用于抑制辣椒炭疽菌附著胞形成的枯草芽孢桿菌及其抗菌肽的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一株用于抑制辣椒炭疽菌附著胞形成的枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)C-D6菌株及應(yīng)用，該菌株已在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（CGMCC）保藏，編號為：CGMCCNo.5345。本發(fā)明還提供了該菌株產(chǎn)生抑制附著胞形成活性物的適宜培養(yǎng)方法和抗菌蛋白分離純化方法。應(yīng)用所述方法，C-D6菌株的培養(yǎng)液能強(qiáng)烈抑制辣椒炭疽菌（Colletotrichum?capsici）501附著胞的形成，從其分離獲得的抗菌蛋白在較低的濃度下就能完全抑制該菌株附著胞的形成。C-D6菌株及其所產(chǎn)生的抗菌蛋白的特異抑制作用，能有效阻斷病菌侵入，可用于辣椒炭疽菌引起的作物炭疽病的生物防治。
【專利說明】用于抑制辣椒炭疸菌附著胞形成的枯草芽孢桿菌及其抗菌肽
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于植物病害生物防治領(lǐng)域，具體涉及一株抑制辣椒炭疽菌附著胞形成的枯草芽孢桿菌及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]生物防治作為植物病害綜合治理的重要內(nèi)容，因與生態(tài)環(huán)境保護(hù)間的“相容性”及與農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展間的“統(tǒng)一性”，倍受世界各國的重視。生物防治在促進(jìn)農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)發(fā)展和保護(hù)生態(tài)環(huán)境方面正發(fā)揮著日益重要的作用。
[0003]辣椒炭疽菌寄主范圍廣，可危害多種蔬菜、花卉、藥用植物和大田作物的果實(shí)、莖、葉和幼果，引起爛果、枯枝、葉斑和死苗等癥狀，對農(nóng)林生產(chǎn)造成嚴(yán)重危害。炭疽病的防治以選用抗病品種和化學(xué)防治為主。近年來，由于規(guī)模化栽培、抗病品種退化和化學(xué)防治易產(chǎn)生產(chǎn)品污染等原因，使該類病害處于較難防治的困境。因此，探索新的、有效的防治途徑具有
重要意義。
[0004]生物防治作為病害綜合治理的一 個重要發(fā)展方向，來源廣泛的微生物，包括熒光假單胞菌、芽孢桿菌和酵母菌等已分別被應(yīng)用于炭疽病的生物防治研究。芽孢桿菌因其具有易培養(yǎng)、所制備的菌劑抗逆性強(qiáng)、易保存等特點(diǎn)，已在病害生防上得到廣泛應(yīng)用。芽孢桿菌在作物炭疽病生防上的應(yīng)用研究也有一些報(bào)道，但這些研究多局限于拮抗菌的分離、篩選、鑒定及其初步的生防作用研究。
[0005]附著胞的分化、形成和成熟是辣椒炭疽菌成功侵入寄主的前提。附著胞的形成是由來自植物表面的物理和(或)化學(xué)信號的識別而觸發(fā)的，信號傳導(dǎo)途徑對于這類病害的發(fā)生可能非常重要。如果能阻斷信號識別和傳導(dǎo)過程，將可阻止附著胞的形成和病害的發(fā)展。Kim等的研究證實(shí)了這一點(diǎn)，他們發(fā)現(xiàn)在大腸桿菌內(nèi)表達(dá)的辣椒酯酶能抑制膠胞炭疽菌和稻瘟病菌附著胞的形成，從而可控制病害的發(fā)生。其作用機(jī)理是該酶通過調(diào)制依賴環(huán)腺苷酸信號途徑(cAMP-dependent signaling pathway)來調(diào)節(jié)附著胞形成(Kim Y S等.1nhibition of fungal appressorium formation by pepper (Capsicum annuum)esterase.MPMI, 2001，14(I):80-85)。