采用具有多形式官能性的顆粒對(duì)免疫球蛋白g制備物的色譜純化的制作方法
【專利摘要】純化含有期望的蛋白的樣品的方法，包括以下步驟：(i)提供具有帶正電的多孔顆粒的填充色譜柱，(ii)將所述柱平衡至樣品的期望的蛋白待洗脫的條件，(iii)將樣品與填充色譜柱接觸使得上樣至填充色譜柱的樣品體積小于或等于填充色譜柱內(nèi)帶正電的多孔顆粒的顆粒間空間，(iv)從填充色譜柱洗脫期望的蛋白，其中期望的蛋白處在更純的狀態(tài)并處在平衡填充色譜柱的條件；其中期望的蛋白是抗體、抗體片段、抗體衍生物或抗體融合蛋白。(沒有合適的附圖)。
【專利說明】采用具有多形式官能性的顆粒對(duì)免疫球蛋白G制備物的色 譜純化 發(fā)明領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及用于蛋白純化的方法，并且更具體地涉及抗體和源于抗體的片段、片 段性構(gòu)建體和FC-融合蛋白的純化。它進(jìn)一步涉及用于降低來自抗體和片段、以及病毒、 DNA和內(nèi)毒素的抗體聚集體（同源聚集體）和抗體-污染物復(fù)合體（異源聚集體）水平的 方法。它進(jìn)一步涉及將這些能力與其它純化方法整合以實(shí)現(xiàn)期望的最終純化水平。
[0002] 發(fā)明背景
[0003] 具有帶電表面的固體材料一般廣泛用于蛋白純化領(lǐng)域，并且特別是用于抗體純 化。這些材料通常包括所謂的離子交換劑，其通常被用于兩種上樣形式中的任一種。在結(jié) 合-洗脫（bind-elute)模式，樣品和離子交換劑被平衡至允許抗體結(jié)合的條件。與帶電表 面相互作用較弱或根本不發(fā)生相互作用的污染物不能結(jié)合并被消除。比抗體更強(qiáng)發(fā)生相互 作用的污染物結(jié)合得更強(qiáng)。在洗去未結(jié)合的污染物之后，可以通過增加鹽濃度對(duì)柱進(jìn)行洗 脫。這允許以增強(qiáng)的與離子交換劑進(jìn)行相互作用的強(qiáng)度進(jìn)行結(jié)合物質(zhì)種類的分級(jí)分離，從 而實(shí)現(xiàn)抗體的高度純化。在流-穿（flow-through)模式中，樣品和離子交換劑均被平衡至 阻止抗體結(jié)合的條件。比抗體與離子交換劑進(jìn)行更強(qiáng)相互作用的物質(zhì)種類被結(jié)合并從而被 去除，但是比抗體結(jié)合更弱的物質(zhì)種類流穿過柱并作為污染物持續(xù)存在。對(duì)于人、人源化 或嵌合IgG單克隆抗體，大部分結(jié)合-洗脫上樣是在陽離子交換劑（帶負(fù)電表面）上進(jìn)行 的。大部分流-穿上樣是在陰離子交換劑（帶正電表面）上進(jìn)行的。兩種模式都是在各種 固相結(jié)構(gòu)上呈現(xiàn)的帶電表面上進(jìn)行，包括填充于柱的多孔或非多孔顆粒，或直接加至大體 積水溶性樣品，或在單塊材料（monolith)或膜上。這些不同結(jié)構(gòu)賦予不同流體性質(zhì)、能力 (capacity)和分辨率，但是不管物理形式，流-穿或結(jié)合-洗脫色譜的限定（defining)化 學(xué)特征是恒定的。兩種方法都依賴于在樣品被引入至柱之前，將離子交換劑和樣品平衡至 相同的條件。
