免疫原性肽綴合物及以之誘導(dǎo)抗流感治療性抗體應(yīng)答的方法
【專利說(shuō)明】免疫原性肽綴合物及以之誘導(dǎo)抗流感治療性抗體應(yīng)答的方 法
[0001] 相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用 本申請(qǐng)是2013年3月14日提交的美國(guó)順序號(hào)13/828,988的部分繼續(xù)申請(qǐng)，其通過(guò)引 用以其整體結(jié)合到本文中。 發(fā)明領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明涉及免疫原性流感血凝素 A2 (HA2)來(lái)源的肽綴合物和使用所述綴合物誘 導(dǎo)針對(duì)流感病毒的特異性抗體應(yīng)答的方法。
[0003] 序列表并入 本申請(qǐng)的生物學(xué)序列信息包含于與本申請(qǐng)一起提交的ASCII文本文檔中，所述ASCII 文本文檔的文件名為"TU-271-5-SEQ. txt"，創(chuàng)建于2013年3月14日，文件大小為29, 368 字節(jié)，其通過(guò)引用結(jié)合到本文中。
[0004] 發(fā)明背景 血凝素（HA)是流感病毒（正黏病毒）的包膜蛋白，并且是原型RNA病毒I類融合蛋 白。HA在感染細(xì)胞中作為前體蛋白HAO產(chǎn)生，所述HAO被蛋白水解裂解成2種蛋白質(zhì)，稱 為HAl和HA2。HA2含有氨基端疏水結(jié)構(gòu)域，被稱為融合肽，它在血凝素前體蛋白裂解時(shí)被 暴露出來(lái)。除融合肽以外，逆轉(zhuǎn)錄病毒跨膜蛋白還含有幾個(gè)與HA2已知結(jié)構(gòu)一樣的結(jié)構(gòu)特 征，包括延長(zhǎng)的氨基端螺旋（N-螺旋，通常為"七殘基重復(fù)序列"或"亮氨酸拉鏈"）、羧基端 螺旋（C-螺旋）和跨膜結(jié)構(gòu)域近端的芳族基序。這5種結(jié)構(gòu)域中至少4種的存在將病毒包 膜蛋白界定為I類融合蛋白。
[0005] 圖1顯示6個(gè)I類病毒家族的融合蛋白的6個(gè)已鑒定的結(jié)構(gòu)域。融合蛋白起源 于疏水融合肽，終止于錨肽，并整合了延長(zhǎng)的氨基端α-螺旋（N-螺旋，通常為"七殘基重 復(fù)序列"或"亮氨酸拉鏈"）、羧基端α-螺旋（C-螺旋）和有時(shí)病毒體包膜近端的芳族基 序。第6個(gè)結(jié)構(gòu)域，本文稱為融合起始區(qū)（FIR)，公開(kāi)于美國(guó)專利號(hào)7, 491，793和美國(guó)專利 號(hào)8, 222, 204 (屬于Garry和Wilson)，它們的每一個(gè)通過(guò)引用以其整體結(jié)合到本文中。
[0006] 存在多個(gè)甲型流感病毒亞型。各病毒亞型包含包埋在病毒的脂質(zhì)膜包膜中的兩種 糖蛋白的一種特定形式組合。兩種界定亞型的糖蛋白為血凝素 HA和神經(jīng)氨酸酶（NA)。有 17種已知的HA變體，分別被稱為Hl至H17,并有9種已知的神經(jīng)氨酸酶變體，被分別稱為 Nl至N9。各個(gè)病毒亞型的特定特征分別在于其血凝素和神經(jīng)氨酸酶變體號(hào)。例如，甲型流 感亞型H3N2為豬流感，亞型H5N1為禽流感。
[0007] 每年大約10-20%的美國(guó)人口罹患季節(jié)性流感。雖然大多數(shù)個(gè)體在1-2周內(nèi)從流 感中恢復(fù)，但是極年幼者、老年人和患有慢性醫(yī)學(xué)病況的人可發(fā)展出流感后肺炎和其它致 死并發(fā)癥。流感的致病物質(zhì)是流感病毒，通過(guò)分段的病毒基因組的再分布和突變過(guò)程容易 發(fā)展出新毒株的正黏病毒。
