專利名稱：修飾的單結構域抗原結合分子及其應用的制作方法
修飾的單結構域抗原結合分子及其應用本申請要求于2010年7月16日提交的美國臨時申請?zhí)?1/365，307的優(yōu)先權，該優(yōu)先權申請的內(nèi)容通過引用結合于此。背景腫瘤壞死因子a (TNFa)是一種主要由巨噬細胞和單核細胞產(chǎn)生的分泌的和膜結合的促炎性細胞因子。TNFa的合成在各種慢性自身免疫炎性疾病中被上調(diào)，所述慢性自身免疫炎性疾病如類風濕性關節(jié)炎(rheumatoid arthritis)、潰瘍性結腸炎(ulcerativecolitis)、局限性腸炎(Crohn' s Disease)及其他。TNF a表達為三聚體跨膜蛋白，其可以被TNF a轉化酶(TACE)蛋白水解切割，從而釋放其可溶形式。兩種形式的TNFa均與TNF受體(TNFR) I和TNFR2相互作用。概述本發(fā)明涉及修飾的單結構域抗原結合分子(jingle domain antigen bindingmolecules，在本文中還稱為“SDAB分子”)。所述修飾的SDAB分子可以包含一個或多個與一種或多種靶標相互作用(例如 ，與之結合)的單抗原結合結構域。在一個實施方案中，所述修飾的SDAB分子的一個或多個單抗原結合結構域與腫瘤壞死因子a (TNFa)結合。所述SDAB分子可以被修飾，從而增加其體內(nèi)生物特性。例如，所述SDAB分子可以被修飾，從而與未修飾的SDAB分子相比改善下述中的一種或多種:增加的半衰期；減少的免疫原性；或改善至少一種藥動學/藥效學(PK/PD)參數(shù)。在一個實施方案中，所述修飾的SDAB分子包含一種或多種聚合物分子，諸如聚(乙二醇)(PEG)或其衍生物。所述修飾的SDAB分子是有用的，例如，用于施用給受試者，例如人。本發(fā)明還公開了制備所述修飾的SDAB分子的方法，和使用所述修飾的SDAB分子治療或預防例如TNF a -相關病癥的方法。因此，在一個方面中，本發(fā)明描述一種修飾的SDAB分子，所述分子包括:(i)與一種或多種靶標(例如，TNFa )相互作用(例如，與之結合)的一個或多個單抗原結合結構域；(ii)連接體(例如，非肽連接體和/或肽連接體)；和(iii) 一個或多個聚合物分子，諸如聚(乙二醇)(PEG)或其衍生物。在一個實施方案中，所述SDAB分子的連接體是非肽連接體。在某些實施方案中，可以通過與第二結構部分(例如，聚合物分子)締合，例如，共價或非共價締合，而修飾所述SDAB分子。例如，所述SDAB分子可以共價連接適當?shù)乃幱镁酆衔?，諸如聚(乙二醇)(PEG)或其衍生物(諸如甲氧基聚(乙二醇)或mPEG)。在一個實施方案中，所述修飾的SDAB分子包括一個或多個單結合結構域。例如，所述SDAB分子可以包括這樣的多肽(例如，單鏈多肽)或由這樣的多肽(例如，單鏈多肽)組成，所述多肽包含至少一個免疫球蛋白可變結構域(包括一個、兩個或三個互補決定區(qū)(CDRs) )。SDAB分子的實例包括天然缺乏輕鏈的分子(例如，VHH、納米抗體或駱駝科動物來源的抗體)。所述SDAB分子可以來源于駱駝科動物或從駱駝科動物獲得，所述駱駝科動物諸如駱騎(camel)、美洲騎(llama)、單峰駱騎(dromedary)、羊騎(alpaca)和栗色羊馬它(guanaco)。在其他實施方案中，所述SDAB分子可以包括一種或多種單結構域分子，其包括但不限于，其他天然存在的單結構域分子(例如，鯊魚單結構域多肽(IgNAR))和單結構域構架(例如，纖連蛋白構架)。