[0004] 已經(jīng)描述了一種稱為高性能切向流過濾（HPTFF)的方法，其中在具有截?cái)嘀?為大約100至大約300kDa的超濾膜表面上產(chǎn)生了正電荷〇3111^18 6丨31.，]\]^111131\Sci. (2007) 297: 16-etseq.；vanReisU.S.PatentNo. 7, 001, 550；vanReiset al. ,J.Membr.Sci. (1999) 159:133-etseq.；Boltonetal. ,Adv.Filtr.Sep.Technol. (1999) 13A:537-etseq.；Burnsetal. ,J.Membr.Sci. (1999)64:27~etseq.；Mehtaet al.，CEP(2008) 104 (5) :S14_etseq.)。當(dāng)粗制IgG單克隆抗體樣品被引入窄范圍的pH和 電導(dǎo)率內(nèi)時(shí)，IgG被膜表面排斥，并因此被阻止穿過孔。大多數(shù)污染物種類或與表面結(jié)合或 通過對(duì)流傳質(zhì)（convectivemasstransport)穿過孔，并因此被消除。該方法還允許抗體 的濃縮，盡管這樣的濃縮依賴于在它被上樣至膜之前將抗體平衡至操作條件。這些操作條 件一般由弱堿性至近中性pH和低電導(dǎo)率組成。過度的電導(dǎo)率可能會(huì)阻斷靜電相互作用并 通過膜孔引起IgG損失。該方法的能力可能會(huì)被結(jié)合至膜的酸性污染物的比例所限制，因 為它們中和膜上的電荷。這可能會(huì)削弱或暫?？贵w排斥，并引起抗體與污染物一起穿過孔 而丟失。因此，與應(yīng)用于傳統(tǒng)離子交換劑的結(jié)合-洗脫和流-穿上樣類似，HPTFF依賴于在 進(jìn)行該技術(shù)之前樣品的平衡和操作條件。目前，HPTFF僅應(yīng)用于膜上樣。它的流體-循環(huán) 方式可能會(huì)妨礙其被應(yīng)用于單塊材料或填充顆粒的柱。
[0005] 另一種方法采用與化學(xué)官能性（functionalities)組合的混合模式的色 譜介質(zhì)(Erikssonetal.,Bioprocess.Inti. (2009)7:52~etseq.；Bresolinet al.,J.Chromatogr.B(2010)878:2087-etseq.；deSouzaetal.,J.Chromatogr. B(2010)878:557-etseq.)。盡管在根據(jù)二級(jí)官能性的特性（nature)的不同化學(xué)條件 下，這些介質(zhì)材料的一些包括正電荷并被應(yīng)用于作為離子交換劑的相同形式中，即，以結(jié) 合-洗脫和流_穿模式。又一種方法是將物理官能性與化學(xué)官能性組合。一個(gè)這樣的例子 采用可變尺寸排阻官能性連同多孔顆粒陰離子交換材料（Hunteretal.，J.Chromatogr. A(2000) 897: 65-etseq.；Hunteretal. ,J.Chromatogr.A(2000) 897: 87~etseq.； Hunteretal. ,J.Chromatogr.A(2001)930:79-etseq.；Hunteretal. ,J.Chromatogr. A(2002)971:105-etseq.)。該方法一般涉及蛋白以尺寸依賴的方式進(jìn)入顆?？?，同時(shí)也展 示對(duì)蛋白電荷以及緩沖液條件的依賴性。盡管它并未被應(yīng)用于純化或減少抗體聚集，該方 法已經(jīng)被用于結(jié)合并洗脫IgG型抗體。
