專利名稱：一種多肽免疫原及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種多肽免疫原及其制備方法，以及該多肽免疫原在制備用于治療 HBV慢性感染持續(xù)狀態(tài)及其相關(guān)的繼發(fā)性肝硬化、肝癌等疾病的疫苗或藥物中的應(yīng)用，屬于 醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
乙型病毒性肝炎是危害全人類健康的傳染性疾病之一。全球乙型肝炎病毒感染者 約占人群的30%，慢性肝炎患者約3.5億。我國屬高流行區(qū)，乙型肝炎病毒的攜帶者約占人 口的10% (1. 3億)，慢性肝炎患者約0. 3億，如其遷延不愈則可發(fā)展為肝硬化、肝癌。
目前控制乙型肝炎流行的主要方法是注射預(yù)防性乙肝疫苗，但其對乙肝病毒感染 者無效，且因種種原因接種率也不是很高，因此，在今后相當(dāng)長時期內(nèi)，乙型肝炎仍將是危 害人類健康的重要疾病之一。 目前已經(jīng)證實HBV作為一種嗜肝病毒，并不能直接引起肝細(xì)胞損傷，其感染的病 理和臨床后果取決于免疫機制。 作為細(xì)胞內(nèi)感染，慢性持續(xù)性感染狀態(tài)主要與機體細(xì)胞免疫應(yīng)答太弱有關(guān)。其中， HBV特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxic T lymphocyte, CTL)反應(yīng)決定了HBV感染的 最終結(jié)果。感染HBV后CTL活性高者體內(nèi)病毒被清除而痊愈；CTL活性低或測不到的感染 者則發(fā)展為慢性持續(xù)感染狀態(tài)，并進(jìn)一步發(fā)展為肝硬化或肝癌。 因此，打破HBV持續(xù)感染患者的免疫耐受狀態(tài)，在體內(nèi)啟動HBV特異性CTL反應(yīng)，
可治療HBV慢性感染持續(xù)狀態(tài)及防止其相關(guān)的繼發(fā)性肝硬化、肝癌等疾病。 美國的一家研究機構(gòu)在自己研究的基礎(chǔ)上分別申請了 4項美國專利。這些專利的
主要內(nèi)容是關(guān)于在HBV抗原上所確定的CTL表位。這些表位分別來源于核心抗原、表面抗
原、多聚酶和X抗原。這些部位或結(jié)構(gòu)，是HBV所誘導(dǎo)的CTL所識別的部位。我國科研人員
聞玉梅發(fā)現(xiàn)抗原-抗體免疫原性復(fù)合物可以有效地在部分鴨中清除病毒及疾病抗原，由此
認(rèn)為發(fā)展成為供人體應(yīng)用的治療性疫苗是有可能的。 當(dāng)前，對HBV慢性持續(xù)感染狀態(tài)(包括病毒攜帶者、慢性遷延性肝炎和慢性活動性 肝炎)尚無特效治療方法。干擾素和拉米呋定雖有特定的治療效果，但并不能清除病毒。因 此，目前急需尋求有效治療HBV慢性持續(xù)感染狀態(tài)的新方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種多肽免疫原及其制備方法。 本發(fā)明的另一目的在于提供了該多肽免疫原在制備用于治療HBV慢性感染持續(xù) 狀態(tài)及其相關(guān)的繼發(fā)性肝硬化、肝癌等疾病的疫苗或藥物中的應(yīng)用。 本發(fā)明所述多肽免疫原，含有一個多肽序列，該多肽序列含有氨基酸序列1、氨基 酸序列2、氨基酸序列3和氨基酸序列4，其中，各氨基酸序列之間由若干個氨基酸殘基組成 的連接肽段連接或直接共價連接；所述的氨基酸序列1是Th細(xì)胞表位序列或Th細(xì)胞表位序列與艾滋病毒HIV-l來源的TAT蛋白的堿性區(qū)域序列共價相連構(gòu)成的混合序列；所述的 氨基酸序列2是艾滋病毒HIV-l來源的TAT蛋白的堿性區(qū)域序列；所述的氨基酸序列3是 乙型肝炎病毒來源的CTL表位序列或乙型肝炎病毒來源的CTL表位序列與艾滋病毒HIV-l 來源的TAT蛋白的堿性區(qū)域序列共價相連構(gòu)成的混合序列；所述的氨基酸序列4是乙型肝 炎病毒來源的B細(xì)胞表位序列或乙型肝炎病毒來源的B細(xì)胞表位序列與艾滋病毒HIV-l來 源的TAT蛋白的堿性區(qū)域序列共價相連構(gòu)成的混合序列。 本發(fā)明所述的多肽序列從N端到C端的排列次序可以是氨基酸序列1、氨基酸序列
