專利名稱：用免疫刺激性Hiv Tat衍生物多肽治療癌癥的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及基于免疫的癌癥治療劑領域。人免疫缺陷病毒(HIV)轉錄反式活化因子(Tat)是長度為86到110個氨基酸的可變RNA結合肽，其被編碼于HIV基因組的兩個分開的外顯子上。Tat在所有人慢病毒之間是高度保守的，并且是病毒復制所必需的。慢病毒Tat與TAR(反式活化相應的)RNA區(qū)結合時，轉錄(病毒RNA到DNA隨后到信使RNA的轉化)水平顯著提高。已經(jīng)證實Tat提高病毒RNA轉錄，已經(jīng)提出Tat可在T4細胞和巨噬細胞中引起細胞凋亡(編程性細胞死亡)(針對HIV感染的機體免疫監(jiān)督系統(tǒng)的關鍵部分)，并且可能刺激α干擾素的過量生產(chǎn) (α-干擾素是一種公認的免疫抑制性細胞因子)。HIV感染過程早期的細胞外Tat存在可降低患者的免疫應答，給予病毒超過宿主的優(yōu)點。另外，Τ4細胞的直接破壞和α-干擾素生產(chǎn)的誘導能夠幫助解釋在獲得性免疫缺陷綜合征(AIDQ患者中觀察到的強烈細胞免疫應答的缺失，以及說明初始時深刻的免疫抑制。然而，從HIV-感染的長期無進展者(LTNP)中分離的Tat蛋白質與AIDS患者中存在的C-Tat不同。在LTNP中發(fā)現(xiàn)的Tat蛋白質能夠反式活化病毒RNA，然而，LTNP Tat (在下文中稱作IS-Tat，表示免疫刺激性Tat)不在T4細胞或巨噬細胞中誘導細胞凋亡，并且不是免疫抑制性的。另外，用分離自LTNP的HIV離體感染的T4細胞(此類細胞系被稱作TatTcL)能夠導致IS-Tat蛋白質的過表達，通常達到其它病毒蛋白質的虛擬排斥 (virtual exclusion)，所述其它病毒蛋白質是強有力地促進生長的，而不是原-細胞凋亡的(pro-apoptotic)。從這些Tat TcL中克隆的Tat基因揭示了位于氨基端和第二外顯子第一部分內的兩個Tat區(qū)中的序列變異。這些令人驚訝的發(fā)現(xiàn)能夠幫助解釋為何被HIV感染的LTNP T4細胞不會以在發(fā)展成AIDS的被HIV感染的個體中所觀察的驚人速率相繼死亡。另外，慢病毒中發(fā)現(xiàn)了下述Tat變體，所述變體感染猴物種，但是不導致免疫缺陷和流行性感染的發(fā)生。這些變體Tat蛋白質指導單核細胞分化成刺激細胞毒性T淋巴細胞 (CTL)應答的樹狀突細胞(DC)。這些猿猴Tat變體和并非免疫抑制性的其它Tat變體已被稱作減毒的或免疫刺激性的Tat(IS-Tat)?；谑褂瞄L期⑶4+Tat T細胞系的觀察、臨床觀察和動物實驗，減毒的Tat (更特定地IS-Tat，或者已被化學或物理改變的Tat蛋白質)可作為免疫刺激劑作用，激活T4細胞，誘導它們的增殖。該原理可幫助解釋在LTNP中觀察到的穩(wěn)定T4水平。另外，與其它活性疫苗(例如但不限于其他病毒、細菌、立克次氏體和癌細胞的疫苗)聯(lián)合施用時，減毒的 Tat可用作佐劑。癌癥和慢性感染是對基于免疫的治療應答的常見人疾病的最突出的例子。盡管感染是要通過免疫來控制的首要疾病，但是臨床人試驗確定免疫應答，尤其是免疫系統(tǒng)的CTL 臂的免疫應答，能夠使一些人黑色素瘤和腎癌消退。這些觀察結果被下述發(fā)現(xiàn)擴展一類特別的抗原呈遞細胞(APC)DC尤其有效地引起針對癌癥和其它疾病的CTL活性。靶向和活化 DC的技術已經(jīng)導致針對由人乳頭狀瘤病毒(HPV)感染引起的人脊椎前惡性腫瘤(cervical pre-malignancies)和人肺癌的一些早期成功。與目前針對癌癥使用的化學治療藥物相反， 激發(fā)針對癌癥的CTL應答的藥劑由于免疫應答的巨大特異性而伴隨著極少的副作用。開發(fā)治療癌癥的免疫治療藥物的努力被下述方面的技術困難阻礙靶向和活化 DC,從而將所需的進入信號遞送并維持至CTL。誘導CTL應答的抗原靶向作用在下述范圍內是一種挑戰(zhàn)天然加工需要抗原進入細胞的細胞質，從而結合免疫系統(tǒng)的主要組織相容性復合物(MHC) I類抗原，這是CTL活化的必要條件，因為活化CTL上T細胞受體的配體是抗原和MHC I類的復合物。在幾乎所有情況下，蛋白質抗原，甚至在它們與DC輔助活化因子偶聯(lián)時，排他地進入替代性的MHC II類抗原呈遞途徑，所述途徑排除CTL刺激。這可以部分通過基于肽的技術來克服，因為肽結合已經(jīng)位于DC表面上的MHC I類。然而，該技術是非特異性的，并且大部分肽是較差的DC活化因子，這限制了它們作為人癌癥治療的功效。已知一組有限的生物學蛋白質刺激CTL應答。人免疫缺陷病毒I(HIV-I)轉錄反式活化因子(Tat)的變體和衍生物能夠刺激該CTL應答。目前已知直接引發(fā)CTL應答的其它生物制品以熱休克蛋白(HSP)為基礎，或者以某些細菌的外殼蛋白為基礎。在與HPV感染相關的某些生殖器新生物的治療中，熱休克蛋白顯示有限的功效。乳腺癌是全世界女性中癌癥相關死亡的主因之一。全世界每年約發(fā)生一百萬新的乳腺癌病例，導致死亡370，000人。每年在美國診斷出大于200，000的浸潤性乳腺癌病例， 約45，000人的死亡歸因于該疾病，使得乳腺癌成為美國女性癌癥死亡率的第二主因，以及總癌癥死亡的第五主因。在乳腺癌發(fā)病率的穩(wěn)定降低后，從廣泛的浸潤性(第4階段)疾病診斷時起的平均乳腺癌存活在過去二十年間沒有改變過。從1988年起，第4階段乳腺癌的五年存活率保持在約20%，表明更新藥劑的存活優(yōu)點已經(jīng)完成了它們對于末期階段疾病的歷程。在過去四十年間，在輔助設置(adjuvant setting)中對乳腺癌的治療經(jīng)歷了顯著的改進。除了更好的腫瘤切除術、放射療法、標準化學療法和激素代替療法以外，出現(xiàn)了具有不同溶瘤細胞機制的新種類療法，例如iTaxol 和Here印tin 。Here印tin 是這些藥劑中的最后一個，在2003年被引進。從2007年起其未在患者中顯著擴展。另外，Here印tin 的功效僅限于20%患有乳腺癌的女性，這些女性最顯著地過表達Herf/neu癌基因。因此需要新的、更閉塞的藥劑來抗爭和預防乳腺癌。在為了改進許多癌癥管理的研究下，免疫療法是一種定向的機制，其能夠控制腫瘤生長并預防轉移，同時避免與標準療法相關的許多副作用。在乳腺癌是過多地影響育齡年輕女性的疾病這一情況下，后一考慮尤其重要。早期乳腺癌免疫療法研究著重于通過施用針對乳腺癌抗原的疫苗或單克隆抗體使天然免疫應答靶向抵抗癌細胞的方式。雖然這一途徑由于乳腺癌是腫瘤特異性蛋白質(例如哺乳抗原乳腺球蛋白A和乳黏著蛋白及其它) 的豐富來源而很好理解，但是其證實在很大程度上是不成功的，因為與溶細胞性T細胞活化相反，抗體顯示在大部分設置下控制實體瘤生長的功用有限。下一代乳腺癌免疫療法著重于增強患者現(xiàn)有的抗乳腺癌免疫應答的方式，以免疫抑制也限制腫瘤靶向策略功效的理論為基礎。