帶有DARPin的雙特異性嵌合蛋白的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及雙特異性嵌合蛋白,其包括經(jīng)設(shè)計(jì)的錨蛋白重復(fù)蛋白(DARPin),以及與所述DARPin相連的IgG抗體,scFv-Fc抗體片段,或其組合;用其治療或預(yù)防癌癥的方法,以及相關(guān)的方法和組合物。KCLRF-BP-002202009.10.06
【專利說明】帶有DARPin的雙特異性嵌合蛋白
[0001] 發(fā)明背景
[0002] 1.發(fā)明領(lǐng)域
[0003] 本文涉及含有經(jīng)設(shè)計(jì)的錨蛋白重復(fù)蛋白(DARPin)的雙特異性嵌合蛋白,以及相 關(guān)的方法和組合物。
[0004] 2.相關(guān)技術(shù)的描述
[0005] 在活細(xì)胞中,各種蛋白彼此相互作用,參與各種致病機(jī)制。如果有至少兩種這樣的 致病蛋白被同時(shí)抑制,相比于僅有單一蛋白被抑制的情況而言,就有更大的可能性來治療 和預(yù)防疾病。為此,研發(fā)了多種能抑制至少兩種蛋白的抗體。
[0006] 盡管研發(fā)出數(shù)種雙特異性抗體,其中大多數(shù)不能在商業(yè)上用作抗體藥物,因?yàn)樗?們的療效未經(jīng)臨床驗(yàn)證或者觀察到了多種副作用。此外,所研發(fā)的雙特異性抗體在穩(wěn)定性 和產(chǎn)量方面有不足,這對于商業(yè)應(yīng)用而言也是障礙。早期研發(fā)的具有IgG形式的雙特異性 抗體難以分離和純化,因?yàn)樵谏a(chǎn)過程中輕鏈和重鏈隨機(jī)組合,導(dǎo)致大規(guī)模生產(chǎn)中的諸多 問題。而且,在非IgG的雙特異性抗體的情形中,與蛋白折疊、藥效學(xué)等無關(guān)的作為藥物的 穩(wěn)定性也沒有得到驗(yàn)證。
[0007] 因此,需要研發(fā)在活體內(nèi)穩(wěn)定性增強(qiáng)、且作為藥物有改進(jìn)特性的雙特異性抗體。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0008] 本申請?zhí)峁┝穗p特異性嵌合蛋白(雙特異性抗體偶聯(lián)物),其包括抗體(例如IgG 抗體)和/或抗體片段(例如ScFv-Fc抗體片段)、以及與其相連的經(jīng)設(shè)計(jì)的錨蛋白重復(fù)蛋 白(DARPin),本發(fā)明還提供了包含所述抗體和可藥用載體的藥物組合物。所述的雙特異性 嵌合蛋白或雙特異性抗體偶聯(lián)物可以用作雙特異性抗體。
[0009] 本申請還提供了制備所述雙特異性嵌合蛋白的方法,其通過將DARPin與抗體(例 如IgG抗體)和/或抗體片段(例如ScFv-Fc抗體片段)相連來實(shí)現(xiàn),或通過在細(xì)胞中表 達(dá)編碼所述雙特異性嵌合蛋白的核酸來實(shí)現(xiàn)。
[0010] 本申請還提供了用于治療或預(yù)防癌癥的所述雙特異性嵌合蛋白,或者所述雙特異 性嵌合蛋白在治療或預(yù)防癌癥方面的用途。
[0011] 此外,本申請還提供了用于增強(qiáng)雙特異性嵌合蛋白的抗癌效力的DARPin,或者 DARPin用于增強(qiáng)雙特異性嵌合蛋白的抗癌效力的用途,是與未連接DARPin的抗體或抗體 片段相比。
[0012] 本申請還提供了相關(guān)的組合物和方法,可以從下文的詳述中更清楚地了解。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0013] 圖1圖示了根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案用抗EGFRDARPin制備多種雙特異性抗體偶聯(lián)物的 過程。
[0014] 圖2圖示了根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案用抗EGFRDARPin制備多種雙特異性抗體偶聯(lián)物的 過程。
[0015] 圖3圖示了根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案制備抗c-Met/抗EGFR雙特異性嵌合蛋白的過程。
[0016] 圖4圖示了根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案的抗C-Met/抗EGFR雙特異性嵌合蛋白在溶液中展 示的穩(wěn)定性特性。