[0008] I類病毒的FIR是參與病毒包膜-宿主細(xì)胞膜融合的病毒融合包膜蛋白的區(qū)域，所 述融合是結(jié)合宿主細(xì)胞膜的病毒籍以打斷宿主細(xì)胞膜的完整性以將病毒的遺傳物質(zhì)注入 宿主細(xì)胞中的過(guò)程。該過(guò)程包括病毒包膜和宿主細(xì)胞膜的合并，這是由病毒融合蛋白（例 如在流感病毒的情況下為血凝素）介導(dǎo)的，因此將宿主細(xì)胞的內(nèi)部暴露于病毒的內(nèi)部。如 上述美國(guó)專利號(hào)7, 491，793和美國(guó)專利號(hào)8, 222, 204 (屬于Garry和Wilson)所公開(kāi)的一 樣，包含F(xiàn)IR區(qū)段或由FIR區(qū)段組成的相對(duì)短的肽可與病毒融合蛋白結(jié)合，并干擾融合發(fā)生 所需要的構(gòu)象變化。所述肽因此防止宿主細(xì)胞被病毒感染，盡管事實(shí)是病毒仍可與宿主細(xì) 胞膜的表面結(jié)合。因此，F(xiàn)IR肽通過(guò)與傳統(tǒng)疫苗治療相比完全不同的機(jī)制抑制病毒感染性， 傳統(tǒng)疫苗治療一般包括產(chǎn)生防止病毒與宿主細(xì)胞結(jié)合的抗體，而不是干擾包括病毒融合機(jī) 制本身的生物化學(xué)事件。
[0009] 甲型流感病毒高毒力毒株可產(chǎn)生流行病和大流行病。近年來(lái)，出現(xiàn)了能夠引起高 死亡率的甲型禽流感病毒亞型H5N1的高致病性毒株。應(yīng)對(duì)由流感病毒造成的對(duì)公共健康 和作為生物恐怖活動(dòng)潛在物質(zhì)二者的威脅是極優(yōu)先考慮的事。因此，有研發(fā)控制季節(jié)性流 感及大流行性流感和武器化流感的威脅增加的治療組合物和方法的持續(xù)需要。本文所述的 肽綴合物、抗體致力于這些需要。
[0010] 發(fā)明概述 本文所述免疫原性流感血凝素來(lái)源的肽綴合物誘導(dǎo)針對(duì)流感病毒的特異性治療性抗 體應(yīng)答。如本文所述，免疫原性肽綴合物包含通過(guò)連接基團(tuán)與載體蛋白（例如免疫原性載 體蛋白）綴合的血凝素（HA)融合起始區(qū)（FIR)肽或其變體。HA FIR肽由不超過(guò)50個(gè)氨 基酸殘基組成，并包含流感血凝素2蛋白的區(qū)段，所述區(qū)段包括SEQ ID NO: 1或與之共享 至少50%序列同一性且以選自以下的一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代之差不同于SEQ ID NO: 1的 SEQ ID NO: 1 的變體的氨基酸序列：V1I、V1L、V1A、V1G、V1T、V1S、V1M、E2D、E2K、E2R、D3E、 T4G、T4S、T4Q、T4A、K5F、K5M、K5I、K5V、K5L、K5A、I6L、I6V、I6A、I6T、I6S、I6Q、I6N、D7E、 L8I、L8V、L8A、W9Y、S10T、S10G、S10A、S10M和E14K。在一些實(shí)施方案中，流感血凝素2蛋白 的區(qū)段包括來(lái)自選自以下甲型流感亞型的血凝素2蛋白的多達(dá)25個(gè)其它氨基酸殘基：H1、 H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16 和 H17。在所選甲型流感亞 型的血凝素2蛋白的氨基酸序列中其它殘基與SEQ ID NO: 1或其變體鄰接。任選HA FIR 肽可包括不是來(lái)自甲型流感血凝素2蛋白的一個(gè)或多個(gè)肽序列。
[0011] 本文所述免疫原性肽綴合物可用于治療或預(yù)防流感感染并用于引起干擾流感病 毒-宿主細(xì)胞膜融合的流感特異性治療性抗體?？蓪㈦木Y合物配制在可用于治療或預(yù)防廣 譜的流感感染的藥物組合物中。本文所述免疫原性肽綴合物可用于治療或預(yù)防流感感染并 用于引起干擾流感病毒-宿主細(xì)胞融合的流感特異性治療性抗體?？蓪㈦木Y合物配制在與 藥學(xué)上可接受的載體組合，任選包括一種或多種佐劑、賦形劑等的可用于治療或預(yù)防流感 感染的藥物組合物中。
[0012] 在一個(gè)實(shí)施方案中，免疫原性流感血凝素來(lái)源的肽綴合物的血凝素 FIR肽由SEQ ID NO: I (SEQ ID NO: 2的殘基84-99,其是甲型流感亞型H3血凝素2的代表性序列）或 其變體組成。