[0006] 帶正電的可溶性聚合物（聚烯丙胺、聚精氨酸）和某些二價(jià)陽離子（依沙 吖啶、金屬離子）已經(jīng)被用于從抗體制備物共沉淀帶負(fù)電的污染物（Thdmmes etal.,in:U.Gottschalk(ed. ),ProcessScalePurificationofAntibodies,J. WileyandSons,Hoboken, (2009) 293~etseq.；MaetalJ.Chromatogr. B(2010)878:798-etseq.；Perametal. ,Biotechnol.Progr. , (2010)26:1322-etseq.； Glynn, ,inU.Gottschalk(ed. ),ProcessScalePurificationofAntibodies,J. T.WileyandSons,Hoboken, (2009) 309~etseq.；Farhneretal. ,U.S.Patent ApplicationNo. 20080193981；Maetal. ,J.Chromatogr.B(2010)878:798-etseq.； Cordesetal. ,Biotechnol.Progr., (1990)6:283-etseq. ；Dissing,etal. ,B ioseparation, (1999), 7:221-etseq.；BernhardtU.S.PatentNo. 5, 559,250 ； Akcasuetal. ,Nature, (1960) 187: 323~etseq. ；Matsuzawa,etal.,Nucl. AcidsRes., (2003) 3 (3) : 163~etseq.；Christensenetal. ,Prot.Expr. Purif. , (2004)37:468-etseq.；Kejnovskyetal. ,Nucl.AcidsRes., (1997)25:187〇-et seq. ;0ngkudonetal.,Anal.Chem.,(2011)83:391-etseq.)。這些方法可以被認(rèn)為是作 為液相類似物的帶正電的顆粒。這樣的方法可以替代性物理形式進(jìn)行，通常稱為批模式，其 中聚合物在仔細(xì)控制的pH和電導(dǎo)率條件的窄范圍內(nèi)被直接加至抗體制備物。這樣的變體 方法已被用于從細(xì)胞培養(yǎng)上清以及DNA、內(nèi)毒素和病毒選擇性沉淀酸性宿主蛋白。
[0007] 另一個(gè)已被指出的問題是可以在源于宿主細(xì)胞的污染物和由體外細(xì)胞培養(yǎng)方 法產(chǎn)生的重組蛋白之間自發(fā)形成非天然的異源聚集體（Shuklaetal.，Biotechnol. Progr. (2008)24:1115-etseq. ；Luhrs,etal. ,J.Chromatogr.B(2009)877:1543-et seq.；Mechetneretal. ,J.Chromatogr.B(2011) 879:2583~etseq.；Gagnonetal. ,J. Chromatogr.A, (2011) 1218:2405-etseq. ；Gagnon,BioprocessingJ. (2010)9 (4):14~et seq.)。這些異源聚集體可以在兩個(gè)方面被認(rèn)為是非天然的：1)組成型污染物常常是非人 來源的，在非人宿主細(xì)胞死亡后裂解時(shí)由非人宿主細(xì)胞分泌的或釋放入培養(yǎng)基。在活人中， 這樣的非人污染并不存在；以及2)組成型污染物與人體內(nèi)系統(tǒng)相比積累至高濃度，其中死 細(xì)胞成分被迅速消除。因此，重組產(chǎn)物以通常在生命系統(tǒng)中不會(huì)發(fā)生的濃度暴露于高水平 的強(qiáng)相互作用的污染物。同時(shí)，重組蛋白的高表達(dá)水平使得它們成為與這些非人污染物非 特異性相關(guān)的合適的底物，有利于不同組成的不期望的異源聚集體的形成。