在另一個實施方案中，所述修飾的SDAB分子是包含一個或多個單抗原結合結構域的單鏈多肽。所述SDAB分子可以例如，在相同或不同的表位結合相同的靶標，或結合不同的靶標。SDAB分子的單抗原結合結構域可以具有相同或不同的氨基酸序列。在一些實施方案中，SDAB分子是單價的或多價的(例如，二價、三價或四價)。在其他實施方案中，SDAB分子是單特異性的或多特異性的(例如，雙特異性、三特異性或四特異性)。所述SDAB分子可以包含一個或多個單抗原結合結構域，所述結構域可以是重組的、CDR-嫁接的、人源化的、駱騎源化的、去免疫的(de-1mmunized)和/或體外產(chǎn)生的(例如，通過曬菌體展示選擇的)。例如，SDAB分子可以是單鏈融合多肽，包含與一種或多種靶抗原結合的一個、兩個、三個、四個或更多個單抗原結合結構域。典型地，靶抗原是哺乳動物蛋白，例如，人蛋白。在一個實施方案中，靶抗原是TNF a，例如，人TNF a。

在一個示例性的實施方案中，所述修飾的SDAB分子是一種二價分子，其包含與靶抗原(例如，TNFa )結合的兩種單抗原結合結構域(例如，兩個駱駝科動物可變區(qū))的單鏈多肽融合體(fusion)。所述修飾的SDAB分子的單抗原結合結構域從N端到C端可以按下述順序排列:結合TNFa的單抗原結合結構域_(任選地連接基團，例如，肽連接體)_結合TNFa的單抗原結合結構域-一個或多個聚合物分子。在一個實施方案中，所述單抗原結合結構域與靶抗原上相同的表位結合(例如，使用相同或不同的單抗原結合結構域)。在其他實施方案中，SDAB分子的單抗原結合結構域結合相同或不同靶標上的不同的表位。應該理解，本發(fā)明包括兩個、三個、四個或更多個針對一種或多種靶標的單抗原結合結構域的任意順序或組合。在其他實施方案中，所述修飾的SDAB分子的兩個、三個、四個或更多個單結構域分子用或不用連接基團締合(例如，融合)為遺傳或多肽融合體。所述連接基團可以是本領域技術人員知曉的任意連接基團。例如，所述連接基團可以是長度為I至100個原子的生物相容的聚合物。所述連接基團可以是肽或非肽連接體。在一個實施方案中，所述連接基團是肽連接體，例如，其包括下述或由下述組成:聚甘氨酸、聚絲氨酸、聚賴氨酸、聚谷氨酰胺、聚異亮氨酸或聚精氨酸殘基、或它們的組合。例如，聚甘氨酸或聚絲氨酸連接基團可以包括至少五個、七個、八個、九個、十個、十二個、十五個、二十個、三十個、三十五個和四十個甘氨酸和絲氨酸殘基?？梢允褂玫氖纠缘倪B接基團包括Gly-Ser重復，例如，至少一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個或更多個重復的(Gly)3-Ser(SEQ ID NO:7)或(Gly)4_Ser (SEQID N0:8)重復。在一些實施方案中，連接基團具有下述序列=(Gly)4-Ser-(Gly)3-SeHSEQID NO:9)或((Gly)4-Ser)n (SEQ ID NO: 10)，其中n為4，5或6。在一個實施方案中，連接基團包括下述序列:((Gly)4-Ser)n(SEQ ID NO:10),其中n = 6。所述修飾的SDAB分子可以另外在單抗原結合結構域的C端包括連接基團(例如，在本文中稱為“C端連接基團”)以促使SDAB與另一個結構部分(例如，載體分子、非肽連接體或結構部分)的連接。本文所述的任意連接基團可以用作C端連接基團。在一個實施方案中，使用一個或多個Gly-Ser重復；例如，使用(Gly)3-Ser或(Gly)4_Ser(SEQ ID NO:8)的一個或多個重復。在一個實施方案中，所述修飾的SDAB分子(在本文中稱為"SDAB-01")包含下述或由下述組成:

圖1所示的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)，或與其基本上相同的氨基酸序列(例如，相對于圖1所示的氨基酸序列，與其至少85^^90^^95%以上相同的氨基酸序列，或具有至多20，15，10，5，4，3，2，I個氨基酸變化(例如，缺失、插入或取代(例如，保守取代))的氨基酸序列)。編碼SEQ ID NO:1的兩個單抗原結合結構域的核苷酸序列提供為SEQ ID NO:6(見表12)。在其他實施方案中，所述修飾的SDAB包含由SEQ ID NO:6或與其基本上相同的核苷酸序列(例如，相對于SEQ ID NO:6的氨基酸序列，與其至少85%、90 %、95%以上相同的核苷酸序列，或具有至多60，45，30，15，12，9，6，3個核苷酸變化的核苷酸序列)編碼的氨基酸序列或由這樣的氨基酸序列組成。另外的單結構域分子的實例包括，但不限于，W02006/122786(通過引用結合于此)的表19中公開的氨基酸序列，并且其也在下表11中公開。在某些實施方案中，與TNFa結合的修飾的SDAB分子的至少一個單抗原結合結構域包含一個、兩個或三個具有下述氨基酸序列的⑶Rs:DYWMY(SFQ ID NO:2)(⑶Rl)，EINTNGLITKYPDSVKG(SEQ ID NO:3) (CDR2)和 / 或 SPSGFN(SEQ ID NO:4) (CDR3)，或具有由于少于3、2或I個氨基酸取代(例如，保守取代)而與所述CDRs中之一不同的CDR。在其他實施方案中，所述單抗原結合結構域包含具有圖1的約1-115位氨基酸的氨基酸序列、或基本上與其相同的氨基酸序列(例如，相對于圖1所示的氨基酸序列，至少85^^90^^95%以上相同的氨基酸序列，或具有至多20，15，10，5，4，3，2，I個氨基酸變化(例如，缺失、插入或取代(例如，保守取代))的氨基酸序列)的可變區(qū)。在一些實施方案中，結合TNF a的SDAB分子具有圖1所示的結合TNF a的單結構域抗體分子的一種或多種生物活性。例如，結合TNFa的SDAB分子結合與圖1所示的結合TNFa的單結構域分子所識別的表位相同的表位或相似的表位(例如，結合以其三聚體形式存在的TNF a ;結合與TNF受體接觸的TNF a位點；結合TNF a三聚體中的表位，所述表位包含在第一 TNF單體(單體A)上位置88的Gln,在位置90的Lys，在第二 TNF單體(單體B)上的位置146的Glu，或如W006/122786中公開的表位)。在其他實施方案中，結合TNF a的SDAB分子結合TNFa的N端。在其他實施方案中，結合TNF a的SDAB分子具有與W006/122786中公開的結合TNF a的單結構域分子相似的活性(例如，結合親和力、解離常數(shù)、結合特異性、TNFa抑制活性)。其他實施方案中，所述結合TNFa的SDAB分子包括表11中公開的一種或多種SDAB分子，其也公開在W02006/122786中(其通過引用結合于此)。例如，所述結合TNFa的SDAB分子可以是W02006/122786的表9中公開的單價的、二價的或三價的結合TNF a的SDAB分子。示例性的結合TNFa的SDAB分子包括，但不限于，TNFl, TNF2, TNF3，及其人源化的形式(例如，TNF29, TNF30, TNF31, TNF32, TNF33)。單價結合TNFa的SDAB分子的另外的實例公開在W02006/122786的表8中。示例性的二價的結合TNF a的SDAB分子包括，但不限于，TNF55和TNF56，其包含通過肽連接體連接的兩個TNF30SDAB分子，從而形成單融合多肽(在W02006/122786中公開)。二價的結合TNFa的SDAB分子的另外的實例公開在本文的表 11 中，或在 W02006/122786 的表 19 中公開為 TNF4, TNF5, TNF6, TNF7, TNF8)。在某些實施方案中，所述SDAB分子被修飾，從而包含一個或多個聚合物分子，諸如聚(乙二醇)(PEG)或其衍生物。所述PEG分子(例如，PEG單體、其聚合物或衍生物)可以是直鏈的或支鏈的。在一個實施方案中，所述SDAB通過連接體結構部分(例如，非肽連接體)連接至一個或多個PEG分子。 在一些實施方案中,所述連接體是非肽連接體。在一個實施方案中，所述連接體由式⑴所示:
權利要求
1.一種修飾的單結構域抗原結合分子，其包含: (i)結合一種或多種靶標的一個或多個單抗原結合結構域； (ii)非肽連接體；和 (iii)一個或多個聚合物分子， 其中所述非肽連接體是式(I)的結構部分:
2.權利要求1的修飾的單結構域抗原結合分子，其中所述一個或多個聚合物分子包括聚(乙二醇)(PEG)單體或其衍生物。
3.權利要求2的修飾的單結構域抗原結合分子，其中所述PEG聚合物分子是支鏈的，并且所述PEG單體是甲氧基聚(乙二醇)(mPEG)或其衍生物。
4.權利要求3的修飾的單結構域抗原結合分子，其中所述PEG聚合物分子是選自由式(a) - (h)組成的組的支鏈PEG聚合物分子:
5.權利要求2-4的修飾的單結構域抗原結合分子，其中每個PEG聚合物結構部分獨立地具有IKDa至IOOKDa的分子量。
6.權利要求5的修飾的單結構域抗原結合分子，其中每個PEG聚合物結構部分獨立地具有IOKDa至50KDa的分子量。
7.權利要求5的修飾的單結構域抗原結合分子，其中每個PEG聚合物結構部分獨立地具有選自由10KDa、20KDa、30KDa、40KDa和50KDa組成的組的分子量。
8.權利要求5的修飾的單結構域抗原結合分子，其中所述連接體和所述PEG聚合物分子具有選自由以下組成的組的結構:
9.權利要求8的修飾的單結構域抗原結合分子，其中所述連接體和所述PEG聚合物分子由下式表示:
10.權利要求1-9中任一項的修飾的單結構域抗原結合分子，其中至少一個所述單抗原結合結構域結合人TNF a。
11.權利要求1-10中任一項的修飾的單結構域抗原結合分子，其為單價的、二價的或三價的。
12.權利要求1-11中任一項的修飾的單結構域抗原結合分子，其為單特異性的、雙特異性的或三特異性的。
13.權利要求1-12中任一項的修飾的單結構域抗原結合分子，其中一個或多個所述單抗原結合結構域是CDR-嫁接的、人源化的、駱駝源化的、去免疫的或是通過噬菌體展示選擇的。
14.權利要求1-10中任一項的修飾的單結構域抗原結合分子，其為單鏈融合多肽，所述單鏈融合多肽從N端到C端以下述順序包含:抗-TNF a單抗原結合結構域_(任選地，肽連接體)-抗-TNF a單抗原結合結構域-非肽連接體-一個或多個聚合物分子。
15.權利要求1-14中任一項的修飾的單結構域抗原結合分子，其中一個或多個所述單抗原結合結構域包含圖2所示的氨基酸序列或與其至少85%相同的氨基酸序列。
16.權利要求14或15的修飾的單結構域抗原結合分子，其中一個或多個所述單抗原結合結構域包含三個CDR，所述CDR具有下述氨基酸序列:DYWMY(CDRl)，EINTNGLITKYPDSVKG(CDR2)和SPSGFN(CDR3)，或具有與所述CDR之一區(qū)別在于I個氨基酸取代的⑶R。
17.權利要求14-16中任一項的修飾的單結構域抗原結合分子，其中所述肽連接體包含至少一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個或更多個(Gly)3-Ser或(Gly)4_Ser (SEQ IDNO:8)重復。
18.權利要求17的修飾的單結構域抗原結合分子，其由以下結構表示:
19.一種藥物組合物，所述藥物組合物包含權利要求1-18中任一項所述的修飾的單結構域抗原結合分子和藥用載體。
20.權利要求19的藥物組合物，其還包含選自以下中的一種或多種的第二試劑:細胞因子抑制劑，生長因子抑制劑，免疫抑制劑，抗炎劑，代謝抑制劑，酶抑制劑，細胞毒性劑或細胞生長抑制劑。