一種此類免疫療法是針對CTLA4的單克隆抗體，所述CTLA4是涉及抑制的溶細胞性T細胞上的受體。盡管證實了抵抗黑色素瘤和卵巢癌的一些承諾，但是抗-CTLA4已經(jīng)證實在乳腺癌動物模型(包括本文報道的研究中使用的乳腺癌動物模型)中作為獨立藥劑是無效的。在癌癥中評價的第二類免疫刺激劑——toll 樣受體(TLR)激動劑通過起始新的觸發(fā)信號從源自單核細胞的樹突狀細胞進入免疫系統(tǒng)而發(fā)揮作用。這些藥劑迄今為止已經(jīng)證實在大部分實體癌癥(包括乳腺癌)中功用有限， 部分是因為它們迅速誘導伴隨著T細胞活化的免疫抑制。人免疫缺陷病毒感染引發(fā)遞增的免疫抑制，所述免疫抑制在缺乏治療時通常發(fā)展成AIDS，之后導致受感染的個體死亡。因為免疫抑制涉及多種實體癌癥進展(包括乳腺癌)模型，所以下述事實并不令人驚訝受HIV感染的人處于對多種惡性腫瘤、特別是非-Hodgkin淋巴瘤(NHL)、Kaposi肉瘤(E)和浸潤性宮頸癌的提高的風險下，所述惡性腫瘤是受HIV感染個人中定義AIDS的癌癥。與之矛盾的是，至少三類已報道在患有進行性 HIV疾病的女性中對浸潤性乳腺癌具有降低的風險。與法國的一般人群相比時，受HIV感染的女性具有遞減的乳腺癌相對風險(RR)的統(tǒng)計學顯著性模式。在坦桑尼亞的AIDS流行后，第二組發(fā)現(xiàn)在男性以及女性中乳腺癌發(fā)病率的統(tǒng)計學顯著性降低。第三，分析了 8500 例進行性HIV疾病的美國財團(US consortium)報道了統(tǒng)計學顯著的降低的乳腺癌發(fā)生風險(ρ < 0. 05)，所述風險在實現(xiàn)病毒復制控制時恢復至基線。

發(fā)明內容
本文公開了用作癌癥免疫治療劑的人免疫缺陷病毒(HIV)轉錄反式活化因子 (Tat)蛋白質的衍生物。在一個實施方案中，提供了包含人免疫缺陷病毒(HIV)轉錄反式活化因子(Tat) 蛋白質的經(jīng)修飾的氨基酸序列的藥物組合物，其中所述經(jīng)修飾的氨基酸序列與選自下組的氨基酸序列具有大于85%的序列同源性，所述組由SEQ ID N0:2、SEQ ID NO :3和SEQ ID NO 4組成。在另一實施方案中，組合物包含SEQ ID NO 3的氨基酸序列。在一個實施方案中，提供了治療癌癥的方法，所述方法包括對有需要的受試者施用治療有效量的Tat衍生物多肽；和在受試者中導致癌癥生長的停止或癌癥的消退。在另一個實施方案中，提供了降低腫瘤負擔的方法，所述方法包括對有需要的受試者施用治療有效量的根據(jù)權利要求1所述的Tat衍生物；和在受試者中導致癌癥的消退。在另一實施方案中，Tat衍生物多肽以多次劑量被施用。在又一實施方案中，施用步驟包括重復性施用循環(huán)，其中每個循環(huán)包括在確定的時間段中施用多次劑量的Tat衍生物多肽，之后是休息時間段，并且其中所述循環(huán)被重復多次。在另一實施方案中，施用步驟包括重復性施用循環(huán)，其中每個循環(huán)包括在確定的時間段中施用多次劑量的Tat衍生物多肽，之后在確定的時間段中施用一次或多次劑量的治療劑，并且其中所述循環(huán)被重復多次。
在另一實施方案中，治療劑是環(huán)磷酰胺。在又一實施方案中，癌癥是乳腺癌。在另一實施方案中，癌癥是卵巢癌。在另一實施方案中，Tat衍生物多肽與SEQ ID NO 3的氨基酸序列至少85%同源。附圖概述

圖1描述了用Tat衍生物對人單核細胞的刺激。圖2描述了用Tat衍生物刺激人單核細胞的劑量應答曲線。圖3描述了 Tat衍生物對體外4T1腫瘤生長的療效。在注射腫瘤細胞后第0、7、 14 和 21 天用 Nani-Pl 或 Nani-P2(400ng，皮下[SC])(圖 3A)或 Nani_P3 (400ng 或 2 μ g， SC)(圖3B)處理注射了 IxlO4 4T1腫瘤細胞的BALB/c小鼠。對照組用PBS處理。數(shù)據(jù)表示平均腫瘤體積；誤差棒士SE。每組含有10只小鼠。從第15天起，對照組和用Nani-Pl 或Nani-P2處理的組之間的差異顯著(ρ < 0. 05，。從第22天開始，對照和Nani-Pl或 Nani-P2之間的差異高度顯著(ρ < 0. 01**)。Nani-P3 (任一劑量)和對照之間無差異。圖4描述了經(jīng)純化的Nani-P2對體內4T1乳腺腫瘤生長影響的劑量應答曲線。對每組十只BALB/c小鼠的四組植入IxlO4 4T1細胞。三組被分別給予每只小鼠0. ^gdng* 40ng的遞增劑量，21天眾在左側肋腹給予四次。第四組對照組在左側肋腹注射PBS。數(shù)據(jù)表示平均腫瘤體積。對照組和0.4ng劑量之間的差異是顯著的(ρ <0.5*)，對照組和^g 或40ngNani-P2處理組之間的差異是高度顯著的(ρ < 0. 1**，ρ < 0. 01**)。圖5描述了用Nani-P2處理帶有4T1乳腺腫瘤的小鼠的Kaplan-Meier存活曲線。 第0天在乳墊(mammary pad)中對小鼠SC注射IxlO4 4T1細胞。第0天用SC施用的四次劑量的Nani-P2(40ng)開始處理。第42天，處理組具有超過對照的統(tǒng)計學顯著更好的存活O (圖5A)。在一組中，治療被展示至第13天，此時一系列三次劑量的Nani-P2(40ng) 被每周靜脈內(IV)施用、SC施用進引流淋巴結中或瘤內(IT)施用(圖5B)。第47天IV Nani-P2的存活益處(survival benefit)是高度統(tǒng)計學顯著的O，同時SC Nani-P2的存活益處也是統(tǒng)計學顯著的O。圖6描述了 TS/A和SMl乳腺癌模型中Nani-P2的抗腫瘤活性。對小鼠SC植入 1x105TS/A乳腺癌細胞(圖6A)，并用遞增劑量的SC Nani-P2 (0. 4、4和40ng)處理。即使在最低劑量時，主要的抗癌差異也是高度顯著的(P < 0. 01**)，同時40ng劑量也是高度顯著的(p<0.01_)。圖6B描述了 SC植入hlO5 SMl乳腺癌細胞并在第0、7、14和21天用 Nani-P2 (40ng) SC處理的小鼠。對照和用Nani-P2處理的SMl動物之間的原發(fā)性腫瘤生長差異是高度統(tǒng)計學顯著的(P < 0. 01***)。圖7描述了來自帶有4T1乳腺腫瘤的小鼠脾細胞的INF-Y生產(chǎn)。對Balb/c小鼠SC注射IxlO4 4T1細胞。對照動物每周接受PBS注射，而Nani-P2處理包括每周一次的 SC注射(40ng)，從第O天開始持續(xù)4周。第33天當對照小鼠處于末期時，將小鼠處死，收獲脾并作為單細胞懸浮液冷凍，直至測定時。將經(jīng)脾細胞(hlO5)和IxlO4絲裂霉素C-處理(50μ g/ml，30分鐘)的4T1刺激劑細胞⑶涂布在96孔平板中。刺激72小時后，收集上清液，使用商業(yè)IFN-γ ELISA試劑盒測定IFN-Y濃度。