[0013] 本文所述任何免疫原性肽綴合物的載體蛋白部分可以是任何蛋白質(zhì)或多肽分子， 優(yōu)選當(dāng)給予受試者時(shí)可引起免疫反應(yīng)（例如抗體產(chǎn)生）的蛋白質(zhì)或多肽分子。所述多肽的 非限制性實(shí)例包括例如KLH、鮑魚血藍(lán)蛋白（CCH)、牛血清白 蛋白（BSA)、陽(yáng)離子化BSA、卵清蛋白、流感血凝素蛋白等。所述免疫原性蛋白質(zhì)是本領(lǐng)域眾 所周知的。
[0014] 本發(fā)明的另一個(gè)方面是本文所述免疫原性肽綴合物在治療或預(yù)防流感感染的方 法中的用途。所述方法包括將肽綴合物（例如以治療有效劑量）給予受試者。肽綴合物刺 激受試者的免疫系統(tǒng)以產(chǎn)生特異性靶向綴合物的FIR肽部分的治療性抗體。這種治療性抗 體應(yīng)答發(fā)生，盡管事實(shí)上當(dāng)給予受試者時(shí)，僅FIR肽（無(wú)載體蛋白）不引起任何免疫應(yīng)答。 如果需要，免疫原性肽綴合物可與藥學(xué)上可接受的載體組合包含在藥物組合物中。
[0015] 本發(fā)明的另一個(gè)方面是分離的治療性抗體，所述抗體能夠抑制結(jié)合細(xì)胞的流感病 毒與病毒與之結(jié)合的細(xì)胞的膜融合。優(yōu)選治療性抗體是人單克隆抗體、人源化單克隆抗體 或嵌合單克隆抗體。所述治療性抗體可例如通過(guò)如下獲得：從用本文所述免疫原性肽綴合 物治療的患者的血清中分離抗體，產(chǎn)生來(lái)自已用（即給予）免疫原性肽綴合物處理的人類 受試者的重組形式的人抗體，或產(chǎn)生來(lái)自已用（即給予）免疫原性肽綴合物治療的合適的 非人類宿主動(dòng)物（例如兔或山羊）的重組嵌合或人源化形式的抗體。
[0016] 提供下列非限制性實(shí)施方案以說(shuō)明本發(fā)明的某些方面和特征。
[0017] 實(shí)施方案1是一種免疫原性肽綴合物，其包含通過(guò)連接基團(tuán)與載體蛋白（例如免 疫原性載體蛋白）綴合的血凝素（HA)融合起始區(qū)（FIR)肽或其變體；其中HA FIR肽由不 超過(guò)50個(gè)氨基酸殘基組成，并包含流感血凝素2蛋白的區(qū)段，所述區(qū)段包括SEQ ID NO: 1 或與之共享至少50%序列同一性且以選自以下的一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代之差不同于SEQ ID NO: 1 的 SEQ IDN0: 1 的變體的氨基酸序列：V1I、V1L、V1A、V1G、V1T、V1S、V1M、E2D、E2K、 E2R、D3E、T4G、T4S、T4Q、T4A、K5F、K5M、K5I、K5V、K5L、K5A、I6L、I6V、I6A、I6T、I6S、I6Q、 I6N、D7E、L8I、L8V、L8A、W9Y、S10T、S10G、S10A、SlOM 和 E14K。
[0018] 實(shí)施方案2包括實(shí)施方案1的免疫原性肽綴合物或由其組成，其中流感血凝素2 蛋白的區(qū)段包括來(lái)自選自以下甲型流感亞型的血凝素2蛋白的多達(dá)25個(gè)其它氨基酸殘基： HI、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、Hll、H12、H13、H14、H15、H16 和 H17,所述其它殘基 在所選甲型流感亞型的血凝素2蛋白的氨基酸序列中與SEQ ID NO: 1或其變體鄰接。
[0019] 實(shí)施方案3包括實(shí)施方案1或?qū)嵤┓桨?的免疫原性肽綴合物或由其組成，其中 HA FIR肽包括不是來(lái)自甲型流感血凝素2蛋白的一個(gè)或多個(gè)肽序列。
[0020] 實(shí)施方案4包括實(shí)施方案1-3中任一個(gè)的免疫原性肽綴合物或由其組成，其中血 凝素 FIR肽具有由SEQ ID NO: 1或與之共享至少50%序列同一性且