專利名稱：抗cd20單克隆抗體可變區(qū)序列及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，涉及抗⑶20單克隆抗體可變區(qū)序列及其制備方法。
背景技術(shù)：
⑶20分子是人類B淋巴細(xì)胞表面特有的標(biāo)識(shí)，在B淋巴細(xì)胞表面以寡聚體形式存在。⑶20的結(jié)構(gòu)與一些離子通道相似，每一個(gè)⑶20單體都是4次跨膜，分子的N端和C端在細(xì)胞質(zhì)的同側(cè)，可形成多聚體，⑶20可在B淋巴細(xì)胞膜上形成鈣離子通道，⑶20抗體在BCR的作用下，可形成鈣離子流。B細(xì)胞活化后，BCR — CD20復(fù)合物解離，磷蛋白、鈣調(diào)素結(jié)合蛋白會(huì)暫時(shí)被招募到CD20，從而參與胞內(nèi)信號(hào)的傳導(dǎo)。在人體中幾乎所有正常或惡性B淋巴細(xì)胞都存在⑶20抗原。但是，其他血細(xì)胞如T淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞及粒細(xì)胞等不存在CD20抗原。因此，CD20抗原是單克隆抗體治療的一個(gè)理想的靶抗原?，F(xiàn)在已經(jīng)合成了一種針對(duì)CD20抗原的特異性抗體，稱為抗CD20，用于治療病情緩慢、侵襲性低的B細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤，有效率達(dá)30% -50%。人體對(duì)鼠源抗體具有免疫反應(yīng)，這也是鼠源抗體應(yīng)用于臨床治療的主要障礙。通過基因工程抗體技術(shù)可以在基因水平上改造抗體，降低鼠源抗體的免疫原性，提高抗體特異性、穩(wěn)定性和親和力。對(duì)鼠源抗體進(jìn)行人源化改造，可保留抗體可變區(qū)與人源抗體恒定區(qū)融合，提高抗體親和力；或改造抗體結(jié)構(gòu)，構(gòu)建只保留抗體可變區(qū)的scFv或含抗體可變區(qū)和部分恒定區(qū)的Fab，可提高抗體在體內(nèi)的吸收百分比和半衰期。

發(fā)明內(nèi)容
如上所述,抗⑶20應(yīng)用于B淋巴細(xì)胞瘤的臨床治療,療效顯著,毒副作用小，如今對(duì)抗CD20的分析研究越來越多，基于這一背景，本發(fā)明的目的是構(gòu)建抗CD20單克隆抗體的重鏈可變區(qū)的核苷酸序列和輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列，同上提供制備上述核苷酸序列的方法。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明用CD20蛋白作為抗原來免疫小鼠，然后檢測(cè)出相應(yīng)抗體表達(dá)呈陽性的小鼠，取表達(dá)呈陽性小鼠的脾臟，分離脾細(xì)胞，然后融合脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞，得到雜交瘤細(xì)胞；在HAT培養(yǎng)基中培養(yǎng)后，檢測(cè)得到抗體表達(dá)陽性克隆，提取陽性雜交瘤細(xì)胞總RNA，以總RNA中的mRNA為模板，反轉(zhuǎn)錄得到相應(yīng)抗體基因的cDNA，再通過PCR擴(kuò)增獲得相應(yīng)抗體重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，由此實(shí)現(xiàn)本發(fā)明。本發(fā)明提供了下述各項(xiàng):抗CD20單克隆抗體可變區(qū)序列，包含兩種核苷酸序列，所述核苷酸序列分別為51802-VH 和 51802-VL。優(yōu)選的，所述核苷酸序列51802-VH和51802-VL由保藏號(hào)為407CT20.1.2的雜交瘤細(xì)胞株制備而成。優(yōu)選的，所述51802-VH編碼117個(gè)氨基酸，分子量為13273D，其中⑶R1、⑶R2和CDR3 的區(qū)域分別為 26aa_33aa, 51aa_60aa 和 99aa_106aa。優(yōu)選的，所述51802-VL編碼113個(gè)氨基酸，分子量為12297D，其中CDR1、CDR2和CDR3 的區(qū)域分別為 27aa_37aa, 55aa_57aa 和 94aa_102aa。優(yōu)選的，還包括與上述兩種核苷酸序列具有相同氨基酸序列產(chǎn)物的核苷酸序列。