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      芽孢桿菌屬中不具有分泌信號的多肽的生產(chǎn)的制作方法

      文檔序號:9568235閱讀:507來源:國知局
      芽孢桿菌屬中不具有分泌信號的多肽的生產(chǎn)的制作方法
      【專利說明】芽孢桿菌屬中不具有分泌信號的多肽的生產(chǎn) 發(fā)明領(lǐng)域
      [0001] 本發(fā)明涉及一種在芽孢桿菌屬宿主細胞中生產(chǎn)不具有分泌信號的天然非分泌多 肽并且無需進行裂解步驟來回收該天然非分泌多肽的方法;并且涉及包括一種或多種外源 或異源多核苷酸的芽孢桿菌屬宿主細胞,該一種或多種外源或異源多核苷酸編碼不具有分 泌信號的天然非分泌感興趣多肽。
      [0002] 發(fā)明背景
      [0003] 芽孢桿菌屬宿主細胞已經(jīng)被表征為工業(yè)制造各種感興趣多肽的主力,主要是因為 它們主動分泌具有所謂信號肽的多肽。該信號肽是一種小多肽,典型的是約20-30個氨基 酸,該小多肽在與待分泌多肽的N-末端的轉(zhuǎn)錄和翻譯融合體中表達。它引導(dǎo)該融合的多肽 進入適當配備的宿主細胞的分泌機構(gòu)中,于是該融合的多肽裂解,這時不具有其信號肽的 現(xiàn)已成熟的感興趣多肽被分泌進入周圍培養(yǎng)液中,該信號肽保留在細胞中并且被降解。
      [0004] 芽孢桿菌屬中重組生產(chǎn)的感興趣多肽的分泌能夠使得不用必須進行細胞裂解步 驟而直接從培養(yǎng)液中比較容易地回收多肽。在芽孢桿菌屬中,只有肯定會從細胞輸出至生 長培養(yǎng)基中的多肽是天然具有信號肽的。
      [0005] 然而,細胞中大多數(shù)的多肽不是肯定會輸出的,而是相反原本在細胞內(nèi)、周質(zhì)、膜 結(jié)合的等等。生產(chǎn)此類天然非分泌多肽通常被認為是繁重的,因為它們需要從宿主細胞內(nèi) 進行回收,這些宿主細胞通常需要凌雜的細胞溶解步驟,這導(dǎo)致了挑戰(zhàn)性的回收過程,或者 它們需要被表達為與異源性分泌信號一起的人工融合多肽,希望這將使得來自像芽孢桿菌 屬的宿主細胞能主動分泌,但這不是絕對能保證成功的。因此,在本領(lǐng)域存在著對以經(jīng)濟有 效的途徑生產(chǎn)天然非分泌多肽的方法的需要。
      [0006] 發(fā)明概述
      [0007] 與我們的預(yù)期相反,當天然細胞內(nèi)的或非分泌的酶在不具有信號肽的地衣芽孢桿 菌和枯草芽孢桿菌宿主中表達時,我們在上清液中發(fā)現(xiàn)了非常高水平的酶活性。這是一個 非常出人意料的結(jié)果并且是一個具有經(jīng)濟重要性的結(jié)果,因為這證實了天然非分泌多肽可 以在芽孢桿菌屬中產(chǎn)生并且可以無需昂貴的細胞裂解步驟直接從培養(yǎng)液中回收。
      [0008] 在以下實例1中,將過表達不具有信號肽的天然非分泌天冬酰胺酶(ASP)的枯草 芽孢桿菌菌株和過表達不具有信號肽的天然非分泌葡聚糖轉(zhuǎn)移酶(GT)的地衣芽孢桿菌菌 株或不具有信號肽的GFP變體,分別與不具有ASP/GT/GFP-變體編碼基因的對照菌株進行 比較。這些ASP、GT和GFP-變體編碼基因在沒有分泌信號的情況下進行表達,該分泌信號 另外被認為是芽孢桿菌屬細胞主動分泌所需要的。非常出人意料的是在芽孢桿菌屬宿主的 上清液中發(fā)現(xiàn)了高水平的酶活性。但是這是一個非常受歡迎的驚喜,我們可以在芽孢桿菌 屬宿主細胞中不必進行昂貴的裂解步驟,重組地生產(chǎn)在天然細胞內(nèi)的或非分泌的沒有信號 肽的多肽,因為這允許更加具有成本效益的生產(chǎn)。
      [0009] 因此,在第一方面,本發(fā)明提供了在芽孢桿菌屬宿主細胞中生產(chǎn)感興趣多肽的方 法,所述方法包括以下步驟:
      [0010] i)在生長培養(yǎng)基中,在有助于表達該多肽的條件下,培養(yǎng)包括一種或多種外源多 核苷酸的芽孢桿菌屬宿主細胞,該一種或多種外源多核苷酸編碼不具有分泌信號的天然非 分泌的感興趣多肽;并且