2、氨基酸序列3、氨基酸序列4的任意組合，其中，優(yōu)選的排列次序為 氨基酸序列1-氨基酸序列2-氨基酸序列3-氨基酸序列4、 氨基酸序列1-氨基酸序列3-氨基酸序列4-氨基酸序列2、 氨基酸序列1-氨基酸序列4-氨基酸序列2-氨基酸序列3、 氨基酸序列2-氨基酸序列1-氨基酸序列3-氨基酸序列4、 和氨基酸序列1-氨基酸序列3-氨基酸序列4， 其中當(dāng)氨基酸序列2存在時，氨基酸序列1、3、4不能為混合序列； 當(dāng)排列次序為氨基酸序列1-氨基酸序列3-氨基酸序列4時，氨基酸序列1、氨基
酸序列3、氨基酸序列4中至少含有一混合序列。 本發(fā)明所述的氨基酸序列1是破傷風(fēng)類毒素來源的Th細(xì)胞表位上的 第830-843氨基酸序列QYIKANSKFIGITE或通用Th細(xì)胞表位PADRE或混合序列 RKKRRQRRRQYIKANSKFIGITE或混合序列RKKRRQRRRPADRE ;所述氨基酸序列2是HIV-l TAT蛋白中第48-60氨基酸序列GRKKRRQRRRPPQ或第49-57氨基酸序列RKKRRQRRR或 第48-57氨基酸序列GRKKRRQRRR ;所述的氨基酸序列3是HBV核心抗原上的第18-27氨 基酸序列FLPSDFFPSV或混合序列RKKRRQRRRFLPSDFFPSV ;所述氨基酸序列4是HBV Pre S2來源的B細(xì)胞表位上的第14-26氨基酸序列DPRVRGLYFPAGG或第14-30氨基酸序列 DPRVRGLYFPAGGVSFG或混合序列RKKRRQRRRDPRVRGLYFPAGGVSFG。 本發(fā)明所述的各氨基酸序列之間的連接肽段為AAA、 GGG或SSS ;所述的多肽免疫 原其N端氨基酸序列的N端上連接著修飾性連接肽段KSS ;所述的修飾性連接肽段KSS的N 端的賴氨酸殘基的a或e氨基上分別或同時共價連接著棕櫚酰基。
本發(fā)明所述的多肽免疫原，可以有多種多肽序列，其中優(yōu)選的多肽序列為
多肽1)、 CH3 (CH2) 14C0K (CH3 (CH2) 14C0) SSPADRESSSGRKKRRQRRRPPQAAAFLPSDFFPSVGGGDPRVRG LYFPAGGVSFG(多肽2)、
AGGVSFG(多肽3)、 CH3 (CH2) 14C0K (CH3 (CH2) 14C0) SSQYIKANSKFIGITEAAAGRKKRRQRRRPPQAAAFLPSDFFPSV GGGDPRVRGLYFPAGGVSFG(多肽4)、 CH3 (CH2) 14COKSSPADREAAAFLPSDFFPSVGGGDPRVRGLYFPAGGGRKKRRQRRRPPQ (多肽5)、
CH3 (CH2) 14C0K (CH3 (CH2) 14C0) SSPADREAAAFLPSDFFPSVGGGDPRVRGLYFPAGGGRKKRRQRR RPPQ(多肽6)、
54C0)SSQYIKANSKFIGITEAAAFLPSDFFPSVGGGDPRVRGLYFPAGG
4C0)SSGRKKRRQRRRPPQSSSPADREAAAFLPSDFFPSVGGGDPRVRG CH3 (CH2) (多肽7)、 CH3 (CH2) 14C0K (CH3 (CH2) GRKKRRQRRRPPQ(多肽8)、
CH3(CH2) 多肽9)、 CH3 (CH2) 14C0K (CH3 (CH2) LYFPAGGVSFG(多肽10)、
CH3 (CH2) AGGVSFG(多肽11)、 CH3 (CH2) 14C0K (CH3 (CH2) 14C0) SSGRKKRRQRRRPPQSSSQYIKANSKFIGITEAAAFLPSDFFPSV GGGDPRVRGLYFPAGGVSFG(多肽12)、CH3 (CH2) 14COKSSPADREAAAFLPSDFFPSVGGGRKKRRQRRRDPRVRGLYFPAGGVSFG (多肽13)
CH3 (CH2) 14C0K (CH3 (CH2) 14C0) SSPADREAAAFLPSDFFPSVGGGRKKRRQRRRDPRVRGLYFPAGG VSFG(多肽14)、
CH3 (CH2)
CH3(CH2) 多肽16)。 —種多肽免疫原的制備方法，包括以下步驟