優(yōu)選的,還包括經(jīng)過一個(gè)或者幾個(gè)堿基替換、缺失或添加后仍具有與所述核苷酸序列產(chǎn)生的氨基酸序列具有相同活性的核苷酸序列。制備抗⑶20單克隆抗體可變區(qū)序列的方法，包括以下步驟:(1)雜交瘤細(xì)胞的制備:首先用CD20蛋白抗原免疫雌性健康的BALB/c小鼠，挑選出免疫后抗體表達(dá)呈陽性的小鼠，取其脾臟細(xì)胞，然后將分離的小鼠脾臟細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，得到雜交瘤細(xì)胞；(2)單克隆細(xì)胞的篩選:將上述雜交瘤細(xì)胞在HAT培養(yǎng)基中培養(yǎng)，對(duì)ELISA檢測(cè)呈陽性的單克隆細(xì)胞進(jìn)行ELISA復(fù)篩，然后將篩選出的ELISA陽性單克隆細(xì)胞進(jìn)行WB復(fù)篩，再將WB陽性細(xì)胞進(jìn)行亞克隆，經(jīng)過2次亞克隆，篩選出能夠穩(wěn)定分泌抗體的單克隆細(xì)胞，將陽性的單克隆細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)后定株、凍存；(3)雜交瘤細(xì)胞抗CD20單克隆抗體的獲得:首先鑒定步驟(2)所制備的單克隆細(xì)胞的亞類亞型，然后將陽性的單克隆細(xì)胞注射到小鼠體內(nèi)進(jìn)行腹水生產(chǎn)，再將產(chǎn)生的腹水通過層析純化后得到抗CD20單克隆抗體；(4)抗⑶20單克隆抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)基因的克隆:提取步驟(3)中所用的單克隆細(xì)胞的總RNA，以總RNA中的mRNA為模板，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，最后克隆得到抗CD20單克隆抗體的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)。本發(fā)明提供了抗CD20單克隆抗體可變區(qū)序列，及其克隆測(cè)序方法，其可用于用于制備重組抗體、ScFv抗體、人源化抗體、嵌合抗體、雙特異性抗體、單域抗體等；在制備用于B淋巴細(xì)胞瘤的治療和診斷藥物中具有重要價(jià)值。


圖1.407CT20.1.2克隆抗體的免疫印跡圖其中1-5 條帶分別表示 8ug/mL, 4ug/mL, 3ug/mL, lug/mL,0.5ug/mL 表示陰性血清；“ + ”表示陽性血清。圖2.407CT20.1.2克隆抗體可變區(qū)VH和VL的RT-PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖分
析結(jié)果其中泳道I為VH基因，泳道2為VL基因，泳道3為DL2000DNA Marker。圖3.407CT20.1.2克隆抗體可變區(qū)VH和VL目的片段構(gòu)建到pMD18_T載體上酶切鑒定瓊脂糖凝膠電泳圖其中泳道1 為 pMD18-T/VH，泳道 2 為 pMD18_T/VL，泳道 3 為 DL2000DNAMarker。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖及實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步描述，應(yīng)理解的是，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而不是對(duì)本發(fā)明的限制，在本發(fā)明的構(gòu)思前題下對(duì)本發(fā)明制備方法的簡(jiǎn)單改進(jìn)，對(duì)本發(fā)明可變區(qū)核苷酸序列的利用都屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