從真菌的次生代謝產(chǎn)物中也發(fā)現(xiàn)了多種抑制炭疽菌等植物病原真菌侵染過程中孢子萌發(fā)和附著胞形成的生物活性物質(zhì)，這些次生代謝產(chǎn)物可有效地阻斷病害的侵入過程，對發(fā)展新型殺菌劑具有重要意義(Thines E等.Fungalsecondary metabolites an inhibitors of infection-related morphogenesis inphytopathogenic fung1.Mycol.Res., 2004, 108 (I): 14-25.)。這些研究表明:以病菌侵入過程中的附著胞形成為作用靶標(biāo)，篩選生物產(chǎn)生的活性物質(zhì)阻斷附著胞形成，從而阻止病害發(fā)生，對炭疽病的生物防治具有重要意義。在生態(tài)上，由于其作用靶標(biāo)專一，對保護(hù)環(huán)境和微生物多樣性也具有十分積極的意義。
[0006]而從枯草芽孢桿菌中篩選抑制辣椒炭疽菌附著胞形成的活性菌株，并應(yīng)用于炭疽病生物防治的研究國內(nèi)外未見報(bào)道。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于:提供一株能抑制辣椒炭疽菌附著胞形成的枯草芽孢桿菌，其可用于該菌引起的作物病害的生物防治。
[0008]本發(fā)明要解決的另一技術(shù)問題在于:提供一種枯草芽孢桿菌培養(yǎng)液，其可高效地抑制辣椒炭疽菌附著胞的形成。
[0009]本發(fā)明還要解決的技術(shù)問題在于:提供一種枯草芽孢桿菌的抗菌蛋白，其可高效地抑制辣椒炭疽菌附著胞的形成。
[0010]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:提供一種用于抑制辣椒炭疽菌附著胞形成的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis )C-D6,其保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)，保藏地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院中科院微生物研究所，郵編:100101，其保藏日期為:2011年10月14日；保藏編號為:CGMCC N0.5345。
[0011]本發(fā)明提供枯草芽孢桿菌C-D6在抑制辣椒炭疽菌附著胞形成方面的應(yīng)用。
[0012]本發(fā)明還提供一種細(xì)菌培養(yǎng)液，包含所述的枯草芽孢桿菌，其由以下步驟進(jìn)行培養(yǎng)而成:
1)斜面活化培養(yǎng)的C-D6菌株；
2)搖瓶培養(yǎng):將斜面活化培養(yǎng)的C-D6菌株接種到Y(jié)PD液體培養(yǎng)基中進(jìn)一步培養(yǎng)而得。
[0013]其中，所述培養(yǎng) 步驟I中，是從枯草芽孢桿菌C-D6的保藏菌種斜面劃線接種到NA平板，37°C培養(yǎng)20-24 h，挑起單菌落接種到NA試管斜面，37°C培養(yǎng)20-24 h后，備用。
[0014]其中，所述培養(yǎng)步驟2中，是將C-D6菌株接種到裝有50mL YPD液體培養(yǎng)基的三角瓶(250 mL)中，37°C，180 r/min振蕩培養(yǎng)12 h后，按1%的接種量接種到相同培養(yǎng)瓶中，相同條件下震蕩培養(yǎng)48 h，從而獲得該細(xì)菌培養(yǎng)液。
[0015]其中，所述YPD培養(yǎng)基組成成分為:酵母膏10 g/L,蛋白胨10 g/L,葡萄糖10 g/L, pH 7.0~7.2。
[0016]本發(fā)明的進(jìn)一步提供一種抗菌蛋白，是由所述的枯草芽孢桿菌按以下分離純化方法獲得，該分離純化方法包括如下步驟:
I)枯草芽孢桿菌細(xì)菌培養(yǎng)液的準(zhǔn)備；
2 )硫酸銨沉淀分離:細(xì)菌培養(yǎng)液經(jīng)20%飽和度(NH4) 2S04沉淀后，離心沉淀蛋白，所得蛋白質(zhì)沉淀用磷酸緩沖液懸浮，并用相同緩沖液透析48h后，離心棄沉淀，即得抗菌蛋白粗提液；
3)抗菌蛋白純化:采用AKTA蛋白純化系統(tǒng)對蛋白粗提液進(jìn)行進(jìn)一步分離純化。
[0017]其中，所述枯草芽孢桿菌細(xì)菌培養(yǎng)液的準(zhǔn)備進(jìn)一步是由以下步驟獲得:
1)斜面活化培養(yǎng)的C-D6菌株；
2)搖瓶培養(yǎng):將斜面活化培養(yǎng)的C-D6菌株接種到Y(jié)PD液體培養(yǎng)基中進(jìn)一步培養(yǎng)而得；所述YPD培養(yǎng)基組成成分為:酵母膏10 g/L，蛋白胨10 g/L，葡萄糖10 g/L, pH 7.0~7.2。
[0018]優(yōu)選地，分離純化方法的步驟2具體為:所述經(jīng)20%飽和度(NH4)2SO4沉淀后，離心收集沉淀蛋白，所得蛋白質(zhì)沉淀用原體積1/15的磷酸緩沖液懸浮，并用相同緩沖液透析48h后，離心棄沉淀，即得抗菌蛋白粗提液；所述純化方法的步驟3具體為:以SephadexG-75凝膠柱為分離柱，上樣量為5 mL，流動相為50mmol/L pH 6.0的磷酸緩沖溶液，洗脫速度為0.5 mL/min,洗脫1.2倍柱體積；Sephadex G-75柱層析分離獲得的活性產(chǎn)物通過陰離子交換層析Q-Fastflow進(jìn)一步純化,獲得純化活性蛋白；所述Q-Fastflow的分離條件為:流動相A:0.01mM磷酸緩沖液(PB)，pH 7.4 ;流動相B:1M NaCl洗脫液(含流動相A);洗脫方式:線性梯度洗脫；洗脫時間:110min ;洗脫速度:lmL/min ;上樣量:2mL/min。
[0019]本發(fā)明具有以下有益效果:所述菌株枯草芽孢桿菌C-D6所產(chǎn)生的抗菌蛋白能抑制辣椒炭疽菌附著胞的形成，從而阻止病害的發(fā)生，可用于兩種重要病原真菌引起的作物病害的生物防治。
[0020]本發(fā)明所述菌株枯草芽孢桿菌C-D6已于2011年10月14日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏編號為CGMCC N0.5345。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0021]本發(fā)明枯草芽孢桿菌C-D6，其分類命名為芽孢桿菌屬(Bacillus)，拉丁文學(xué)名為Bacillus subtilis，其保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)，保藏地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院中科院微生物研究所，郵編:100101，其保藏日期為:2011年10月14 H ;保藏編號為=CGMCC N0.5345。
[0022]圖1是本發(fā)明實(shí)施例菌株C-D6基于16SrDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹。
[0023]圖2是本發(fā)明實(shí)施例菌株C-D6特異性基因序列PCR擴(kuò)增照片；其中泳道1、3為YyaO-F/Tetb-R擴(kuò)增結(jié)果；泳道2、4為YyaR-F/Tetb-R擴(kuò)增結(jié)果。
[0024]圖3是本發(fā)明實(shí)施例菌株C-D6培養(yǎng) 液對辣椒炭疽菌附著胞形成的抑制作用圖；其中A:CK，YPD培養(yǎng)基；B:C-D6的YPD培養(yǎng)液。
[0025]圖4是本發(fā)明實(shí)施例20%活性蛋白粗提液S印hadex G-75柱層析分離效果圖。