a.多肽固相合成所述多肽免疫原_樹脂，所述多肽免疫原 的多肽免疫原； b.對多肽免疫原_樹脂進(jìn)行裂解，得到裂解液； c.將裂解液采用體積排阻層析進(jìn)行初步分離純化，然后通過反向?qū)游黾兓玫蕉?肽免疫原。 多肽免疫原在制備用于治療HBV慢性感染持續(xù)狀態(tài)及其相關(guān)的繼發(fā)性肝硬化、肝 癌疾病的疫苗或藥物中的應(yīng)用。 所述的HBV慢性感染持續(xù)狀態(tài)為慢性乙型肝炎或乙型肝炎病毒攜帶者。
所述的疫苗或藥物還含有藥學(xué)上可接受的輔料、佐劑和載體。
所述的疫苗或藥物的給藥方式為注射給藥。
本發(fā)明常用氨基酸英文縮寫含義為








COKSSPADREGGGDPRVRGLYFPAGGGRKKRRQRRRFLPSDFFPSV(多肽15)或 fOK (CH, (CH2) 14C0) SSPADREGGGDPRVRGLYFPAGGGRKKRRQRRRFLPSDFFPSV (
樹脂表示與樹脂結(jié)合
A Ala丙氨酸
D Asp天冬氨酸
E Glu谷氨酸
F Phe苯丙氨酸
G Gly甘氨酸
I lie異亮氨酸
K Lys賴氨酸
L Leu亮氨酸
N Asn天冬酰胺酸
P Pro 脯氨酸
Q Gin谷氨酰胺酸
R Arg精氨酸
S Ser 絲氨酸
T Thr 蘇氨酸
V Val 纈氨酸
Y Tyr 酪氨酸 本發(fā)明采用固相化學(xué)合成方法制備該種免疫原，確定了反應(yīng)體系的最佳溫度、投 料比、肽樹脂裂解方法和時間、純化條件等因素。 在本發(fā)明方法中，當(dāng)反應(yīng)溫度在30-4(TC時，采用HOBT/DCC偶聯(lián)策略，氨基酸序 列連續(xù)合成，原料和樹脂的最佳摩爾投料比為3 : l，每個氨基酸或組分平均偶聯(lián)效率達(dá) 99. 5%以上；肽樹脂裂解采用三氟乙酸法，最佳裂解時間為90分鐘。 純化采用兩步法(l)采用體積排阻層析法初步純化，二甲基亞砜(DMSO)為流 動相，最佳柱溫為20-4(TC ;(2)采用反相層析法高度純化，研究了其最佳上樣條件、最佳 層析填料、最佳柱溫等因素。在本發(fā)明方法中，最佳層析填料是POROS 50 Rl，最佳柱溫為 22-34 。C。 經(jīng)乙醇溶液劑型、脂質(zhì)體混懸液體劑型、脂質(zhì)體凍干劑型的比較，證明脂質(zhì)體劑型 在誘導(dǎo)Thl極化和誘導(dǎo)CTL活性方面優(yōu)于乙醇溶液劑型，皮下注射疼痛感明顯減輕；脂質(zhì)體 凍干劑型在穩(wěn)定性方面明顯優(yōu)于脂質(zhì)體混懸液劑型。 本發(fā)明設(shè)定所述多肽免疫原的脂質(zhì)體注射液最佳處方。其中，含有上述多肽免疫 原、大豆磷脂、棕櫚酸、維生素E和膽固醇。 本發(fā)明所述脂質(zhì)體凍干劑型除含上述多肽免疫原、磷脂、膽固醇、棕櫚酸、維生素E 外，還含有人白蛋白、甘露醇和磷酸鹽。 本發(fā)明所述多肽免疫原及其劑型，可以使用任何一種公知的免疫方式，例如皮下 注射、皮內(nèi)注射、腹腔注射、靜脈注射等。免疫劑量可以是0. Olnmol至20nmol，可以不使用 另外的佐劑。用于免疫HBV轉(zhuǎn)基因小鼠可以劑量依賴性方式剌激淋巴細(xì)胞活化和增殖，Thl 極化和CTL應(yīng)答，并抑制HBV復(fù)制，血中HBV DNA拷貝數(shù)下降，HbsAg和HbeAg滴度下降或 消失。該效力為單獨使用單表位多肽或多表位多肽所不能達(dá)到的。 本發(fā)明以乙型肝炎抗原表位圖譜為基礎(chǔ)，確定了具有特定骨架結(jié)構(gòu)的多肽免疫 原。該多肽免疫原在HBV轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)能有效激發(fā)Thl極化反應(yīng)、HBV特異性CTL反應(yīng) 和抑制HBV的復(fù)制。實驗結(jié)果表明上述多肽免疫原可開發(fā)成為一種新型乙型肝炎及其繼發(fā) 性肝硬化、肝癌的治療用疫苗或藥物。
具體實施例方式
以下實施例僅用于解釋本發(fā)明，但不能因此限制本發(fā)明。 實施例1 多肽免疫原合成通法 采用Fmoc固相化學(xué)合成方法。固定羧基端，由C端向N端延伸肽鏈，在合成儀 上進(jìn)行。Fmoc氨基酸為原料，上樣量為0. 75mmol，側(cè)鏈保護(hù)氨基酸Ser(tBU) 、 Thr(tBU)、Tyr (tBU) 、 Gin (Trt) 、 Asp (OtBU) 、 Glu (OtBU) 、 Arg (pbf) 、 Asn (Trt) 、 Lys (Boc)，選用Wang-樹 脂為固相載體，上樣量0.25mmol，原料和樹脂摩爾比為3 : 1，偶聯(lián)到樹脂上的第一個氨基 酸采用DIC/HOBT法偶聯(lián)，其余氨基酸和棕櫚酸的活化及其偶聯(lián)采用HOBT/DCC法。