21.一種改善受試者中的炎性或自身免疫性病癥的方法，所述方法包括:以使TNF a相關病癥的一種或多種癥狀減輕的量，給所述受試者施用權利要求1-18中任一項所述的修飾的單結構域抗原結合分子。
22.權利要求21的方法，所述方法還包括:與所述修飾的單結構域抗原結合分子聯(lián)合施用第二試劑，其中所述第二試劑選自以下中的一種或多種:細胞因子抑制劑，生長因子抑制劑，免疫抑制劑，抗炎劑，代謝抑制劑，酶抑制劑，細胞毒性劑或細胞生長抑制劑。
23.權利要求21或22的方法，其中所述TNFa-相關病癥選自以下中的一種或多種:類風濕性關節(jié)炎(RA)，關節(jié)炎性病癥，銀屑病關節(jié)炎，多關節(jié)青少年特發(fā)性關節(jié)炎(JIA)，強直性脊柱炎(AS)，銀屑病，潰瘍性結腸炎，局限性腸炎，炎性腸病，或多發(fā)性硬化病。
24.權利要求23的方法，其中所述修飾的單結構域抗原結合分子或第二試劑通過皮下、血管內(nèi)、肌內(nèi)或腹膜內(nèi)注射或通過吸入被施用給所述受試者。
25.—種評估修飾的單結構域抗原結合分子的方法，所述方法包括: 將權利要求1-18中任一項所述的修飾的SDAB分子施用給受試者；和 評估所述修飾的SDAB分子的一種或多種藥動學/藥效學(PK/PD)參數(shù)。
26.—種評估或選擇修飾的單結構域抗原結合分子的方法，所述方法包括: 提供施用給受試者的權利要求1-18中任一項所述的修飾的SDAB分子在受試者中的至少一個PK/H)參數(shù)的檢測值；和 將所提供的檢測值與至少一個參照值比較，從而評估或選擇所述修飾的SDAB分子。
27.權利要求25或26的方法，所述方法還包括:提供包含所述修飾的SDAB分子的樣品；并且在捕獲檢測測定中檢測所述樣品。
28.權利要求25-27中任一項的方法，其中所評估的PK/H)參數(shù)選自以下中的一種或多種:所述修飾的SDAB分子的體內(nèi)濃度(例如，在血液、血清、血漿和/或組織中的濃度)；所述修飾的SDAB分子的清除率(CL);所述修飾的SDAB分子的穩(wěn)定-容積分布(Vdss);所述修飾的SDAB分子的半衰期(t1/2);所述修飾的SDAB分子的生物利用度；所述修飾的SDAB分子的劑量標準化的最大血液、血清或血漿濃度；所述修飾的SDAB分子的劑量標準化的暴露；或所述修飾的SDAB分子的組織與血清的比率。
29.一種用于評估修飾的單結構域結合分子的捕獲檢測測定法，所述測定法包括提供:固定到固體支持物上的靶標；和一種試劑，所述試劑與修飾的單結構域抗原結合分子的蛋白或聚合物結構部分結合，以檢測結合的修飾的單結構域抗原結合分子-靶標復合物。
30.一種試劑盒或制品，其包括裝置、注射器或小瓶，所述裝置、注射器或小瓶包含權利要求1-17中任一項的修飾的單結構域結合分子，并且任選地包括使用說明書。
31.一種制備修飾的單結構域結合分子的方法，所述方法包括: 提供單結構域結合分子； 使所述單結構域結合分子與式(I)的非肽連接體在形成至少一個化學鍵的條件下接觸:
全文摘要
本發(fā)明涉及修飾的單結構域抗原結合分子，例如，SDAB分子，特別是結合TNFa的SDAB分子。本發(fā)明還公開了制備本發(fā)明所述的修飾的單結構域抗原結合分子的方法和使用本發(fā)明所述的修飾的單結構域抗原結合分子治療例如TNFa-相關病癥的方法。
文檔編號A61K39/395GK103119062SQ201180044867
公開日2013年5月22日 申請日期2011年7月6日 優(yōu)先權日2010年7月16日
發(fā)明者馬丁·黑根, 斯特凡娜·于貝爾·奧蘭德, 尤利婭·武格邁施特, 徐鑫 申請人:埃博靈克斯股份有限公司