專利名稱：結合il-23的基于纖連蛋白的支架結構域蛋白質的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及結合白介素23 (IL-23)、特別為IL-23的pl9亞單位的基于纖連蛋白的支架結構域蛋白質。本發(fā)明亦涉及創(chuàng)新蛋白質在治療應用中用于治療自身免疫疾病的用途。本發(fā)明還涉及包含所述蛋白質、編碼所述蛋白質或其片段的多核苷酸的細胞，且涉及包含編碼所述創(chuàng)新蛋白質的多核苷酸的載體。引言
IL-23為IL-12異源二聚體細胞因子家族的成員。其含有與IL-12共有的p40亞單位及獨特的P19亞單位。IL-23通過由IL-12RP I及IL-23R組成的異源二聚體受體復合物發(fā)送信號(Aggarwal S 等人。Interleukin-23 promotes a distinct CD4 T cellactivation state characterized by the production of interleukin-17. J BiolChem. 278:1910-4，2003)。IL-23為用于治療慢性炎性病癥(例如多發(fā)性硬化、類風濕性關 節(jié)炎、牛皮癖及克羅恩病(Crohn’s disease))的潛在革巴?；诶w連蛋白的支架(Fibronectin based scaffold)為能發(fā)展到結合任一所關注化合物的蛋白質家族。這些蛋白質通常利用衍生自纖連蛋白III型(Fn3)或Fn3-樣結構域的支架，以天然或改造抗體(亦即，多克隆抗體、單克隆抗體或單鏈抗體)所特有的方式起作用，且另外具有結構優(yōu)勢。特別地，這些抗體模擬物的結構已經(jīng)設計而具有最優(yōu)選折疊、穩(wěn)定性及溶解性，甚至在通常導致抗體結構及功能喪失的情況下亦如此?；诶w連蛋白的支架蛋白質的實例為 Adnectin (Adnexus, Bristol-Myers Squibb R&D Company)。纖連蛋白III型(Fn3)結構域自N-末端至C-末端按順序包含P或P樣鏈A ;環(huán)AB ； ^或P樣鏈B ;環(huán)BC邛或P樣鏈C ;環(huán)CD邛或P樣鏈D ;環(huán)DE邛或P樣鏈E ；環(huán)EF邛或P樣鏈F ;環(huán)FG;及P或P樣鏈G。環(huán)AB、BC、CD、DE、EF及FG中的任一個或全部均可參與靶結合。BC、DE及FG環(huán)在結構與功能兩方面皆與免疫球蛋白的互補決定區(qū)(OTR)類似。美國專利號7，115，396闡述Fn3結構域蛋白質，其中改變BC、DE及FG環(huán)產(chǎn)生高親和力TNFa結合劑。美國公布號2007/0148126闡述Fn3結構域蛋白質，其中改變BC、DE及FG環(huán)產(chǎn)生高親和力VEGFR2結合劑。將有利的是，獲得用于治療性治療自身免疫病癥的經(jīng)改進的纖連蛋白結構域支架蛋白質。產(chǎn)生白介素17(IL-17; “Thl7細胞”)的效應T細胞亞群具有高促炎性并誘導嚴 重自身免疫。與Thl及Th2細胞相比，Thl7細胞表達不同亞群的細胞因子及趨化因子，包括IL-6、腫瘤壞死因子(TNF)、IL-22、IL-17A及IL-17F以及趨化因子受體CCR6。IL-23通過活化 T 細胞來促進 IL-17 產(chǎn)生(Aggarwal S 等人。Interleukin-23 promotes a distinctCD4 T cell activation state characterized by the production of interleukin-17.J Biol Chem. 278:1910-4，2003)且為誘導產(chǎn)生IL-17的CD4+ T細胞擴增的關鍵細胞因子。暴露于IL-23似乎為決定Thl7細胞的致病性的關鍵特征。發(fā)明概述
本申請?zhí)峁┽槍θ薎L-23特異性pl9亞單位的Adnectins 。本發(fā)明的一方面提供包含F(xiàn)n3結構域的多肽,其中一個或多個溶劑可及環(huán)(solvent accessible loop)已被隨機化或突變。在一些實施方案中，F(xiàn)n3結構域為衍生自人纖連蛋白III型結構域的野生型第10模塊(module) (10Fn3)的Fn3結構域。在一些實施方案中，本發(fā)明的wFM多肽與人kiFM結構域具有至少 40%、50%、60%、65%、70%、75%、80%、85% 或 90% 同一性。在一些實施方案中，一個或多個選自BC、DE及FG的環(huán)的長度可相對于相應人纖連蛋白環(huán)延長或縮短。 