實施例2
多肽免疫原裂解通法選用TFA裂解液(0. 75g苯酚、0. 25ml乙二硫醇、0. 5ml苯甲硫醚、0. 5ml去離子水、
10. OmlTFA)，可最大限度的抑制副反應(yīng)的發(fā)生。反應(yīng)濃度40mg/ml (40mg指的是實施例1合
成得到的多肽免疫原_樹脂的質(zhì)量，ml指的是裂解液的體積)，反應(yīng)溫度為25°C ，反應(yīng)時間
為1. 5小時。將多肽分子從樹脂上切割下來，乙醚沉淀，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得粗肽產(chǎn)品。 實施例3 多肽免疫原初步純化通法 將粗肽產(chǎn)品采用SEC加樣55.0ml，進(jìn)行多肽分子的初步純化。層析條件層析系
統(tǒng)P-6000泵及AKTA印lorer 100 ;層析柱直徑25mrn，柱長850mm ;±真料S印hadex LH20 ;
流動相DMSO ;流速2. Oml/min。得到較好的純化結(jié)果。 實施例4 多肽免疫原純化通法 采用層析柱APS 50/275 POROS 50 Rl進(jìn)行批量制備。肽樹脂經(jīng)過裂解和初步純 化后，收集樣品分成7次進(jìn)行高度純化。層析條件層析系統(tǒng)AKTAe鄧lorerlOO ;樣品濃 度10. 52mg/ml ;加樣量11. Oml ;層析柱直徑50mm，柱長275mm ;±真料POROS 50 Rl ;柱 溫34°C ;流動相A :30%乙醇-lOmmol/L磷酸；流動相B :90%乙醇-lOmmol/L磷酸；梯度 0-50% B，5CV ;50-100% B，O. 5CV ;100-100% B，O. 5CV ;流速100. Oml/min。將收集的洗脫 峰合并液混勻后，存放于-2(TC備用。本品的純度為98. 5%，收率為85%。
實施例5 在HBV轉(zhuǎn)基因小鼠誘導(dǎo)Thl極化 采用HBV-DNA轉(zhuǎn)基因小鼠(ayw型HBV全基因(1. 3Kb)傳染昆明種小鼠)。將動物 隨機分組，每組10只，于雙側(cè)肋下和后腳掌皮下注射多肽5，按10、 100和1000U/鼠的3個 劑量給藥，每周加強免疫一次，共三次。設(shè)IFN-a2b(15000U/鼠)為陽性對照藥，設(shè)生理鹽 水為陰性對照藥。給藥前和最后一次給藥結(jié)束后10天、20天、30天，取小鼠脾臟，分離脾臟 淋巴細(xì)胞，用試品10ng/ml體外剌激3天，取上清，用ELISA法檢測培養(yǎng)上清中IFN-y 、IL-4 等細(xì)胞因子的分泌情況，分析受試藥物體內(nèi)誘導(dǎo)T細(xì)胞Thl/Th2型極化的功效。結(jié)果可檢 測到較強的IFN-y分泌，IL-4的檢測未見明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系。
實施例6 在HBV轉(zhuǎn)基因小鼠誘導(dǎo)CTL活性 采用HBV-DNA轉(zhuǎn)基因小鼠(ayw型HBV全基因(1. 3Kb)傳染昆明種小鼠)。將動物 隨機分組，每組10只，于雙側(cè)肋下和后腳掌皮下注射多肽5，按10、 100和1000U/鼠的3個 劑量給藥，每周加強免疫一次，共三次。設(shè)IFN-a2b(15000U/鼠)為陽性對照藥，設(shè)生理鹽 水為陰性對照藥。給藥前和最后一次給藥結(jié)束后10天、20天、30天，取小鼠脾臟，分離脾臟 淋巴細(xì)胞，用試品10ng/ml體外剌激3天，用ELI-SPOT法檢測IFN- y分泌細(xì)胞在外周血淋 巴細(xì)胞中的表達(dá)頻率。結(jié)果表明，在結(jié)束免疫后第30天，隨著免疫劑量的升高，外周血淋巴細(xì)胞中IFN-y分泌細(xì)胞的表達(dá)頻率升高，其中100和1000U/鼠的免疫劑量，體內(nèi)誘導(dǎo)外周 血淋巴細(xì)胞中IFN-y分泌細(xì)胞的表達(dá)頻率升高明顯，最高可檢測到3600士IFN-y分泌細(xì) 胞/106PBMC.
