專利名稱：重組人胰島素原的復(fù)性與純化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用高效體積排阻色譜(HPSEC或SEC)法復(fù)性與純化重組人胰島素原的方法，屬于生物醫(yī)藥中變性蛋白復(fù)性技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
胰島素原(ProinSUlin，PI)是由86個(gè)氨基酸組成的單鏈肽，其C肽的兩端各自通過兩個(gè)堿性氨基酸殘基與胰島素A鏈的N末端和B鏈的C末端相連。胰島素原分子的折疊卷曲保證了三對二硫鍵的正確對接。在胰島素制備中，采用胰島素原法直接酶切后獲得有活性的胰島素已經(jīng)是一種成熟的方法。因此，獲得高質(zhì)量回收率的具有活性重組人胰島素原(簡稱:rhPI)是制備重組人胰島素的前提。Robert B.M 等[Robert B.M, et al, Protein Expres Purif, 1999, 15:308-313]曾利用離子交換色譜(IEC)法和親和色譜(AFC)法對rhPI包涵體蛋白進(jìn)行純化，之后用稀釋法復(fù)性、酶切獲得產(chǎn)物用RPLC法分析。而Gusarova V等[Gusarova V, et al,J Chromatogr A.2007, 1176: 157-162]報(bào)道了先利用稀釋法復(fù)性rhPI，再分別用IEC法和SEC法進(jìn)行兩步純化后，通過酶切轉(zhuǎn)換為胰島素。上述方法均利用稀釋法復(fù)性，難于大規(guī)模進(jìn)行蛋白藥物的制備。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供的一種高效、快速的復(fù)性與純化重組人胰島素原的方法，能夠提高重組人胰島素原的質(zhì)量回收率和純度，并可直接用于酶切為胰島素，適用于胰島素的規(guī)?；a(chǎn)。本發(fā)明實(shí)現(xiàn)過程如下: 重組人胰島素原的復(fù)性與純化方法，包括以下步驟:
(1)在大腸桿菌(疋co7i)中表達(dá)的重組人胰島素原(rhPI)的菌體細(xì)胞經(jīng)離心、超聲破碎后分別用緩沖液I和II洗滌、離心溶解于強(qiáng)變性緩沖液中得到含有重組人胰島素原的變性抽提液；
所述緩沖液 I 為 10 20 mmol/L PBS,0.5 I mmol/L EDTA, pH 7.0 7.5 ;
所述緩沖液 II 為 0.5 2.0 mol/L脲，0.5 I mmol/L EDTA，0.5 1.0 mol/L NaCl，10 20 mmol/L PBS, pH 7.0 7.5 ;
所述的強(qiáng)變性緩沖液為6.0 8.0 mol/L脲，10 20 mmol/LDTT，0.5 I mmol/LEDTA,pH7.0 8.0;或6 7 mol/L 鹽酸胍，10 20mmol/LDTT，0.5 lmmol/LEDTA，pH7.0 8.0 ；
(2)將含有重組人胰島素原的變性抽提液直接進(jìn)樣到流動(dòng)相A(20 40 mmol/LPBS,O 8.0 mol/L脲，pH6.0 7.0)平衡的色譜柱，然后用含20 40 mmol/LPBS, pH6.0 7.0的流動(dòng)相B線性梯度洗脫，流速為0.3 0.7mL/min，收集目標(biāo)峰色譜餾分得到復(fù)性與純化含重組人胰島素原的色譜餾分；(3)將步驟(2)含人胰島素原的色譜餾分直接進(jìn)樣，用O 10 mmol/LPBS, pH6.0
7.0的流動(dòng)相平衡的色譜柱進(jìn)一步脫鹽,持續(xù)洗脫20 40 min,流速0.5 I mL/min,得到