實(shí)施例1.抗CD20單克隆抗體可變區(qū)序列的制備與鑒定1、雜交瘤細(xì)胞制備1.1動(dòng)物免疫以⑶20蛋白抗原同時(shí)免疫3只6-8周齡的雌性健康的BALB/c小鼠，3次免疫后，7天采血并測(cè)血清中抗體的效價(jià),選擇1:4000稀釋時(shí)ELISA檢測(cè)OD值大于1.0的血清，同時(shí)血清WB檢測(cè)呈陽性的BALB/c小鼠用于融合，融合之前的3天，用不加佐劑的抗原腹腔加強(qiáng)免疫注射，注射劑量為50ug/只。1.2收集B淋巴細(xì)胞追加免疫后3天，小鼠摘眼球取血，離心后獲得血清作陽性對(duì)照；無菌狀態(tài)下取小鼠脾臟，并將脾臟放在IO mL預(yù)溫不完全培養(yǎng)基中，去除結(jié)締組織，置于100目不銹鋼網(wǎng)中，用注射器的內(nèi)芯研磨，邊研磨邊滴加不完全培養(yǎng)基沖洗；收集過濾后的細(xì)胞懸液于離心管中，離心后棄上清液，然后用不完全培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞，取I X IO8個(gè)細(xì)胞，在室溫下放置待用。1.3小鼠骨髓瘤細(xì)胞的制備融合前10天，將骨髓瘤細(xì)胞從液氮中取出，迅速放入37 °C水浴中，在Imin內(nèi)使凍存液完全溶解；離心，棄上清液，置MDM完全培養(yǎng)基中，37°C，5%C02細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)；融合前
2-3天，細(xì)胞應(yīng)處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。融合前將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期小鼠骨髓瘤細(xì)胞收集到離心管中，計(jì)數(shù)，取2 X 107-3 X IO7個(gè)細(xì)胞，離心棄上清液，用不完全培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞，置室溫待用。1.4細(xì)胞融合融合前將50%PEG置37°C，5%C02細(xì)胞培養(yǎng)箱中調(diào)整溫度，將2 X 107-3 X IO7個(gè)骨髓瘤細(xì)胞懸液和IX IO8個(gè)脾臟B淋巴細(xì)胞懸液移至一個(gè)50mL離心管中，補(bǔ)加30mL不完全培養(yǎng)基，在轉(zhuǎn)速1200rpm的條件下離心lOmin，棄去上清液，輕輕彈擊管底，使細(xì)胞團(tuán)松散，一邊均勻地轉(zhuǎn)動(dòng)離心管，一邊用ImL吸量管吸取ImL預(yù)溫的PEG融合劑，在離心管的離管底約2cm處沿管壁慢慢加入細(xì)胞中，邊加邊轉(zhuǎn)動(dòng)離心管，從加入到加完的時(shí)間控制在60s，輕搖離心管30s，靜置60s，然后立即加入20mL不完全培養(yǎng)液,使PEG稀釋而失去促融作用，具體加法是第一分鐘加ImL,第二分鐘加4mL，隨后的三分鐘之內(nèi)將剩余液體加完，在37°C水浴中靜置lOmin，1200rpm,離心lOmin，棄去上清，加入含有HAT的完全培養(yǎng)基，制成細(xì)胞懸液，鋪到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，置37°C，5%C02細(xì)胞培養(yǎng)箱中。1.5單克隆細(xì)胞的篩選細(xì)胞在HAT培養(yǎng)基中培養(yǎng)，未融合的骨髓瘤細(xì)胞和未融合的淋巴細(xì)胞逐漸死亡；融合的雜交瘤細(xì)胞能在HAT培養(yǎng)基中存活和增殖。在37°C，5%C02細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7_10天；用抗原包被酶標(biāo)板，37°C包被2h，然后用2%BSA封閉；吸取96孔板中生長(zhǎng)克隆的細(xì)胞上清加到封閉好的酶標(biāo)板中，37°C孵育Ih ;洗滌5遍后，加入HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG，37°C孵育Ih ;洗滌后加入TMB顯色液，然后加2M硫酸終止反應(yīng)，在酶標(biāo)儀上進(jìn)行讀數(shù)；將ELISA檢測(cè)陽性的克隆挑入24孔細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)，3天后進(jìn)行ELISA復(fù)篩，將篩選出的ELISA陽性克隆進(jìn)行WB復(fù)篩，WB陽性細(xì)胞進(jìn)行亞克隆，經(jīng)過2次亞克隆，篩選出能夠穩(wěn)定分泌抗體的單克隆細(xì)胞，將陽性的單克隆擴(kuò)大培養(yǎng)后定株、凍存。