實施例7 在HBV轉(zhuǎn)基因小鼠抑制病毒表面抗原(HbsAg) 采用HBV-DNA轉(zhuǎn)基因小鼠(ayw型HBV全基因(1. 3Kb)傳染昆明種小鼠)。將動物 隨機分組，每組10只，于雙側(cè)肋下和后腳掌皮下注射多肽5，按10、 100和1000U/鼠的3個 劑量給藥，每周加強免疫一次，共三次。設(shè)IFN-a2b(15000U/鼠)為陽性對照藥，設(shè)生理鹽 水為陰性對照藥。給藥前和最后一次給藥結(jié)束后10天、20天、30天，取血，分離血清，分別 用ELISA法測定血清中HbsAg。結(jié)果表明血清HbsAg明顯降低，且呈劑量依賴性和時間依賴 性。 實施例8 在HBV轉(zhuǎn)基因小鼠抑制病毒復(fù)制 采用HBV-DNA轉(zhuǎn)基因小鼠(ayw型HBV全基因(1. 3Kb)傳染昆明種小鼠)。將動物 隨機分組，每組10只，于雙側(cè)肋下和后腳掌皮下注射多肽5，按10、100、1000U/鼠的3個劑 量給藥，每周加強免疫一次，共三次。設(shè)IFN-a2b(15000U/鼠)為陽性對照藥，設(shè)生理鹽水 為陰性對照藥。給藥前和最后一次給藥結(jié)束后10天、20天、30天，取血，分離血清，分別用 定量PCR法檢測血清中HBV DNA拷貝數(shù)。結(jié)果表明血清HBV DNA拷貝數(shù)明顯降低，且呈劑 量依賴性和時間依賴性。
序列表
〈110〉張，嘎 〈120〉 一種多肽免疫原及其制備方法和應(yīng)用
〈130〉
〈160>16 〈170>PatentIn version 3. 4 〈210>1 〈211>57 〈212>PRT 〈213>人工序列 〈220〉 〈221>M0D_RES 〈222〉 (1) (1) 〈223>棕櫚?；?00>1 Lys Ser Ser Pro Ala Asp Arg Glu Ser Ser Ser Gly Arg Lys Lys Arg
15 10 15Arg Gin Arg Arg Arg Pro Pro Gin Ala Ala Ala Phe Leu Pro Ser Asp
20 25 30 Phe Phe Pro Ser Val Gly Gly Gly Asp Pro Arg Val Arg Gly Leu Tyr
9:0117] 35 40 45
:0118] Phe Pro Ala Gly Gly Val Ser Phe Gly
:0119] 50 55
:0120] 〈210>2
:0121] 〈211>57
:0122] 〈212>PRT
:0123] 〈213>人工序列
:0124] 〈220〉
:0125] 〈221〉M0D一RES
:0126] <222>(1). . (1)
:0127] 〈223〉雙棕櫚酰化
:0128] 〈400>2
:0129] Lys Ser Ser Pro Ala Asp Arg Glu Ser Ser Ser Gly Arg Lys Lys Arg
:0130] 15 10 15
:0131] Arg Gin Arg Arg Arg Pro Pro Gin Ala Ala Ala Phe Leu Pro Ser Asp
:0132] 20 25 30
:0133] Phe Phe Pro Ser Val Gly Gly Gly Asp Pro Arg Val Arg Gly Leu Tyr
:0134] 35 40 45
:0135] Phe Pro Ala Gly Gly Val Ser Phe Gly
:0136] 50 55
:0137] 〈210>3
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:0139] 〈212>PRT
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:0141] 〈220〉
:0142] 〈221〉M0D一RES
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:0144] 〈223>棕桐?；?br> :0145] 〈400>3
:0146] Lys Ser Ser Gin Tyr lie Lys Ala Asn Ser Lys Phe lie Gly lie Thr
:0147] 15 10 15
:0148] Glu Ala Ala Ala Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gin Arg Arg Arg Pro Pro
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:0150] Gin Ala Ala Ala Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Gly Gly
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:0152] Gly Asp Pro Arg Val Arg Gly Leu Tyr Phe Pro Ala Gly Gly Val Ser
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0157]<211>66
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0159]〈213〉人工序列
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0162]〈222〉 (1) . (1)
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0166]1
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:0181]<222>(1). (1)
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:0193]〈211>50