在一些實施方案中，本發(fā)明多肽包含纖連蛋白III型第10 (10Fn3)結構域，其中該10Fn3結構域包含環(huán)AB ;環(huán)BC ;環(huán)⑶；環(huán)DE ;環(huán)EF ;及環(huán)FG ;且具有至少一個選自環(huán)BC、DE及FG的環(huán)且所述環(huán)的氨基酸序列相對于人wFM結構域中相應環(huán)的序列經(jīng)改變。在一些實施方案中，本發(fā)明多肽包含F(xiàn)n3結構域，其包含與非環(huán)區(qū)具有至少80、85、90、95、98、99或100%同一性的氨基酸序列。在一些實施方案中，本發(fā)明蛋白質的BC環(huán)包含選自SEQ ID NO: 2_6的氨基酸序列。在一些實施方案中，本發(fā)明蛋白質的DE環(huán)包含選自SEQ ID NO: 7-48的氨基酸序列。在一些實施方案中，本發(fā)明蛋白質的FG環(huán)包含選自SEQ ID NO: 49_59的氨基酸序列。在一些實施方案中，kiFM結構域可以氨基酸取代、插入或缺失開始和/或結束。在一些實施方案中，本發(fā)明蛋白質包含一個來自SEQ ID NO: 2_6中所示的BC環(huán)序列的環(huán)序列、一個SEQ ID NO: 7-48中所示的DE環(huán)序列及一個SEQ ID NO: 49-59中所示的FG環(huán)序列。在一些實施方案中，本發(fā)明蛋白質包含與SEQ ID NO: 2_59中任一個具有至少70、75、80、85、90、95、98、99或100%同一性的BC、DE及FG環(huán)氨基酸序列。在一些實施方案中，抗IL-23 Adnectin包含SEQ ID NO: 60-100中任一個的氨基
酸序列。在一些實施方案中，抗IL-23 Adnectin包含SEQ ID NO: 60-100中任一個的3至96位的Fn3結構域氨基酸序列。在一些實施方案中，抗IL-23 Adnectin包含與SEQ ID NO: 60-100中任一個具有至少70、75、80、85、90、95、98、99或100%同一性的氨基酸序列。在一方面，抗IL-23 Adnectin還包含藥代動力學(PK)部分。在一些實施方案中，PK部分包含聚乙二醇(PEG)。在一方面，本申請?zhí)峁┛捎糜谥委熥陨砻庖呒膊〉目笽L-23 Adnectin0在一方面，本發(fā)明提供包含纖連蛋白III型第10C°Fn3)結構域及抗IL-23Adnectin的融合多肽,其中該uiFr^結構域以I PM或更低的Kd結合至HSA。在某些實施方案中，1QFn3結構域包含與SEQ ID NO: 103具有至少70%同一性的氨基酸序列。在一個實施方案中，1QFn3結構域包含具有SEQ ID NO: 104中所示氨基酸序列的BC環(huán)、具有SEQ IDNO: 105中所示氨基酸序列的DE環(huán)及具有SEQ ID NO: 106中所示氨基酸序列的FG環(huán)。在另一實施方案中，1QFn3結構域包含以下中的一個或多個具有SEQ ID NO: 104中所示氨基酸序列的BC環(huán)、具有SEQ ID NO: 105中所示氨基酸序列的DE環(huán)及具有SEQ ID NO: 106中所示氨基酸序列的FG環(huán)。
在一個實施方案中，融合多肽的kiFM結構域亦結合至以下中的一種或多種獼猴血清白蛋白(RhSA)、食蟹猴(cynomolgus monkey)血清白蛋白(CySA)或鼠血清白蛋白(MuSA)。在其它實施方案中，1QFn3結構域不與RhSA、CySA或MuSA中的一種或多種交叉反應。在某些實施方案中，融合多肽的kiFM結構域以I PM或更低的Kd結合至HSA。在一些實施方案中，kiFM結構域以500 nM或更低的Kd結合至HSA。在其它實施方案中，uiFr^結構域以至少 200 nMUOO nM、50 nM、20 nM、10 nM 或 5 nM 的 Kd 結合至 HSA。在其它實施方案中，融合多肽的kiFM結構域結合至HSA的結構域I或II。在一個實施方案中，kiFM結構域結合至HSA的結構域I與II 二者。在一些實施方案中，kiFM結構域在5. 5至7. 4的pH范圍下結合至HSA。在其它實施方案中，kiFM結構域在pH 5. 5下以200 nM或更低的Kd結合至HSA。在另一實施方案中，kiFM結構域在5. 5至7. 4的pH范圍下以至少 500 nM、200 nMUOO nM、50 nM、20 nM、10 nM 或 5 nM 的 Kd 結合至 HSA。在一個實施方案中，1QFn3 結構域在 pH 5. 5 下以至少 500 nM、200 nMUOO nM、50 nM、20 nM、10 nM 或
