一種4-氨基芐基磷酸二乙酯完全抗原的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種4-氨基芐基磷酸二乙酯完全抗原的制備方法，包括以下步驟：（1）制備載體蛋白溶液；（2）將載體蛋白溶液和橋聯(lián)劑溶液混合并4℃避光攪拌30分鐘；（3）用0.01M磷酸鹽緩沖液透析或者超濾除去載體蛋白溶液和橋聯(lián)劑溶液混合液中游離的橋聯(lián)劑，得到活化后的載體蛋白溶液；（4）抗原溶液緩慢滴入活化后的載體蛋白溶液中，4℃攪拌20小時(shí)以上，經(jīng)透析、脫鹽或者超濾除去游離抗原，得偶聯(lián)物，對(duì)偶聯(lián)物進(jìn)行還原。本發(fā)明提供了一種制備方法簡(jiǎn)單、生產(chǎn)周期短，生產(chǎn)成本低的4-氨基芐基磷酸二乙酯完全抗原的制備方法，解決了有機(jī)磷類物質(zhì)是小分子結(jié)構(gòu)，不具備免疫原性，激發(fā)不了動(dòng)物免疫反應(yīng)產(chǎn)生抗體的問題。
【專利說明】一種4-氨基芐基磷酸二乙酯完全抗原的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于免疫學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體的是一種4-氨基芐基磷酸二乙酯完全抗原的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]有機(jī)磷農(nóng)藥屬有機(jī)磷酸酯類的一組化合物，是目前廣泛應(yīng)用于防治糧、棉、水果及蔬菜蟲害的農(nóng)藥。對(duì)人畜具有毒性，在生產(chǎn)和使用過程中不注意防護(hù)，可引起中毒。雖然與已禁用的有機(jī)氯農(nóng)藥相比其在環(huán)境中降解快，殘毒低，但由于使用量大，加上違章非正常操作，不僅糧食、蔬菜農(nóng)藥殘留問題日漸突出，在生產(chǎn)和使用這些農(nóng)藥的過程中殘留的農(nóng)藥會(huì)將污染延伸到環(huán)境水體中，對(duì)地表水、地下水造成污染。目前有機(jī)磷農(nóng)藥殘留檢測(cè)方法主要有兩大類——色譜檢測(cè)法和快速檢測(cè)法。色譜檢測(cè)法是目前農(nóng)藥殘留主要的檢測(cè)方法，包括氣相色譜法、高效液相色譜法、毛細(xì)管電泳法、薄層色譜法。其特點(diǎn)是檢測(cè)時(shí)間稍長(zhǎng)，但檢測(cè)精度高，可為農(nóng)藥殘留執(zhí)法提供依據(jù)。農(nóng)藥殘留快速檢測(cè)法是一類快速檢測(cè)農(nóng)藥殘留的方法，包括免疫分析技術(shù)、酶抑制法等。
[0003]有機(jī)磷的免疫法檢測(cè)不僅方法簡(jiǎn)便，成本低廉，而且靈敏度高。但建立高效的免疫法檢測(cè)需要高品質(zhì)的抗原和抗體。但是，有機(jī)磷類化合物均是小分子，不具備免疫原性，不能直接產(chǎn)生抗體。因此，需要一種簡(jiǎn)單可靠的方法，合成一種能夠激發(fā)動(dòng)物產(chǎn)生抗體的完全抗原。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是為了解決上述`技術(shù)問題，提供一種制備方法簡(jiǎn)單、生產(chǎn)周期短，生產(chǎn)成本低的用于有機(jī)磷抗體制備和免疫學(xué)檢測(cè)的完全抗原。