在體外培養(yǎng)物的所有條件下， 來自經(jīng)Nani-P2-處理的小鼠的脾細胞培養(yǎng)物中IFN-γ生產(chǎn)顯著(ρ < 0. 05*)更高。1 無再刺激；2 :IL-4 (50ng/ml) /GM-CSF (100mg/ml) ；3 刺激劑細胞 /IL-4/GM-CSF ；4 僅刺激劑細胞。體外激動劑IL-4和GM-CSFQ和幻的添加誘導了高度顯著的IFN-Y生產(chǎn)提高(ρ < 0. 01**)。圖8描述了 Nani-P2處理使確立的4T1乳腺腫瘤消退并抑制肺轉移。在圖8A中， 第0天對兩組10BALB/c小鼠在乳墊中注射ΙχΙΟΜΤΙ細胞。一組用Nani_P2 (40ng)每周給藥，從第14天開始持續(xù)三周。第二組用PBS處理并用作對照。第22天時腫瘤負擔高度顯著，并且在試驗的持續(xù)時間中始終保持如此(P < 0. 01**)。腫瘤直徑達到15mm時處死小鼠， 此時計數(shù)肺轉移灶(圖8B)。數(shù)據(jù)表示由對處理流程不知情的兩個觀察者定量的總肺轉移灶(p<0.01**)。圖8C描述存活。圖9描述了 BALB/c小鼠中的4T1腫瘤生長和肺轉移。對兩組lOBALB/c小鼠皮下 (SC)植入IXlO4 4T1細胞，或用40ng Nani_P2或PBSIV注射小鼠。在處理的第觀天，殺死小鼠，取出肺和腫瘤，并用眼計數(shù)腫瘤結節(jié)。展示了代表10只小鼠的腫瘤和肺的圖片?？梢栽诜伪砻嫔嫌^察到發(fā)白的腫瘤損傷。三次實驗得到相似的結果。圖10描述了 Nani-P2處理誘導的確立的4T1乳腺腫瘤的消退。10只小鼠中的一只經(jīng)歷了完全消退并且保持無疾病超過50天，此時研究結束。第0天在乳墊中對兩組10BALB/ c小鼠注射IxlO4 4T1細胞。一組每周IV進行每只小鼠Nani-P2(40ng)的給藥，從第14天開始持續(xù)3周，另一組用PBS處理并且用作對照。對照和Nani-P2-處理組之間原發(fā)性腫瘤生長的差異是高度顯著的(P < 0. 01**)。圖11描述了用重復的劑量的Nani-P2和環(huán)磷酰胺治療后的腫瘤生長。圖12描述了重復的劑量的Nani-P2和環(huán)磷酰胺的存活益處，這是與每周環(huán)磷酰胺的存活益處相比而言的。發(fā)明詳述設計了在乳腺癌動物模型中有高度活性的一系列人工人免疫缺陷病毒(HIV)轉錄反式活化因子(Tat)肽衍生物。所述分子在本文中被稱作Tat衍生物或“精確免疫刺激劑”(PINQ，并且包括下述Tat分子所述分子缺失了有助于HIV介導的免疫抑制的元件。 這些衍生物之一——Nani-P2引起確立的轉移性乳腺癌疾病的消退。在本文中報道的劑量下，高度純化(>95%純)的衍生物的皮下或靜脈內施用不伴隨顯著的毒性。盡管具有相對豐富的腫瘤特異性抗原，但是乳腺癌已被證實是一種困難的免疫療法靶標。已積累了多個下述證據(jù)乳腺癌和其它癌癥對免疫療法的不應狀態(tài)可能源自與確立的癌癥相關的免疫抑制。至少三種獨立的流行病學研究顯示，患有HIV感染甚至獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)的女性被矛盾地保護免于發(fā)生乳腺癌，甚至在免疫缺陷顯著的晚期疾病中也是如此?；诜肿臃治?，Tat蛋白(SEQ ID NO 1)編碼四種不同的相聯(lián)系的肽活性。本文公開的內容描述了以增強多肽的免疫治療潛能的方式，至少在第一個肽或氨基肽上衍生自規(guī)范的HIV-ITat結構的多肽組合物。Tat的氨基端部分包括來自核轉錄因子(TF)的短肽區(qū)， 其側翼典型地是脯氨酸殘基。該區(qū)域至少部分決定了 Tat多肽對免疫系統(tǒng)細胞、尤其是先天免疫細胞例如樹狀突細胞(DC)和巨噬細胞(抗原呈遞細胞或APC)如何具有刺激性或抑制性。因此，預測對TF區(qū)的修飾能夠使多肽在癌癥和其它慢性疾病的治療中更有活性。HIV-ITat 蛋白質(SEQ ID NO 1)MEPVDPRLEPWKHPGSQPKTACTTCYCKKCCFHCQVCFTKK ALGISYGRKKRRQRRRAPEDSQTHQVSPPKQPAPQFRGDPTGPKESKKKVERETETHPVD
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計算機分析發(fā)現(xiàn)，HIV-ITat編碼與另一 TF蛋白質hairless (hr)中存在的序列相同的短SH3結合結構域，所述hairless (hr)先前顯示在小鼠中具有免疫抑制性質。帶有hr 突變的小鼠發(fā)生免疫失調，目前最常被稱作“TH1到TH2的移位”，這是被HIV感染的個體發(fā)展成為AIDS的必要條件。進一步的分析確定，源自hr基因的SH3結合序列是從HIV-I分離的Tat的幾乎不變的特征，以及HIV-2的非常一致的特征。被HIV-I或HIV-2感染的個體只有在極少的情況下才不發(fā)展成AIDS。相反，被與HIV密切相關的一種慢病毒——猴免疫缺陷病毒(SIV)的某些毒株感染的靈長動物很少發(fā)展成AIDS或者，或者出乎意料地發(fā)展成AIDS。該觀察結果與免疫抑制性HIV-ITat中推定為免疫抑制性的hrTF片段的發(fā)現(xiàn)結合，表明一些靈長動物會在SIV Tat 的氨基端具有不同的(或不具有)TF片段。來自某些具有衰減的免疫缺陷過程的被SIV感染的烏黑白眉猴的Tat在其氨基端具有來自TF TARA而不是TF hr的片段。TARA與涉及某些癌基因活化的GIPase活化因子rho家族相關。在三種不同的被廣泛接受的小鼠乳腺癌模型4T1、SMl和TS/A中用重組生產(chǎn)的 Tat蛋白質衍生物進行的動物試驗提供了下述支持這些Tat衍生物在小鼠中抑制原發(fā)性乳腺癌生長是有活性的。另外，最有活性的衍生物Nani-P2顯著地抑制了自發(fā)性4T1肺轉移的發(fā)生，并且與對照小鼠相比提高了存活。顯著地，用Tat衍生物治療小鼠乳腺癌伴隨著提高的IFN-Y生產(chǎn)水平。在研究中，通過原發(fā)性腫瘤生長、存活和與PBS處理的對照相比時轉移性肺負擔的降低來評價時，在開始治療之前十四天播種4T1乳腺癌時，Tat衍生物與在腫瘤植入時給予的情況同等有效。合成的Tat衍生物對APC是免疫刺激性的，具有針對三種廣泛使用的小鼠乳腺癌模型中原發(fā)性癌癥以及確立的癌癥的巨大活性。特別地，衍生物之一——Nani-P2對侵略性的Her2 (-) 4T1乳腺癌模型中的原發(fā)性腫瘤生長、肺轉移灶形成和存活產(chǎn)生劑量依賴型和途徑依賴型的影響。下述事實并不令人驚訝減少的肺轉移與被改進的存活相關，因為肺轉移是晚期乳腺癌死亡率的主要原因。重要的是，用Nani-P2蛋白質靜脈內治療的帶有確立的4T1乳腺腫瘤的小鼠具有高度顯著的腫瘤生長抑制和擴展至最后一次給藥后至少36 天的存活益處。在有限的情況下，明顯觀察到完全緩解，這在侵略性較小(SMl)和/或多少更加致免疫(TS/A)的乳腺腫瘤中更加頻繁。