專利名稱：蘇云金桿菌殺蟲工程菌及其構建方法
技術領域：
本發(fā)明屬于蘇云金桿菌(Bacillus thuringiensis，簡稱Bt)基因工程技術領域，具體涉及一種蘇云金桿菌殺蟲工程菌及其構建方法。
蘇云金桿菌殺蟲劑是目前國內外生產量最大、應用面積最廣的一種微生物殺蟲劑，具有無污染、無殘毒、對靶害蟲專一和對人畜、植物等非目標生物安全等優(yōu)點。但利用天然Bt菌株生產的殺蟲劑也存在缺點，如殺蟲譜窄、毒力不夠強等，而且害蟲也會對Bt產生抗性。斜紋夜蛾(Spodoptera litura)和甜菜夜蛾(SPodoptera exigua)都是雜食性害蟲，食量大且分布廣，對多種農作物尤其是蔬菜危害嚴重，而且已對許多化學殺蟲劑產生了抗性，同時也是典型的對Bt殺蟲劑不夠敏感的害蟲。自八十年代中期以來，已有大量實驗數據與統(tǒng)計資料證明，昆蟲會象對付化學農藥一樣發(fā)展自己對Bt的抗性。在我國深圳地區(qū)連續(xù)使用Bt的田間，已經發(fā)現了高抗性的小菜蛾(Plutella xylostella)。在夏威夷連續(xù)兩年使用Bt殺蟲劑后，小菜蛾種群對B.t.subsp.kurstaki的敏感性下降了25-30倍。在Bt廣泛和大量使用的臺灣和菲律賓地區(qū)，也有小菜蛾對Bt敏感性降低的報道。其他一些抗性昆蟲亦陸續(xù)見諸報道，如埃及伊蚊(Aedes aegypti)、干果斑螟(Cadracautella)、煙芽夜蛾(Heliothis vtrescens)、向日葵同斑螟(Homoeosoma electellum)及馬鈴薯葉甲(Lepinotarsa decemlineata)等。最近，Monsanto公司推出不久的轉Bt-ICP基因的棉花已完全失去抗棉鈴蟲的能力。因此對Bt進行遺傳改良，擴大殺蟲范圍，提高晶體蛋白的產量和毒力，延緩害蟲產生抗性等，對于充分發(fā)揮Bt制劑綜合效能具有特別重要的意義。
蘇云金桿菌對昆蟲的毒性主要靠菌體產生的各種殺蟲晶體蛋白(Insecticidal CrystalProteins,ICPs)，這些ICPs具有殺蟲的專一性，研究已證明大多數ICPs的編碼基因位于菌體內的大質粒上。Bt在形成芽孢時能形成由殺蟲晶體蛋白構成的伴孢晶體，當敏感害蟲吞食后，在昆蟲中腸內晶體蛋白溶解、一級結構發(fā)生變化而被激活為活性毒素并與特異性受體結合，最終導致膜穿孔使取食昆蟲感染并逐漸死亡(Adang,1991；龍綮新、龐義，1994)。目前已報道的ICP基因有135個，根據其編碼蛋白的氨基酸序列同源性的大小被劃分為24群48類71亞類，具有溶細胞作用的ICP基因歸為cyt系列如cyt1、cyt2，其余都歸入cry系列如cry1、cry2等(Crickmore,1998)。ICP基因編碼的蛋白，其N-端為毒性區(qū)，決定ICPs對靶昆蟲的毒力，C-端為保守區(qū)，與其對靶昆蟲的專一性(specificity)有關。
cry11Aa基因(EMBL Accession NO.X03182)和cyt1Aa基因(EMBL Accession No.M31737或J03510)克隆自蘇云金桿菌莫里遜亞種(B.t.subsp.morrisoni),cyt1Aa基因原名cytA，表達27kDa蛋白，在靶昆蟲中腸消化液中被激活為25kDa的核心毒素cry11Aa基因原名cryIVD，表達67kDa蛋白，在靶昆蟲中腸消化液中被激活為40kDa的核心毒素。兩者對雙翅目的蚊子及黑蠅具高毒效，前者還有廣譜溶細胞特性；此外，在研究害蟲對Bt抗性過程中人們發(fā)現廣譜溶細胞的Cyt1Aa蛋白，不但對其它ICPs有協(xié)同增效作用，而且可能有克服或延緩目標害蟲對Bt制劑產生抗性的作用。但目前對鱗翅目、鞘翅目害蟲有效的Bt制劑中均不含Cyt1Aa蛋白。另外，現有含有cyt1Aa和cry11Aa基因的蘇云金桿菌其所含這兩個基因均位于大質粒上。而通過質粒轉移或ICPs的共表達構建蘇云金桿菌重組菌株，以期擴大Bt殺蟲譜和增強毒力，常因質粒的不穩(wěn)定性和質粒間的排斥性而受到一定限制(莊美寶、龐義，1995)。