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Tyr lie Lys Ala Asn Ser Lys Phe lie Gly lie Thr
5 10 15
Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gin Arg Arg Arg Pro Pro
25 30 Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Gly Gly
40 45 Val Arg Gly Leu Tyr Phe Pro Ala Gly Gly Val Ser 55 60
Ala Asp Arg Glu Ala Ala Ala Phe Leu Pro Ser Asp
5 10 15
Val Gly Gly Gly Asp Pro Arg Val Arg Gly Leu Tyr
25 30
Gly Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gin Arg Arg Arg Pro
40 459/13頁
:0195] 〈213>人工序列
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:0203] Phe Phe Pro Ser Val Gly Gly Gly Asp Pro Arg Val Arg Gly Leu Tyr
:0204] 20 25 30
:0205] Phe Pro Ala Gly Gly Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gin Arg Arg Arg Pro
:0206] 35 40 45
:0207] Pro Gin
:0208] 50
:0209] 〈210>7
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:0212] 〈213>人工序列
:0213] 〈220〉
:0214] 〈221>M0D_RES
:0215] 〈222〉 (1) (1)
:0216] 〈223>棕櫚?；?br> :0217] 〈400>7
:0218] Lys Ser Ser Gin Tyr lie Lys Ala Asn Ser Lys Phe lie Gly lie Thr
:0219] 15 10 15
:0220] Glu Ala Ala Ala Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Gly Gly
:0221] 20 25 30
:0222] Gly Asp Pro Arg Val Arg Gly Leu Tyr Phe Pro Ala Gly Gly Gly Arg
:0223] 35 40 45
:0224] Lys Lys Arg Arg Gin Arg Arg Arg Pro Pro Gin
:0225] 50 55
:0226] 〈210>8
:0227] 〈211>59
:0228] 〈212>PRT
:0229] 〈213〉人工序列
:0230] 〈220〉
:0231] 〈221>M0D_RES
:0232] 〈222〉 (1) (1)
:0233] 〈223〉雙棕櫚?；?br> <400>8 Lys Ser Ser Gin Tyr lie Lys Ala Asn Ser Lys Phe lie Gly lie Thr 15 10 15 Glu Ala Ala Ala Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Gly Gly 20 25 30 Gly Asp Pro Arg Val Arg Gly Leu Tyr Phe Pro Ala Gly Gly Gly Arg 35 40 45 Lys Lys Arg Arg Gin Arg Arg Arg Pro Pro Gin 50 55 〈210>9 〈211>57 〈212>PRT 〈213〉人工序列 〈220〉 〈221>M0D_RES 〈222>(1). . (1) 〈223〉棕櫚酰化 〈400>9 Lys Ser Ser Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gin Arg Arg Arg Pro Pro Gin 15 10 15 Ser Ser Ser Pro Ala Asp Arg Glu Ala Ala Ala Phe Leu Pro Ser Asp 20 25 30 Phe Phe Pro Ser Val Gly Gly Gly Asp Pro Arg Val Arg Gly Leu Tyr 35 40 45 Phe Pro Ala Gly Gly Val Ser Phe Gly 50 55 〈210>10 〈211>57 〈212>PRT 〈213〉人工序列 〈220〉 〈221>M0D_RES 〈222〉 (1)(1) <223>雙棕櫚?；?〈400>10 Lys Ser Ser Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gin Arg Arg Arg Pro Pro Gin 15 10 15 Ser Ser Ser Pro Ala Asp Arg Glu Ala Ala Ala Phe Leu Pro Ser Asp
20 25 30