重組人胰島素原。上述步驟(2)中色譜柱為TSK gel 620005' 0^型(7.811111^300111111)或5即61(^\20010/300GL 型(10 mmX300 mm)。上述步驟(2)中所述洗脫方式可以采用流動(dòng)相A平衡后，用流動(dòng)相B線性梯度洗脫20 40 min,延長5 10 min。上述步驟(3)中所述色譜柱為HiTrap Desalting column。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn):本發(fā)明提供的利用脲濃度梯度體積排阻色譜對重組人胰島素原復(fù)性與純化的方法，解決了蛋白分子直接從高濃度變性劑擴(kuò)散到與流動(dòng)相中，而不能提供一個(gè)緩和的蛋白再折疊環(huán)境的問題，同時(shí)也克服了其他色譜方法成本高，難于放大的缺點(diǎn)。本發(fā)明在流動(dòng)相中添加了小分子脲之后，在洗脫過程中，為蛋白再折疊提供了一個(gè)溫和的環(huán)境，促進(jìn)蛋白折疊成緊密的結(jié)構(gòu)，保留時(shí)間延長，復(fù)性效率和質(zhì)量回收率也得到提高。并且經(jīng)過脫鹽柱后更加利于后續(xù)酶切而得到胰島素，操作簡單成熟、穩(wěn)定，固定相成本較低，易于控制和放大


圖1復(fù)性與純化前后rhPI的SDS-PAGE分析
條帶M:蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；條帶1:未誘導(dǎo)表達(dá)的重組人胰島素原；條帶2:重組人胰島素原誘導(dǎo)表達(dá)5 h后；條帶3:8.0 m ol/L urea抽提液；條帶4:脲濃度梯度SEC法對rhPI的純化與復(fù)性；條帶5:對一步餾分脫鹽的二次純化；條帶6:標(biāo)準(zhǔn)胰島素；條帶7:酶切轉(zhuǎn)化的胰島素；
圖2添加不同的脲濃度時(shí)對rhPI的復(fù)性與純化色譜圖(A )和質(zhì)量回收率(B)
圖(A)中橫坐標(biāo)為保留時(shí)間(time)，縱坐標(biāo)為波長280nm處紫外吸收值(mAU);
圖(B)中橫坐標(biāo)為添加脲濃度(Urea concentration),縱坐標(biāo)為質(zhì)量回收率(Massrecovery)；
曲線 1: 0.0 mol/L 脲；曲線 2: 2.0 mol/L 脲；曲線 3: 4.0 mol/L 脲；曲線 4:6.0 mol/L 服；曲線 5: 8.0 mol/L 服；
圖3為不同洗脫模式下對rhPI的復(fù)性與純化
圖中橫坐標(biāo)為保留時(shí)間(time )，縱坐標(biāo)為波長280nm處紫外吸收值(mAU);
曲線1:在流動(dòng)相A中添加0.0 mol/L脲等度洗脫；曲線2:在流動(dòng)相A中添加2.0mol/L脲等度洗脫；曲線3:在流動(dòng)相A中添加2.0 mol/L脲梯度洗脫。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例和附圖詳細(xì)說明本發(fā)明的技術(shù)方案，但保護(hù)范圍不被此限制。實(shí)施例中所用設(shè)備或原料皆可從市場獲得。實(shí)施例1
(O重組人胰島素原變性抽提液的準(zhǔn)備
用萬作為宿主細(xì)胞表達(dá)重組人胰島素原(rhPI)蛋白，再將發(fā)酵菌液經(jīng)離心、細(xì)胞破碎和分別用緩沖液 I (20 mmol/L PBS, I mmol/L EDTA，pH 7.4)和 II (2.0 mol/L 脲，
1mmol/L EDTA, 1.0 mol/L NaCl，20 mmol/L PBS, pH 7.4)洗滌、并離心的粗純化后，得到的包涵體溶于 8.0moI/L 脲，20 mmol/LDTT, 1.0 mmol/LEDTA, pH 8.0 (或 6 7 mol/L 鹽酸胍，10 20mmol/LDTT，0.5 lmmol/LEDTA，pH7.0 8.0)的變性劑中，變性抽提液濃度為9.92 mg/mL, rhPI純度為65.7 %以上，電泳見圖1中條帶3。(2)高效體積排阻色譜復(fù)性與純化重組人胰島素原