本發(fā)明的目的是通過遺傳工程方法提供一種含有cyt1Aa和cry11Aa基因的殺蟲蘇云金桿菌工程菌及其構建方法，該工程菌具有高毒、廣譜、遺傳穩(wěn)定且害蟲不易產生抗性等優(yōu)點，從而解決已有Bt制劑所存在的上述問題。
本發(fā)明的蘇云金桿菌殺蟲工程菌的特征是其染色體DNA中含有cyt1Aa和cry11Aa基因。
上述工程菌的代表菌株Bt-TnY已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC，中國，武漢大學校內)，保藏編號CCTCC M98017，保藏日1998年11月26日。該菌株Bt-TnY的染色體DNA中含有cyt1Aa和cry11Aa基因，主要產生130、60、67和27kDa的4種殺蟲晶體蛋白(如圖6)。
本發(fā)明的蘇云金桿菌殺蟲工程菌的構建方法是把cyt1Aa和cry11Aa基因分別克隆到鏈球菌(Streptococcus faecalis)的轉座子Tn917(Youngman,1983；1984)(如

圖1)載體pTV1TS(Sandman&Youngman,1987)上，然后同時轉入出發(fā)菌中，使這兩個基因整合到出發(fā)菌染色體上，得到第一代工程菌，再將這工程菌與出發(fā)工程菌進行原生質體融合，從而獲得目標工程菌。其具體步驟如下1．分別在Tn917的tnpA序列區(qū)中，以HindⅢ酶切去掉1.3kbp的DNA片段，再插入8kbp左右的目標基因(cyt1Aa和cry11Aa基因)DNA片段，從而分別得到含cyt1Aa基因和含cry11Aa基因的轉座子衍生載體pTYP45和pTYP26。這兩個目標基因直接來源于質粒pWF45和pWF25，質粒pWF45含有cyt1Aa基因和20kDa蛋白基因及啟動子(Wu,etal.,1993)，而質粒pWF26含有cry11Aa和20kDa蛋白基因(Wu,et al.,1995)。將tnpA基因克隆到B.t-E.coli穿梭質粒pHT3101(D.Lereclus,et al.,1989)上，得到一個非轉座載體質粒pHtnpA 。上述載體pTYP45、pTYP26和pHtnpA的構建過程分別如圖2、圖3和圖4所示。
由于在Tn917的tnpA序列區(qū)中，以HindⅢ酶切去掉1.3kbp的DNA片段，再插入8kbp左右的目的基因DNA片段，這樣，重組的轉座子衍生載體pTYP26和pTYP45實際上轉座酶基因已失活，不能再表達TnpA蛋白，理論上轉座作用不能發(fā)生，需要依靠一個非轉座載體質粒pHtnpA的幫助。由于整合進染色體的轉座酶基因tnpA已失活，因而可避免在自然界中二次轉座作用的發(fā)生；外源基因隨染色體DNA的復制而復制，遺傳穩(wěn)定，不會擴散于環(huán)境中，安全性高。
2．用高壓電激法同時把pTYP26、pTYP45和pHtnpA(按1∶1∶1)轉入出發(fā)菌，在含紅霉素的培養(yǎng)基上篩選轉化子。分別提取質粒DNA和總DNA，用目標DNA片段標記為探針，經Dot blot和Southern blot鑒定，并經PCR驗證，獲得目的基因整合進染色體的第一代工程菌。所得到的轉座頻率為5.9×10-5，共合體折分率為97％。上述得到的第一代工程菌能高水平表達Cyt1Aa和Cry11Aa蛋白，對雙翅目昆蟲(如蚊子和黑蠅等)幼蟲有高毒，如對庫蚊的毒力LC50達10～80ng/ml。
由于在篩選工程菌過程中，多次進行42℃高溫處理，因高溫處理可促進轉座作用的進行及富集染色體上多點插入突變菌，但也極易使存在于菌體中的質粒丟失。第一代工程菌基本上丟失了原出發(fā)菌株的大部分質粒。蘇云金桿菌大多數伴孢晶體的結構基因及調節(jié)基因位于較大的質粒上，其大小為33-150MD，目前尚未在小于30MD的質粒上發(fā)現有毒素基因。
3．將第一代工程菌與出發(fā)菌與進行原生質體融合，融合子重新獲得大質粒。對融合子進行晶體鏡檢、質粒圖譜分析、PCR、SDS-PAGE及生物測定等，最后獲得目標工程菌。