[0008] 異源聚集體的污染性蛋白含量，已經(jīng)通過直接靶向污染性蛋白（Shuklaet al.andGagnonetal.，同上），以及間接通過革El向負(fù)責(zé)污染性蛋白的相應(yīng)DNA成分（Luhrs etal.andGagnon，同上）被解決到一定程度。當(dāng)一些復(fù)合物解離時(shí)已經(jīng)表明減少抗體聚 集水平（Shuklaetal.，Mechetneretal.，andGagnon，同上）。已經(jīng)公開了陰離子交換 劑減少抗體-污染物復(fù)合物水平的能力（Luhrsetal.andGagnonetal.，同上），但沒有 研宄揭示陰離子交換處理能夠完全消除異源聚集體。體積排阻、陽離子交換和疏水相互作 用層析通常均不如陰離子交換（Gagnonetal.，同上）。
[0009] 用預(yù)計(jì)可以解離異源聚集體的試劑處理抗體制備物通常已經(jīng)證明是無效的。例 如采用高濃度的尿素、鹽或二者的組合并不能實(shí)質(zhì)上解離IgM-污染物異源聚集體（Gagnon etal.，同上）。如將尿素、鹽和EDTA與蛋白G親和色譜組合起來進(jìn)行預(yù)先洗脫洗滌一樣 (Mechetneretal.，同上），用尿素、醇和表面活性劑預(yù)先洗脫洗絳的蛋白A親和色譜已被 指出，與不進(jìn)行洗滌相比，更加有效地減少異源聚集體水平（Shuklaetal.，同上）。具有 尿素的預(yù)先洗脫洗滌的陰離子交換色譜已被指出，比在缺乏尿素洗滌的情況下更加有效地 減少異源聚集體（Mechetneretal.，同上）。具有預(yù)先洗脫EDTA洗絳的陽離子交換色譜 已被指出，比沒有洗絳更加有效地減少異源聚集體（Mechetneretal.，同上）。最后，具有 尿素和/或鹽的預(yù)先洗脫洗滌的羥基磷灰石，也已比沒有這樣的洗滌更加有效地減少異源 聚集體（Gagnon，同上）。盡管有這些觀察結(jié)果，在一般情況下，在結(jié)合至色譜柱的抗體預(yù)先 洗脫洗滌中采用解離劑一直只有適度的成功。
[0010] 發(fā)明概述
[0011] 提供了用于基于IgG的免疫學(xué)構(gòu)建體純化的方法、材料和試劑盒。在某些實(shí)施方 案中，本發(fā)明提供了用于純化含有期望的蛋白的樣品的方法，包括以下步驟：（i)提供包含 帶正電的多孔顆粒的填充色譜柱，（ii)將填充色譜柱平衡至樣品的期望的蛋白待洗脫的條 件，（iii)將樣品與填充色譜柱接觸使得上樣至填充色譜柱的樣品體積小于或等于填充色 譜柱內(nèi)帶正電的多孔顆粒的顆粒間空間，以及（iv)從填充色譜柱洗脫期望的蛋白，其中期 望的蛋白處在更純的狀態(tài)并處在平衡填充色譜柱的條件；其中期望的蛋白是IgG抗體、IgG 抗體片段、IgG抗體衍生物或IgG抗體融合蛋白。
[0012] 在前面的實(shí)施方案中，期望的蛋白可以源于選自以下形式的IgG抗體：Fab片段、 F(ab'）2片段、微抗體、雙抗體、VHH結(jié)構(gòu)域、Fc-融合蛋白或具有與IgG抗體相似電荷性質(zhì) 的IgG衍生物。
[0013] 在一個(gè)或更多的每個(gè)前面的實(shí)施方案中，樣品可以是之前未純化的。
[0014] 在一個(gè)或更多的每個(gè)前面的實(shí)施方案中，樣品可以已經(jīng)經(jīng)歷之前的純化步驟至中 等水平或高等水平純度。
[0015] 在一個(gè)或更多的每個(gè)前面的實(shí)施方案中，樣品的中等水平純度可為大約40%至大 約90%純度的范圍。
[0016] 在一個(gè)或更多的每個(gè)前面的實(shí)施方案中，樣品的高等水平純度可為大約90%或更 大的范圍。
[0017] 在一個(gè)或更多的每個(gè)前面的實(shí)施方案中，樣品中的宿主細(xì)胞蛋白或DNA污染物的 初始水平可為大約lOOppm至大約10,OOOppm的范圍。