在下述情況下腫瘤植入后延遲Nani-P2的施用對4T1腫瘤生長抑制幾乎沒有負面影響腫瘤細胞注射后第0天開始的療法(SC)將腫瘤負擔平均縮小53%，而在第13天(此時腫瘤生長已經(jīng)達到平均直徑約5mm)開始的SC療法的最大效果是將腫瘤負擔平均降低52%?？偠灾@些觀察結果表明Nani-P2能夠在人中有利地影響晚期和Her2(_)人乳腺癌。另外，本文公開的Tat衍生物包含全人序列。在施用了大于三劑的小鼠中觀察到針對Tat衍生物的逐步快速耐受(數(shù)據(jù)未顯示)，這可主要歸因于宿主發(fā)生了抑制性抗衍生物抗體應答。因為人的這類抗體應答能夠阻斷DC活化從而可觀地減少HIV復制，所以其顯然不能容易地在人中建立，使得至少歸因于基于抗體的機制的類似程度的快速耐受更不可能在人療法中運作。本文報道的研究使用通過IV或SC任一給予的每周約三劑或四劑Tat衍生物的流程，其中IV施用證實對于提高存活和降低轉移最為有效。在給予了這些組合物的超過250 只的小鼠中未觀察到毒性。與4-8gm/kg為標準療法的Here印tin 的劑量應答曲線相比，乳腺癌對Tat衍生物的靈敏度有利地與之相反。估計Tat衍生物在人中具有多達小鼠中 100倍的生物活性，表明與進一步更低的毒性風險相關的進一步更低的劑量可能證實是成功的。本文中確定了 Tat衍生物活化抗癌T細胞免疫應答的INF-Y臂(圖5)。由來自用Nani-P2處理的小鼠脾細胞分泌的INF- γ的基線水平是來自用PBS處理的對照小鼠的 8倍高。可以通過先天的免疫激動劑GM-CSF和IL-4體外額外地增強(高達53倍)應答體內Tat衍生物處理的INF-Y分泌，盡管來自對照小鼠的脾細胞甚至在嘗試用高劑量的 GM-CSF和/或IL4共同刺激后仍保持被抑制。盡管所公開的Tat衍生物在晚期和早期小鼠乳腺癌中均具有“獨立”功效的反抑制劑，但是這些觀察結果還支持了下述展望Tat衍生物能夠與目前處于臨床開發(fā)中的其它反抑制性抗癌療法協(xié)同作用，所述其它反抑制性抗癌劑療法可能在面對晚期腫瘤負擔和伴隨的嚴重免疫抑制時具有有限的效果。一種更致免疫的乳腺癌模型(SMl)和/或具有免疫優(yōu)勢表位的一種乳腺腫瘤(TS/ A)在Tat衍生物療法后具有相對高的消退率，而“非致免疫”的4T1模型更加難治。這與下述模型相一致免疫抑制是乳腺癌發(fā)展中的主要因素，事實上可有助于乳腺癌侵襲。該模型得到下述觀察結果的支持4T1以高水平表達若干常見的乳腺癌抗原，包括乳黏著蛋白和雌激素結合蛋白，在沒有Tat衍生物誘導的反抑制時針對所述高水平表達的免疫應答顯然被完全抑制?？偠灾?，這些觀察結果提出下述可能性Tat衍生物與一種或若干種常見的人乳腺癌抗原一起被施用給健康的有風險女性時，能夠最終被發(fā)展成預防性的抗乳腺癌疫
田ο在另外一些實施方案中，本文公開了 Tat衍生物的經(jīng)保守修飾的變體。本文所述的變體維持親本分子或來源分子的生物活性。在本文中使用時，術語“經(jīng)保守修飾的變體”是指與原始肽具有相同或相似生物活性的變體肽。例如，可以制造保守的氨基酸改變，所述改變盡管改變了蛋白質或肽的一級序列，但是不改變蛋白質或肽的功能。保守的氨基酸取代典型地包括以下組中的取代甘氨酸和丙氨酸；纈氨酸、異亮氨酸和亮氨酸；天冬氨酸和谷氨酸；天冬酰胺和谷氨酰胺；絲氨酸和蘇氨酸；賴氨酸和精氨酸；苯丙氨酸和酪氨酸。(通常不改變一級序列的)修飾包括多肽的體內或體外化學衍生化，例如乙?；螋然＿€包括在內的是糖基化修飾，例如如下進行在多肽合成和加工或其它加工步驟中修飾多肽的糖基化模式；將多肽暴露于影響糖基化的酶，例如哺乳動物糖基化酶或去糖基化酶。還包括在內的是具有磷酸化的氨基酸殘基例如磷酸酪氨酸、磷酸絲氨酸或磷酸蘇氨酸的序列。本發(fā)明還包括已使用常規(guī)分子生物學技術修飾從而改進它們對蛋白水解降解的抗性或優(yōu)化其溶解度性質的多肽。此類多肽的類似物包括含有除天然存在的L-氨基酸之外的殘基(例如D-氨基酸或非天然存在的合成氨基酸)的多肽。本文公開的多肽不限于本文所列的任何特定示例性方法的產(chǎn)物。除了基本全長的多肽以外，本公開還提供了多肽的生物活性片段。在本文中使用時，基本相同的氨基酸序列典型地共享大于95%的氨基酸同一性。 然而，公認作為剪接變體出現(xiàn)的或者通過保守氨基酸取代(或簡并密碼子取代)被修飾的、含有小于上述同源性水平的蛋白質(和編碼此類蛋白質的DNA或mRNA)被認為在本公開的范圍內。如本領域技術人員容易公認的，已經(jīng)設計出多種方式來比對序列進行比較，例如 Henikoffand Henikoff 在 Proc. Natl. Acad Sci. USA 89 :10915(1992)中描述的 Blosum 62 評分矩陣。為了該目的而便利使用的算法是可廣泛獲得的(見例如Needleman and Wunsch in J. Mol.Bio. 48 :443 (1970))。因此，本文公開了與SEQ ID NOs. 1-4中公開的Tat衍生物85%、90%、95%、98%、 99%或100%相同的氨基酸序列。以下的表達體系適用于表達所公開的Tat衍生物哺乳動物細胞表達體系，例如但不限于，昆蟲細胞表達體系，例如但不限于，Bac-to-Bac表達體系，桿狀病毒表達體系，和 DES表達體系；和E. coli表達體系，包括但不限于pET、pSUMO和GST表達體系。在另一實施方案中，Tat衍生物與可用于分離多肽的6-His標簽一起表達。6-His標簽純化系統(tǒng)是本領域常規(guī)技術人員已知的。“治療有效量”旨在表示定量實現(xiàn)療效所需要的量。本文公開的Tat衍生物是在多種類型癌癥中有用的免疫刺激性多肽。在一個實施方案中，Tat衍生物可用于治療一類癌癥，包括但不限于乳腺癌、黑色素瘤、卵巢癌、肺癌、胰腺癌、骨髓瘤、結腸直腸癌、直腸癌、淋巴瘤和結腸癌。在另一實施方案中，癌癥是乳腺癌。在又一實施方案中，癌癥是卵巢癌。本公開還涉及包含上述Tat衍生物多肽的藥物組合物。所公開的藥物組合物的劑量和期望地藥物濃度可根據(jù)展望的具體用途而變化。適當劑量或施用途徑的決定完全在常規(guī)醫(yī)生的技術范圍內。動物實驗提供了測定用于人治療的有效劑量測定的可靠指導?？梢园凑?Toxicokinetics and New Drug Development,Yacobi et al,Eds. ,Pergamon Press, New York 1989, pp. 42-96 中 Mardenti, J. and Chappel1, W. “The use of interspecies scaling in toxicokinetics”制定的原則進行有效劑量的物種間縮放。在一個實施方案中，存在疾病。在另一實施方案中，細胞或個體的生命由于本文所述的方法而被延長。可以根據(jù)具體應用的需要配制上述Tat衍生物多肽，來施用給哺乳動物(包括人)，而不需要過多的實驗。另外，可以使用標準劑量-應答流程確定組合物的適當劑量，而不需要過多地實驗。