本發(fā)明的殺蟲蘇云金桿菌的具體構建過程如圖5所示。
上述方法中所用的出發(fā)菌通常選用較高殺蟲活性的Bt菌株。本發(fā)明所用的優(yōu)選菌株是從德國土壤中分離的菌株Bt-S184(用特定引物對其PCR檢測，可檢出cry1和cry2型ICP基因)所得到的目標工程菌即為Bt-TnY(CCTCC M98017)。經SDS-PAGE蛋白電泳分析、PCR檢測等表明，Bt-TnY產生的伴孢晶體除含有出發(fā)菌株Bt-S184的130kD和60kD兩個主要蛋白外，還含有外源基因cyt1Aa和cry11Aa的表達產物27kD和67kD蛋白。進一步的生物測定證實，該工程菌不但對鱗翅目的斜紋夜蛾(Spodoptera litura)和甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)等難治的夜蛾科害蟲以及棉鈴蟲有高毒，而且對雙翅目的蚊子也有強烈毒殺作用；初步實驗證明該菌還有延緩害蟲產生抗性的作用；室內試驗證實了工程菌株Bt-ThY有良好的遺傳穩(wěn)定性。Bt-TnY是一株高毒、廣譜的殺蟲Bt工程菌。
在工程菌Bt-TnY中，目標基因cyt1Aa和cry11Aa通過非轉座載體介導整合進染色體基因組中，并獲得穩(wěn)定的高效表達在光學顯微鏡和電子顯微鏡下，可看見菱形、方形、不規(guī)則形和卵圓形伴孢晶體(如表四)。SDS-PAGE分析顯示有四條主帶，分子量分別為130、60、67和27kDa(如圖6)。由于非轉座載體pHtnpA上的轉座酶基因隨著熱處理(42℃)質粒的丟失而丟失，發(fā)生二次轉座的可能性很小，目的基因能隨受體菌的分裂、傳代而穩(wěn)定遺傳，連續(xù)培養(yǎng)100代，丟失頻率小于10-5。
本發(fā)明所采用的轉座子Tn917的衍生載體pTV1TS如圖1所示。Tn917作為特別有效的插入突變介導具有如下特征(a)Tn917插入染色體、質?；蚴删w具有相當高的隨機性。Tn917可在不同染色體或染色體不同位點上形成插入突變子，但Tn917的插入在染色體上具有區(qū)域優(yōu)先性。(b)Tn917轉座頻率相當高，轉座染色體的頻率為10-5，質粒為10-4。(c)Tn917插入突變非常穩(wěn)定，回復率小于10-10。(d)Tn917允許容納8kbp的外源DNA而對其轉座頻率無影響。(e)在Bs或其它許多G+菌中，可利用Tn917攜帶的Emr作選擇壓力(余健秀、龐義，1998)。pTV1TS由轉座子Tn917、溫度敏感復制子Ts-Rep和存在于轉座子序列之外的cat基因三部分構成。該載體具有如下兩大優(yōu)點(a)較低溫(38～48℃)可以富集染色體上有轉座插入的菌落。(b)染色體上含有轉座插入的菌落可以不必在選擇壓力溫度而在32℃下直接鋪平板而得到。pTV1TS不帶有任何危險的標記基因，對人類和生態(tài)環(huán)境沒有或危害的可能性極小。
圖1是轉座子Tn917的衍生載體pTV1TS的結構示意圖。
圖2是衍生載體pTYP45的結構及其構建過程示意圖。
圖3是衍生載體pTYP26的結構及其構建過程示意圖。
圖4是非轉座載體pHtnpA的結構及其構建過程示意圖。
圖5是本發(fā)明工程菌的構建過程示意圖。
圖6是本發(fā)明的野生菌株Bt-S184和工程菌Bt-TnX、Bt-TnY的SDS-PAGE分析。圖中M代表標準蛋白，X代表Bt-TnX,Y代表Bt-TnY,S代表Bt-S184。Bt-TnY主要含有Cry11Aa(67kDa)、Cyt1Aa(27kDa)、Cry1(130kDa)和Cry2(60kDa)四種蛋白Bt-TnX主要含有Cry11Aa(67kDa)、Cyt1Aa(27kDa)和Cry1(130kDa)三種蛋白；Bt-S184主要含有Cry1(130kDa)和Cry2(60kDa)兩種蛋白。