[0026]圖5是本發(fā)明實(shí)施例活性蛋白Q-Fastflow柱層析圖譜。
[0027]圖6是本發(fā)明實(shí)施例活性蛋白過Q-FF后的HPLC圖譜。
【具體實(shí)施方式】
[0028]以下結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)描述。
[0029]本發(fā)明涉及一株用于抑制辣椒炭疽菌附著胞形成的枯草芽孢桿菌{Bacillussubtilis )C-D6菌株及應(yīng)用，該菌株已在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)保藏，編號為=CGMCC N0.5345。本發(fā)明還提供了該菌株產(chǎn)生抑制附著胞形成活性物的適宜培養(yǎng)方法和抗菌蛋白分離純化方法。應(yīng)用所述方法，C-D6菌株的培養(yǎng)液能強(qiáng)烈抑制辣椒炭疽菌附著胞的形成，從其分離獲得的抗菌蛋白在較低的濃度下就能完全抑制上述兩種重要病原真菌附著胞的形成。附著胞形成是一些植物病原真菌侵入寄主的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。C-D6菌株及其所產(chǎn)生的抗菌蛋白的特異抑制作用，能有效阻斷病菌侵入，可用于辣椒炭疽病等重要病害的生物防治。
[0030]在具體實(shí)施例中，本發(fā)明所述的枯草芽孢桿菌(Zfeci77w5.subtilis )C_D6,是從土壤樣品中，經(jīng)過初篩、復(fù)篩和性能測定等分離篩選步驟獲得的。用于分離篩選的土壤樣品采集自湖南、海南、廣東、江西和安徽等省，共100余份。篩選的具體步驟為:從不同生態(tài)環(huán)境的土壤中采集樣品，用平板稀釋法分離獲得大量細(xì)菌菌株，將不同分離菌株的培養(yǎng)液分別與病原菌的孢子在載玻片上進(jìn)行對峙培養(yǎng)，最后通過鏡檢，檢查不同菌株抑制附著胞形成的情況，篩選獲得目標(biāo)菌株。
[0031]本發(fā)明所述菌株的培養(yǎng)條件為:
(O培養(yǎng)基:采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(NA);具體配方為:蛋白胨10 g/L，牛肉浸膏3g/L,氯化鈉 5 g/L,瓊脂 20 g/L, pH 7.2~7.3。
[0032](2)培養(yǎng)溫度:37°C。
[0033]本發(fā)明還提供一種枯草芽孢桿菌C-D6細(xì)菌培養(yǎng)液，能高效產(chǎn)生抗菌物質(zhì),是通過以下方法獲得，該方法包括如下步驟:
(1)菌種活化培養(yǎng):從枯草芽孢桿菌C-D6的保藏菌種斜面劃線接種到NA平板，37°C培養(yǎng)20-24 h，挑起單菌落接種到NA試管斜面，37°C培養(yǎng)20-24 h后，備用；
(2)搖瓶培養(yǎng):將斜面活化培養(yǎng)的C-D6菌株接種到裝有50mLYPD液體培養(yǎng)基的三角瓶(250 mL)中，37°C，180 r/min振蕩培養(yǎng)12 h后，按1%的接種量接種到相同培養(yǎng)瓶中，相同條件下震蕩培養(yǎng)48 h，從而獲得該細(xì)菌培養(yǎng)液。
[0034]其中，所述Yro培養(yǎng)基組成成分為:酵母膏10 g/L，蛋白胨10 g/L，葡萄糖10 g/L, pH 7.0~7.2。
[0035]本發(fā)明進(jìn)一步提供一種枯草芽孢桿菌抑制附著胞形成的抗菌蛋白，其由以下分離純化方法獲得，該方法包括如下步驟:
(1)細(xì)菌培養(yǎng)液準(zhǔn)備:見上述枯草芽孢桿菌C-D6細(xì)菌培養(yǎng)液的培養(yǎng)方法； (2)硫酸銨沉淀分離:最佳地，細(xì)菌培養(yǎng)液經(jīng)20%飽和度(NH4)2S04沉淀后，離心(10000r/min, 30 min)收集沉淀蛋白，所得蛋白質(zhì)沉淀用原體積1/15的磷酸緩沖液(50 mmol/L pH