因此，可以通過本領域公知的手段，例如使用惰性稀釋劑或使用藥物可接受的載體，來制造被設計為用于口、鼻、舌、舌下、頰、頰內、靜脈內、皮下、肌內和肺施用的組合物， 而不需要過多的實驗。為了治療性施用的目的，可以將藥物組合物與賦形劑摻合在一起，并以片劑、錠劑、膠囊、酏劑、懸浮液、溶液、糖漿等等形式使用?！八幬锟山邮艿妮d體”表示任何標準的藥物載體。合適的載體的例子是本領域公知的，并且可包括但不限于任何標準藥物載體，如磷酸鹽緩沖的鹽水溶液，含有Polysorb 80的磷酸鹽緩沖的鹽水，水，乳液例如油/ 水乳液，和多種類型的濕潤劑。其它載體可包括無菌溶液、片劑、有涂層的片劑和膠囊。典型地，此類載體含有賦形劑例如淀粉、奶、糖、某些類型的粘土、明膠、硬脂酸或其鹽、硬脂酸鎂或硬脂酸鈣、滑石、植物脂肪或油脂、膠質、二醇或其它已知的賦形劑。包含此類載體的組合物通過公知的常規(guī)方法配制。Tat衍生物多肽組合物能夠例如通過靜脈內、肌內、椎管內或皮下注射而容易地腸胃外施用。腸胃外施用可以通過將化合物摻入溶液或懸浮液中來完成。此類溶液或懸浮液也可包括無菌稀釋劑例如注射用水、鹽水溶液、不揮發(fā)性油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶劑。腸胃外配制物也可包括抗菌劑例如苯甲醇或對羥基苯甲酸甲酯，抗氧化劑例如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉，和螯合劑例如EDTA。也可以添加緩沖液例如乙酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽和用于調節(jié)張力的試劑例如氯化鈉或右旋糖。腸胃外制劑可以被包封在由玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多劑量管中。經(jīng)皮施用包括通過皮膚經(jīng)皮吸收組合物。經(jīng)皮配制物包括貼片、離子電滲裝置、軟膏劑、霜劑、凝膠、油膏劑等等。組合物可包括修飾固體或液體劑量單位的物理形式的多種材料。例如，組合物可包括在活性成分周圍形成涂層殼的材料。形成涂層殼的材料典型地是惰性的，并且可以選自例如糖、紫膠和其它腸溶包衣試劑。或者，活性成分可以被包裝在明教膠囊或扁膠囊中。本公開的Tat衍生物多肽組合物可以根據(jù)適當?shù)慕o藥方案，以治療有效量被施用。如本領域技術人員所理解的，需要的精確量可在受試者之間變化，取決于受試者的物種、年齡和一般條件，感染的嚴重性，具體地藥劑和施用的模式。在一些實施方案中，每天一次或多次，以受試者的體重為基礎施用約0. OOlmg/kg到約50mg/kg的組合物，以獲得想要的療效。在其它實施方案中，每天一次或多次，以受試者的體重為基礎施用約lmg/kg到約 25mg/kg的組合物，以獲得想要的療效。組合物的總每日劑量應由主治醫(yī)師在健全的醫(yī)療判斷范圍內決定。針對任何具體患者或受試者的特異性治療有效劑量水平會取決于多種因素，包括被治療的病癥和病癥的嚴重性；使用的特定化合物的活性；使用的特定組合物；患者或受試者的年齡、體重、一般健康、并別和飲食；施用時間、施用途徑、和使用的特定化合物的排泄速率；治療的持續(xù)時間；與使用的特定化合物組合使用或同時使用的藥物；和醫(yī)學領域中公知的其它因素。本文公開的組合物也可以在組合療法中使用。也就是說，本文公開的組合物可以在一種或多種其它想要的組合物、療法、治療或醫(yī)學程序的同時、之前、或之后被施用。所施用的具體療法組合應由主治醫(yī)師決定，并且應當考慮多種治療的相容性和想要實現(xiàn)的療效。應當理解，組合使用的治療活性劑可以在單一組合物、治療或程序中一起施用，或者可以單獨施用。在另一實施方案中，考慮了所公開的Tat衍生物的重復性給藥或頻繁給藥，這可在快速耐受之前進行，以及逆轉在乳腺癌發(fā)展期間確立的免疫抑制性潮流。頻繁給藥時例如在變態(tài)反應療法中使用的一種程序，其能夠支持對藥劑的免疫學耐受。一旦Tat衍生物能夠被用于恢復對乳腺腫瘤的免疫反應性，則由于晚期疾病而喪失了益處的其它免疫療法可能能夠重獲功效。在第二種方案中，使用化學治療方案，所述方案能夠與Tat衍生物免疫療法交替地釋放大量腫瘤抗原。因為晚期階段的人乳腺癌是多藥物抗性的，所以放射性療法可以是人試驗中實用的替代方案。Tat衍生物的重復給藥次數(shù)可以由醫(yī)學專業(yè)人士基于患者對劑量的應答而確立。 在一個實施方案中，Tat衍生物每3天施用一次，在10天的時間段中施用3劑。然后將該施用流程重復多個循環(huán)。本公開展望了多種不同的施用流程，其中Tat衍生物在選擇的時間框內被施用多次，然后將所述施用流程重復多個循環(huán)。在另一實施方案中，Tat衍生物的施用可以與一種或多種其它抗癌劑、免疫調節(jié)劑或免疫抑制劑的施用交替進行。在一個實施方案中，免疫抑制劑是環(huán)磷酰胺。
實施例1Tat衍生物的設計和生產(chǎn)本文公開了三種示例性的Tat衍生物，其中每種都以不同的方式代替TF hr片段。 序列中加有下劃線的部分表示脯氨酸之間的序列。Nani-Pl(MPM1 ；SEQ ID NO 2)-MEPVDANLEAffKHAGSQPRKTACTTCYCKKCCFHCQVCFTRKGLGISYGRKKRRQRRRAPQDSQT
HQASLSKQPASQSRGDPTGPTESKKKVERETETDPFDNani-P2(ASH4 ； SEQ ID NO 3)-MDPKGEEDQDVSHQDLIKQYRKPRTACNNCYCKKCCFHCYACFLRKGLGITYHAFRTRRKKIASADRIPVPQQSISIRGRDSQTTQESQKKVEEQAKANLRISRKNL⑶ETRGPVGAGN.Nani-P3 (TMPD5 ； SEQ ID NO 4) -METPLKEQENSLESCREHSSSISEVDVPTPVSCLRKGGRCffNRCIGNTRQIGSCGVPFLKCCKRKPFTRKGLGISYGRKKRRQRRRAPQDSQTHQASLSKQPASQSRGDPTGPTESKKKVERETETDPFDSH3結合蛋白含有TF功能所需的一系列內部脯氨酸。Nani-Pl去除了內部脯氨酸， 每個內部脯氨酸被丙氨酸取代，使得SH3-結合位點失活。所述改變使得作為TF的整個Tat 蛋白質殘缺，因為此時其主要作為胞漿內蛋白質被生產(chǎn)，與其它Tat衍生物不同。 Nani-P2具有來自非洲綠猴變體SIV的衍生化的Tat氨基端，所述SIV在宿主中具有低致病性。在所述序列中只有側翼為羧基的脯氨酸是保守的。在Nani-P3中，富含絲氨酸的TARA同源序列代替SH3結合序列，作為側翼是脯氨酸的氨基TF肽。Tat最初由短尾猴(macaques)和烏黑白眉猴(sooty mangabey monkeys) 中低致病性變體SIV測序而來。