[0018] 在一個(gè)或更多的每個(gè)前面的實(shí)施方案中，樣品中的總污染物的初始水平可為大約 200,OOOppm至大約 5, 000,OOOppm的范圍。
[0019] 在一個(gè)或更多的每個(gè)前面的實(shí)施方案中，期望的蛋白中的污染物的最終水平可為 大約0? 1至大約10ppm的范圍。
[0020] 在一個(gè)或更多的每個(gè)前面的實(shí)施方案中，期望的蛋白中的污染物的最終水平可為 大約0. 01至大約lppm的范圍。
[0021 ] 在一個(gè)或更多的每個(gè)前面的實(shí)施方案中，樣品體積可以小于所述柱內(nèi)帶正電的多 孔顆粒的顆粒間空間的99%。
[0022] 在一個(gè)或更多的每個(gè)前面的實(shí)施方案中，樣品體積可以小于所述柱內(nèi)帶正電的多 孔顆粒的顆粒間空間的95%。
[0023] 在一個(gè)或更多的每個(gè)前面的實(shí)施方案中，樣品體積可以小于填充色譜柱內(nèi)帶正電 的多孔顆粒的顆粒間空間的90%。
[0024] 在一個(gè)或更多的每個(gè)前面的實(shí)施方案中，樣品體積可以小于填充色譜柱內(nèi)帶正電 的多孔顆粒的顆粒間空間的80%。
[0025] 在一個(gè)或更多的每個(gè)前面的實(shí)施方案中，樣品體積可以小于填充色譜柱內(nèi)帶正電 的多孔顆粒的顆粒間空間的70%。
[0026] 在一個(gè)或更多的每個(gè)前面的實(shí)施方案中，樣品體積可以小于填充色譜柱內(nèi)帶正電 的多孔顆粒的顆粒間空間的10%。
[0027] 在一個(gè)或更多的每個(gè)前面的實(shí)施方案中，樣品體積可以小于填充色譜柱內(nèi)帶正電 的多孔顆粒的顆粒間空間的5%。
[0028] 在一個(gè)或更多的每個(gè)前面的實(shí)施方案中，樣品體積可以小于填充色譜柱內(nèi)帶正電 的多孔顆粒的顆粒間空間的1%。
[0029] 在一個(gè)或更多的每個(gè)前面的實(shí)施方案中，樣品體積可以小于填充色譜柱內(nèi)帶正電 的多孔顆粒的顆粒間空間的〇. 1%。
[0030] 在一個(gè)或更多的每個(gè)前面的實(shí)施方案中，填充色譜柱可以僅用帶正電的多孔顆粒 填充，并且樣品體積可以小于填充色譜柱體積的40 %。
[0031] 在一個(gè)或更多的每個(gè)前面的實(shí)施方案中，樣品上樣條件包括大約2至大約10的pH 范圍。
[0032] 在一個(gè)或更多的每個(gè)前面的實(shí)施方案中，填充色譜柱可以被平衡至pH大約4至大 約9〇
[0033] 在一個(gè)或更多的每個(gè)前面的實(shí)施方案中，填充色譜柱可以用pH大約7. 5至大約 8. 5的緩沖液平衡。
[0034] 在一個(gè)或更多的每個(gè)前面的實(shí)施方案中，樣品上樣條件包括電導(dǎo)率大約0.lmS/cm 至大約250mS/cm的范圍。
[0035] 在一個(gè)或更多的每個(gè)前面的實(shí)施方案中，填充色譜柱可以被平衡至大約0.lmS/cm 至大約30mS/cm的電導(dǎo)率值。
[0036] 在一個(gè)或更多的每個(gè)前面的實(shí)施方案中，填充色譜柱可以被平衡至大約0.lmS/cm 至大約15mS/cm的電導(dǎo)率值。
[0037] 在一個(gè)或更多的每個(gè)前面的實(shí)施方案中，填充色譜柱可以用大約8的pH和小于大 約lmS/cm的非零電導(dǎo)率值的緩沖液進(jìn)行平衡。
[0038] 在一個(gè)或更多的每個(gè)前面的實(shí)施方案中，填充色譜柱可以被平衡至在或接近于用 于要對(duì)洗出液進(jìn)行后續(xù)純化步驟的上樣條件的條件。