      [0011] ii)無需進行裂解步驟回收該多肽。
      [0012] 在第二方面,本發(fā)明涉及包括一種或多種外源或異源多核苷酸的重組體芽孢桿菌 屬宿主細胞,該一種或多種外源或異源多核苷酸編碼不具有分泌信號的天然非分泌的感興 趣多肽。
      [0013] 定義
      [0014] 等位基因變體:術(shù)語"等位基因變體"意指占用同一染色體位點的一種基因的兩個 或更多個替代形式中的任一者。等位基因變異由突變天然產(chǎn)生,并且可以導(dǎo)致群體內(nèi)的多 態(tài)性。基因突變可以是沉默的(在所編碼的多肽中沒有改變)或可編碼具有改變的氨基酸 序列的多肽。多肽的等位基因變體是由基因的等位基因變體編碼的多肽。
      [0015] 細胞裂解步驟:術(shù)語"細胞裂解步驟"意指一種在回收期間引入的加工步驟,以導(dǎo) 致芽孢桿菌屬細胞的裂解。實例包括向耗盡的發(fā)酵培養(yǎng)基添加酶,例如,溶菌酶;超聲處理; 均質(zhì)化、凍結(jié)并研磨,和珠磨裂解。
      [0016] 編碼序列:術(shù)語"編碼序列"意指直接指定一個多肽的氨基酸序列的多核苷酸。編 碼序列的邊界一般由一個開放閱讀框架決定,該開放閱讀框架從一個起始密碼子(如ATG、 GTG或TTG)開始并且以一個終止密碼子(如TAA、TAG或TGA)結(jié)束。編碼序列可以是一種 基因組DNA、cDNA、合成DNA或其組合。
      [0017] 控制序列:術(shù)語"控制序列"意指表達編碼本發(fā)明的成熟多肽的多核苷酸所必需的 核酸序列。每個控制序列對于編碼該多肽的多核苷酸來說可以是天然的(即,來自相同基 因)或外源的(即,來自不同基因),或相對于彼此是天然的或外源的。此類控制序列包括 但不限于前導(dǎo)子、聚腺苷酸化序列、前肽序列、啟動子、信號肽序列、以及轉(zhuǎn)錄終止子。至少, 控制序列包括啟動子,以及轉(zhuǎn)錄和翻譯終止信號。出于引入有利于將這些控制序列與編碼 一種多肽的多核苷酸的編碼區(qū)連接的特異性限制酶切位點的目的,這些控制序列可以提供 有多個接頭。
      [0018] 表達:術(shù)語"表達"包括涉及多肽產(chǎn)生的任何步驟,包括但不限于,轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后修 飾、翻譯、翻譯后修飾、以及分泌。
      [0019] 表達載體:術(shù)語"表達載體"意指一種直鏈或環(huán)狀DNA分子,該分子包括編碼一種 多肽的一種多核苷酸并且可操作地連接至提供用于其表達的控制序列。
      [0020] 宿主細胞:術(shù)語"宿主細胞"意指易于用包括本發(fā)明的一種多核苷酸的一種核酸構(gòu) 建體或表達載體進行轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)等的任何細胞類型。術(shù)語"宿主細胞"涵蓋由于復(fù)制 期間發(fā)生的突變而與親本細胞不同的親本細胞的任何后代。
      [0021] 分離的:術(shù)語"分離的"意指處于非天然存在的形式或環(huán)境中的物質(zhì)。分離的物 質(zhì)的非限制性實例包括:(1)任何非天然存在的物質(zhì);(2)至少部分地從與其天然相關(guān)聯(lián)的 一種或多種或所有天然存在的成分中去除的任何物質(zhì),包括但不限于任何酶、變體、核酸、 蛋白質(zhì)、肽或輔因子;(3)相對于在自然界中發(fā)現(xiàn)的那種物質(zhì)通過人工修飾的任何物質(zhì);或 (4)通過相對于與其天然相關(guān)聯(lián)的其他組分增加該物質(zhì)的量(例如,宿主細胞中的重組體 產(chǎn)量;編碼該物質(zhì)的基因的多個拷貝;以及比與編碼該物質(zhì)的基因天然相關(guān)聯(lián)的啟動子更 強的啟動子的使用)而修飾的任何物質(zhì)。