[0005]本發(fā)明是在分析了大量常用的有機(jī)磷農(nóng)藥結(jié)構(gòu)的情況下，應(yīng)用4-氨基芐基磷酸二乙酯(DAP)作為半抗原，制備完全抗原。其特點(diǎn)是具備大部分有機(jī)磷的共同結(jié)構(gòu)，并且結(jié)構(gòu)相對(duì)復(fù)雜。采用戊二醛作為橋聯(lián)劑，將4-氨基芐基磷酸二乙酯(DAP)通過五個(gè)碳的橋與載體蛋白連接，從而使半抗原完全暴露在載體蛋白的表面，有利于抗體的識(shí)別，免疫原性得到增強(qiáng)，有利于動(dòng)物產(chǎn)生抗體。
[0006]本發(fā)明提供的技術(shù)方案是:
[0007]—種4-氨基芐基磷酸二乙酯完全抗原的制備方法，包括以下步驟:
[0008](I)將4-氨基芐基磷酸二乙酯溶于去離子水制備抗原溶液，戊二醛溶于去離子水制備橋聯(lián)劑溶液，載體蛋白溶于PH9.6的0.05M碳酸鹽緩沖液制備載體蛋白溶液；
[0009](2)將載體蛋白溶液和橋聯(lián)劑溶液混合并4°C避光攪拌30分鐘；
[0010](3)用0.01M磷酸鹽緩沖液透析或者超濾除去載體蛋白溶液和橋聯(lián)劑溶液混合液中游離的橋聯(lián)劑，得到活化后的載體蛋白溶液；
[0011](4)抗原溶液緩慢滴入活化后的載體蛋白溶液中，4°C攪拌20小時(shí)以上，經(jīng)透析、脫鹽或者超濾除去游離抗原，得偶聯(lián)物；[0012](5 )加NaBH4溶液還原偶聯(lián)物。
[0013]進(jìn)一步，步驟(1)中，所述載體為含有游離氨基的蛋白大分子。
[0014]進(jìn)一步，所述的蛋白大分子為牛血清白蛋白或者卵清蛋白或者牛丙種球蛋白或者鑰孔血藍(lán)蛋白。
[0015]進(jìn)一步，所述步驟(1)中，所述抗原溶液濃度為lOmmol/L，載體蛋白溶液濃度為0.5mmol/L,橋聯(lián)劑溶液濃度為50mmol/L。
[0016]進(jìn)一步，所述步驟(2)中按照血管緊張素與載體蛋白摩爾比10-20:1的比例。
[0017]采用紫外分光光度計(jì)對(duì)載體蛋白、未偶聯(lián)小分子、偶聯(lián)物在200_500nm之間進(jìn)行掃描，在同坐標(biāo)下進(jìn)行圖形比對(duì)，在偶聯(lián)物和載體蛋白對(duì)照濃度相同的情況下，如果偶聯(lián)物的特征峰與載體蛋白特征峰及實(shí)驗(yàn)對(duì)照組特征峰相比發(fā)生明顯偏移，說明偶聯(lián)成功。
[0018]實(shí)驗(yàn)對(duì)照組按照上述步驟(1) - (5)制備，只是不添加抗原溶液。 [0019]戊二醛法原理:戊二醛是一種常用交聯(lián)劑，兩端的醛基均可與伯氨基縮合。本方法就是利用其交聯(lián)劑的特性，將4-氨基芐基磷酸二乙酯(DAP)的氨基及載體蛋白中的伯氨基交聯(lián)在一起。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是提供一種制備方法簡(jiǎn)單、生產(chǎn)周期短，生產(chǎn)成本低的用于4-氨基芐基磷酸二乙酯抗體制備和免疫學(xué)檢測(cè)的完全抗原，直接應(yīng)用于免疫檢測(cè)。
【專利附圖】

【附圖說明】:
[0020]圖1是偶聯(lián)物通過分光光度計(jì)掃描鑒定圖【具體實(shí)施方式】:
[0021]實(shí)施例1 4-氨基芐基磷酸二乙酯與載體蛋白BSA偶聯(lián)
[0022](I)將4-氨基芐基磷酸二乙酯溶于去離子水制備抗原溶液，載體蛋白BSA溶于去離子水制備載體蛋白溶液，戊二醛溶于去離子水制備催化溶液，4-氨基芐基磷酸二乙酯抗原溶液為 IOmmoI/L (即 3.37mg/ml)，載體蛋白 BSA 溶液為 0.5mmol/L (即 33mg/ml)B，戊二醛溶液為 20mmol/L (即 3.82mg/ml)；
