2的方法，其中第一異源二聚化區(qū)域和第二異源二聚化區(qū)域包含亮氨酸拉鏈。
7.權(quán)利要求I或2的方法，其中第一異源二聚化區(qū)域和第二異源二聚化區(qū)域包含卷曲螺旋。
8.權(quán)利要求I或2的方法，其中鏈間二硫鍵位于抗體的鉸鏈區(qū)。
9.權(quán)利要求I或2的方法，其中所述鏈間二硫鍵位于鉸鏈區(qū)之間。
10.權(quán)利要求I或2的方法，其中所述二硫鍵是分子間的。
11.權(quán)利要求I或2的方法，其中所述分子間二硫鍵位于兩個包含免疫球蛋白鉸鏈的多肽鏈的半胱氨酸之間。
12.權(quán)利要求I或2的方法，其中含鉸鏈的多肽包含Ch結(jié)構(gòu)域或其變體。
13.權(quán)利要求I或2的方法，其中含鉸鏈的多肽包含F(xiàn)e區(qū)或其變體。
14.權(quán)利要求I或2的方法，其中第一含鉸鏈的多肽是抗體重鏈。
15.權(quán)利要求I或2的方法，其中第二含鉸鏈的多肽是抗體重鏈。
16.權(quán)利要求I或2的方法，其中第一含鉸鏈的多肽是與抗體輕鏈配對的抗體重鏈。
17.權(quán)利要求I或2的方法，其中第二含鉸鏈的多肽是與抗體輕鏈配對的抗體重鏈。
18.權(quán)利要求16或17的方法，其中含鉸鏈的多肽與抗體輕鏈多肽配對形成靶標結(jié)合臂。
19.權(quán)利要求I或2的方法，其中含鉸鏈的多肽包含人Ch2和/或Ch3結(jié)構(gòu)域的至少一部分。
20.權(quán)利要求I或2的方法，其中一對含鉸鏈的多肽和輕鏈多肽是人源化的，或者兩對均是人源化的。
21.權(quán)利要求I的方法，其中含鉸鏈的多肽和輕鏈多肽在分開的表達質(zhì)粒上編碼。
22.權(quán)利要求I的方法，其中含鉸鏈的多肽和輕鏈多肽在相同的表達質(zhì)粒上編碼。
23.權(quán)利要求I的方法，其中宿主細胞選自原核細胞、真核細胞、哺乳動物細胞和植物細胞。
24.權(quán)利要求I的方法,其中宿主細胞是原核細胞。
25.權(quán)利要求24的方法，其中所述原核細胞是大腸桿菌細胞。
26.權(quán)利要求25的方法，其中所述大腸桿菌細胞是Ipp缺陷型。
27.權(quán)利要求I的方法，其中宿主細胞是哺乳動物細胞。
28.權(quán)利要求27的方法，其中所述哺乳動物細胞是CHO細胞。
29.權(quán)利要求I的方法，其中第一宿主細胞和第二宿主細胞在分開的細胞培養(yǎng)物中。
30.權(quán)利要求I的方法，其中步驟(a)和(b)的細胞在包含這兩種宿主細胞的混合培養(yǎng)物 中。
31.權(quán)利要求29的方法，其中在破壞細胞膜之前，將步驟(a)和(b)的細胞混合、離心和重懸浮于緩沖液中。
32.權(quán)利要求29的方法，其中，將步驟(a)和(b)的細胞離心和重懸浮于緩沖液中，然后組合，之后破壞細胞膜。
33.權(quán)利要求I的方法，其中破壞細胞膜選自對細胞膜進行通透化和使細胞膜解體。
34.權(quán)利要求I的方法，其中破壞細胞膜選自細胞裂解、超聲、滲壓震擾、通過微流化器、加入EDTA、各種洗滌劑、溶劑(例如甲苯、二甲基亞砜等)、表面活性劑(例如Triton-X100、吐溫20等)、低滲緩沖液、使用凍/融技術(shù)、電穿孔、和通過不銹鋼球勻漿器。
35.權(quán)利要求I或2的方法，其中回收步驟還包括至少一個純化步驟。
36.權(quán)利要求I或2的方法，還包括步驟 (a)在包含蛋白A的柱上捕獲所述抗體， (b)從所述柱上洗脫所述抗體，和 (C)將所述洗脫的抗體稀釋到包含離液劑或溫和洗滌劑的溶液中。
