專利名稱：蘇云金桿菌分子伴侶基因、含有該基因的載體及菌株的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于蘇云金桿菌的基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種蘇云金桿菌殺蟲晶體蛋白的分子伴侶基因、含有該基因的載體及菌株。
蘇云金桿菌(Bacillus thuringiensis，簡稱Bt)殺蟲劑是目前國內(nèi)外生產(chǎn)量最大、應(yīng)用面積最廣的一種微生物殺蟲劑，具有無污染、無殘毒、對靶害蟲專一和對人畜、植物等非目標生物安全等優(yōu)點。蘇云金桿菌對昆蟲的致病作用主要靠殺蟲晶體蛋白(Insecticidal crystalproteins,ICPs)起作用，提高ICPs的產(chǎn)量即可提高產(chǎn)品的總毒力，降低生產(chǎn)成本。過去只從常規(guī)篩選和選育菌株著手，但其產(chǎn)量隨著菌種的退化而不穩(wěn)定或降低。
Ellis和Hemmingsen把分子伴侶定義為一類互不相關(guān)的細胞蛋白質(zhì)，它們能介導(dǎo)其他蛋白質(zhì)的正確裝配，但它們本身卻不是有功能的最終裝配產(chǎn)物的組成成分。目前對其作用的詳細機制還不清楚，分子伴侶概念已被廣泛用于幾乎所有動植物和細菌的蛋白質(zhì)裝配過程之中?，F(xiàn)已證明，許多細胞內(nèi)蛋白的裝配都需要一類稱做“分子伴侶”(molecularchaperone)的蛋白質(zhì)幫助才能完成。分子伴侶概念的提出并沒有否定“氨基酸的順序決定蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)”這一原則，只是補充和修正“自裝配”學(xué)說，它認為在活細胞中蛋白質(zhì)分子內(nèi)部或分子間以及與其它非蛋白質(zhì)分子間的相互作用都必須受到控制才能有效地形成有生物活性的正確裝配產(chǎn)物。分子伴侶就是這種有控制功能的蛋白質(zhì)，它能阻止不正確的相互作用以防止錯誤裝配。這里的裝配不僅指蛋白質(zhì)的折疊，也包括蛋白質(zhì)的多聚化和蛋白質(zhì)與其它非蛋白質(zhì)分子形成復(fù)雜的結(jié)構(gòu)。任何裝配過程都存在著因錯誤的相互作用而產(chǎn)生無功能活性的結(jié)構(gòu)的可能性。只有當這種可能性極小時“自裝配”才能自發(fā)完成。反之，正確的裝配就必須有分子伴侶的幫助。分子伴侶概念的提出是近十幾年來蛋白質(zhì)研究的一次飛躍。
在蘇云金桿菌中，國外實驗室已發(fā)現(xiàn)來源于蘇云金桿菌以色列亞種(Bacillusthuringiensis subsp.israelensis)，定位于cry11Aa下游的一個開放讀碼框ORF編碼20kDa蛋白，這個基因后來命名為P20基因。20kDa蛋白實際上具有“Chaperone”蛋白的作用。至目前為止，已經(jīng)證實20kDa蛋白可促進Cyt1Aa(Wu and Federici,1993；Visisck and Whiteley1991)、Cry4Aa(Yoshisue,1992)、Cry11Aa(Wu and Federici,1995)蛋白的從頭合成，有趣的是Cyt和Cry蛋白在氨基酸序列差異很大且生化特性也不一樣(Hofte and whiteley,1989)，這些暗示著20kDa蛋白可能對其他蛋白同樣有類似的功能，所以它在重組細胞中穩(wěn)定那些特別容易降解的蛋白可能是有益的(Visick and Whiteley,1991)。1997年Thiery等在medellin亞種中也克隆到相似的基因，命名為p21med，其功能未知。上述20kDa蛋白雖然能提高ICP“表達”基因的表達水平，但沒有關(guān)于它能激發(fā)ICP“沉默”基因的報道。ICP“表達”基因是指一個Bt菌株在正常培養(yǎng)條件下能夠表達的殺蟲晶體蛋白，這些蛋白的編碼基因處于表達狀態(tài)中，此類基因命名為ICP“表達”基因；ICP“沉默”基因是指一個Bt菌株在正常培養(yǎng)條件下由于未知的原因不能夠表達的殺蟲晶體蛋白，這些蛋白的編碼基因其實存在于該菌株的染色體或質(zhì)粒上，此類基因命名為ICP“沉默”基因。