5nM的Kd結合至HSA。在一些實施方案中，在血清白蛋白存在下融合多肽的血清半衰期為在血清白蛋白不存在下多肽的血清半衰期的至少5倍。在某些實施方案中，在血清白蛋白存在下融合多肽的血清半衰期為在血清白蛋白不存在下多肽的血清半衰期的至少2倍、5倍、7倍、10倍、12倍、15倍、20倍、22倍、25倍、27倍或30倍。在一些實施方案中，血清白蛋白為HSA、RhSA、CySA或MuSA中的任一種。在某些實施方案中，在血清白蛋白存在下融合多肽的血清半衰期為至少20小時。 在某些實施方案中，在血清白蛋白存在下融合多肽的血清半衰期為至少10小時、12小時、15小時、20小時、25小時、30小時、40小時、50小時、75小時、90小時、100小時、110小時、120小時、130小時、150小時、170小時或200小時。在一些實施方案中，在靈長類動物(例如，人或猴)或鼠中觀測融合多肽的半衰期。在任一上述方面及實施方案中，1QFn3結構域包含選自SEQ ID NO: 107、111、115、119及123-143的序列。附圖簡述
圖I顯示本發(fā)明抗IL23 Adnectin的全長DNA序列比對。圖2顯示如實施例2中所述pBMS2008/ATI001044蛋白質表達載體。圖3顯示本發(fā)明抗IL23 Adnectin的全長氨基酸序列比對。圖4顯示如實施例4中所述抗IL-23 Adnectin抑制PBMC pSTAT3的代表性IC5tl曲線。圖5顯示如實施例4中所述抗IL-23 Adnectin及抗p40單克隆抗體(MAB1510)抑制IL-23依賴性IL-17A的代表性IC5tl曲線。圖6顯示ATI001045抑制供體228 (如實施例4中所述測試的4種供體之一)PBMC中IL-23-誘導的IL-17產(chǎn)生。圖7顯示抗IL-23 Adnectin的代表性選擇性數(shù)據(jù)。顯示扣除緩沖液的感應圖,其說明結合至如實施例4中所述捕獲的ATI001016的10 nM IL-23及I y M IL-12的締合期
及解離期。
圖8顯示抗IL-23 Adnectin未抑制如實施例4中所述NK-92細胞中IL-12誘導的IFN-Y產(chǎn)生。圖9a顯示在如實施例4中所述小鼠藥效學模型中ATI001045抑制血清IL-17水平。圖9b顯示在如實施例4中所述小鼠藥效學模型中比較抗IL-23 Adnectin的抑制
活性。 圖IOa顯示如實施例4中所述人IL-23誘導的棘皮癥的ATI000934劑量反應。圖IOb顯示如實施例4中所述人IL-23誘導的棘皮癥的ATI001045劑量反應。

圖11顯示小鼠的體內HSA半衰期。以20 mg/kg (圖11A)或50 mg/kg (圖11B)將HSA注射至小鼠中。圖12a_d顯示小鼠中SABA1-SABA4的半衰期測定。圖13a顯示在與HSA共注射時，小鼠中SABA1-4半衰期延長的圖表概述。圖13b比較食蟹猴與小鼠的數(shù)據(jù)。圖14A-B顯示食蟹猴中SABA1. I及SABA5. I的半衰期測定。圖15顯示通過直接結合ELISA測定來測定結合至人、小鼠及大鼠的白蛋白的SABAI. 2。圖16顯不SABAI. I與HSA化學計量比(stoichiometry)的測定。圖17顯示結合至HSA的重組結構域片段的SABA1. 2的Biacore分析。圖18顯示以I mpk及10 mpk給藥的猴中，SABA1. 2的藥代動力學概況(profile)。圖19顯示以I mpk經(jīng)靜脈內或皮下給藥的猴中，SABA1. 2的藥代動力學概況。發(fā)明詳述 定義
“多肽”意指無論長度、翻譯后修飾或功能，具有兩個或更多個氨基酸的任何序列。在本文中，“多肽”、“肽”與“蛋白質”可互換使用。多肽可包括天然氨基酸及非天然氨基酸，例如闡述于美國專利號6，559，126中的那些，該專利通過引用結合到本文中。多肽亦可以多種標準化學方式中的任一種來修飾(例如，氨基酸可用保護基團修飾；可使羧基末端氨基酸成為末端酰氨基；氨基末端殘基可用基團修飾以(例如)增強親油性；或多肽可經(jīng)化學糖基化或以其它方式修飾以增加穩(wěn)定性或體內半衰期)。多肽修飾可包括另一結構(例如環(huán)狀化合物或其它分子)與多肽的連接且亦可包括含有一個或多個呈經(jīng)改變構型(即，R或S;*L*D)的氨基酸的多肽。本發(fā)明肽為衍生自纖連蛋白III型第10結構域的蛋白質，其已被修飾以特異性結合IL-23的pl9亞單位且在本文中稱為“Adnectin”或“抗IL-23Adnectin，，。術語“PK”為“藥代動力學”的縮寫且涵蓋化合物的性質，包括(例如)受試者的吸收、分布、代謝及消除?！癙K調節(jié)蛋白質”或“PK部分”是指當與生物活性分子融合或一起給予時，影響生物活性分子的藥代動力學性質的任何蛋白質、肽或部分。PK調節(jié)蛋白質或PK部分的實例包括PEG、人血清白蛋白(HSA)結合劑(如美國公開號2005/0287153及2007/0003549中所公開的)、人血清白蛋白、Fe或Fe片段及糖(例如，唾液酸)。