[0023](2)將戊二醛溶液和載體蛋白BSA4°C避光攪拌30分鐘，4_氨基芐基磷酸二乙酯與載體蛋白BSA的摩爾比為20:1 ;
[0024](3)用0.01M磷酸鹽緩沖液透析除去4-氨基芐基磷酸二乙酯與載體蛋白BSA混合液中游離的戊二醛，得到活化后的載體蛋白BSA溶液；
[0025](4)抗原溶液緩慢滴入活化后的載體蛋白溶液中，4°C攪拌22小時(shí)，經(jīng)透析除去游離抗原，得偶聯(lián)物；
[0026](5 )加NaBH4溶液還原偶聯(lián)物。
[0027]按照步驟(1) (2) (3) (4) (5)的方法，不需要4-氨基芐基磷酸二乙酯制備抗原溶液，維持其他各反應(yīng)條件不變，制備實(shí)驗(yàn)對(duì)照樣品。
[0028]采用紫外分光光度計(jì)對(duì)載體蛋白、未偶聯(lián)小分子、偶聯(lián)物在200_500nm之間進(jìn)行掃描，在同坐標(biāo)下進(jìn)行圖形比對(duì)，在偶聯(lián)物和載體蛋白對(duì)照濃度相同的情況下，如果偶聯(lián)物的特征峰與載體蛋白特征峰及實(shí)驗(yàn)對(duì)照樣品特征峰相比發(fā)生明顯偏移，說明偶聯(lián)成功。
[0029]實(shí)施例2 4-氨基芐基磷酸二乙酯與載體蛋白卵清蛋白偶聯(lián)
[0030](I)將4-氨基芐基磷酸二乙酯溶于去離子水制備抗原溶液，載體蛋白卵清蛋白溶于去離子水制備載體蛋白溶液，戊二醛溶于去離子水制備催化溶液，4-氨基芐基磷酸二乙酯抗原溶液為10mmol/L (即3.37mg/ml),載體蛋白卵清蛋白溶液為0.5mmol/L (即33mg/ml) B，戊二醛溶液為 20mmol/L (即 3.82mg/ml)；
[0031](2)將戊二醛溶液和載體蛋白卵清蛋白4°C避光攪拌30分鐘，4-氨基芐基磷酸二乙酯與載體蛋白卵清蛋白的摩爾比為15:1 ;
[0032](3)用0.01M磷酸鹽緩沖液超濾除去4-氨基芐基磷酸二乙酯與載體蛋白卵清蛋白混合液中游離的戊二醛，得到活化后的載體蛋白卵清蛋白溶液；
[0033](4)抗原溶液緩慢滴入活化后的載體蛋白卵清蛋白溶液中，4°C攪拌24小時(shí)，經(jīng)透析除去游離抗原，得偶聯(lián)物；
[0034](5 )加NaBH4溶液還原偶聯(lián)物。
[0035]按照步驟(1) (2) (3) (4) (5)的方法，不需要4-氨基芐基磷酸二乙酯制備抗原溶液，維持其他各反應(yīng)條件不變，制備實(shí)驗(yàn)對(duì)照樣品。
[0036]采用紫外分光光度計(jì)對(duì)載體蛋白、未偶聯(lián)小分子、偶聯(lián)物在200_500nm之間進(jìn)行掃描，在同坐標(biāo)下進(jìn)行圖形比對(duì)，在偶聯(lián)物和載體蛋白對(duì)照濃度相同的情況下，如果偶聯(lián)物的特征峰與載體蛋白特征峰及實(shí)驗(yàn)對(duì)照樣品特征峰相比發(fā)生明顯偏移，說明偶聯(lián)成功。
[0037]實(shí)施例3 4-氨基芐基磷酸二乙酯與載體蛋白鑰孔血藍(lán)蛋白偶聯(lián)
[0038](I)將4-氨基芐基磷酸二乙酯溶于去離子水制備抗原溶液，載體蛋白鑰孔血藍(lán)蛋白溶于去離子水制備載體蛋 白溶液，戊二醛溶于去離子水制備催化溶液，4-氨基芐基磷酸二乙酯抗原溶液為10mmol/L(即3.37mg/ml),載體蛋白鑰孔血藍(lán)蛋白溶液為0.5mmol/L(即33mg/ml) B,戍二醒溶液為 20mmol/L (即 3.82mg/ml)；