用流動(dòng)相A(20 mmol/ LPBS,4.0moI/L 脲，ρΗ6.5)平衡 HPSEC柱(TSK gel G2000SWXL,300 X 7.8 mm 1.D.)，變性抽提液直接進(jìn)樣200 μ L，在流速0.3 mL/min下進(jìn)行30 min的線性梯度洗脫，直至流動(dòng)相B (20 mmol/L PBS, pH 6.5)為100%,延長10 min。rhPI質(zhì)量回收率為42.5%，純度達(dá)到95%以上，色譜圖見圖2 (A)的曲線3，質(zhì)量回收率見圖2 (B)中。(3)用脫鹽色譜柱二次純化重組人胰島素原
用0-10 mmol/LPBS, pH6.0-7.0的流動(dòng)相平衡的脫鹽色譜柱(HiTrap Desaltingcolumn)，對復(fù)性與純化得到的含人胰島素原的色譜餾分I直接進(jìn)樣，持續(xù)洗脫30 min，流速1.0ml/min。rhPI的純度達(dá)到了 99%以上。見圖1中條帶5。實(shí)施例2
與實(shí)施例1類似，不同的是步驟(2)用未添加脲100%流動(dòng)相A平衡TSK gel G2000SWXL型HPSEC柱(300 X7.8 mm 1.D.)，變性抽提液直接進(jìn)樣200 μ L，在流速0.5 mL/min下進(jìn)行30 min線性梯度洗脫，直至流動(dòng)相B(20.0 mmol/L PBS,pH 6.5)為100%，延長lOmin。rhPI質(zhì)量回收率為39.7%，純度可達(dá)到95%以上。色譜圖見圖2 (A)的曲線1，質(zhì)量回收率見圖2 (B)。實(shí)施例3
與實(shí)施例1類似，不同的是步驟(2)在流動(dòng)相中脲濃度和色譜條件優(yōu)化的條件下，用100% 流動(dòng)相 A(20.0 mmol/ LPBS, 2.0 mol/L 脲，ρΗ7.0)平衡 TSK gel G2000SWXL 型 HPSEC柱(300 X 7.8 mm 1.D.)，變性抽提液直接進(jìn)樣200 μ L，在流速0.5 mL/min下進(jìn)行30 min脲濃度線性梯度洗脫，直至流動(dòng)相B (20.0 mmol/L PBS,pH 7.0)為100%，延長10 min。rhPI質(zhì)量回收率為56.8%，純度可達(dá)到96%以上。色譜圖見圖2 (A)的曲線2，質(zhì)量回收率見圖2 (B)。實(shí)施例4
與實(shí)施例1類似，不同的是步驟(2)在流動(dòng)相中脲濃度和色譜條件優(yōu)化的條件下，用100% 流動(dòng)相 A (20.0 mmol/ LPBS,2.0 mol/L 脲，ρΗ7.0)平衡 SuperdeX200 10/300GL型的SEC柱(10 X 300 mm 1.D.)，變性抽提液直接進(jìn)樣200 yL，在流速0.5 mL/min下進(jìn)行30 min脲濃度線性梯度洗脫，直至流動(dòng)相B (20.0 mmol/L PBS, pH 7.0)為100%，延長IOmin0 rhPI質(zhì)量回收率為51.7%，純度可達(dá)到96%以上。實(shí)施例5
與實(shí)施例1類似，不同的是步驟(2)用100%流動(dòng)相A (20.0 mmol/ LPBS，2.0 mol/L脲，pH7.5)平衡 TSK gel G2000SWXL 型 HPSEC 柱(300 X7.8 mm 1.D.)，變性抽提液直接進(jìn)樣200 μ L，改變流速為0.5 mL/min時(shí)，分別進(jìn)行脲濃度等度洗脫或脲濃度線性梯度洗脫，后者rhPI質(zhì)量回收率可以提高10%。色譜圖見圖3曲線2和曲線3。
實(shí)施例6胰島素原轉(zhuǎn)化為胰島素
將得到的高純度重組人胰島素原在37°C溶液中或控制HPSEC柱37°C柱溫的條件下，用胰蛋白酶和羧肽 酶B協(xié)同酶切30 min，使rhPI轉(zhuǎn)化為hi。電泳見圖1中條帶7。
權(quán)利要求