本文中的“氨基酸序列同一性百分比(%)”定義為在比對各序列及(若需要)引入缺口以達到最大序列同一性百分比后，候選序列中與所選序列中的氨基酸殘基相同的氨基酸殘基的百分比，且不將任何保守性取代視為序列同一性的一部分。出于測定氨基酸序列同一性百分比目的的比對可用本領域技術范圍內的多種方式實現(xiàn)，例如，使用可公開獲得的計算機軟件，例如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign (DNASTAR )軟件。本領域技術人員可確定用于測量比對的合適參數(shù)，包括在所比較序列全長范圍內達到最大比對所需要的任何算法?！胺蛛x的”多肽為已鑒定并自其天然環(huán)境組分中分離和/或回收的多肽。其天然環(huán)境的污染組分為可干擾抗體的診斷或治療用途的物質，且可包括酶、激素及其它蛋白質性溶質或非蛋白質性溶質。在優(yōu)選實施方案中，可將多肽純化至(I)大于95%重量的多肽(如通過Lowry方法測定的)，且最優(yōu)選大于99%重量的多肽，(2)通過使用旋杯式序列分析儀足以至少獲得N末端或內部氨基酸序列殘基的程度，或(3)均質，通過還原或非還原條件下的SDS-PAGE并使用考馬斯藍或優(yōu)選銀染進行。所分離多肽包括重組細胞內的原位多肽，這是因為多肽的天然環(huán)境的至少一種組分將不存在。然而，分離的多肽通?？赏ㄟ^至少一個純化步驟來制備。氨基酸序列或化合物的“半衰期”通?？啥x為在體內(例如)由于天然機制導 致的序列或化合物的降解和/或序列或化合物的清除或螯合而使多肽血清濃度降低50%所耗的時間。半衰期可用本身已知的任一方式(例如通過藥代動力學分析)來確定。適宜技術應為本領域技術人員所明了，且通常可涉及(例如)以下步驟向靈長類動物適宜地給予適宜劑量的本發(fā)明的氨基酸序列或化合物；以規(guī)律間隔收集來自所述靈長類動物的血樣或其它樣品；測定所述血樣中本發(fā)明的氨基酸序列或化合物的水平或濃度；及根據(jù)由此獲得的數(shù)據(jù)(曲線)計算相對于本發(fā)明的氨基酸序列或化合物給藥時的初始水平，直至其水平或濃度降低50%所需的時間?？蓞⒄绽鐦藴适謨?例如Kenneth, A等人，ChemicalStability of Pharmaceuticals: A Handbook for Pharmacists 以及 Lee, P. I. D 等人，Pharmacokinetic Analysis: A Practical Approach (1996)。 #胃Gibaldi， M ^人，Pharmacokinetics,第 2 修訂版，由 Marcel Dekker 出版 1982)。半衰期可使用諸如tl/2-a、tl/2_P及曲線下面積(AUC)等參數(shù)來表示。在本說 明書中，“半衰期的增加”是指這些參數(shù)中任一個、這些參數(shù)中任兩個或所有這三個參數(shù)的增加?！鞍胨テ诘脑黾印庇绕涫侵竧l/2-P的增加，且有或無tl/2-a和/或AUC或二者的增加。概述
本申請?zhí)峁┽槍θ薎L-23特異性pl9亞單位的Adnectin。為了鑒別IL-23特異性拮抗劑，使用抗p40 mAb將IL-23呈遞至Adnectin大型合成文庫。針對以下方面對結合至IL-23 pl9亞單位的Adnectin進行篩選與人IL-23的結合、對IL-23/IL-23R相互作用的競爭及對IL-23誘導的T細胞系中的信號轉導的抑制。通過降低靶濃度并選擇具有緩慢解離速率的抗IL-23 Adnectin使抗IL-23 Adnectin經(jīng)受進一步選擇壓力。根據(jù)此優(yōu)化過程，將Adnectin家族確定為具有有利的生物化學及生物物理學性質的IL-23特異性抑制劑?；诶w連蛋白的支架
本申請的一方面提供包含F(xiàn)n3結構域的多肽，其中一個或多個溶劑可及環(huán)已被隨機化或突變。在一些實施方案中，F(xiàn)n3結構域為衍生自人纖連蛋白III型結構域的野生型第10模塊(10Fn3)的Fn3結構域VSLWfRDLEVVAAI-rrSLLISWDAPAyrVRYYRrrYGErGGNSPVQErrVPGSKSTATlSGLKPGVPYll'I'VYAVTGRGDSPASSKI*fSlNYRT (SEQ ID NO; I:.在以上 10Fn3 序列中，對BC、DE及FG環(huán)加下劃線。已報道多種突變型wFM支架。在一方面，Asp 7、Glu 9及Asp 23中的一個或多個被另一氨基酸(例如不帶負電荷的氨基酸殘基例如Asn、Lys等)替代。已報道與野生型形式相比，這些突變在中性PH下具有促進突變型kiFM的更大穩(wěn)定性的作用(參見，PCT公布號WO 02/04523)。已公開了 1QFn3支架中多種有益或無作用的額外改變。