實施例2Tat衍生物的體外活性將人單核細胞與Tat衍生物(Nani-P2)、toll樣受體(TLR)的免疫刺激性序列 (ISS)(圖1)或脂多糖(LPS)(圖2) —起培養(yǎng)M-28小時，然后洗滌細胞并用熒光標記的 ⑶86染色。Tat衍生物刺激了比ISS (TLR)或LPS任一更高的⑶86表達。實施例3在乳腺癌的小鼠模型中評價Tat衍生物材料和方法動物。6到 8 周齡的雌性 BALB/c 小鼠購自 Jackson Laboratory (Bar Harbor, NE)。使用前使小鼠適應至少 1 周。在 Animal Maintenance Facility of the Columbia University of Medical Center將小鼠保持在無病原體的條件下，并且所有實驗由 Institutional Animal Care and Use Committee of Columbia University of Medical Center 批準。細胞系。源自BALB/c自發(fā)性乳腺癌的6-硫鳥嘌呤抗性細胞系——4T1細胞得自 ATCC ；小鼠腺癌細胞系 TS/A 由 Dr. Sandra Demaria(Demaria S. et al. Clin Cancer Res. 11 :728-34,2005)提供；源自 BALB/C 的乳腺癌 SM 1 由 Dr. James Allison,Universityof California, Berkeley友好提供。所有腫瘤細胞系在補充了 2mM L-谷氨酰胺、IOmM HEPES, 150單位/ml青霉素/鏈霉素、10%熱失活的FCS (Invitrogen) >50 μ M 2-巰基乙醇 (Sigma)和50mg/L慶大霉素(Lanza)的DMEM中培養(yǎng)。腫瘤攻擊和治療。第O天在左乳墊中分別用IxlO4 4T1、1x105TS/A或2X105SM1細胞(SC)注射BALB/c。通過在確立腫瘤后第0、7、12和17天將Tat衍生物直接注射進右肋腹中，進行免疫治療。對照組接受PBS注射。在一些實驗中，當所有小鼠具有確立的可測量的腫瘤(腫瘤注射后14天直徑3-5mm)時，將動物隨機指定至所示的多個處理組中。每周三次測量并記錄腫瘤負擔(腫瘤體積)。當腫瘤達到直徑15mm的體積時處死動物，收獲腫瘤并稱重。檢測肺轉移。如先前所述檢查肺的4T1轉移(Pulaski B. et al. Cancer Res. 60 2710-2715,2000)。在非常大多數(shù)的動物中，BALB/c小鼠中已確立2-3周的原發(fā)性4T1腫瘤轉移至肺。簡言之，在試驗開始時根據(jù)確立的IACUC指南處死小鼠，取出肺，由對處理流程不知情的兩個獨立的研究者用肉眼列舉肺表面上的腫瘤結節(jié)。免疫脾細胞的IFN- Y生產(chǎn)的ELISA分析。通過OptEIA ELISA試劑盒(BD Biosciences)評價IFN-γ的脾細胞分泌。簡言之，在96孔板中，20 1的E T (效應物 腫瘤)比例在含IL-2 (50ng/mL)和GM-CSF (100ng/ml)的DMEM中，使用或不使用切103/孔經(jīng)絲裂霉素C(50y g/ml)_處理的4T1細胞(用于提供腫瘤抗原)地培養(yǎng)來自4T1帶腫瘤小鼠的脾細胞(IxlO5/孔)。72小時后收集上清液并在-80°C下保持冷凍直至分析，而不喪失活性。根據(jù)制造商的說明，通過ELISA在一式兩份孔中無細胞的上清液中測量IFN-Y。如下計算腫瘤特異性IFN-Y生產(chǎn)減去在單獨使用培養(yǎng)基培養(yǎng)的脾細胞上清液中測量的背景值，并使用重組的IFN- γ標準曲線將光密度(OD)數(shù)值轉化成以pg/ml為單位的IFN- γ 量。刺激指數(shù)(Si)被計算為被刺激的培養(yǎng)物與對照培養(yǎng)物相比的IFN-Y比例。統(tǒng)計學分析。使用Student' s t_ 檢驗(Graph Pad Prism第 5 版；GraphPad)對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。使用log-rank檢驗(Graph Pad Prism第5版)對來自動物存活實驗的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。MM研究了乳腺癌小鼠模型中合成的、源自Tat的組合物的全身性施用的療效。為了比較一小組不同衍生物針對原發(fā)性乳腺腫瘤生長所賦予的相對保護，將IxlO4 4T1乳腺腫瘤細胞SC注射進雌性BALB/c小鼠的乳墊中，然后在第0、7、14和21天用400ng部分純化的Tat衍生物處(PBS中SC注射)進腋下引流淋巴結中。與單獨接受PBS注射的對照小鼠相比時，衍生物中的兩種(Nani-Pl和Nani-P2) 顯著地減小了腫瘤負擔，所述差異在腫瘤植入后第15天首次開始明顯(圖3A，第15天ρ < 0. 05)。相比之下，用與其它衍生物相同的流程生產(chǎn)并部分純化的第三種衍生物Nani-P3 甚至在五倍高的劑量O μ g，圖3B)下在抑制4T1原發(fā)性腫瘤生長或者延長存活(未顯示) 方面都更不有效。這些結果有效地排除了制劑中的污染物有助于抗腫瘤功效，尤其是在隨后的試驗用低得多的劑量下高度純化(> 95%純)的材料進行時。Nani-P2的功效比 Nani-Pl顯著更持久，因而在第21天(最后一次給藥)時，經(jīng)Nani-P2和Nani-Pl處理的腫瘤之間原發(fā)性腫瘤負擔的差異變?yōu)?8mm3，并且是高度統(tǒng)計學顯著性的(ρ <0.01)。盡管不再有其它療法，但是該效應持續(xù)該試驗的整個剩余部分。
高度純化的Nani-P2對4T1腫瘤的乳腺腫瘤生長抑制效應是劑量依賴型的，SC 施用低至0.4ng化合物之后觀察到顯著的效應(圖4)。將在引流腋窩側翼(draining axillary flank) SC施用的Nani_P2劑量通過對數(shù)增量從0. 4ng每劑遞增至40ng每劑逐漸地抑制了 4T1乳腺腫瘤生長。0. 4ng到40ng之間更高劑量Nani-P2下更強有力的4T1生長抑制是統(tǒng)計學顯著性的(P < 0. 01)，而將劑量遞增至400ng甚至2 μ g不導致進一步的抗腫瘤功效(數(shù)據(jù)未顯示)。重要的是，在使用多次給藥方案的多次試驗中SC或IV施用40ng Nani-P2后，未觀察到毒性。選擇40ng Nani-P2的劑量用于進一步研究。為了測定Nani-P2處理在小鼠中是否能夠除了縮小原發(fā)性腫瘤之外還延長存活， 進行了使用多種給藥方案和途徑(Sc、IV或IT)施用40ngNani-P2的處理流程。針對每組十只小鼠的小組監(jiān)督存活長度，所述存活長度使用Kaplan-Meier產(chǎn)物限制方法來評價。