2、雜交瘤細(xì)胞抗⑶20單克隆抗體的獲得及生物學(xué)鑒定2.1雜交瘤細(xì)胞抗⑶20單克隆抗體的獲得將定株的單克隆細(xì)胞的細(xì)胞上清液用美國(guó)BD公司Mouse Monoclonal AntibodyIsotyping Kit鑒定單抗的亞類亞型，然后將陽性的單克隆細(xì)胞注射到小鼠體內(nèi)進(jìn)行腹水生產(chǎn)，生產(chǎn)的腹水通過層析純化后的得到抗體。2.2ffestern blot檢測(cè)抗體的特異性取已處理的細(xì)胞裂解液，在凝膠上進(jìn)行垂直SDS-PAGE，120v90min,電泳結(jié)束后，取下凝膠，置于PVDF膜上，將蛋白用半干法轉(zhuǎn)染到PVDF膜上，IOv, 120min ;將轉(zhuǎn)印后的PVDF膜在5%脫脂奶粉中室溫封閉2h ;將抗體溶解于3mL封閉液中，4°C過夜；用洗滌液洗滌3次，每次5min，用封閉液來稀釋HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG，室溫下孵育2h ;再用洗滌液洗滌3次，將化學(xué)發(fā)光試劑加到PVDF膜上，到暗室曝光到X膠片上，通過顯影和定影，將結(jié)果反映在膠片上；掃描膠片，分析結(jié)果，其結(jié)果參照?qǐng)D1。2.3單克隆抗體親和常數(shù)測(cè)定用包被液將抗原稀釋， 分別加入酶標(biāo)板，100微升/孔，370C 2h，PBS洗滌5次，拍干，加2%BSA封閉液200微升/孔，4°C過夜，洗滌5次，拍干；將抗體從4ug/mL開始進(jìn)行梯度稀釋后加入到包被好的酶標(biāo)板中，100微升/孔，37°C lh，洗滌5次，拍干；加入HRP標(biāo)記的羊抗小鼠IgG抗體，工作液100微升/孔，370C Ih,洗滌5次，拍干；加入TMB顯色液，37°C反應(yīng)5-10min，加終止液50微升/孔，立即在酶標(biāo)儀上以450nm波長(zhǎng)測(cè)定OD值，按照公式計(jì)算出單克隆抗體親和常數(shù)。3、抗⑶20單克隆抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)基因的克隆所用細(xì)胞株為采用上述方法獲得的能分泌高親和力、高特異性的抗CD20抗體的雜交瘤細(xì)胞株，對(duì)應(yīng)的保藏編號(hào)為407CT20.1.2，其分泌的抗體分子亞型IgGl。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的407CT20.1.2雜交瘤細(xì)胞，用QIAGEN公司的試劑盒RNeasy MiniKit (貨號(hào):QIAGEN-74106)提取總RNA，取少量用nanodrop定量及1%非變性瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，隨后用 SuperScript.1ll First-Strand Synthesis System for RT-PCR 試劑盒(貨號(hào):Invitrogen-18080-051)反轉(zhuǎn)錄cDNA，用特異引物擴(kuò)增抗CD20抗體基因的輕鏈或重鏈可變區(qū)。將含有相應(yīng)重鏈可變區(qū)或輕鏈可變區(qū)片段的PCR反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，切膠分離目的片段。通過膠回收試劑盒(捷瑞-GK2042)純化目的產(chǎn)物后，1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定目的片段的純度；之后，將回收得到的相應(yīng)重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)克隆至測(cè)序載體PMD18-T，后測(cè)序，對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行同源性和結(jié)構(gòu)分析。相關(guān)操作具體步驟如下:3.1RT-PCR擴(kuò)增CD20抗體輕鏈和重鏈可變區(qū)3.1.1引物設(shè)計(jì)根據(jù)IgG可變區(qū)的序列，在信號(hào)區(qū)和恒定區(qū)合成5’和3’端引物用于擴(kuò)增CD20抗體重鏈可變區(qū)，引物序列如下:VHF (5，-ACTAGTCGACATGGVTTGGSTGTGGAMCTTGCYATTCCT-3’)，含有 Sal I 酶切位占.