Phe Phe Pro SerVal Gly GlyGly Asp Pro Arg Val ArgGlyLeu Tyr3540 45Phe Pro Ala GlyGly Val SerPhe Gly5055〈210>11〈211>66〈212>PRT〈213〉人工序列〈220〉〈221>M0D_RES〈222>(1).. (1)〈223〉棕櫚酰化<400>11Lys Ser Ser GlyArg Lys LysArg Arg Gin Arg Arg ArgProPro Gin151015Ser Ser Ser GinTyr lie LysAla Asn Ser Lys Phe lieGlylie Thr202530Glu Ala Ala AlaPhe Leu ProSer Asp Phe Phe Pro SerValGly Gly3540 45Gly Asp Pro ArgVal Arg GlyLeu Tyr Phe Pro Ala GlyGlyVal Ser505560Phe Gly65〈210>12〈211>66〈212>PRT〈213〉人工序列<220>〈221〉M0D_RES〈222〉 (1) . (1)〈223〉雙棕櫚?；?00>12Lys Ser Ser GlyArg Lys LysArg Arg Gin Arg Arg ArgProPro Gin151015Ser Ser Ser GinTyr lie LysAla Asn Ser Lys Phe lieGlylie Thr202530Glu Ala Ala AlaPhe Leu ProSer Asp Phe Phe Pro SerValGly Gly3540 45Gly Asp Pro ArgVal Arg GlyLeu Tyr Phe Pro Ala GlyGlyVal Ser
14
50 55 60 Phe Gly 65 〈210>13 〈211>50 〈212>PRT 〈213>人工序列 〈220〉 〈221〉M0D_RES 〈222〉 (1) (1) 〈223〉棕櫚?；?〈400>13 Lys Ser Ser Pro Ala Asp Arg Glu Ala Ala Ala Phe Leu Pro Ser Asp 1 5 10 15 Phe Phe Pro Ser Val Gly Gly Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gin Arg Arg 20 25 30 Arg Asp Pro Arg Val Arg Gly Leu Tyr Phe Pro Ala Gly Gly Val Ser 35 40 45 Phe Gly 50 〈210>14 〈211>50 〈212>PRT 〈213>人工序列 〈220> <221>M0D_RES 〈222〉 (1) (1) 〈223〉雙棕櫚?；?〈400〉 14 Lys Ser Ser Pro Ala Asp Arg Glu Ala Ala Ala Phe Leu Pro Ser Asp 1 5 10 15 Phe Phe Pro Ser Val Gly Gly Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gin Arg Arg 20 25 30 Arg Asp Pro Arg Val Arg Gly Leu Tyr Phe Pro Ala Gly Gly Val Ser 35 40 45 Phe Gly 50 〈210>15 〈211>44
〈212>PRT 〈213〉人工序列 〈220〉 〈221>M0D—RES 〈222>(1). . (1) 〈223〉棕櫚酰化 〈400〉 15 Lys Ser Ser Pro Ala Asp Arg Glu Gly Gly Gly Asp Pro Arg Val Arg 15 10 15 Gly Leu Tyr Phe Pro Ala Gly Gly Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gin Arg 20 25 30 Arg Arg Phe Leu Pro SerAsp Phe Phe Pro Ser Val 35 40 <210>16 〈211>44 〈212>PRT 〈213〉人工序列 〈220〉 〈221>M0D—RES 〈222>(1). . (1) <223>雙棕櫚?；?〈400〉 16 Lys Ser Ser Pro Ala Asp Arg Glu Gly Gly Gly Asp Pro Arg Val Arg 15 10 15 Gly Leu Tyr Phe Pro Ala Gly Gly Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gin Arg
20 25 30 Arg Arg Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val
35 40
權(quán)利要求
一種多肽免疫原，其特征在于，所述多肽免疫原含有一個多肽序列，所述的多肽序列含有氨基酸序列1、氨基酸序列2、氨基酸序列3和氨基酸序列4，其中，各氨基酸序列之間由若干個氨基酸殘基組成的連接肽段連接或直接共價連接；所述的氨基酸序列1是Th細(xì)胞表位序列或Th細(xì)胞表位序列與艾滋病毒HIV-1來源的TAT蛋白的堿性區(qū)域序列共價相連構(gòu)成的混合序列；所述的氨基酸序列2是艾滋病毒HIV-1來源的TAT蛋白的堿性區(qū)域序列；所述的氨基酸序列3是乙型肝炎病毒來源的CTL表位序列或乙型肝炎病毒來源的CTL表位序列與艾滋病毒HIV-1來源的TAT蛋白的堿性區(qū)域序列共價相連構(gòu)成的混合序列；所述的氨基酸序列4是乙型肝炎病毒來源的B細(xì)胞表位序列或乙型肝炎病毒來源的B細(xì)胞表位序列與艾滋病毒HIV-1來源的TAT蛋白的堿性區(qū)域序列共價相連構(gòu)成的混合序列。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的多肽免疫原，其特征在于，所述的多肽序列從N端到C端的排 列次序為氨基酸序列1-氨基酸序列2-氨基酸序列3-氨基酸序列4、氨基酸序列1-氨基酸序列3-氨基酸序列4-氨基酸序列2、氨基酸序列1-氨基酸序列4-氨基酸序列2-氨基酸序列3、氨基酸序列2-氨基酸序列1-氨基酸序列3-氨基酸序列4、和氨基酸序列1-氨基酸序列3-氨基酸序列4，其中當(dāng)氨基酸序列2存在時，氨基酸序列1、3、4不能為混合序列；當(dāng)排列次序為氨基酸序列1-氨基酸序列3-氨基酸序列4時，氨基酸序列1、氨基酸序列3、氨基酸序列4中至少含有一混合序列。