例如，參見Batori 等人，Protein Eng. 2002 年 12 月；15 (12) : 1015-20 ;Koide 等人，Biochemistry2001 年 8 月 28 日；40 (34) : 10326-33。變體與野生型kiFM蛋白質二者的特征在于相同結構，即7個命名為A至G的3鏈結構域序列及6個連接該7個P鏈結構域序列的環(huán)區(qū)(AB環(huán)、BC環(huán)、CD環(huán)、DE環(huán)、EF環(huán)及FG環(huán))。位于最靠近N-及C末端處的P鏈可采用溶液中的P樣構象。在SEQ ID NO:I中，AB環(huán)對應于殘基15-16，BC環(huán)對應于殘基21-30，CD環(huán)對應于殘基39-45，DE環(huán)對應于殘基51-56，EF環(huán)對應于殘基60-66，且FG環(huán)對應于殘基76-87 (Xu等人，Chemistry & Biology 2002 9:933-942)。在一些實施方案中，1QFn3多肽可與SEQ ID NO: I中所示的人1QFn3結構域具有至少40%、50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%或90%同一性。在一個或多個所述環(huán)中通常可出現(xiàn)許多變化。kiFM多肽的每一 P或P樣鏈可基本上由這樣的氨基酸序列組成其與SEQ IDNO: I的相應P或P樣鏈的序列具有至少80%、85%、90%、95%或100%同一性，前提為此變化不會破壞生理條件下多肽的穩(wěn)定性。在一些實施方案中，本公開內容提供包含纖連蛋白III型第10 (10Fn3)結構域的多肽，其中該1QFn3結構域包含環(huán)AB ;環(huán)BC ;環(huán)⑶；環(huán)DE ;環(huán)EF ;及環(huán)FG ;且具有至少一個選自環(huán)BC、DE及FG的環(huán)且所述環(huán)的氨基酸序列相對于人wFM結構域中相應環(huán)的序列經(jīng)改變。在一些實施方案中，改變BC及FG環(huán)，在一些實施方案中，改變BC、DE及FG環(huán)，S卩，F(xiàn)n3結構域包含非天然存在的環(huán)。“經(jīng)改變”意指相對于模板序列(相應人纖連蛋白結構域)氨基酸序列中的一個或多個改變且包括氨基酸添加、缺失及取代。改變氨基酸序列通?？山?jīng)由核酸編碼序列的有意、盲目或自發(fā)序列變化來實現(xiàn)，且可通過任一技術(例如PCR、易錯PCR或化學DNA合成)來進行。在一些實施方案中，一個或多個選自BC、DE及FG的環(huán)的長度可相對于相應人纖連蛋白環(huán)延長或縮短。在一些實施方案中，所述環(huán)的長度可延長2-25個氨基酸。在一些實施方案中，所述環(huán)的長度可減少1-11個氨基酸。因此，為了優(yōu)化抗原結合，可在長度上以及序列上改變wFM環(huán)的長度，以獲得最大可能的抗原結合靈活性及親和力。在一些實施方案中，多肽包含F(xiàn)n3結構域，其包含與SEQ ID NO: I的非環(huán)區(qū)具有至少80、85、90、95、98、99或100%同一性的氨基酸序列，其中至少一個選自BC、DE及FG的環(huán)經(jīng)改變。在一些實施方案中，經(jīng)改變BC環(huán)具有至多10個氨基酸取代、至多4個氨基酸缺失、至多10個氨基酸插入或其組合。在一些實施方案中，經(jīng)改變DE環(huán)具有至多6個氨基酸取代、至多4個氨基酸缺失、至多13個氨基酸插入或其組合。在一些實施方案中，F(xiàn)G環(huán)具有至多12個氨基酸取代、至多11個氨基酸缺失、至多25個氨基酸插入或其組合。
在一些實施方案中，本發(fā)明蛋白質的BC環(huán)包含選自以下的氨基酸序列GHYPMHV(SEQ ID NO: 2)、GHYPLHV (SEQ ID NO: 3)、GHYPMHI (SEQ ID NO: 4)、GHYPLHI (SEQ IDNO: 5)及 GHYPLHL (SEQ ID NO: 6)。在一些實施方案中，本發(fā)明蛋白質的DE環(huán)包含選自以下的氨基酸序列HRTH(SEQID NO: 7),YYHY(SEQ ID NO: 8),SKQH (SEQ ID NO: 9),SNVH (SEQ ID NO: 10)、NRAH (SEQID NO: 11),RKTY(SEQ ID NO: 12) ,RSRY (SEQ ID NO: 13),SRYY (SEQ ID NO: 14) ,PHRY(SEQ ID NO: 15),RSTH (SEQ ID NO: 16) ,SRIY (SEQ ID NO: 17)、HQRY (SEQ ID NO: 18)、KQVY (SEQ ID NO: 19),AHRY (SEQ ID NO: 20),RSRH (SEQ ID