[0017] 圖5圖示了根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案的抗-c-Met/抗-EGFR雙特異性嵌合蛋白與EGF在 競爭性ELISA試驗(yàn)中的競爭。
[0018] 圖6圖示了根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案的抗-C-Met/抗-EGFR雙特異性嵌合蛋白在A431 細(xì)胞中抑制EGFR磷酸化的程度。
[0019] 圖7圖示了根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案的抗-C-Met/抗-EGFR雙特異性嵌合蛋白對SNU5 細(xì)胞增殖的抑制程度。
[0020] 圖8圖示了根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案的抗-c-Met/抗-EGFR雙特異性嵌合蛋白對MKN45 細(xì)胞增殖的抑制程度。
[0021] 圖9圖示了根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案的抗-C-Met/抗-EGFR雙特異性嵌合蛋白對H1993 細(xì)胞增殖的抑制程度。
[0022] 圖10圖示了根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案的抗-c-Met/抗-EGFR雙特異性嵌合蛋白對A431 細(xì)胞增殖的抑制程度。
[0023] 圖11的熒光圖像顯示了根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案的抗-c-Met/抗-EGFR雙特異性嵌合 蛋白對c-Met和EGFR的內(nèi)在化。
[0024] 圖12圖示了根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案的抗-c-Met/抗-EGFR雙特異性嵌合蛋白的 c-Met(上圖)和EGFR(下圖)表達(dá)量。
[0025] 圖13圖示了根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案制備抗HER2/抗-EGFR雙特異性嵌合蛋白的過程。
[0026] 圖14圖示了根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案的抗HER2/抗EGFR雙特異性嵌合蛋白展示的穩(wěn)定 性特性。
[0027] 圖15圖示了根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案的抗HER2/抗-EGFR雙特異性嵌合蛋白對MKN45 細(xì)胞增殖的抑制程度。
[0028] 圖16的熒光圖像顯示了根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案的抗HER2/抗-EGFR雙特異性嵌合蛋 白對HER2和EGFR的內(nèi)在化。
[0029] 圖17圖示了根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案制備抗HER3/抗-EGFR雙特異性嵌合蛋白的過程。
[0030] 圖18圖示了根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案的抗HER3/抗EGFR雙特異性嵌合蛋白展示的穩(wěn)定 性特性
[0031] 圖19圖示了根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案制備抗c-Met/抗-EGFR(E01+E69)DARPin雙特異 性嵌合蛋白的過程。
[0032] 圖20圖示了根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案的抗c-Met/抗-EGFR(E01+E69)DARPin雙特異性 嵌合蛋白展示的穩(wěn)定性特性。
[0033] 圖2IA至2IG展示了各種DARPin的核苷酸序列。
【具體實(shí)施方式】
[0034] 已研發(fā)出多種類型和形式的雙特異性抗體,且由于這些抗體結(jié)合至少兩種抗原的 能力,可預(yù)期其與早已存在的單克隆抗體相比具有出色的治療效果。本文通過將DARPin與 IgG抗體或其片段結(jié)合提供了雙特異性嵌合蛋白。
