腫瘤細(xì)胞特異性多克隆t細(xì)胞制備方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及分子生物學(xué)和細(xì)胞免疫學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及腫瘤細(xì)胞特異性多克 隆T細(xì)胞制備方法，通過該方法制備的腫瘤細(xì)胞特異性多克隆T細(xì)胞在預(yù)防或治療癌癥的 藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 目前，過繼性免疫細(xì)胞治療在治療黑色素瘤和血液系統(tǒng)的腫瘤中取得了突破性進(jìn) 展；因此，再次成為腫瘤免疫治療研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。國際上，選擇的效應(yīng)細(xì)胞主要包括腫瘤 浸潤(rùn)淋己細(xì)胞（tumor infiltrating lympho巧te, TIL)、腫瘤抗原或病毒抗原特異性細(xì) 胞毒性T細(xì)胞（巧totoxic T lympho巧te, CTL)和嵌合抗原受體修飾的T細(xì)胞（chimeric antigen receptor modified T lympho巧te, CART);國內(nèi)，臨床應(yīng)用的還主要是20世紀(jì)80 年代發(fā)明的細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞（巧tokine in化ced killer cell, CIK)及在此基礎(chǔ) 上改進(jìn)的樹突狀細(xì)胞活化的細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞（DC-CIK)。CIK及DC-CIK細(xì)胞制備工 藝相對(duì)簡(jiǎn)單、很容易在臨床進(jìn)行規(guī)?；茝V，但由于其主要通過非特異性機(jī)制殺傷腫瘤細(xì) 胞，目前的臨床結(jié)果顯示，療效非常有限。TIUCTL和CART在臨床上取得了很好的臨床治療 效果，但是TIL卻存在取材困難，而且需要經(jīng)過1~2個(gè)月較長(zhǎng)時(shí)間的培養(yǎng)，因此，很難在臨床 規(guī)?；茝V應(yīng)用；CTL細(xì)胞的制備，首先分離出腫瘤或者病毒特異性抗原，然后分離單核細(xì) 胞誘導(dǎo)DC，在此過程中加入特異性抗原，使成熟的DC最后能夠通過主要組織相容性復(fù)合體 (major histocompatibility complex, MHC)編碼的 I、II 類分子的形式遞呈到 DC 表面， 然后與T細(xì)胞共培養(yǎng)誘導(dǎo)CTL細(xì)胞的產(chǎn)生，整個(gè)過程中涉及到抗原制備、DC和T細(xì)胞分離 培養(yǎng)，因此工藝較為復(fù)雜；CART的制備目前主要方式是通過慢病毒載體進(jìn)行基因修飾，工 藝流程更為復(fù)雜，而且成本高昂，因此，目前還處于臨床試驗(yàn)階段，很難在臨床規(guī)?；瘧?yīng)用。 最近研究顯示，慢性淋己細(xì)胞白血?。–虹onic lympho巧tic leukemia,化L)患者來源的 外周血單個(gè)核細(xì)胞（Peripheral blood mononuclear cell, PBMC)，在體外培養(yǎng)中加入一種 雙碑1 向特異性抗體（Bispecific Antibody, BsAb)的藥物 blinatumomab (CD3XCD19),同 時(shí)加入IL-2,能夠消除PBMC中的白血病細(xì)胞，同時(shí)誘導(dǎo)的多克隆T細(xì)胞能夠顯示出較強(qiáng)的 殺瘤效應(yīng)（Golay等，2014)。但該技術(shù)使用的雙祀向特異性抗體涉及到在體外進(jìn)行生產(chǎn)、純 化、包裝、運(yùn)輸、保存等環(huán)節(jié)，因此成本高昂、并且費(fèi)時(shí)費(fèi)力；此外，該技術(shù)制備的多克隆T細(xì) 胞僅針對(duì)B細(xì)胞系腫瘤，應(yīng)用范圍非常有限。因此，如何克服上述系列技術(shù)的限制性，開發(fā) 出一種能夠針對(duì)大部分腫瘤甚至全部腫瘤類型的、工藝簡(jiǎn)單、成本低廉的腫瘤特異性T細(xì) 胞制備通用技術(shù)，則是目前腫瘤免疫治療面臨的關(guān)鍵問題和難題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 為解決上述問題，本發(fā)明提供了 一種腫瘤細(xì)胞特異性多克隆T細(xì)胞（tumor specific polyclonal T lymphocyte, TSPT)的制備方法及其在預(yù)防或治療癌癥的藥物中 的應(yīng)用。
[0004] 第一方面，本發(fā)明提供了 TSPT細(xì)胞的制備方法，所述TSPT細(xì)胞是通過獲取PBMC 然后用基因修飾腫瘤細(xì)胞與獲取的PBMC共培養(yǎng)制備所得。盡管獲取PBMC和體外制備特異 性T細(xì)胞的方法已經(jīng)很多，但目前還沒有描述通過對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行雙重基因修飾，修飾的 腫瘤細(xì)胞能同時(shí)表達(dá)分泌型基因工程抗體（Genetic engineering Antibody, GeAb)和膜 結(jié)合型祀抗原（Target Antigen, TAg)，然后用上述基因修飾腫瘤細(xì)胞與PBMC共培養(yǎng)獲取 TSPT細(xì)胞的組合型方法。