[0039] 在一個(gè)或更多的每個(gè)前面的實(shí)施方案中，帶正電的多孔顆粒是陰離子交換顆粒。
[0040] 在一個(gè)或更多的每個(gè)前面的實(shí)施方案中，陰離子交換顆粒具有正電性，至少部分 正電性是由選自以下的部分提供的：三（2-氨基乙基）胺、聚精氨酸、聚賴氨酸、聚乙烯亞 胺、聚烯丙胺、二亞乙基氨基乙基、亞乙基二氨基、伯氨基部分、仲氨基部分、叔氨基部分和 季氨基部分、正電性物質(zhì)種類的組合及其混合物。
[0041] 在一個(gè)或更多的每個(gè)前面的實(shí)施方案中，填充色譜柱還包含除電正性多孔顆粒之 外的其它顆粒。
[0042] 在一個(gè)或更多的每個(gè)前面的實(shí)施方案中，電正性多孔顆粒或其它顆粒的至少一 種，包含一個(gè)或更多選自以下的二級(jí)化學(xué)官能性：陽離子交換、疏水相互作用、氫鍵結(jié)合、 31- 31相互作用和金屬螯合。
[0043] 在一個(gè)或更多的每個(gè)前面的實(shí)施方案中，該方法可以在將樣品與填充色譜柱接觸 的步驟之前，還包括將樣品與聚集體解離劑（aggregate-dissociatingagent)接觸的額外 步驟。
[0044] 在一個(gè)或更多的每個(gè)前面的實(shí)施方案中，聚集體解離劑可以是有機(jī)陽離子。
[0045] 在一個(gè)或更多的每個(gè)前面的實(shí)施方案中，有機(jī)陽離子可以選自：依沙吖啶、 9_氨基卩丫啶（aminoacridine/aminacrine)、3, 6-卩丫啶二胺（普魯黃素）、卩丫啶鎖辛 (acrisorcin)、卩丫 啶氯（acrizane)(酷卩丫啶（phenacridane))、卩丫 啶橙、喹卩丫因、樂殺螨 (acricide)、卩丫啶酮、卩丫啶-9-羧酸、氯甲氧卩丫胺（acranil) (1-[ (6-氯-2-甲氧基-9-卩丫啶 基）氨基]-3-(二乙基氨基）-2-丙醇二鹽酸鹽）、吩番紅、吩噁嗪、吩噻嗪、叮啶黃（3, 6-二 氨基-10-甲基吖啶氯化物和3, 6-二氨基吖啶）、精氨酸和氯己定。
[0046] 在一個(gè)或更多的每個(gè)前面的實(shí)施方案中，有機(jī)陽離子可以是依沙吖啶、氯己定、精 氨酸或它們的鹽。
[0047] 在一個(gè)或更多的每個(gè)前面的實(shí)施方案中，有機(jī)陽離子可以是依沙吖啶或其鹽。
[0048] 在一個(gè)或更多的每個(gè)前面的實(shí)施方案中，有機(jī)陽離子可以以大約0.01 %至大約 0.05% (w/v)的量存在。
[0049] 在一個(gè)或更多的每個(gè)前面的實(shí)施方案中，有機(jī)陽離子可以以小于大約0.01% (w/ v)的非零的量存在。
[0050] 在一個(gè)或更多的每個(gè)前面的實(shí)施方案中，有機(jī)陽離子可以以小于大約0.005% (w/v)的非零的量存在。
[0051] 在一個(gè)或更多的每個(gè)前面的實(shí)施方案中，有機(jī)陽離子可以以小于大約0.001% (w/v)的非零的量存在。
[0052] 在一個(gè)或更多的每個(gè)前面的實(shí)施方案中，有機(jī)陽離子可以以大約0. 020至大約 0.025% (w/v)的量存在。
[0053]在一個(gè)或更多的每個(gè)前面的實(shí)施方案中，可以在將樣品與填充色譜柱接觸步驟之 前，用超過一種選自以下的有機(jī)陽離子處理樣品：依沙吖啶、精氨酸和氯己定及它們的鹽。
[0054] 在一個(gè)或更多的每個(gè)前面的實(shí)施方案中，在將樣品與填充色譜柱接觸步驟之前， 用于處理樣品的有機(jī)陽離子可以以小于1% (w/v)的非零的濃度提供。