1.重組人胰島素原的復(fù)性與純化方法，其特征在于包括以下步驟: (1)在大腸桿菌中表達(dá)的重組人胰島素原的菌體細(xì)胞經(jīng)離心、超聲破碎后分別用緩沖液I和II洗滌、離心溶解于強(qiáng)變性緩沖液中得到含有重組人胰島素原的變性抽提液；所述緩沖液 I 為 10 20 mmol/L PBS, 0.5 I mmol/L EDTA, pH 7.0 7.5 ; 所述緩沖液 II 為 0.5 2.0 mol/L脲，0.5 I mmol/L EDTA，0.5 1.0 mol/L NaCl，10 20 mmol/L PBS, pH 7.0 7.5 ; 所述的強(qiáng)變性緩沖液 為6.0 8.0 mol/L脲，10 20mmol/LDTT，0.5 lmmol/LEDTA，pH7.0 8.0;或6 7 mol/L 鹽酸胍，10 20mmol/LDTT，0.5 lmmol/LEDTA，pH7.0 8.0 ； (2)將含有重組人胰島素原的變性抽提液直接進(jìn)樣到流動(dòng)相A平衡的色譜柱，然后用含20 40 mmol/LPBS,pH6.0 7.0的流動(dòng)相B線性梯度洗脫，流速為0.3 0.7mL/min,收集目標(biāo)峰色譜餾分得到復(fù)性與純化含重組人胰島素原的色譜餾分；流動(dòng)相 A 為:20 40 mmol/LPBS, O 8.0 mol/L 脲，ρΗ6.0 7.0 ; (3)將步驟(2)含重組人胰島素原的色譜餾分直接進(jìn)樣，用O 10mmol/LPBS，pH6.0 7.0的流動(dòng)相平衡的色譜柱進(jìn)一步脫鹽,持續(xù)洗脫20 40 min,流速0.5 I mL/min,得到重組人胰島素原。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組人胰島素原的復(fù)性與純化方法，其特征在于: 步驟(2)中色譜柱為 TSK gel G2000SWXL 型或 SuperdeX200 10/300GL 型。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組人胰島素原的復(fù)性與純化方法，其特征在于:步驟(2)中所述洗脫方式采用流動(dòng)相A平衡后，用流動(dòng)相B線性梯度洗脫20 40 min,延長5 10min。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組人胰島素原的復(fù)性與純化方法，其特征在于:步驟(3)中所述色譜柱為 HiTrap Desalting column。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種高效體積排阻色譜(HPSEC)復(fù)性與同時(shí)純化重組人胰島素原的方法。包括(1)將含有胰島素原的菌體細(xì)胞經(jīng)超聲波細(xì)胞破碎，緩沖液洗滌和溶解于強(qiáng)變性劑(如8mol/L或6-7mol/L鹽酸胍)，由此得到粗分離的重組人胰島素原；(2)在優(yōu)化的色譜條件下含有胰島素原的變性抽提液直接進(jìn)樣，采用脲濃度線性梯度洗脫一步色譜所得的目標(biāo)餾分rhPI的純度可達(dá)到96%以上，質(zhì)量回收率為56.8%；(3)將含有胰島素原餾分進(jìn)一步脫鹽，由此得復(fù)性與純化更高純度和活性的餾分。本發(fā)明所述的方法得到的重組人胰島素原可以經(jīng)色譜柱上的酶切或溶液中酶切轉(zhuǎn)換為胰島素，并且該色譜過程操作簡單，重復(fù)性高，易于規(guī)?；a(chǎn)。
文檔編號C07K1/16GK103172727SQ20131006581
公開日2013年6月26日 申請日期2013年3月4日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月4日
發(fā)明者王驪麗, 吳溪, 周慧芳, 袁潔 申請人:西北大學(xué)