上述組合中，制備TSPT細(xì)胞的原理是：基因修飾腫瘤細(xì)胞能夠分 泌GeAb同時(shí)又能表達(dá)膜結(jié)合型TAg，在與PBMC混合培養(yǎng)的過程中，GeAb通過識(shí)別TAg和T 細(xì)胞，將二者較鏈在一起，從而有利于基因修飾腫瘤細(xì)胞對(duì)T細(xì)胞的抗原遞呈，然后進(jìn)一步 刺激、活化和擴(kuò)增T細(xì)胞形成TSPT細(xì)胞，培養(yǎng)過程中基因修飾腫瘤細(xì)胞被殺死；對(duì)腫瘤抗原 明確的腫瘤細(xì)胞來說，進(jìn)行基因修飾表達(dá)TAg,起到了強(qiáng)化抗原抗體特異性識(shí)別的作用，而 對(duì)腫瘤抗原不明確的腫瘤細(xì)胞來說，通過選擇一個(gè)已知的TAg進(jìn)行修飾，則起到了架起抗 原抗體特異性識(shí)別的作用。因此該技術(shù)方案，解決了目前大部分腫瘤抗原不明確或者表達(dá) 量低的腫瘤細(xì)胞無法與T細(xì)胞識(shí)別進(jìn)而誘導(dǎo)特異性T細(xì)胞產(chǎn)生的技術(shù)難題。該方法包括如 下步驟；首先采集外周靜脈血，然后用聚藏糖-泛影葡糖胺密度梯度離也法分離獲取PBMC， 將上述PBMC與基因修飾腫瘤細(xì)胞進(jìn)行混合，然后在含有重組人白介素-2 (Recombinant Human Interleukin-2, rh]X-2)的培養(yǎng)基中共培養(yǎng)。隨后每2~3天，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，然 后用含有rhIL-2的新鮮培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞到適宜密度后繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)9~20天后，所收集的 細(xì)胞即為TSPT細(xì)胞。
[0005] 優(yōu)選地，初始培養(yǎng)PBMC和基因修飾腫瘤細(xì)胞的密度分別均為（0. 5 ~2) X l〇6/ml， 兩者混合的體積比為0. 1~10。
[0006] 進(jìn)一步優(yōu)選地，初始培養(yǎng)PBMC和基因修飾腫瘤細(xì)胞的密度分別均為1 X l〇6/ml，兩 者混合的體積比為1。
[0007] 優(yōu)選地，使用rh比-2的終濃度為50 ~ 1000 lU/ml。
[0008] 進(jìn)一步優(yōu)選地，使用rh比-2的終濃度為300 lU/ml。
[0009] 優(yōu)選地，隨后每2~3天，細(xì)胞培養(yǎng)的適宜密度為（0.5 ~ 3) Xl〇6/ml。
[0010] 進(jìn)一步優(yōu)選地，隨后每2~3天，細(xì)胞培養(yǎng)的適宜密度為IX l〇6/ml。
[0011] 第二方面，本發(fā)明提供了一種基因修飾腫瘤細(xì)胞的制備方法，所述基因修飾腫瘤 細(xì)胞可W通過同時(shí)具有編碼GeAb和TAg (GeAb. TAg)基因的載體轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞獲得。
[001引優(yōu)選地，所述GeAb基因具有編碼GeAb的堿基序列，所述GeAb為BsAb，所述BsAb 具有祀向T細(xì)胞抗原表位的結(jié)合位點(diǎn)和腫瘤細(xì)胞表面抗原表位結(jié)合位點(diǎn)的分泌型BsAb。
[0013] 優(yōu)選地，所述TAg基因是具有編碼TAg的堿基序列，所述TAg選之組織特異性分化 抗原、致癌病毒表達(dá)的腫瘤抗原、突變基因或癌基因的表達(dá)產(chǎn)物、異常表達(dá)的細(xì)胞蛋白和胚 胎抗原中的一種。
[0014] 優(yōu)選地，所述載體選之慢病毒表達(dá)載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺相關(guān)病毒載體、腺病 毒載體、非復(fù)制型病毒載體、復(fù)制型病毒載體和睡美人轉(zhuǎn)座子等中的一種。
[0015] 優(yōu)選地，所述腫瘤細(xì)胞選之肝癌、肺癌、胃癌、食管癌、腸癌、宮頸癌、乳腺癌和鼻咽 癌等腫瘤細(xì)胞中的一種。
[0016] 第H方面，本發(fā)明提供了一種編碼GeAb. TAg基因載體的構(gòu)建方法，所述具有編碼 GeAb. TAg基因的載體是在載體的多克隆位點(diǎn)（MCS)中插入GeAb. TAg基因序列組合而成，所 述GeAb.TAg基因序列包括依次連接的編碼免疫球蛋白K鏈信號(hào)膚的堿基序列、編碼Flag 標(biāo)簽的堿基序列、GeAb的堿基序列、編碼組氨酸化s6標(biāo)簽的堿基序列、P2A的堿基序列、TAg 基因和終止密碼子。
[0017] 優(yōu)選地，所述載體選之慢病毒表達(dá)載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺相關(guān)病毒載體、腺病 毒載體、非復(fù)制型病毒載體、復(fù)制型病毒載體和睡美人轉(zhuǎn)座子等中的一種。
[0018] 進(jìn)一步優(yōu)選地，所述載體為慢病毒表達(dá)載體。
[0019] 優(yōu)選地，所述免疫球蛋白K鏈信號(hào)膚的堿基序列如SEQ ID NO: 1所示。
[0020] 優(yōu)選地，所述Flag標(biāo)簽的堿基序列如SEQ ID NO: 2所示。
[0021] 優(yōu)選地，所述GeAb基因?yàn)锽sAb基因。
[0022] 進(jìn)一步優(yōu)選地，所述BsAb的基因由編碼抗CD20抗體的單鏈抗體（single-chain antibody fragment, scFv)基因和編碼抗CD3的scFv基因通過短鏈（GGGGS)鏈接而成 (CD20XCD3)。
[0023] 進(jìn)一步優(yōu)選地，所述BsAb的堿基