NO: 21)、ARQY (SEQ ID NO:22)、RTQY (SEQ ID NO: 23)、PRYH (SEQ ID NO: 24)、MRQH (SEQ ID NO: 25)、SRKY (SEQID NO: 26)、RQKY (SEQ ID NO: 27)、HAKY(SEQ ID NO: 28)、SNRY (SEQ ID NO: 29)、NTSH(SEQ ID NO: 30),SQVY (SEQ ID NO: 31),NRVY (SEQ ID NO: 32)、PRSH (SEQ ID NO: 33)、RTKY (SEQ ID NO: 34),SRYH (SEQ ID NO: 35),PRRY(SEQ ID NO: 36)、RQKY (SEQ ID NO:37)、RYKY (SEQ ID NO: 38)、VPRH (SEQ ID NO: 39)、TPKH (SEQ ID NO: 40)、RSKY (SEQ ID NO: 41),SRKY (SEQ ID NO: 42)、VPRY (SEQ ID NO: 43)、PRRY (SEQ ID NO: 44)、RMRH(SEQ ID NO: 45)、PPRH (SEQ ID NO: 46)、RQIY (SEQ ID NO: 47)及 MRQH(SEQ ID NO:48)。在一些實施方案中，本發(fā)明蛋白質的FG環(huán)包含選自以下的氨基酸序列YYNEADYSQI (SEQ ID NO: 49)、YYQEYEYRYI (SEQ ID NO: 50)、YYMEEKYAVI (SEQ ID NO:51)、YYAQENYKEI (SEQ ID NO: 52)、YYKEANYREI (SEQ ID NO: 53)、YYAQEEYHII (SEQ IDNO: 54)、YYKEADYSQI (SEQ ID NO: 55)、YYEQVEYREI (SEQ ID NO: 56)、YYEQPIYATI (SEQID NO: 57)、YYEQVEYREI (SEQ ID NO: 58)及 YYSEELYKYI (SEQ ID NO: 59)。10Fn3結構域可始于氨基酸變化。例如，額外MG序列可位于Fn3結構域的N末端處。通常M將被切割掉，在N末端處留下G。在一些實施方案中，序列可位于kiFM結構域的C末端處。例如，在定點聚乙二醇化中，其中將諸如GSGC (SEQ ID NO: 101)等含有半胱氨酸的接頭添加至C末端。或者，天然存在的C末端尾巴的聚乙二醇化，其中通過將Ser改變?yōu)镃ys使所述尾巴突變以獲得含有半胱氨酸的接頭EIDKPfQ (SEQ ID NO: 102)。包含 GSGC 接頭的本發(fā)明抗 IL-23 Adnectin 的實例包括 ATI001014、ATI001015、ATI001016、ATI001044、ATI001045 及 ATI001047。ATI000934 為包含 EIDKPCQ 接頭的本發(fā)明抗 IL-23Adnectin的實例。在一些實施方案中，本發(fā)明蛋白質包含一個來自SEQ ID NO: 2_6中所示的BC環(huán)序列的環(huán)序列、一個SEQ ID NO: 7-48中所示的DE環(huán)序列及一個SEQ ID NO: 49-59中所示的FG環(huán)序列。在一些實施方案中，本發(fā)明蛋白質包含與SEQ ID NO: 2_59中任一個具有至少70、75、80、85、90、95、98、99或100%同一性的BC、DE及FG環(huán)氨基酸序列。此外，本領域技術人員將認識到，SEQ ID NO: 2_6中所示的BC環(huán)序列共享共有序列基序 GHYPX1HX2 (SEQ ID NO: 257)，其中 X1 為 M 或 L，且 X2 為 I 或 V，且 SEQ ID NO:49-59中所示的FG環(huán)序列共享共有序列基序YYX3X3X3X3YX3X3I (SEQ ID NO: 258)，其中X3可為任一氨基酸。因此，將可能生成結合IL-23的其它Adnectin，所述結合利用適合共有序列GHYPX1HX2的BC環(huán)和/或利用除明確列于SEQ ID NO: 49-59中的那些以外的其它FG環(huán)(其適合模式 YYX3X3X3X3YX3X3I)。