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的多肽免疫原，其特征在于，所述的氨基酸序列1是破傷 風(fēng)類毒素來源的Th細(xì)胞表位上的第830-843氨基酸序列QYIKANSKFIGITE或通用Th細(xì)胞 表位PADRE或混合序列RKKRRQRRRQYIKANSKFIGITE或混合序列RKKRRQRRRPADRE ;所述氨基 酸序列2是HIV-1TAT蛋白中第48-60氨基酸序列GRKKRRQRRRPPQ或第49-57氨基酸序列 RKKRRQRRR或第48-57氨基酸序列GRKKRRQRRR ;所述的氨基酸序列3是HBV核心抗原上的 第18-27氨基酸序列FLPSDFFPSV或混合序列RKKRRQRRRFLPSDFFPSV ;所述氨基酸序列4是 HBV Pre S2來源的B細(xì)胞表位上的第14-26氨基酸序列DPRVRGLYFPAGG或第14-30氨基酸 序列DPRVRGLYFPAGGVSFG或混合序列RKKRRQRRRDPRVRGLYFPAGGVSFG。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的多肽免疫原，其特征在于，所述的各氨基酸序列之間的連 接肽段為AAA、 GGG或SSS ;所述的多肽免疫原N端氨基酸序列的N端上連接著修飾性連接 肽段KSS;所述的修飾性連接肽段KSS的N端的賴氨酸殘基的a或e氨基上分別或同時 共價連接著棕櫚?；?。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的多肽免疫原，其特征在于，所述多肽序列為CH3 (CH2) 14C0K (CH3 (CH2) 14C0) SSPADRESSSGRKKRRQRRRPPQAAAFLPSDFFPSVGGGDPRVRGLYFP AGGVSFG、SFG、CH3 (CH2) 14C0K (CH3 (CH2) 14C0) SSQYIKANSKFIGITEAAAGRKKRRQRRRPPQAAAFLPSDFFPSVGGGD PRVRGLYFPAGGVSFG、CH3 (CH2)14COKSSPADREAAAFLPSDFFPSVGGGDPRVRGLYFPAGGGRKKRRQRRRPPQ、CH3 (CH2) 14C0K (CH3 (CH2) 14C0) SSPADREAAAFLPSDFFPSVGGGDPRVRGLYFPAGGGRKKRRQRRRPPQ、4C0K (CH, (CH2) 14C0) SSQYIKANSKFIGITEAAAFLPSDFFPSVGGGDPRVRGLYFPAGGGRKK4C0K (CH3 (CH2) 14C0) SSGRKKRRQRRRPPQSSSPADREAAAFLPSDFFPSVGGGDPRVRGLYFPCH3 (CH2)CH3 (CH2) RRQRRRPPQ、CH3 (CH2)CH3 (CH2) AGGVSFG、CH3 (CH2) SFG、CH3 (CH2) 14C0K (CH3 (CH2) 14C0) SSGRKKRRQRRRPPQSSSQYIKANSKFIGITEAAAFLPSDFFPSVGGGD PRVRGLYFPAGGVSFG、CH3(CH2)14COKSSPADREAAAFLPSDFFPSVGGGRKKRRQRRRDPRVRGLYFPAGGVSFG、CH, (CH2) 14C0K (CH, (CH2) 14C0) SSPADREAAAFLPSDFFPSVGGGRKKRRQRRRDPRVRGLYFPAGGVSFG、CH3 (CH2) 14COKSSPADREGGGDPRVRGLYFPAGGGRKKRRQRRRFLPSDFFPSV或CH3 (CH2) 14C0K (CH3 (CH2) 14C0) SSPADREGGGDPRVRGLYFPAGGGRKKRRQRRRFLPSDFFPSV。
6. —種如權(quán)利要求1、2或5所述的多肽免疫原的制備方法，其特征在于包括以下步驟a. 多肽固相化學(xué)合成多肽免疫原-樹脂，b. 采用三氟乙酸法對多肽免疫原-樹脂進(jìn)行裂解，得到裂解液，c. 將裂解液采用體積排阻層析進(jìn)行分離純化，然后通過反向?qū)游黾兓玫蕉嚯拿庖咴?br> 7. 如權(quán)利要求1、2或5所述的多肽免疫原在制備用于治療HBV慢性持續(xù)感染狀態(tài)及其 相關(guān)的繼發(fā)性肝硬化、肝癌疾病的疫苗或藥物中的應(yīng)用。
8. 如權(quán)利要求7所述的多肽免疫原在制備用于治療HBV慢性持續(xù)感染狀態(tài)及其相關(guān)的 繼發(fā)性肝硬化、肝癌疾病的疫苗或藥物中的應(yīng)用，其特征在于所述HBV慢性感染持續(xù)狀態(tài) 為慢性乙型肝炎或乙型肝炎病毒攜帶者。
9. 如權(quán)利要求7所述的多肽免疫原在制備用于治療HBV慢性持續(xù)感染狀態(tài)及其相關(guān)的 繼發(fā)性肝硬化、肝癌疾病的疫苗或藥物中的應(yīng)用，其特征在于，所述的疫苗或藥物還含有藥 學(xué)上可接受的輔料、佐劑和載體。
10. 如權(quán)利要求7所述的多肽免疫原在制備用于治療HBV慢性持續(xù)感染狀態(tài)及其相關(guān) 的繼發(fā)性肝硬化、肝癌疾病的疫苗或藥物中的應(yīng)用，其特征在于所述的疫苗或藥物的給藥 方式為注射給藥。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種多肽免疫原及其制備方法。該多肽免疫原含有一個多肽序列，該多肽序列含有氨基酸序列1、氨基酸序列2、氨基酸序列3和氨基酸序列4。其中，各氨基酸序列之間由若干個氨基酸殘基組成的連接肽段連接或直接共價連接。本發(fā)明還提供了該多肽免疫原在制備用于治療HBV慢性感染持續(xù)狀態(tài)及其相關(guān)的繼發(fā)性肝硬化、肝癌等疾病的疫苗或藥物中的應(yīng)用。
文檔編號C07K1/04GK101717433SQ20091022736
公開日2010年6月2日 申請日期2009年12月8日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月8日
發(fā)明者馮長訪, 張嘎, 張賁, 韓斌 申請人:張嘎