[0035] DARPin(經(jīng)設(shè)計(jì)的錨蛋白重復(fù)蛋白;見第5章"DesignedAnkyrinRepeat Proteins(DARPins):FromResearchtoTherapy",MethodsinEnzymology,vol503:101~ 134(2012)^"EfficientSelectionofDARPinswithSub-nanomolarAffinitiesusing SRPPhageDisplay",J.Mol.Biol. (2008) 382, 1211-1227,其全部公開內(nèi)容引入本文作為 參考)是指具有對靶蛋白的高特異性和高結(jié)合親和力的抗體模擬蛋白,其通過基因工程制 備。DARPin起源于天然的錨蛋白,且具有包含至少2個(gè)錨蛋白重復(fù)基元(例如,包含至少 3、4或5個(gè)錨蛋白重復(fù)基元)的結(jié)構(gòu)。根據(jù)重復(fù)基元的數(shù)量,DARPin可具有任何適宜的分 子量。例如,包含3、4、或5個(gè)錨蛋白重復(fù)基元的DARPin可分別具有約10kDa、約14kDa、或 約18kDa的分子量。
[0036] DARPin包括提供結(jié)構(gòu)的核心部分和位于該核心外且結(jié)合靶標(biāo)的靶結(jié)合部分。該結(jié) 構(gòu)性核心包括保守的氨基酸序列而該靶結(jié)合部分包括根據(jù)靶標(biāo)而相區(qū)別的氨基酸序列。
[0037] 下表中總結(jié)了DARPin的實(shí)例且圖21A-21G圖釋了其核苷酸序列:
[0038]
【權(quán)利要求】
1. 一種雙特異性嵌合蛋白,包含: 設(shè)計(jì)的錨蛋白重復(fù)蛋白(DARPin),和 與DARPin連接的IgG抗體、scFv-Fc抗體片段、或其組合。
2. 依照權(quán)利要求1的雙特異性嵌合蛋白,其中所述DARPin是抗EGFR DARPin。
3. 依照權(quán)利要求1的雙特異性嵌合蛋白,包含: 抗 EGFR DARPin,和 與所述DARPin連接的抗c-Met IgG抗體、抗c-Met scFv-Fc抗體片段、或其組合。
4. 依照權(quán)利要求2或3的雙特異性嵌合蛋白,其中所述抗EGFR DARPin包含SEQ ID NO: 109、SEQ ID NO: 110、SEQ ID NO: 111、或 SEQ ID NO: 112 的一種或多種,任選地,其中任 一種重復(fù)2至10次。
5. 依照權(quán)利要求3或4的特異性嵌合蛋白,其中所述抗c-Met抗體或抗體片段包含: 選自下組的至少一種重鏈互補(bǔ)決定區(qū)(⑶R):(a)⑶R-H1,其包含SEQ ID N0:4的氨基 酸序列;(b)CDR_H2,其包含,SEQ ID NO:5的氨基酸序列,SEQ ID NO:2的氨基酸序列,或具 有SEQ ID N0:2的8-19個(gè)連續(xù)氨基酸且包含SEQ ID N0:2第3位到第10位氨基酸殘基的 氨基酸序列;和(c)CDR_H3,其包含,SEQ ID N0:6的氨基酸序列,SEQ ID N0:85的氨基酸序 列,或具有SEQ ID NO: 85的6-13個(gè)連續(xù)氨基酸且包含SEQ ID NO: 85第1位到第6位氨基 酸殘基的氨基酸序列; 選自下組的至少一種輕鏈互補(bǔ)決定區(qū):(a)⑶R-L1,包含SEQ ID N0:7的氨基酸序列, 〇3)0?-12,包含5£〇10勵(lì):8的氨基酸序列,和((3)0)1?-13,其包含,5£〇10勵(lì):9的氨基酸 序列,SEQ ID NO: 86的氨基酸序列,或具有SEQ ID NO: 89的9-17個(gè)連續(xù)氨基酸且包含SEQ ID N0:89第1位到第9位氨基酸殘基的氨基酸序列;或者所述至少一種重鏈互補(bǔ)決定區(qū)和 所述至少一種輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)的組合。
6. 依照權(quán)利要求5的雙特異性嵌合蛋白,其中 所述〇?-111包含5£0 10勵(lì):1、5£0 10勵(lì):22、5£0 10勵(lì):23、或5£0 10勵(lì):24的氨 基酸序列, 所述〇?-112包含5£0 10勵(lì):2、5£0 10勵(lì):25、或5£0 10勵(lì):26的氨基酸序列, 所述〇?-113包含5£0 10勵(lì):3、5£0 10勵(lì):27、5£0 10勵(lì):28、或5£0 10勵(lì):85的氨 基酸序列;和 所述 CDR-L1 包含 SEQ ID N0:10、SEQ ID N0:29、SEQ ID N0:30、SEQ ID N0:31、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 33、或 SEQ ID NO:106 的氨基酸序列, 所述〇?