6.0)懸浮，并用相同緩沖液透析(外液為2 L)48h后，離心棄沉淀，即得抗菌蛋白粗提液；
(3)抗菌蛋白純化:采用SephadexG_75層析和陰離子交換層析Q-Fastflow純化抗菌蛋白。
[0036]其中，所述Sephadex G_75層析的分離條件為:柱長40 cm,柱高與直徑之比為25:1，上樣量為5mL，流動相為50mmol/L pH6.0的磷酸緩沖溶液，洗脫速度為0.5mL/min，洗脫1.2倍柱體積。
[0037]所述陰離子交換層析Q-Fastflow的分離條件為:流動相A:0.01mM磷酸緩沖液(PB)，pH 7.4 ;流動相B:1M NaCl洗脫液(含流動相A);洗脫方式:線性梯度洗脫；洗脫時間:IlOmin ;洗脫速度:1mT,/miη ;上樣量:2mL/min,0.5mL/min。
[0038]實(shí)施例1菌株的篩選
以牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基為分離培養(yǎng)基，用常規(guī)稀釋平板分離法分離細(xì)菌菌株。菌株的篩選用載片培養(yǎng)法。具體方法為:從37°C培養(yǎng)12-20h的分離平板上，用牙簽逐一挑起單菌落，分別接種到含280 μ L YI3D培養(yǎng)液的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，37°C培養(yǎng)18h，獲得用于菌株篩選的細(xì)菌培養(yǎng)液。辣椒炭疽菌菌株501在PDA平板上25°C培養(yǎng)7_10天，使其產(chǎn)生大量乳黃色粘孢團(tuán)。挑起粘孢團(tuán)溶入無菌蒸餾水中制備孢子懸浮液，并用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)將孢子濃度調(diào)整到IXlO6/ mL，孢子液中加入青霉素(IOOU/ mL)和鏈霉素(100 μ g/ mL)抑制細(xì)菌生長。取細(xì)菌培養(yǎng)液和炭疽菌孢子懸浮液各20 μ L，混合滴加于載片上，25°C培養(yǎng)保濕培養(yǎng)12h，顯微鏡觀察不同細(xì)菌培養(yǎng)液對炭疽菌孢子萌發(fā)、附著胞形成和菌絲生長的影響。
[0039]對篩選獲得的菌株進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)(250 mL三角瓶裝入60 mL YPD，180r/min培養(yǎng)20-24h),經(jīng)0.22 μ m濾膜過濾除菌后得到無菌培養(yǎng)液。用上述載片培養(yǎng)法(孢子液不加抗生素)測定細(xì)菌發(fā)酵液對炭疽菌孢子萌發(fā)、附著胞形成和菌絲生長的影響。
[0040]用上述方法，經(jīng)過初篩、復(fù)篩和性能測定等分離篩選步驟，從采集自湖南、海南、廣東、江西和安徽五省11個地區(qū)的100余份土壤樣品中，獲得本發(fā)明所述菌株----芽孢桿菌C-D6。
[0041]實(shí)施例2菌株的鑒定
經(jīng)實(shí)驗(yàn)觀察，菌株C-D6具有以下微生物學(xué)特征:在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上37 °C培養(yǎng)18h，形成乳白、表面粗糙有皺褶、邊緣整齊的圓形突起菌落；菌體桿狀，大小為
0.89ymX2.74μπι。經(jīng)革蘭氏染色后觀察:芽孢中生，橢圓，孢囊不膨大。革蘭氏染色陽性。
[0042]應(yīng)用常規(guī)PCR方法，采用
通用引物 8F:5’-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’和 1492R:5’-GGYTACCTTGTTACGACTT-3’，從C-D6的基因組DNA擴(kuò)增獲得一條1691bp的16S rDNA序列，具體序列見SEQ ID NO:1。