本發(fā)明的目的之一是提供一個新的蘇云金桿菌殺蟲晶體蛋白的分子伴侶基因，該基因不僅能顯著提高野生型蘇云金桿菌ICP“表達”基因的表達水平和促進晶體的形成，且能激發(fā)蘇云金桿菌ICP“沉默”基因的高水平表達。
本發(fā)明的目的之二是提供含有上述基因的重組載體。
本發(fā)明的目的之三是提供一種含有上述基因的蘇云金桿菌及其構(gòu)建方法。
本發(fā)明的分子伴侶基因是從新分離的蘇云金桿菌Bt.ZB522菌株中克隆得到的，該基因與p20和p21med基因相比其同源性分別為97.8％和85.1％(如圖2和圖3所示)，該基因編碼21kDa蛋白，具有分子伴侶作用，命名為p21zb基因。p21zb基因的DNA和氨基酸序列已輸入國際數(shù)據(jù)庫EMBL，且已得到認可，其Accession NO為AJ011857，其全序列
公開日為1999年12月30日。
該基因的基本特征如下a．序列特征長度549bp，類型為核酸，雙鏈，線性b．分子類型DNAc．來源克隆自蘇云金桿菌d．DNA序列如

圖1所示。
本發(fā)明還構(gòu)建了含有上述p21zb基因的重組載體。該重組載體是將含有完整p21zb基因及其調(diào)控區(qū)的Pst1片段插入出發(fā)載體的多克隆位點而構(gòu)成的。出發(fā)載體可以是各種細菌如Bt、E.coli等的載體和病毒的載體。
上述所用的出發(fā)載體優(yōu)選Bt-E.coli穿梭載體pHT3101(D.Lereclus等,1989)，所構(gòu)建成的含p21zb基因的重組載體為pHZB1。pHZB1的結(jié)構(gòu)及構(gòu)建過程如圖6所示。
將含有完整p21zb基因及其調(diào)控區(qū)的Pst1片段插入pHT3101的多克隆位點，酶切分析篩選獲得重組質(zhì)粒pHZB1。外源片段的導(dǎo)入對pHT3101復(fù)制特性、穩(wěn)定性和安全性均無影響。
所采用的Bt-E.coli穿梭載體pHT3101(如圖6所示)，為法國巴斯德研究所D.Lereclus等人構(gòu)建。pHT3101由三部分構(gòu)成一個2.9kb的BalⅠ片段來源于Bt，為Bt中的復(fù)制子；一個1kb的紅霉素(Em)抗性基因，來源于鏈球菌；一個pUC18的全組件，由青霉素(Ap)抗性基因、多克隆位點、大腸桿菌的復(fù)制子和LacZ基因的5’-端α-lac片段組成。pHT3101是目前已知的蘇云金桿菌穩(wěn)定性較好的質(zhì)粒，能在Bt-E.coli中穩(wěn)定遺傳?；蚱尾迦氲蕉嗫寺∥稽c后導(dǎo)致LacZ基因失活，得到的重組克隆在含有IPTG和X-gal的LB-紅霉素/青霉素平板上是白色菌落。相反，非重組質(zhì)粒則可大腸桿菌宿主互補為藍色菌落。pHT3101及其衍生質(zhì)粒已在蘇云金桿菌的基因克隆和基因表達中得到廣泛應(yīng)用，質(zhì)粒遺傳性穩(wěn)定，不帶有任何危險的標記基因，對人類和生態(tài)環(huán)境沒有或危害的可能性極小。
本發(fā)明還提供了一種含有上述p21zb基因的蘇云金桿菌殺蟲工程菌。該工程菌是用本發(fā)明的上述含p21zb基因的重組載體pHZB1轉(zhuǎn)化蘇云金桿菌出發(fā)菌而獲得的。其具體構(gòu)建成方法為a．根據(jù)需要，選擇具有較高殺蟲活性的蘇云金桿菌為出發(fā)菌株；b．參照Schurter(1989)及Brain&Luke(1988)的方法制備出發(fā)菌的感受態(tài)細胞；c．采用高壓電激法將含p21zb基因的穿梭載體導(dǎo)入出發(fā)菌的感受態(tài)細胞；d．在抗生素板上篩選陽性菌落。抽提陽性菌落的質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM101或TG1，再提取質(zhì)粒，酶切分析確認陽性菌落，即為目標工程菌。