-12包含5£0 10勵(lì):11、5£0 10勵(lì):34、5£0 10勵(lì):35、或5£0 10勵(lì):36的氨 基酸序列,和 所述 CDR-L3 包含 SEQ ID N0:12、SEQ ID N0:13、SEQ ID N0:14、SEQ ID N0:15、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 37、SEQ ID NO:86、或 SEQ ID NO:89 的氨基酸序列。
7. 依照權(quán)利要求5的雙特異性嵌合蛋白,其中所述抗c-Met抗體或抗體片段包含: 重鏈,包含以下:SEQ ID N0:62的氨基酸序列,從SEQ ID N0:62的第18位至第462位 的氨基酸序列,SEQ ID N0:64的氨基酸序列,從SEQ ID N0:64的第18位至第461位的氨 基酸序列,SEQ ID N0:66的氨基酸序列,或從SEQ ID N0:66的第18位至第460位的氨基 酸序列;和 輕鏈,包含以下:SEQ ID N0:68的氨基酸序列,從SEQ ID N0:68的第21位至第240位 的氨基酸序列,SEQ ID NO:70的氨基酸序列,從SEQ ID NO:70的第21位至第240位的氨 基酸序列,或SEQ ID NO: 108的氨基酸序列。
8. -種用于預(yù)防或治療癌癥的藥物組合物,其包含權(quán)利要求2至7中任一項(xiàng)的雙特異 性嵌合蛋白。
9. 一種制備雙特異性嵌合蛋白的方法,包括: 將i)DARPin和ii) IgG抗體、scFv-Fc抗體片段或其組合連接;或 在細(xì)胞中表達(dá)編碼所述雙特異性嵌合蛋白的核酸。 10?權(quán)利要求 9 的方法,其中所述 DARPin 包含 SEQ ID N0:109、SEQ ID N0:110、SEQ ID NO: 111、或SEQ ID NO: 112的一種或多種,任選地,其中任一種重復(fù)2至10次。
11. 權(quán)利要求9或10的方法,其中所述抗體或抗體片段是抗c-Met抗體或其抗體片段。
12. 權(quán)利要求11的方法,其中所述抗c-Met抗體或抗體片段包含: 選自下組的至少一種重鏈互補(bǔ)決定區(qū)(⑶R):(a)⑶R-H1,包含SEQ ID N0:4的氨基酸 序列;(b)CDR-H2,其包含,SEQ ID N0:5的氨基酸序列,SEQ ID N0:2的氨基酸序列,或具有 SEQ ID NO: 2的8-19個(gè)連續(xù)氨基酸且包含SEQ ID NO: 2第3位到第10位氨基酸殘基的氨 基酸序列;和(c)⑶R-H3,其包含,SEQ ID NO:6的氨基酸序列,SEQ ID NO:85的氨基酸序 列,或具有SEQ ID NO: 85的6-13個(gè)連續(xù)氨基酸且包含SEQ ID NO: 85第1位到第6位氨基 酸殘基的氨基酸序列; 選自下組的至少一種輕鏈互補(bǔ)決定區(qū):(a)⑶R-L1,包含SEQ ID NO: 7的氨基酸序列, 〇3)0?-12,包含5£〇10勵(lì):8的氨基酸序列,和((3)0)1?-13,其包含,5£〇10勵(lì):9的氨基酸 序列,SEQ ID NO: 86的氨基酸序列,或具有SEQ ID NO: 89的9-17個(gè)連續(xù)氨基酸且包含SEQ ID NO:89第1位到第9位氨基酸殘基的氨基酸序列;或 所述至少一種重鏈互補(bǔ)決定區(qū)和所述至少一種輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)的組合。
13. 權(quán)利要求11或12的方法,其中所述雙特異性嵌合蛋白的抗癌功效相比于沒有所述 DARPin與其連接的所述抗c-Met抗體或抗體片段增強(qiáng)。
14. 編碼權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)的雙特異性嵌合蛋白的核酸,任選地在載體中。
15. 包含權(quán)利要求14的核酸的細(xì)胞。
【文檔編號(hào)】C07K19/00GK104341529SQ201410363385
【公開日】2015年2月11日 申請日期:2014年7月28日 優(yōu)先權(quán)日:2013年7月26日
【發(fā)明者】鄭光鎬, 李承炫, 高榮晙, 金罠京, 黃載雄, 趙美英, 李政昱, 林柏瑋 申請人:三星電子株式會(huì)社