按照 Columbia University Medical Center Animal Facility 規(guī)程，在約 15mm 平均月中瘤直徑下使每只小鼠安樂死，或者在小鼠瀕死時可以更早，使得這兩種輸出之一成為死亡率的定義標準。在評價Nani-P2的第一個試驗中，與腫瘤植入同時開始SC處理。對照(經(jīng)PBS處理的)小鼠的中位存活時間是30天，100%的死亡率發(fā)生于第36天。通過Nani-P2施用 (14天中4劑)，35%經(jīng)處理的小鼠在第48天仍然存活(ρ < 0. 001，圖6A)，此時所有小鼠由于原發(fā)性腫瘤負擔而被處死。在第二個存活試驗中，允許腫瘤確立十四天，以更好地評價在轉移性疾病中的功效，之后通過若干途徑(Sc、IV或IT)之一每周施用三個循環(huán)的Nani-P2療法，以比較每種給藥途徑的相對功效(圖5B)。與先前的試驗相似，對照(SC經(jīng)PBS處理)的中位存活是 32天，第36天100%死亡。IV施用Nani-P2延長了存活(ρ < 0. 005，圖5Β)，在第47天有 60%存活，與之相比，經(jīng)SC處理的小鼠在第47天有20%存活(ρ <0.05)。化合物的瘤內施用略次于SC施用。選擇4Τ1小鼠乳腺腫瘤模型進行研究，因為這是一種侵略性和迅速浸潤的腫瘤； 其通常在植入后第十四天轉移，此時已難以治療。為了學習Nani-P2的效能如何擴展至其它小鼠乳腺腫瘤模型，研究了兩種額外的乳腺腫瘤TS/A和SMl (圖6)。TS/A原發(fā)性乳腺腫瘤大致與4T1同樣具有侵略性，在第30天達到15mm的腫瘤體積(圖6A)。然而，TS/A腫瘤可觀地更加應答Nani-P2處理，用0. 4ng Nani-P2處理后具有約50%的生長抑制，第30天總計40%消退。SMl乳腺癌模型(圖6B)最初作為原發(fā)性腫瘤侵略性較低，并且顯示死亡穿插在除轉移疾病之外的機制中。在處理的第30天，SMl腫瘤達到比TS/A或4T1任一小約33% 的平均體積。這表示與4T1相比，SMl腫瘤對Nani-P2免疫療法具有提高的靈敏度，從而在 16天中100%的動物中腫瘤生長被抑制，甚至在植入后28天和終止給藥方案后整整一周， 40%的動物仍保持減輕。為了測定細胞毒性T淋巴細胞在Nani-P2療法誘導的腫瘤排斥中是否起作用，進行了 IFN-γ ELISA測定(圖7)，以比較不用(對照)或用Nani-P2處理的4T1帶腫瘤小鼠任一的脾細胞(圖7)。在無菌條件下取出脾，并如別處(duftV S. et al. Exp. Mol. Path. 85 174-188,2008)所述制備。簡言之，將脾勻漿，將作為全身溶細胞性T細胞和APC的豐富來源的脾細胞與經(jīng)絲裂霉素C處理的4T1刺激劑細胞共同培養(yǎng)，以誘導記憶性免疫應答。單獨用培養(yǎng)基培養(yǎng)對照孔。通過商業(yè)ELISA (BD Biosciences)定量CTL活化的標準代用品——IFN-γ濃度。 在測定的所有條件下，來自經(jīng)Nani-P2-處理的BALB/c小鼠的脾細胞培養(yǎng)物中IFN- γ生產(chǎn)顯著(？<0.01，更高。與對照動物不同，經(jīng)Nani-P2-處理的動物中的IFN-Y活性可以在顯示促進DC分化的條件下通過添加IL-4和GM-CSF來增強(ρ < 0. 05)，，如果在開始培養(yǎng)時添加回腫瘤刺激劑(次級指數(shù)=53比對照，3S+IL4+GM-CSF)則甚至可以被進一步增加，證實Nani-P2在與其它CTL激動劑的協(xié)同作用中的潛能。為了進一步研究Nani-P2激動劑抵抗確立和轉移性乳腺癌的功效，在小鼠的腹部乳墊中SC注射4T1細胞，并且延遲治療直至腫瘤轉移至肺并且大小平均為3. 5mm (圖8A，第 13天)，對應于2. 4cm或T2階段人乳腺腫瘤。監(jiān)測小鼠的腫瘤生長(圖8A)、肺轉移(圖 8B)和存活(圖8C)。在尸檢時，與對照相比，接受Nani-P2的動物顯示可視的肺轉移灶數(shù)量的客觀降低(圖9)。用Nani-P2IV處理的小鼠肺中顯著可視的腫瘤結節(jié)的平均數(shù)量為 7，與之相比，PBS對照組具有35. 3的平均值(ρ < 0. 01**)。這對應于原發(fā)性腫瘤侵略性較低的外觀，以及大小平均小得多的肺轉移灶(圖8B)。通過比較靜脈內處理的動物GOng IV Nani-P2)和對照(經(jīng)PBS處理的)動物的原發(fā)性腫瘤負擔，清楚并顯著地證實了預先確立的、侵略性4T1乳腺癌設置中的Nani-P2功效(第18天ρ < 0. 01**,圖10)。在原發(fā)性腫瘤抑制中的該統(tǒng)計學顯著的益處(圖10)在持續(xù)了 50天的試驗的整個持續(xù)時間內保持(ρ < 0. 01**)，即使在第14天和觀天之間僅有三次每周PINS給藥。另外，有7/10的小鼠在第14天開始治療腫瘤時證實有腫瘤消退。這被翻譯成對存活的非常高統(tǒng)計學顯著的益處(P < 0. 005:見圖5B)?？捎^的是，1/10的動物經(jīng)歷了完全消退，并且在研究終結的第50天時保持無疾病，支持了已經(jīng)顯然使動物無腫瘤的推論。實施例4Tat衍生物和環(huán)磷酰胺的重復給藥療法將IxlO4 4T1細胞SC植入四組lOBALB/c小鼠的乳腺脂肪墊中。第10天腫瘤直徑達到4-5mm時開始治療。以3天的間隔對對照小鼠IV注射PBS，而交替治療小鼠在輪轉的10天循環(huán)中每3天接受3劑藥物。使用標準式計算腫瘤負擔(腫瘤大小mm3)。CY (單獨環(huán)磷酰胺)從第10天開始，每只小鼠每周用80mg/kg IP注射小鼠。Cy/Nani-P2 (首先環(huán)磷酰胺，之后Nani-P^從第10天開始，首先以3天的間隔用環(huán)磷酰胺(80mg/kg)對小鼠 IP注射三劑，然后以3天的間隔用Nani-P2 (40ng) IV注射3劑，輪轉進行。重復3劑CY之后3劑Nani-P2的循環(huán)，直至第50天。Nani-P2/CY (首先Nani-P2，之后環(huán)磷酰胺)從第 10天開始首先以3天的間隔用Nani-P2(40ng)對小鼠IV注射3劑，然后以3天的間隔用環(huán)磷酰胺腹腔內注射，輪轉進行。重復3劑Nani-P2之后3劑CY的循環(huán)，直至第50天。Nani-P2/CY組中與CY組相比降低的腫瘤負擔是具有非常高度統(tǒng)計學顯著性的 (圖 11，P = 0. 003077)。與環(huán)磷酰胺交替的Nani-P2大丸劑治療相比每周環(huán)磷酰胺的的存活益處是高度統(tǒng)計學顯著的(圖12，ρ = 0. 0001)。第50天時Nani-P2小組有3/10的小鼠完全緩解， 9/10的小鼠部分緩解(未顯示)，而第42天時10/10用環(huán)磷酰胺治療的小鼠死亡。除非另有說明，用于說明書和權利要求書中的表達成分數(shù)量、如分子量的性質、反應條件的所有數(shù)字等應理解為在所有情況下由術語“約”修飾。