在一些實施方案中，抗IL-23 Adnectin包含SEQ ID NO: 60-100中任一個的氨基酸序列。在一些實施方案中，抗IL-23 Adnectin包含SEQ ID NO: 60-100中任一個的3至96位的Fn3結構域氨基酸序列。在一些實施方案中，抗IL-23 Adnectin包含與SEQ ID NO:60-100中的任一個具有至少70、75、80、85、90、95、98、99或100%同一性的氨基酸序列。在一些實施方案中，抗IL-23 Adnectin包含與SEQ ID NO: 60-100中任一個的3至96位的氨基酸序列具有至少70、75、80、85、90、95、98、99或100%同一性的氨基酸序列。在一些實施方案中，抗IL-23 Adnectin可經(jīng)聚乙二醇化和/或含有his-標簽。本文所用ATI000934是指其中環(huán)序列與構建體1571G06 (Seq ID 87)的環(huán)序列相同的蛋白質，且該蛋白質在C末端處含有殘基EIDKP￡Q，其中該蛋白質經(jīng)聚乙二醇化且含有his-標簽。ATI001014是指其中環(huán)序列與構建體1571G04 (Seq ID 86)的環(huán)序列相同的蛋白質，且該蛋白質在C末端處含有GSGC接頭，其中該蛋白質經(jīng)聚乙二醇化且含有his-標簽。ATI001015是指其中環(huán)序列與構建體1572G06 (Seq ID 91)的環(huán)序列相同的蛋白質，且該蛋白質在C末端處含有GSGC接頭，其中該蛋白質經(jīng)聚乙二醇化且含有his-標簽。ATIOO1016是指其中環(huán)序列與構建體1490B03 (Seq ID 79)的環(huán)序列相同的蛋白質，且該蛋白質在C末端處含有GSGC接頭，其中該蛋白質經(jīng)聚乙二醇化且含有his-標簽。ATIOO1044是指其中環(huán)序列與構建體1490B03 (Seq ID 79)的環(huán)序列相同的蛋白質，且該蛋白質在C末端處含有GSGC接頭，但該蛋白質未經(jīng)聚乙二醇化且不含有his標簽。ATI001045是指其中環(huán)序列與構建體1490B03 (Seq ID 79)的環(huán)序列相同的蛋白質，且該蛋白質在C末端處含有GSGC接頭，其中該蛋白質經(jīng)聚乙二醇化且不含有his標簽。ATI001047是指其中環(huán)序列與構建體1571G04 (Seq ID 86)的環(huán)序列相同的蛋白質，且該蛋白質在C末端處含有GSGC接頭，其中該蛋白質經(jīng)聚乙二醇化且不含有his標簽。纖連蛋白經(jīng)由其整聯(lián)蛋白結合基序“精氨酸-甘氨酸 天冬氨酸”(RGD)天然地結合某些類型的整聯(lián)蛋白。在一些實施方案中，多肽包含缺乏(RGD)整聯(lián)蛋白結合基序的10Fn3結構域。藥代動力學部分
在一方面，本申請?zhí)峁┻€包含藥代動力學(PK)部分的抗IL-23 Adnectin。經(jīng)改進藥代動力學可根據(jù)感知性治療需要來評估。通常期望通過增加蛋白質在給予后在血清中保持可用的時間來增加生物利用度和/或延長劑量之間的時間。在一些情況下，期望提高蛋白質血清濃度隨時間的連續(xù)性(例如，減小蛋白質血清濃度在給予后不久與下一次給予前不久的差異)?？笽L-23 Adnectin可連接至這樣的部分,其相對于未經(jīng)修飾Adnectin將該多肽在哺乳動物(例如，小鼠、大鼠或人)中的清除率降低3倍以上。經(jīng)改進藥代動力學的其它測量可包括血清半衰期，其通常分為a階段及3階段。此兩個階段中的一個或兩個可通過添加合適部分來顯著改進。傾向于延緩蛋白質自血液清除的部分(本文中稱為“PK部分”)包括聚氧化烯部分例如聚乙二醇、糖(例如唾液酸)及良好耐受的蛋白質部分(例如，F(xiàn)e、Fe片段、轉鐵蛋白或血清白蛋白)。Adnectin可融合至白蛋白或白蛋白的片段(部分)或變體，如美國公布號2007/0048282中所述。在一些實施方案中，PK部分為血清白蛋白結合蛋白，例如闡述于美國公布號 2007/0178082 及 2007/0269422 中闡述的那些。
在一些實施方案中，PK部分為血清免疫球蛋白結合蛋白，例如闡述于美國公布號2007/0178082中闡述的那些。在一些實施方案中，Adnectin包含聚乙二醇(PEG)。一個或多個PEG分子可連接于蛋白質上的不同位置，且此連接可通過與胺、硫醇或其它適宜反應基團反應來實現(xiàn)。胺部分可為(例如)在多肽N末端存在的伯胺或存在于諸如賴氨酸或精氨酸等氨基酸中的胺基團。在一些實施方案中，PEG部分連 接于多肽上的位置,該位置選自a)N末端；b)介于N末端與最N末端P鏈或P樣鏈之間；c)位于與靶結合位點相對的多肽面上的環(huán)；d)介于C末端與最C末端0鏈或0樣鏈之間；及e)在C末端處。聚乙二醇化可通過定點聚乙二醇化來實現(xiàn)，其中將適宜反應基團引入蛋白質中以產(chǎn)生其中聚乙二醇化優(yōu)先發(fā)生的位點。在一些實施方案中，對蛋白質進行修飾以在期望位置處引入半胱氨酸殘基，從而允許對半胱氨酸進行定點聚乙二醇化。PEG的分子量可大幅度變化且可具支鏈或為直鏈。在一些實施方案中，Adnectin包含F(xiàn)n3結構域及PK部分。在一些實施方案中，F(xiàn)n3結構域為kiFM結構域。在一些實施方案中，相對于僅Fn3結構域，PK部分使多肽的血清半衰期延長多于 5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、120、150、200、400、600、800、1000% 或更多。在一些實施方案中，PK部分為聚合糖。在一些實施方案中，PK部分為聚乙二醇部分。在一些實施方案中，PK部分為血清白蛋白結合蛋白。在一些實施方案中，PK部分為人血清白蛋白。在一些實施方案中，PK部分為血清免疫球蛋白結合蛋白。在一些實施方案中，PK部分為轉鐵蛋白。在一些實施方案中，PK部分為對血清蛋白質具有特異性的另一Adnectin。生物物理學及生物化學表征