      [0022] 成熟多肽:術(shù)語"成熟多肽"意指在翻譯和任何翻譯后修飾如N-末端加工、C-末 端截短等之后處于其最終形式的多肽。本領(lǐng)域中已知的是,一個宿主細胞可以產(chǎn)生由同一 多核苷酸表達的兩種或更多種不同成熟多肽(即,具有不同C-末端和/或N-末端氨基酸) 的混合物。本領(lǐng)域還已知,不同的宿主細胞不同地加工多肽,并且因此一個表達一種多核苷 酸的宿主細胞當與另一個表達相同多核苷酸的宿主細胞相比時可以產(chǎn)生一種不同的成熟 多肽(例如,具有一個不同的C-末端和/或N-末端氨基酸)。
      [0023] 天然非分泌多肽:術(shù)語"天然非分泌多肽"意指通過其天然的、野生型來源胞內(nèi)產(chǎn) 生(即,非分泌)的多肽。在變體的情況下,術(shù)語"天然非分泌多肽"意指通過其天然的、野 生型來源胞內(nèi)產(chǎn)生(即,非分泌)的野生型多肽(該變體衍生自該野生型多肽)。
      [0024] 核酸構(gòu)建體:術(shù)語"核酸構(gòu)建體"意指單-鏈或雙鏈核酸分子,其分離自天然存在 的基因,或其被修飾成以本來在自然界中不存在的方式含有核酸的區(qū)段,或其為合成的,其 包括一個或多個控制序列。
      [0025] 可操作地連接:術(shù)語"可操作地連接"意指一種配置,其中一個控制序列相對于一 種多核苷酸的編碼序列放置在一個適當位置處,以使得控制序列指引編碼序列的表達。
      [0026] 序列一致性:兩個氨基酸序列之間或兩個核苷酸序列之間的相關(guān)性由參數(shù)"序列 一致性"描述。出于本發(fā)明的目的,使用如在EMBOSS包(EMBOSS :歐洲分子生物學(xué)開放軟 件套件(The European Molecular Biology Open Software Suite),賴斯(Rice)等人, 2000,遺傳學(xué)趨勢(Trends Genet.) 16:276-277)(優(yōu)選5.0.0版或更新版本)的尼德爾 (Needle)程序中所實施的尼德爾曼-翁施(Needleman-Wunsch)算法(Needleman(尼德爾 曼)和Wunsch (翁施),1970,分子生物學(xué)雜志(J. Mol. Biol.) 48:443-453)來確定兩個氨 基酸序列之間的序列一致性。所使用的參數(shù)是空位開放罰分10,空位延伸罰分〇. 5,以及 EBL0SUM62 (BL0SUM62的EMBOSS版本)取代矩陣。尼德爾標注的"最長的一致性"的輸出 (使用-非簡化選項獲得)被用作百分比一致性,并且如下計算:
      [0027] (一致的殘基X 100V(比對長度-比對中的空位總數(shù))
      [0028] 出于本發(fā)明的目的,使用如在EMBOSS包(EMBOSS :歐洲分子生物學(xué)開放軟件套件, 賴斯(Rice)等人,2000,見上文)(優(yōu)選5. 0. 0版或更新版本)的尼德爾程序中所實施的尼 德爾曼-翁施算法(尼德爾曼(Needleman)和翁施(Wunsch),1970,見上文)來確定兩個 脫氧核糖核苷酸序列之間的序列一致性。所使用的參數(shù)是空位開放罰分10,空位拓展罰分 0. 5,和EDNAFULL(NCBI NUC4. 4的EMBOSS版)取代矩陣。尼德爾標注的"最長的一致性"的 輸出(使用-非簡化選項獲得)被用作百分比一致性,并且如下計算:
      [0029] (-致的脫氧核糖核苷酸X 100)八比對長度-比對中的空位總數(shù))
      [0030] 變體:術(shù)語"變體"意指具有酶活性的且相比于其親本野生型或參照的氨基酸序列 在一個或多個(例如,若干個)位置處包含改變(即取代、插入、和/或缺失)的多肽。取 代意指占據(jù)一個位置的氨基酸替換不同的氨基酸;缺失意指去除占據(jù)一個位置的氨基酸; 并且插入意指在鄰接并且緊隨占據(jù)一個位置的氨基酸之后添加一個氨基酸。