[0043]通過Blast進(jìn)行搜索比對，該序列與Genbank中的兩個枯草芽孢桿菌參考菌株Bacillus subtilis L4和WD23的序列(登陸號分別為:GQ421472、EU780682)同源性大于99%。從Genbank中選擇了 8個芽孢桿菌菌株的16SrRNA基因序列，應(yīng)用軟件進(jìn)行多重比較后構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹見圖1。結(jié)果表明:菌株C-D6與枯草芽胞桿菌的親緣關(guān)系最近。
[0044]采用兩對芽孢桿菌特異基因引物YyaO-F/TetB-R和YyaR-F/TetB-R，通過常規(guī)PCR方法進(jìn)行枯草芽孢桿菌的特異基因鑒定。引物序列如下:
YyaO-F:5/ -GGAACCAGTCCACAGGGTTGTGG-3'，
TetB - R:5/ -CCATATAGAGCTGTTCCAATGGAGAAG -3'；
YyaR-F:5' -CGATTGAGTGGGCRAAGGAGAATCATTTWTGYGGT-3'；
TetB - R:5/ -CCATATAGAGCTGTTCCAATGGAGAAG -3/ ；
PCR反應(yīng)條件為:94°C變性Imin ;94°C變性lmin、52°C引物復(fù)性lmin、72°C延伸lmin，30個循環(huán)，最后72°C延伸7min。1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的結(jié)果。
[0045]結(jié)果表明:當(dāng)以枯草芽孢桿菌特異引物YyaO-F/TetB-R為擴(kuò)增引物時，菌株C-D6能夠擴(kuò)增，擴(kuò)增得到的片段約600多bp，以解淀粉芽孢桿菌特異引物YyaR-F/TetB-R為擴(kuò)增引物，菌株C-D6不能夠擴(kuò)增，見圖2。
[0046]基于上述形態(tài)和分子特征，菌株C-D6被鑒定為枯草芽孢桿菌。
[0047]實(shí)施例3菌株的抑制效果測定
細(xì)菌培養(yǎng)液抑制附著胞形成的活性用載玻片培養(yǎng)法進(jìn)行測定。方法為:取過濾除菌后的細(xì)菌培養(yǎng)液和炭疽菌孢子懸浮液(I X 106/mL)各20 μ L，混合滴加于載玻片上，25°C培養(yǎng)保濕培養(yǎng)12h，顯微鏡觀察細(xì)菌培養(yǎng)液對孢子形成附著胞的影響。
[0048]采用上述方法測定了芽孢桿菌C-D6培養(yǎng)液對辣椒炭疽菌附著胞形成的影響。C-D6菌株的培養(yǎng)液對辣椒炭疽菌附著胞形成的抑制效果見圖3。附圖3顯示:該菌的培養(yǎng)液不影響辣椒炭疽菌的孢子萌發(fā)，但能明顯影響芽管生長，使菌絲前端不能分化形成附著胞。實(shí)驗(yàn)結(jié)果還表明:C-D6菌株的培養(yǎng)液對辣椒炭疽菌附著胞形成的抑制率為100%。
[0049]實(shí)施例4聞效廣生抑制附著胞形成的抗菌`蛋白的實(shí)驗(yàn)條件
應(yīng)用載玻片培養(yǎng)法對細(xì)菌培養(yǎng)液的抑菌活性進(jìn)行測定，比較了不同培養(yǎng)基、培養(yǎng)時間和搖瓶裝量等培養(yǎng)條件，對菌株C-D6產(chǎn)生抑制附著胞形成的活性物質(zhì)的影響。結(jié)果表明:該菌產(chǎn)生抑制附著胞形成的活性物質(zhì)的最適培養(yǎng)條件為:以YPD為培養(yǎng)基，搖瓶裝量為50mL/250 mL，在 37°C下，180 r/min 振蕩培養(yǎng) 48h。
[0050]實(shí)施例5抗菌蛋白的分離純化