因此，除非指出反例，說明書和附加的權利要求書中公開的數(shù)量參數(shù)是近似值，其可根據(jù)本發(fā)明想要獲得的所需性質而變化。至少，并不企圖限制將等同原則應用于權利要求書的范圍，每個數(shù)量參數(shù)至少應按照經(jīng)報導的有效數(shù)字的位數(shù)并通過應用常規(guī)約數(shù)技術解釋。不反對公開本發(fā)明廣大范圍的數(shù)量范圍和參數(shù)為約數(shù)，而特定實施例中公開的數(shù)量值則是盡可能精確地報導的。然而，任何數(shù)量值固有地包含某些誤差，這是由它們各自檢測測量中發(fā)現(xiàn)的標準差必然地導致的。除非在本文另有說明或同上下文明顯抵觸，描述本發(fā)明的上下文中(特別是在以下的權利要求書上下文中)使用的術語“一個”(〃 a"，“ an")和“這個”(〃 the") 和類似的指代被解釋為包括單數(shù)和復數(shù)。對本文數(shù)值范圍的敘述僅意圖用作為引用落入該范圍的每個單獨的值的速記方法(shorthand method)。除非本文另有說明，每個單獨的值都被并入說明書，就像其被單獨地并入本文一樣。除非在本文另有說明或與上下文明顯抵觸，本文所述的所有方法可以以任何合適的順序進行。本文所提供的任何和所有實例或舉例文字(例如“例如”)的使用僅意欲用來更好地闡述本發(fā)明，而非對本發(fā)明通過其它方式要求保護的范圍設定限制。申請文件中的文字不應被理解為表示任何不要求保護的元素對本發(fā)明的實踐而言是必需的。本文公開的備選元素或實施方案的分組不應解釋為限制。各組成員可被單獨提到或要求保護，或與本文發(fā)現(xiàn)的組的其它成員或其它元素任意組合。應當理解，由于便利和/ 或專利的原因，一組的一個或多個成員可以被包括進一組中或從該組刪除。當任何這類包括或刪除發(fā)生時，本申請文件在本文中被認為含有經(jīng)改寫的組，以滿足對附加的權利要求書中所用的所有馬庫什組的書面描述。本文描述了根據(jù)本發(fā)明的某些實施方案，包括本發(fā)明的發(fā)明人已知的實現(xiàn)本發(fā)明的最佳模式。當然，本領域常規(guī)技術人員閱讀上述描述后會明白這些實施方案的變更。本發(fā)明人預期熟練的技術人員能適當?shù)夭捎眠@類變更，且本發(fā)明者意欲使得本發(fā)明以與本文特定描述不同的方式應用。因此，至少可適用的法律允許，本發(fā)明包括附加的權利要求書中所述的主體內容的所有修飾和等價物。另外，除非本文另有說明或與上下文明顯抵觸，在其所有可能變化中，上述元件的任何組合由本發(fā)明所包括。本文公開的特定實施方案可在使用語言“由……組成”或“基本由……組成”的權利要求中被進一步限制。在無論是被提交的或是通過修改而添加的權利要求中使用時，過渡術語“由……組成”將權利要求中未指定的任何元素、步驟或成分排除在外。過渡術語“基本由……組成”將權利要求的范圍限制為指定的材料或步驟和不實質性影響基本特征和新穎特征的材料或步驟。藉此要求保護的本發(fā)明的實施方案被固有地或清楚地描述并且能夠實施。另外，在本申請文件中，引用了大量專利和印刷出版物作為參考文獻。上述各參考文獻和印刷出版物通過引用其整體并入本文。最后，應理解本文公開的本發(fā)明的實施方案僅用于闡述本發(fā)明的原則。其它可使用的修飾也在本發(fā)明的范圍內。因此，通過示例而非限制的方式，可根據(jù)本文的教導利用本發(fā)明的備選形式。因此，本發(fā)明并非被限制為如精確地所示和所述的。
權利要求
1.藥物組合物，其包含人免疫缺陷病毒(HIV)轉錄反式活化因子(Tat)蛋白質的經(jīng)修飾的氨基酸序列，其中所述經(jīng)修飾的氨基酸序列與選自由SEQ ID NO 2,SEQ ID NO :3和SEQ ID NO 4組成的組的氨基酸序列具有大于85%的序列同源性。
2.根據(jù)權利要求1所述的藥物組合物，其包含SEQID NO 3的氨基酸序列。
3.用于治療癌癥的方法，所述方法包括對需要其的受試者施用治療有效量的根據(jù)權利要求1所述的Tat衍生物多肽；和在所述受試者中導致所述癌癥生長的停止或所述癌癥的消退。
4.根據(jù)權利要求3所述的方法，其中所述Tat衍生物多肽以多次劑量被施用。
5.根據(jù)權利要求3所述的方法，其中所述施用步驟包括重復性的施用循環(huán)，其中每個循環(huán)包括在確定的時間段中施用多次劑量的所述Tat衍生物多肽，之后是休息時間段，并且其中所述循環(huán)被重復多次。
6.根據(jù)權利要求3所述的方法，其中所述施用步驟包括重復性的施用循環(huán)，其中每個循環(huán)包括在確定的時間段中施用多次劑量的所述Tat衍生物多肽，之后在確定的時間段中施用一次或多次劑量的治療劑，并且其中所述循環(huán)被重復多次。
7.根據(jù)權利要求6所述的方法，其中所述治療劑是環(huán)磷酰胺。
8.根據(jù)權利要求3所述的方法，其中所述癌癥是乳腺癌。
9.根據(jù)權利要求3所述的方法，其中所述癌癥是卵巢癌。
10.根據(jù)權利要求3所述的方法，其中所述Tat衍生物多肽與SEQID NO 3的氨基酸序列至少85%同源。
11.降低腫瘤負擔的方法，所述方法包括向需要其的受試者施用治療有效量的根據(jù)權利要求1所述的Tat衍生物；和在所述受試者中導致所述癌癥的消退。
12.根據(jù)權利要求11所述的方法，其中所述Tat衍生物多肽以多次劑量被施用。
13.根據(jù)權利要求11所述的方法，其中所述施用步驟包括重復性的施用循環(huán)，其中每個循環(huán)包括在確定的時間段中施用多次劑量的所述Tat衍生物多肽，之后是休息時間段， 并且其中所述循環(huán)被重復多次。
14.根據(jù)權利要求11所述的方法，其中所述施用步驟包括重復性的施用循環(huán)，其中每個循環(huán)包括在確定的時間段中施用多次劑量的所述Tat衍生物多肽，之后在確定的時間段中施用一次或多次劑量的治療劑，并且其中所述循環(huán)被重復多次。
15.根據(jù)權利要求14所述的方法，其中所述治療劑是環(huán)磷酰胺。
16.根據(jù)權利要求11所述的方法，其中所述癌癥是乳腺癌。
17.根據(jù)權利要求11所述的方法，其中所述癌癥是卵巢癌。
18.根據(jù)權利要求11所述的方法，其中所述Tat衍生物多肽與SEQID NO :3的氨基酸序列至少85%同源。
全文摘要
本發(fā)明公開了通過施用經(jīng)修飾的人免疫缺陷病毒(HIV)轉錄反式活化因子(Tat)多肽來治療癌癥的方法，所述經(jīng)修飾的Tat多肽具有與未經(jīng)修飾的Tat多肽相比提高的免疫刺激性質。
文檔編號C07K14/00GK102405057SQ201080013578
公開日2012年4月4日 申請日期2010年3月23日 優(yōu)先權日2009年3月23日
發(fā)明者大衛(wèi)·I·科亨 申請人:那尼爾科斯治療公司