      [0031] 成熟多肽的變體可以在一個或多個(例如,若干個)位置處包括取代、缺失和/或 插入。弓丨入成熟多肽中的氨基酸取代、缺失和/或插入的數(shù)目可以多達10個,例如1、2、3、 4、5、6、7、8、9或10個。這些氨基酸變化可以具有微小性質(zhì),8卩,不會顯著地影響蛋白質(zhì)的折 疊和/或活性的保守氨基酸取代或插入;典型地1-30個氨基酸的小缺失;小的氨基-或羧 基-末端延伸,如氨基末端的甲硫氨酸殘基;多達20-25個殘基的小接頭肽;或便于通過改 變凈電荷或另一種功能來純化的小延伸,如聚組氨酸段(tract)、抗原表位或結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
      [0032] 保守取代的實例是在下組的范圍內(nèi):堿性氨基酸(精氨酸、賴氨酸及組氨酸)、酸 性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、極性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸(亮 氨酸、異亮氨酸及纈氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸及酪氨酸)及小氨基酸(甘 氨酸、丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸及甲硫氨酸)。一般不會改變特異性活性的氨基酸取代是本 領(lǐng)域已知的并且例如由H.諾伊拉特(H.Neurath)和R. L.希爾(R. L.Hill),1979,在蛋白 質(zhì)(The Proteins),學(xué)術(shù)出版社,紐約中描述。常見的取代是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、 Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/ Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu、以及 Asp/Gly〇
      [0033] 可替代地,氨基酸改變具有這樣一種性質(zhì):改變多肽的物理化學(xué)特性。例如,氨基 酸改變可以提高多肽的熱穩(wěn)定性、改變底物特異性、改變最適pH,等等。
      [0034] 可以根據(jù)本領(lǐng)域中已知的程序,如定點誘變或丙氨酸掃描誘變(坎寧漢 (Cunningham)和威爾斯(Wells),1989,科學(xué)(Science) 244:1081-1085)來鑒定多肽中的必 需氨基酸。在后一項技術(shù)中,在該分子中的每個殘基處引入單個丙氨酸突變,并且對所得突 變體分子的酶活性進行測試以鑒定對于該分子的活性至關(guān)重要的氨基酸殘基。還參見,希 爾頓(Hilton)等人,1996,生物化學(xué)雜志(J. Biol. Chem.) 271:4699-4708。也可結(jié)合假定接 觸位點氨基酸的突變,如通過以下技術(shù)例如核磁共振、結(jié)晶學(xué)、電子衍射、或光親和標記進 行確定的對結(jié)構(gòu)進行物理學(xué)分析,從而確定酶的活性位點或其他生物學(xué)相互作用。參見例 如,德弗斯(de Vos)等人,1992,科學(xué)(Science) 255:306-312 ;史密斯(Smith)等人,1992, 分子生物學(xué)雜志(J. Mol. Biol. )224:899-904 ;烏樂達維爾(Wlodaver)等人,1992,歐洲生 化學(xué)會聯(lián)合會快報(FEBS Lett. )309:59-64。還可以從與相關(guān)多肽的比對來推斷鑒定必需 氨基酸。
      [0035] 可以做出單個或多個氨基酸取代、缺失和/或插入并且使用誘變、重組和/或改組 的已知方法進行測試,隨后進行相關(guān)篩選程序,如由里德哈爾-奧爾森(Reidhaar-Olson) 和薩奧爾(Sauer),1988,科學(xué)(Science) 241:53
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