37.權(quán)利要求I或2的方法，其中異源多聚體蛋白質(zhì)選自抗體、雙特異性抗體、多特異性抗體、單臂抗體、多特異性單價抗體、雙特異性maxibody、monobody、免疫粘附素、肽體、雙特異性肽體、單價肽體和親和體。
38.權(quán)利要求37的方法，其中異源多聚體蛋白質(zhì)是抗體。
39.權(quán)利要求37的方法，其中異源多聚體蛋白質(zhì)是雙特異性抗體。
40.權(quán)利要求37的方法，其中異源多聚體蛋白質(zhì)是多特異性抗體。
41.權(quán)利要求37的方法，其中異源多聚體蛋白質(zhì)是單臂抗體。
42.權(quán)利要求37的方法，其中所述抗體包含重鏈恒定區(qū)和輕鏈恒定區(qū)。
43.權(quán)利要求37的方法，其中所述抗體是人源化的。
44.權(quán)利要求37的方法，其中所述抗體是全長抗體。
45.權(quán)利要求44的方法，其中所述全長抗體包含重鏈和輕鏈。
46.權(quán)利要求16或17的方法，其中重鏈和輕鏈多肽之一或兩者是人的。
47.權(quán)利要求37的方法，其中所述抗體是人的。
48.權(quán)利要求37的方法，其中抗體是包含人Ch2和/或Ch3結(jié)構(gòu)域的至少一部分的抗體片段。
49.權(quán)利要求48的方法，其中所述抗體片段是Fe融合多肽。
50.權(quán)利要求37的方法，其中抗體選自IgG、IgA和IgD。
51.權(quán)利要求50的方法，其中抗體是IgG。
52.權(quán)利要求51的方法，其中抗體是IgGl。
53.權(quán)利要求51的方法，其中抗體是IgG2。
54.權(quán)利要求37的方法，其中抗體是治療性抗體。
55.權(quán)利要求37的方法，其中抗體是激動劑抗體。
56.權(quán)利要求37的方法，其中抗體是拮抗劑抗體。
57.權(quán)利要求37的方法，其中抗體是診斷性抗體。
58.權(quán)利要求37的方法，其中抗體是封閉抗體。
59.權(quán)利要求37的方法，其中抗體是中和抗體。
60.權(quán)利要求37的方法，其中抗體能夠與腫瘤抗原結(jié)合。
61.權(quán)利要求60的方法，其中腫瘤抗原不是細胞表面分子。
62.權(quán)利要求60的方法，其中腫瘤抗原不是分化群因子。
63.權(quán)利要求37的方法，其中抗體能夠與分化群因子結(jié)合。
64.權(quán)利要求37的方法，其中抗體能夠與細胞存活調(diào)節(jié)因子結(jié)合。
65.權(quán)利要求37的方法，其中抗體能夠與細胞增殖調(diào)節(jié)因子特異性結(jié)合。
66.權(quán)利要求37的方法，其中抗體能夠與和組織發(fā)育或分化相關(guān)的分子結(jié)合。
67.權(quán)利要求37的方法，其中抗體能夠與細胞表面分子結(jié)合。
68.權(quán)利要求37的方法，其中抗體能夠與淋巴因子結(jié)合。
69.權(quán)利要求37的方法，其中第一對和第二對的輕鏈包含不同的可變區(qū)序列。
70.權(quán)利要求37的方法，其中多肽的至少45%形成所述雙特異性抗體。
71.權(quán)利要求39的方法，其中所述雙特異性抗體能夠特異性結(jié)合兩個靶標分子。
72.權(quán)利要求71的方法，其中第一臂特異性結(jié)合第一靶標分子，第二臂特異性結(jié)合第二革El標分子。
73.權(quán)利要求I或2的方法，其中多肽的至少45%存在于復合物中，所述復合物包含第一含鉸鏈的多肽和輕鏈對以及第二含鉸鏈的多肽和輕鏈對。
74.權(quán)利要求I或2的方法，其中在純化抗體的步驟之前，分離的多肽中不超過10%以單體或同源二聚體存在。