以下通過工程菌Bt-TnY的構建實例及應用實例對本發(fā)明作進一步說明。一．Bt-TnY的構建(1)在液體培養(yǎng)基富集衍生轉座子整合進Bt染色體的陽性菌落利用高壓電激法同時把pTYP26、pTYP45和pHtnpA(按1∶1∶1)轉入Bt-S184受體菌，電激后靜置30分鐘，在32℃25ml LB液體培養(yǎng)基(含1μg/ml Em、5μg/ml Cm及25μg/ml Lm)在250ml錐瓶振搖至中對數生長期。按1∶20稀釋上述菌液，42℃繼續(xù)培養(yǎng)，只加入針對轉座子的抗生素Em(1μg/ml)。再按1∶20稀釋，置42C,1μg/ml Em繼續(xù)培養(yǎng)至晚對數期(3-5h)。以4000rpm離心5分鐘收集菌體。用原體積數的1/25的10％甘油懸浮沉淀，然后分裝于EP管中，迅速放入到液氮中保存?zhèn)溆谩?2)初選陽性菌落取晚對數期培養(yǎng)液100-200μl在含1μg/ml Em的LB固體平板上劃線，12-16小時培養(yǎng)。挑取單菌落接種到含1μg/ml Em的LB固體平板上，待生長成2-3mm。同時計算轉座子衍生質粒的轉座頻率及共合體拆分率。(3)挑選有意義的陽性菌落上述單菌落在含Em的LB液體培養(yǎng)基中32℃搖床培養(yǎng)，3天收獲菌體，進行SDS-PAGE鑒定外源基因表達與否。同時分別進行總DNA(包括染色體、質粒)和質粒DNA的酶切后，進行Southern分析，探針標記采用Dig法。這樣得到了第一代工程菌Bt-TnX。(4)已知大多數ICPs的編碼基因位于菌體內的大質粒上，但42℃高溫處理使存在于菌體中的大質粒極易丟失。所以必須進行出發(fā)菌與陽性菌的原生質體融合，采取如下路線種的復壯-抗生素梯度試驗一原生質體形成及再生曲線一原生質體融合--融合子的篩選。這樣得到了目標工程菌Bt-TnY。(5)工程菌遺傳穩(wěn)定性試驗在無選擇壓力下連續(xù)繼代培養(yǎng)50-100代，稀釋涂板，進行抗性檢測和生產檢測，穩(wěn)定系數達到98.1％。將目的基因整合到不同Bt菌株染色體上的方法與上述相同。二．工程菌Bt-TnY應用實例a．室內外試驗證實該工程菌株具有高毒、廣譜和遺傳穩(wěn)定的特點，對鱗翅目害蟲如斜紋夜蛾(Spodoptera litura)、銀紋夜蛾(Arrgyrogramma agnata)、甜菜夜蛾(Spodopteraexigua)、小菜蛾(Plutella xylostella)、小菜粉蝶(Pieris rapae)、玉米螟(Ostrinianubilalis)和棉鈴蟲(Heliothis armigera)等幼蟲有更高毒效并能延緩或克服害蟲抗性，同時擴大殺蟲譜即兼殺雙翅目害蟲(如蚊子)。
表一是工程菌Bt-TnY對斜紋夜蛾的生物測定。
表二是工程菌Bt-TnY對銀紋夜蛾的生物測定。
權利要求
1．一種蘇云金桿菌(Bacillus thuringiensis,Bt)殺蟲工程菌，其特征在于其染色體DNA中含有cyt1Aa基因和cry11Aa基因。
2．按照權利要求1所述的殺蟲蘇云金桿菌工程菌，其特征在于該菌株為Bt-TnY(CCTCC M98017)。
3．權利要求1所述蘇云金桿菌殺蟲工程菌的構建方法，其特征是把cyt1Aa和cry11A基因分別克隆到鏈球菌的轉座子Tn917載體pTV1Ts上，然后同時轉入出發(fā)菌中，得到第一代工程菌，再將該工程菌與出發(fā)菌進行原生質體融合，從而獲得目標工程菌。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種染色體DNA中含有cytlAα和cryllAα基因的蘇云金桿菌(Bacillus thuringiensis)殺蟲工程菌及其構建方法。該工程菌是利用轉座子衍生載體pTV1TS將cytlAα和cryllAα基因導入受體染色體中,并使之缺失轉座酶而獲得的。室內外試驗證實該工程菌株具有高毒、廣譜和遺傳穩(wěn)定的特點,對鱗翅目害蟲有更高毒效并能延緩或克服害蟲抗性,同時擴大殺蟲譜即兼殺雙翅目害蟲。
文檔編號C12N15/34GK1224760SQ9812223
公開日1999年8月4日 申請日期1998年12月3日 優(yōu)先權日1998年12月3日
發(fā)明者龐義, 余健秀, 鄧日強, 龍綮新 申請人:中山大學