[0039](2)將戊二醛溶液和載體蛋白鑰孔血藍(lán)蛋白4°C避光攪拌30分鐘，4-氨基芐基磷酸二乙酯與載體蛋白鑰孔血藍(lán)蛋白的摩爾比為10:1 ；
[0040](3)用0.01M磷酸鹽緩沖液超濾除去4-氨基芐基磷酸二乙酯與載體蛋白鑰孔血藍(lán)蛋白混合液中游離的戊二醛，得到活化后的載體蛋白鑰孔血藍(lán)蛋白溶液；
[0041](4)抗原溶液緩慢滴入活化后的載體蛋白卵清蛋白溶液中，4°C攪拌28小時(shí)，經(jīng)脫鹽除去游離抗原，得偶聯(lián)物；
[0042](5 )加NaBH4溶液還原偶聯(lián)物。
[0043]按照步驟(1) (2) (3) (4) (5)的方法，不需要4-氨基芐基磷酸二乙酯制備抗原溶液，維持其他各反應(yīng)條件不變，制備實(shí)驗(yàn)對(duì)照樣品。
[0044]采用紫外分光光度計(jì)對(duì)載體蛋白、未偶聯(lián)小分子、偶聯(lián)物在200_500nm之間進(jìn)行掃描，在同坐標(biāo)下進(jìn)行圖形比對(duì)，在偶聯(lián)物和載體蛋白對(duì)照濃度相同的情況下，如果偶聯(lián)物的特征峰與載體蛋白特征峰及實(shí)驗(yàn)對(duì)照樣品特征峰相比發(fā)生明顯偏移，說明偶聯(lián)成功。
【權(quán)利要求】
1.一種4-氨基芐基磷酸二乙酯完全抗原的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)將4-氨基芐基磷酸二乙酯溶于去離子水制備抗原溶液，戊二醛溶于去離子水制備橋聯(lián)劑溶液，載體蛋白溶于PH9.6的0.05M碳酸鹽緩沖液制備載體蛋白溶液； (2)將載體蛋白溶液和橋聯(lián)劑溶液混合并4°C避光攪拌30分鐘； (3)用0.01M磷酸鹽緩沖液透析或者超濾除去載體蛋白溶液和橋聯(lián)劑溶液混合液中游離的橋聯(lián)劑，得到活化后的載體蛋白溶液； (4)抗原溶液緩慢滴入活化后的載體蛋白溶液中，4°C攪拌20小時(shí)以上，經(jīng)透析、脫鹽或者超濾除去游離抗原，得偶聯(lián)物； (5)加NaBH4溶液還原偶聯(lián)物。
2.根據(jù)權(quán)利要 求1所述的一種4-氨基芐基磷酸二乙酯完全抗原的制備方法，其特征在于，步驟(1)中，所述載體為含有游離氨基的蛋白大分子。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種4-氨基芐基磷酸二乙酯完全抗原的制備方法，其特征在于，所述的蛋白大分子為牛血清白蛋白或者卵清蛋白或者牛丙種球蛋白或者鑰孔血藍(lán)蛋白。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種4-氨基芐基磷酸二乙酯完全抗原的制備方法，其特征在于，所述步驟(1)中，所述抗原溶液濃度為lOmmol/L，載體蛋白溶液濃度為0.5mmol/L載體蛋白溶液，橋聯(lián)劑溶液溶液濃度為50mmol/L。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種4-氨基芐基磷酸二乙酯完全抗原的制備方法，其特征在于，所述步驟(2)中按照4-氨基芐基磷酸二乙酯與載體蛋白摩爾比10-20:1的比例。
【文檔編號(hào)】C07K14/47GK103613659SQ201310606470
【公開日】2014年3月5日 申請(qǐng)日期:2013年11月25日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月25日
【發(fā)明者】張振斌, 侯玉文, 田云霞, 李克錦, 劉萍, 欒大偉 申請(qǐng)人:博奧賽斯（天津）生物科技有限公司