VHR (5，-CCCAAGCTTCCAGGGRCCARKGGATARACIGRTGG-3’)，含有 Hind TTT酶切位點(diǎn)。根據(jù)IgG可變區(qū)的序列，在信號(hào)區(qū)和恒定區(qū)合成5’和3’端引物用于擴(kuò)增CD20抗體輕鏈可變區(qū)，引物序列如下:LHF (5，-ACTAGTCGACATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTGGTGCT-3’)，含有 Sal I 酶切位占.
LHR (5 ’ -CCCAAGCTTACTGGATGGTGGGAAGATGGA-3 ’ ),含有 Hind TTT酶切位點(diǎn)。3.1.2雜交瘤細(xì)胞總RNA提取用上述的雜交瘤細(xì)胞407CT20.1.2提取總RNA，具體步驟如下:收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期雜交瘤細(xì)胞407CT20.1.2，各2X IO6個(gè)，800rpm離心5min，去上清，沉淀下來的細(xì)胞可保存于_80°C，或直接用于RNA提取；每份細(xì)胞樣品(細(xì)胞數(shù)約2 X IO6個(gè))中加入350 μ L RTL溶液，渦旋30s ；向以上每體系中加入70%乙醇，用ImL移液槍輕輕吹打均勻；將以上體系混合液轉(zhuǎn)入RNeasy spin column, 8000x g離心15s,去濾液；向以上RNeasy spin column 中各加入 700 μ L RWl 溶液，8000x g 離心 15s,去濾液；向以上RNeasy spin column 中各加入 500 μ L RPE 溶液，8000x g 離心 15s,去濾液；向以上RNeasy spin column 中各加入 500 μ L RPE 溶液，8000x g 離心 2min,去濾液；將RNeasy spin column換到無RNA酶的2mT,收集管中，全速離心Imin ；將RNeasy spin column 換到無 RNA 酶的 1.5mT,FP 管中，加入 30-50 μ L 無 RNA 酶的 H20,8000x g 離心 Imin,洗脫 RNA。3.1.3 反轉(zhuǎn)錄 PCR以雜交瘤細(xì)胞407CT20.1.2總RNA為模板，用Invitrgen的RT-PCR第一鏈合成SuperScript.1II試劑盒(貨號(hào)18080-051),反轉(zhuǎn)錄cDNA,具體步驟如下:(I)引物與模板變性按表I中所不，配成10 μ L體系,65°C，5min,隨后冰上放置Imin,利于引物與RNA模板結(jié)合。表I
權(quán)利要求
1.抗CD20單克隆抗體可變區(qū)序列，其特征在于，包含兩種核苷酸序列，所述核苷酸序列分別為 51802-VH 和 51802-VL。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗CD20單克隆抗體可變區(qū)序列，其特征在于，所述核苷酸序列51802-VH和51802-VL由保藏號(hào)為407CT20.1.2的雜交瘤細(xì)胞株制備而成。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗CD20單克隆抗體可變區(qū)序列，其特征在于，所述51802-VH編碼117個(gè)氨基酸，分子量為13273D，其中CDR1、⑶R2和⑶R3的區(qū)域相應(yīng)地分別為26aa_33aa, 51aa_60aa 和 99aa_106aa。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗CD20單克隆抗體可變區(qū)序列，其特征在在于，所述51802-VL編碼113個(gè)氨基酸，分子量為12297D，其中CDR1、CDR2和CDR3的區(qū)域相應(yīng)地分別為 27aa_37aa, 55aa_57aa 和 94aa_102aa。