C-D6發(fā)酵液蛋白粗提液的制備:采用(NH4)2SO4分級鹽析法，方法為:細(xì)菌發(fā)酵液過濾除菌后，加入固體(NH4)2SO4至20%飽和度，4°C沉淀過夜。4。。下，10000 r/min離心30 min后，所得蛋白質(zhì)沉淀用原體積1/15的50 mmol/L磷酸緩沖液(PH6.0)懸浮，獲得20 %飽和度蛋白鹽析液。上清液再冰浴，緩慢加入固體(NH4)2SO4M 30%飽和度，用同樣方法制備得到20%~30%的鹽析蛋白，依次制備得到30%~40%、40%~70%的鹽析蛋白。將不同飽和度獲得的鹽析蛋白質(zhì)液加入到透析袋中，放入外液為2 L的50 mmol/L磷酸緩沖液(PH6.0)中透析，室溫透析48 h后，離心棄沉淀，即得不同飽和度的蛋白粗提液。
[0051]用載片培養(yǎng)法測試了(NH4)2SO4分級鹽析獲得的不同蛋白粗提液對稻瘟病菌和辣椒炭疽菌附著胞形成的影響。結(jié)果顯示:0%~20%、30%~40%和40%~70%飽和度的(NH4)2SO4鹽析蛋白組分對辣椒炭疽菌的芽管生長和附著胞形成均有抑制作用，30%~40%飽和度的鹽析蛋白組分無活性。進(jìn)一步的觀察發(fā)現(xiàn):0%~20%飽和度粗提液的作用效果最好，能顯著影響芽管生長，使菌絲前端不能分化形成附著胞。且粗提液稀釋8倍后，仍有同樣的效果。因此，選擇該飽和度的蛋白粗提液為進(jìn)一步分離純化活性蛋白的材料。
[0052]Sephadex G-75分子篩純化活性蛋白:采用AKTA層析系統(tǒng)，以Sephadex G-75層析柱為分離柱對20%飽和度的活性蛋白粗提液進(jìn)行初步純化。層析分離條件為:柱長40 cm,柱高與直徑之比為25:1，上樣量為5mL，流動相為50mmol/L pH6.0的磷酸緩沖溶液，洗脫速度為0.5ml/min，洗脫1.2倍柱體積。洗脫結(jié)果如圖4所示。
[0053]結(jié)果顯示:20%飽和度的粗體液從加樣后洗脫開始至所有組分全部流出，共出現(xiàn)2個峰，收集后標(biāo)記為組 分I和組分II。載片培養(yǎng)檢測收集液的生物活性，結(jié)果顯示:組分I對辣椒炭疽菌的附著胞形成的抑制作用與過柱前的效果一致，組分II無效果。組分I經(jīng)過HPLC檢測發(fā)現(xiàn)仍含有多種蛋白，需進(jìn)一步純化。
[0054]陰離子交換層析Q-Fastflow純化活性蛋白:采用AKTA層析系統(tǒng)，以Q-Fastflow層析柱為分離柱對活性組分I進(jìn)行進(jìn)一步純化。層析分離條件為:流動相A:0.01mM磷酸緩沖液(PB)，pH 7.4 ;流動相B:1M NaCl洗脫液(含流動相A);洗脫方式:線性梯度洗脫；洗脫時間:110min ;洗脫速度:lmL/min ;上樣量:2mL/min。洗脫結(jié)果見附圖5。
[0055]結(jié)果表明:從上樣至洗脫共出現(xiàn)三個峰，其中峰I為死體積峰，即鬼峰，峰II和峰III為IM NaCl洗脫峰。收集后分別標(biāo)記為組分1、組分II和組分III。生物活性檢測顯示:只有組分II有活性，組分I和組分III均無活性。
[0056]HPLC檢測活性蛋白的純度:應(yīng)用Agilentl200 HPLC檢測經(jīng)Q-Fastflow陰離子交換柱層析后，收集的活性組分II的純度。實(shí)驗(yàn)參數(shù)為:流動相A:含0.09% TFA的超純水；流動相B:含0.09% TFA的70%乙腈；流速:lmL/min ;進(jìn)樣量:20μ L ;柱子:C3柱(4.6mm*180mm)ο
[0057]經(jīng)HPLC系統(tǒng)過C3柱的檢測結(jié)果見圖6。由圖可知，活性蛋白經(jīng)過Q-Fastflow陰離子交換柱層析純化后，顯示單一峰，表明分離效果較好，組分較單一。
[0058]通過上述工作，初步建立了從C-D6菌株分離抑制辣椒炭疽菌附著胞形成的活性蛋白的實(shí)驗(yàn)方法。
【權(quán)利要求】
1.一株枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis )C_D6，其保藏編號為=CGMCC N0.5345。