本申請?zhí)峁┌Y合至IL-23的pl9亞單位的Fn3結構域的Adnectin。如表I及實施例4中所示，可在平衡常數(shù)(例如解離常數(shù)，Kd)方面及在動力學常數(shù)(例如，結合速率常數(shù)(on-rate constant) Km及解離速率常數(shù)(off-rate constant) koff)方面對多肽與革巴分子的結合進行評估。Adnectin通常將以小于500 nMUOO nM、10 nM、l nM、500 pM、200 pM、100 pM的Kd結合至靶分子，但可耐受更高Kd值，其中Ktjff足夠低或Km足夠高。本發(fā)明的抗IL-23 Adnectin家族的BC、DE及FG環(huán)序列以及相應全長SEQ ID NO呈現(xiàn)于下表I中。
權利要求
1.一種多肽，其包含纖連蛋白III型第10結構域C°Fn3)，其中所述kiFM具有至少一個選自環(huán)BC、DE及FG的環(huán)且所述環(huán)的氨基酸序列相對于人wFM結構域中相應環(huán)的序列經(jīng)改變，且其中所述多肽以小于500 nM的Kd結合IL-23的pl9亞單位。
2.一種多肽，其包含纖連蛋白III型第10結構域C°Fn3)，其中所述kiFM具有至少一個選自環(huán)BC、DE及FG的環(huán)且所述環(huán)的氨基酸序列相對于人wFM結構域中相應環(huán)的序列經(jīng)改變，且其中所述多肽結合IL-23的pl9亞單位的結構表位。
3.權利要求I或2的多肽，其中所述BC環(huán)選自SEQID NO: 2_6。
4.權利要求I或2的多肽，其中所述DE環(huán)選自SEQID NO: 7-48
5.權利要求I或2的多肽，其中所述FG環(huán)選自SEQID NO: 49-59。
6.權利要求I或2的多肽，其中所述BC、DE或FG環(huán)氨基酸序列與SEQID NO: 2-59中的任一個具有至少80%同一性。
7.權利要求I或2的多肽，其中所述多肽氨基酸序列與SEQID NO: 60-100中的任一個具有至少90%同一性。
8.權利要求I或2的多肽，其中所述多肽氨基酸序列與SEQID NO: 60-100中的氨基酸3-96具有至少90%同一性。
9.權利要求I或2的多肽，其中所述BC環(huán)序列基序為SEQID NO: 257中所示的GHYPX1HX2，其中X1為甲硫氨酸或亮氨酸，且X2為異亮氨酸或纈氨酸。
10.權利要求I或2的多肽，其中所述FG環(huán)序列基序為SEQID NO: 258中所示的YYX3X3X3X3YX3X3I,其中X3可為任何氨基酸。
11.權利要求I或2的多肽，其還包含一個或多個選自以下的藥代動力學(PK)部分聚乙二醇、唾液酸、Fe、Fe片段、轉鐵蛋白、血清白蛋白、血清白蛋白結合蛋白及血清免疫球蛋白結合蛋白。
12.權利要求11的多肽，其中所述PK部分為聚乙二醇。
13.權利要求I或2的多肽，其還包含半胱氨酸接頭。
14.權利要求13的多肽，其中所述半胱氨酸接頭選自SEQID NO: 101中所示的氨基酸 GSGC 及 SEQ ID NO: 102 中所示的 EIDKPCQ。
15.—種藥學上可接受的組合物，其包含權利要求I至14中任一項的多肽，其中所述組合物基本上不含內毒素。
16.一種用于調節(jié)Thl7細胞的致病性的方法，其包括使權利要求I至14的多肽以有效干擾內源性IL-23與Thl7細胞反應的量與IL-23接觸。
全文摘要
本發(fā)明涉及結合白介素23(IL-23)，特別為IL-23的p19亞單位的基于纖連蛋白的支架結構域蛋白質。本發(fā)明亦涉及創(chuàng)新蛋白質在治療應用中用于治療自身免疫疾病的用途。本發(fā)明還涉及包含所述蛋白質、編碼所述蛋白質或其片段的多核苷酸的細胞，且涉及包含編碼所述創(chuàng)新蛋白質的多核苷酸的載體。
文檔編號C07K14/78GK102762591SQ201180010054
公開日2012年10月31日 申請日期2011年2月16日 優(yōu)先權日2010年2月18日
發(fā)明者A.布什, L.恩格爾, L.施尼維斯, R.達斯古普塔 申請人:百時美施貴寶公司