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗CD20單克隆抗體可變區(qū)序列，其特征在于，還包括:與上述兩種核苷酸序列具有相同氨基酸序列產(chǎn)物的核苷酸序列。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的抗⑶20單克隆抗體可變區(qū)序列，其特征在于，還包括:經(jīng)過一個(gè)或者幾個(gè)堿基替換、缺失或添加后仍具有與所述核苷酸序列產(chǎn)生的氨基酸序列具有相同活性的核苷酸序列。
7.制備權(quán)利要求1至6任意一項(xiàng)所述的抗CD20單克隆抗體可變區(qū)序列的方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)雜交瘤細(xì)胞的制備:首先用CD20蛋白抗原免疫雌性健康的BALB/c小鼠，挑選出免疫后抗體表達(dá)呈陽性的小鼠，取其脾臟細(xì)胞，然后將分離的小鼠脾臟細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，得到雜交瘤細(xì)胞； (2)單克隆細(xì)胞的篩選:將上述雜交瘤細(xì)胞在HAT培養(yǎng)基中培養(yǎng)，對(duì)ELISA檢測(cè)呈陽性的單克隆細(xì)胞進(jìn)行ELISA復(fù)篩，然`后將篩選出的ELISA陽性單克隆細(xì)胞進(jìn)行WB復(fù)篩，再將WB陽性細(xì)胞進(jìn)行亞克隆，經(jīng)過2次亞克隆，篩選出能夠穩(wěn)定分泌抗體的單克隆細(xì)胞，將陽性的單克隆細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)后定株、凍存； (3)雜交瘤細(xì)胞抗CD20單克隆抗體的獲得:首先鑒定步驟(2)所制備的單克隆細(xì)胞的亞類亞型，然后將陽性的單克隆細(xì)胞注射到小鼠體內(nèi)進(jìn)行腹水生產(chǎn)，再將產(chǎn)生的腹水通過層析純化后得到抗CD20單克隆抗體； (4)抗CD20單克隆抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)基因的克隆:提取步驟(3)中所用的單克隆細(xì)胞的總RNA，以總RNA中的mRNA為模板，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，最后克隆得到抗CD20單克隆抗體的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)。
全文摘要
抗CD20單克隆抗體可變區(qū)序列，包含兩種核苷酸序列，所述核苷酸序列分別為51802-VH和51802-VL。用CD20蛋白作為抗原，免疫小鼠后，檢測(cè)得到相應(yīng)抗體表達(dá)呈陽性的小鼠，分離其脾細(xì)胞后，融合脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞，在HAT培養(yǎng)基中培養(yǎng)后，檢測(cè)得到抗體表達(dá)陽性克隆，提取陽性雜交瘤細(xì)胞總RNA，以總RNA中的mRNA為模板，反轉(zhuǎn)錄得到相應(yīng)抗體基因的cDNA，再用特異引物PCR獲得相應(yīng)抗體重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，并進(jìn)行克隆和測(cè)序。
文檔編號(hào)C07K16/28GK103173457SQ201310066338
公開日2013年6月26日 申請(qǐng)日期2013年3月4日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月4日
發(fā)明者吳純, 李靜文, 鄒建炫, 汪偉, 楊春花, 周延慶, 李順玲, 孫其玲, 洪揚(yáng), 陳媛 申請(qǐng)人:百奇生物科技(蘇州)有限公司