本發(fā)明的含有p21zb基因的蘇云金桿菌殺蟲工程菌還可通過將含p21zb基因的Bt重組載體經(jīng)轉(zhuǎn)座子載體(transposon vector)整合進Bt出發(fā)菌染色體中而獲得。
本發(fā)明的含有p21zb基因的蘇云金桿菌殺蟲工程菌的代表菌株為Bt-YPF22菌株。該菌株是由本發(fā)明的含有p21zb基因的重組載體pHZB1轉(zhuǎn)化野生菌株Bt-F2而獲得的。
上述工程菌Bt-YPF22已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC，中國，武漢大學(xué)校內(nèi))，保藏編號CCTCCM98018，保藏日1998年11月26日。
由該Bt-YPF22菌株即可直接提取得到本發(fā)明的重組載體質(zhì)粒pHZB1。質(zhì)粒pHZB1的復(fù)制方法參照Sambrook(1989)方法，轉(zhuǎn)化大腸桿菌如TG1或JM10，加入氨芐青霉素(100ug/ml)和紅霉素(50ug/ml)的培養(yǎng)基培養(yǎng)，堿法提取質(zhì)粒。
由質(zhì)粒pHZB1經(jīng)NsiⅠ/ClaⅠ酶切，可得約1.2kb的DNA片段；也可經(jīng)PstⅠ酶切，可得約1.5kb的DNA片段，即可獲得本發(fā)明的p21zb基因。
試驗表明，本發(fā)明的p21zb基因的表達產(chǎn)物有助于ICPs表達和形成晶體，具分子伴侶的功能，而且能激發(fā)蘇云金桿菌ICP“沉默”基因的高水平表達，是一個“增產(chǎn)”基因。含有此基因的重組質(zhì)粒pHZB1經(jīng)電激轉(zhuǎn)化至野生菌株Bt-F2，獲得工程菌株。在相同培養(yǎng)條件下，取等量培養(yǎng)物經(jīng)SDS-PAGE蛋白電泳證實，工程菌產(chǎn)生的晶體量提高一倍多。生物測定也表明，工程菌株的毒力明顯提高。這表明，p21zb基因具有增產(chǎn)增效的功能，用其構(gòu)建的工程菌的可獲得高產(chǎn)高毒的新性狀。
作為本發(fā)明工程菌Bt-YPF22的出發(fā)菌的蘇云金桿菌Bt-F2菌株從我國土壤中分離獲得。這株野生菌株產(chǎn)生的伴孢晶體為菱形，主要含分子量為130～140kDa和60～70kDa兩種蛋白，基因型屬于cry1和cry2。
在基因工程菌Bt-YPF22(CCTCC M98018)中，目的基因p21zb及其調(diào)控區(qū)片段位于高拷貝的重組質(zhì)粒pHZB1上，在受體菌中能穩(wěn)定遺傳和表達，在電子顯微鏡下能觀察到晶體數(shù)量明顯增多，晶體形狀也發(fā)生明顯變化，不僅有菱形，還有方形晶體，兩種形狀的晶體數(shù)量上均等。連續(xù)培養(yǎng)150代質(zhì)粒丟失頻率小于10-4/代。
以下通過附圖和實施例對本發(fā)明作進一步說明。
圖1是本發(fā)明的p21zb基因的DNA序列。
圖2是p21zb基因與p20基因的DNA序列同源性比較，顯示其同源性為97.8％，其中第一行為p21zb基因，第二行為p21基因。
圖3是p21zb基因與p21med基因的DNA序列同源性比較，顯示其同源性為85.1％。
圖4是p21zb蛋白與p20蛋白的氨基酸序列同源性比較，顯示其同源性為97.3％，其中第一行為p21zb蛋白，第二行為p20蛋白。
圖5是p21zb蛋白與p21med蛋白的氨基酸序列同源性比較，顯示其同源性為70.2％。
圖6是穿梭質(zhì)粒pHT3101的結(jié)構(gòu)及重組質(zhì)粒pHZB1的結(jié)構(gòu)和構(gòu)建過程示意圖。
圖7是工程菌Bt-YPF22和Bt-QS與相應(yīng)出發(fā)菌株的晶體蛋白SDS-PAGE對比分析圖M1和M2代表標準蛋白，Q代表Bt-QS,S代表Bt-S181,Y代表Bt-YPF22,F代表Bt-F2。