2.如權(quán)利要求1所述的枯草芽孢桿菌C-D6，在抑制辣椒炭疽菌附著胞形成方面的應(yīng)用。
3.—種細(xì)菌培養(yǎng)液，包含權(quán)利要求1所述的枯草芽孢桿菌，其由以下步驟進(jìn)行培養(yǎng)而成: 1)斜面活化培養(yǎng)的C-D6菌株； 2)搖瓶培養(yǎng):將斜面活化培養(yǎng)的C-D6菌株接種到Y(jié)PD液體培養(yǎng)基中進(jìn)一步培養(yǎng)而得。
4.如權(quán)利要求3所述細(xì)菌培養(yǎng)液，其特征在于:所述培養(yǎng)步驟I中，是從枯草芽孢桿菌C-D6的保藏菌種斜面劃線接種到NA平板，37°C培養(yǎng)20-24 h，挑起單菌落接種到NA試管斜面，37°C培養(yǎng)20-24 h后，備用。
5.如權(quán)利要求3所述細(xì)菌培養(yǎng)液，其特征在于:所述培養(yǎng)步驟2中，是將C-D6菌株接種到裝有YPD液體培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，370C，180 r/min振蕩培養(yǎng)12 h后，按1%的接種量接種到相同培養(yǎng)瓶中，相同條件下震蕩培養(yǎng)48 h,從而獲得該細(xì)菌培養(yǎng)液。
6.如權(quán)利要求3所述細(xì)菌培養(yǎng)液，其特征在于:所述Yro培養(yǎng)基組成成分為:酵母膏10g/L,蛋白胨 10 g/L,葡萄糖 10 g/L, pH 7.0~7.2。
7.一種抗菌蛋白，是由權(quán)利要求1所述的枯草芽孢桿菌由以下分離純化方法獲得，該分離純化方法包括如下步驟: 1)枯草芽孢桿菌細(xì)菌培養(yǎng)液的準(zhǔn)備； 2)硫酸銨沉淀分離:細(xì)菌培養(yǎng)液經(jīng)20%飽和度(NH4)2S04沉淀后，離心沉淀蛋白，所得蛋白質(zhì)沉淀用磷酸緩沖液懸浮，并用相同緩沖液透析48h后，離心棄沉淀，即得抗菌蛋白粗提液； 3)抗菌蛋白純化:采用AKTA蛋白純化系統(tǒng)對蛋白粗提液進(jìn)行進(jìn)一步分離純化。
8.如權(quán)利要求7所述的抗菌蛋白，其特征在于:所述枯草芽孢桿菌細(xì)菌培養(yǎng)液的準(zhǔn)備進(jìn)一步是由以下步驟獲得: 1)斜面活化培養(yǎng)的C-D6菌株； 2)搖瓶培養(yǎng):將斜面活化培養(yǎng)的C-D6菌株接種到Y(jié)PD液體培養(yǎng)基中進(jìn)一步培養(yǎng)而得；所述YPD培養(yǎng)基組成成分為:酵母膏10 g/L，蛋白胨10 g/L，葡萄糖10 g/L, pH 7.0~7.2。
9.如權(quán)利要求7所述的抗菌蛋白，其特征在于:分離純化方法的步驟2具體為:所述經(jīng)20%飽和度(NH4)2SO4沉淀后，離心收集沉淀蛋白，所得蛋白質(zhì)沉淀用原體積1/15的磷酸緩沖液懸浮，并用相同緩沖液透析48h后，離心棄沉淀，即得抗菌蛋白粗提液；所述純化方法的步驟3具體為:以S印hadex G_75凝膠柱為分離柱，上樣量為5 mL，流動相為50mmol/L pH·6.0的磷酸緩沖溶液，洗脫速度為0.5 1^/1^11，洗脫1.2倍柱體積；S^)hadex G-75柱層析分離獲得的活性產(chǎn)物通過陰離子交換層析Q-Fastflow進(jìn)一步純化，獲得純化活性蛋白；所述Q-Fastflow的分離條件為:流動相A:0.01mM磷酸緩沖液(PB), pH 7.4;流動相B:1M NaCl洗脫液(含流動相A);洗脫方式:線性梯度洗脫；洗脫時間=IlOmin ;洗脫速度:lmL/min ;上樣量:2mL/min。
【文檔編號】C07K1/30GK103589657SQ201310210150
【公開日】2014年2月19日 申請日期:2013年5月31日 優(yōu)先權(quán)日:2013年5月31日
【發(fā)明者】曾大興, 吳小麗, 賈書娟, 張曉陽 申請人:深圳職業(yè)技術(shù)學(xué)院