75.權(quán)利要求71的方法，其中第一對和第二對的輕鏈包含不同的可變區(qū)序列。
76.權(quán)利要求71的方法，其中第一和第二重鏈-輕鏈對各包含通過二硫鍵互相連接的重鏈和輕鏈。
77.權(quán)利要求71的方法，其中第一對和第二對之間的pi值差異為至少O.5。
78.通過權(quán)利要求1-2之任一生產(chǎn)的異源多聚體蛋白質(zhì)。
79.權(quán)利要求78的異源多聚體蛋白質(zhì)，其中異源多聚體蛋白質(zhì)是多特異性抗體。
80.權(quán)利要求78的異源多聚體蛋白質(zhì)，其中異源多聚體蛋白質(zhì)能夠結(jié)合至少2個靶標分子。
81.權(quán)利要求78的異源多聚體蛋白質(zhì)，其中異源多聚體蛋白質(zhì)是能夠結(jié)合相同抗原上的至少2個表位的抗體。
82.根據(jù)權(quán)利要求I或2的方法生產(chǎn)的雙特異性抗體。
83.包含第一對重鏈和輕鏈多肽以及第二對重鏈和輕鏈多肽的雙特異性抗體，其中所述輕鏈多肽包含不同的可變區(qū)序列。
84.包含權(quán)利要求78的異源多聚體蛋白質(zhì)及載體的組合物。
85.包含至少10%的權(quán)利要求78的異源多聚體蛋白質(zhì)的組合物。
86.包含根據(jù)權(quán)利要求78的異源多聚體蛋白質(zhì)的藥物組合物。
87.產(chǎn)生異源多聚體蛋白質(zhì)組合文庫的方法，其中所述異源多聚體蛋白質(zhì)包含具有第一異源二聚化區(qū)域的第一含鉸鏈的多肽、和包含具有第二異源二聚化區(qū)域的第二含鉸鏈的多肽，其中第二異源二聚化區(qū)域與第一異源二聚化區(qū)域相互作用，其中第一和第二含鉸鏈的多肽通過至少一個鏈間二硫鍵連接，所述方法包括步驟 (a)培養(yǎng)第一宿主細胞和至少兩種另外的宿主細胞,其中 i.所述第一宿主細胞包含第一核酸，所述核酸編碼包含第一異源二聚化區(qū)域的多肽；和 .所述另外的宿主細胞包含核酸，所述核酸編碼包含第二異源二聚化區(qū)域的多肽， (b)破壞第一宿主細胞和至少兩種另外的宿主細胞的細胞膜，以使包含第一和第二異源二聚化區(qū)域的多肽釋放到細胞外環(huán)境中，其中該第一宿主細胞和至少兩種另外的宿主細胞已經(jīng)在單個懸浮液中組合在一起；和 (c)回收異源多聚體蛋白質(zhì)， 其中所述方法不需要添加還原劑。
88.權(quán)利要求I或2的方法，其中第一含鉸鏈的多肽與抗體輕鏈多肽配對形成第一靶標結(jié)合臂，第二含鉸鏈的多肽與抗體輕鏈多肽配對形成第二靶標結(jié)合臂。
89.權(quán)利要求88的方法，其中每一個或兩個結(jié)合臂能夠結(jié)合一個以上的靶標。
全文摘要
本申請描述用于高效生產(chǎn)能夠特異性結(jié)合多個靶標的抗體和其它多聚體蛋白質(zhì)復合物(在本文中統(tǒng)稱為異源多聚體蛋白質(zhì))的方法。所述靶標可以是例如單個分子上的不同表位或位于不同分子上。該方法將異源多聚體蛋白質(zhì)的高效高基因表達水平、正確組裝和易于純化組合在一起。本發(fā)明還提供使用這些異源多聚體蛋白質(zhì)的方法，和包含這些抗體的組合物、套盒和制品。
文檔編號C07K16/46GK102946906SQ201180031150
公開日2013年2月27日 申請日期2011年4月22日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月23日
發(fā)明者J·舍爾, C·斯皮斯, D·G·延蘇拉 申請人:弗·哈夫曼-拉羅切有限公司