圖8是電激轉(zhuǎn)化晶體缺陷型菌株的晶體蛋白SDS-PAGE對比分析圖；M代表標準蛋白，B代表晶體缺陷型菌株BtK-BE20,Q代表晶體缺陷型菌株Bti-4Q7,T代表晶體缺陷型菌株Btt-P12；(+)表示經(jīng)pHZB1(p21zb基因)轉(zhuǎn)化。
實施例1．p1zb基因的制備過程從我室新分離菌株Bt-ZB522中提取質(zhì)粒，質(zhì)粒DNA經(jīng)PstⅠ酶切消化，隨機克隆于穿梭質(zhì)粒pHT3101上，并直接電激轉(zhuǎn)化晶體缺陷型菌株BtK-BE20，將轉(zhuǎn)化處理的受體菌涂布于含50ug/ml Em和100ug/ml Ap的LB平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)，在光學(xué)顯微鏡下觀察有無伴孢晶體產(chǎn)生，進而確定有效重組子。用此法篩選到的重組菌株之一JB001，能夠產(chǎn)生大卵圓型晶體。提取JB001的全部質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM101，獲得重組穿梭質(zhì)粒pHZB001，外源片段大小為1.6kbp的片段。
基因p21zb也可如前面所述，直接從Bt-YPF22(CCTCC M98018)菌株提取質(zhì)粒pHZB1,經(jīng)NsiⅠ/ClaⅠ酶切，可得約1.2kb的DNA片段；也可經(jīng)PstⅠ酶切，可得約1.5kb的DNA片段，p21zb基因(549bp)定位于這兩個片段上，即獲得本發(fā)明的p21zb基因。
實施例2．含p21zb基因的重組質(zhì)粒pHZB1的構(gòu)建a．設(shè)計2個引物PrimerⅠ:C[CTGCAG]GTCAACACCCTGGGTCAA，括號中為PstⅠ位點；PrimerⅡ:G[ATGCAT]TCATTGATGTTCGG，括號中為NsiⅠ位點；模板為質(zhì)粒pWF45，含有基因cryIA(c)的啟動子。通過PCR反應(yīng)獲得195bp的DNA片段，序列測定表明PCR產(chǎn)物是預(yù)期的；b．上述片段與pALTER-EX1/PstⅠ、NsiⅠ連接轉(zhuǎn)化，獲得重組質(zhì)粒pAL-P。；c．質(zhì)粒pAL-P經(jīng)PstⅠ/HindⅢ雙酶切獲295bp含啟動子的DNA片段，插入BluscriptM13-，得到質(zhì)粒pBL-P；d．p21zb基因的ORF、啟動子調(diào)控區(qū)域及轉(zhuǎn)錄終止區(qū)等定位于NsiⅠ/ClaⅠ雙酶切的1.2kb片段內(nèi)，把這個片段插入質(zhì)粒pBL-P，獲得重組質(zhì)粒pBL-P-CH；e．質(zhì)粒pBL-P-CH經(jīng)KpnⅠ/Bam HⅠ雙酶切，回收約1 5kb片段，插入pUC18，獲得配套質(zhì)粒pHZY1。
f．質(zhì)粒pBL-P-CH經(jīng)PstⅠ酶切，回收約1.5kb片段，插入pHT3101，獲得Bt表達載體質(zhì)粒pHZB1。
重組質(zhì)粒pHZB1也可如前面所述，直接從Bt-YPF22(CCTCC M98018)菌株提取得到。
實施例3．含p21zb基因的工程菌Bt-YPF22的構(gòu)建a．選擇具有較高殺蟲毒性的Bt-F2菌株作為出發(fā)菌株；b．參照Schuler(1989)及Brain&Luke(1988)的方法制備蘇云金桿菌感受態(tài)細胞；c．吸取0.01～0.05uf/ul的質(zhì)粒pHZB1加入到準備好的感受態(tài)細胞中，充分混勻，置冰浴10分鐘，移入預(yù)冷的電激杯中(0.2mm)，電壓1500v，電阻400～800進行電激，電激后迅速移入冰浴經(jīng)10分鐘，加入800ml SOC,30～35℃靜止培養(yǎng)1～2小時，然后取樣，涂布于青霉素和紅霉素雙抗板上篩選陽性菌落。由于pHZB1是Bt-E.coli的穿梭質(zhì)粒，可抽提陽性菌落的質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM101或TG1，再提取質(zhì)粒，酶切分析而排除假陽性菌落。確認的陽性菌落即為Bt-YPF22。
權(quán)利要求
1．蘇云金桿菌殺蟲晶體蛋白的分子伴侶基因，其特征在于該基因為p21zb，其DNA序列如下ATGACAGAAA ATGGAGTGTT TTATAAAATA TTCACAACAG AAAATAATAA TTTCTGTATA 60AATCCTACTT TGTTAGAAAG GGTTTTTAAA AATAATTTAG ATGAATTTGA TTTTTCGCTA 120GTAAAAAAAA ACTTAGAACA TGAGAAGAAT TGTGTGATTA CTTCTACAAT GAATCAAACA 180ATTTCTTTCG AGAATATGAA TAGTACAGAA ATGGGGCATA AGACATATTC CTTTTTAAAT 240CAAACAGTTT TAAATAATAA GGGGAAATCC TCTTTAGAGG AACAAGTCTC TAATATTTTT 300TATAGATGTG TATATATGGA AGTTTGGAAA TCAAGTTCAT ATATTAACCC TCTTGAGCAG 360GATTCTAATA AATTAAGGTA TGTGTGTAGT TTGCTCTTTA TAGTGCCCTA TAAGGATAAC 420ATAACATCAA TTATTCCAGT AAATTTACAA CTAACATTAT TATCGAAAAA TGTAAAACAA 480TCGTCTTCTA CAAATATATT TTCAGGAGAT ATACATTTTA ATATGGTAAC AATGACTTAT 540TTAACTTAA 549
2．一種重組載體，其特征是該載體含有權(quán)利要求1所述的基因。
3．按照權(quán)利要求2所述的載體，其特征是該載體為蘇云金桿菌表達載體pHZB1。
4．一種蘇云金桿菌殺蟲工程菌，其特征是該菌株含有權(quán)利要求1所述的基因。
5．按照權(quán)利要求4所述的蘇云金桿菌殺蟲工程菌，其特征在于該菌株為Bt-YPF22(CCTCC M98018)。
6．權(quán)利要求4所述的蘇云金桿菌殺蟲工程菌的構(gòu)建方法，其特征包括a．根據(jù)需要，選擇具有較高殺蟲活性的蘇云金桿菌為出發(fā)菌株；b．參照Schurter(1989)及Brain&Luke(1988)的方法制備出發(fā)菌的感受態(tài)細胞；c．采用高壓電激法將含p21zb基因的穿梭載體導(dǎo)入出發(fā)菌的感受態(tài)細胞；d．在抗生素板上篩選陽性菌落，抽提陽性菌落的質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM101或TG1，再提取質(zhì)粒，酶切分析確認陽性菌落，即為目標工程菌。
全文摘要
本發(fā)明涉及克隆自蘇云金桿菌(Bt)的一個分子伴侶(Chaperone)基因p21zb以及含有該基因的載體和菌株。該基因轉(zhuǎn)入Bt菌株不僅能顯著提高野生型蘇云金桿菌殺蟲晶體蛋白(ICPs)的產(chǎn)量,且能激發(fā)蘇云金桿菌殺蟲晶體蛋白“沉默”基因的高水平表達。本發(fā)明構(gòu)建了含有p21zb基因的重組載體和工程菌,該工程菌的ICPs表達量比出發(fā)菌提高一倍以上,室內(nèi)外試驗證實了該工程菌株對鱗翅目害蟲的幼蟲有高毒力和良好的遺傳穩(wěn)定性,且有高產(chǎn)高毒的新性狀。
文檔編號C12N15/32GK1234446SQ98122230
公開日1999年11月10日 申請日期1998年12月3日 優(yōu)先權(quán)日1998年12月3日
發(fā)明者余健秀, 龐義, 鄧日強 申請人:中山大學(xué)