[0055] 在一個(gè)或更多的每個(gè)前面的實(shí)施方案中，在將樣品與填充色譜柱接觸步驟之前， 用于處理樣品的有機(jī)陽離子可以以大約0.01%至大約0.05% (w/v)的濃度提供。
[0056] 在一個(gè)或更多的每個(gè)前面的實(shí)施方案中，在將樣品與填充色譜柱接觸步驟之前， 用于處理樣品的有機(jī)陽離子可以以小于大約〇. 01%的非零的濃度提供。
[0057] 在一個(gè)或更多的每個(gè)前面的實(shí)施方案中，在將樣品與填充色譜柱接觸步驟之前， 用于處理樣品的有機(jī)陽離子可以以小于大約〇. 005%的非零的濃度提供。
[0058] 在一個(gè)或更多的每個(gè)前面的實(shí)施方案中，在將樣品與填充色譜柱接觸步驟之前， 用于處理樣品的有機(jī)陽離子可以以小于大約〇. 001%的非零的濃度提供。
[0059] 在一個(gè)或更多的每個(gè)前面的實(shí)施方案中，在將樣品與所述柱接觸步驟之前，用于 處理樣品的有機(jī)陽離子可以以大約〇. 020至大約0. 025%的濃度提供。
[0060] 在一個(gè)或更多的每個(gè)前面的實(shí)施方案中，該方法可以在將樣品與填充色譜柱接觸 步驟之前，還包括將樣品與選自非離子有機(jī)聚合物、有機(jī)溶劑、表面活性劑和酰脲的可溶性 有機(jī)調(diào)節(jié)劑接觸。
[0061 ] 在一個(gè)或更多的每個(gè)前面的實(shí)施方案中，將樣品與有機(jī)調(diào)節(jié)劑接觸的步驟，可以 在將樣品與有機(jī)陽離子接觸的步驟之前發(fā)生。
[0062] 在一個(gè)或更多的每個(gè)前面的實(shí)施方案中，將樣品與有機(jī)調(diào)節(jié)劑接觸的步驟，可以 與將樣品與有機(jī)陽離子接觸的步驟基本上同時(shí)發(fā)生。
[0063] 在一個(gè)或更多的每個(gè)前面的實(shí)施方案中，將樣品與有機(jī)調(diào)節(jié)劑接觸的步驟，可以 在將樣品與有機(jī)陽離子接觸的步驟之后發(fā)生。
[0064] 在一個(gè)或更多的每個(gè)前面的實(shí)施方案中，可溶性有機(jī)調(diào)節(jié)劑可以包含選自聚乙二 醇、聚丙二醇和聚丁二醇的非離子有機(jī)聚合物。
[0065] 在一個(gè)或更多的每個(gè)前面的實(shí)施方案中，非離子有機(jī)聚合物可以具有大約500D 或更小的非零的平均分子量。
[0066] 在一個(gè)或更多的每個(gè)前面的實(shí)施方案中，可溶性有機(jī)調(diào)節(jié)劑可以包含選自乙二 醇、丙二醇、丁二醇、二甲亞砜、乙醇、異丙醇和苯氧基乙醇的有機(jī)溶劑。
[0067] 在一個(gè)或更多的每個(gè)前面的實(shí)施方案中，可溶性有機(jī)調(diào)節(jié)劑可以以大約1% (w/ v)或更大的濃度提供。
[0068] 在一個(gè)或更多的每個(gè)前面的實(shí)施方案中，可溶性有機(jī)調(diào)節(jié)劑可以包含選自Tween、 Triton、CHAPS、CHAPSO和辛基葡糖苷的表面活性劑。
[0069] 在一個(gè)或更多的每個(gè)前面的實(shí)施方案中，表面活性劑可以以大約1% (w/v)或更 小的非零的濃度提供。
[0070] 在一個(gè)或更多的每個(gè)前面的實(shí)施方案中，表面活性劑可以以大約0. 1% (w/v)或 更小的非零的濃度提供。
[0071 ] 在一個(gè)或更多的每個(gè)前面的實(shí)施方案中，可溶性有機(jī)調(diào)節(jié)劑可以包含以亞飽和量 提供的酰脲。
[0072] 在一個(gè)或更多的每個(gè)前面的實(shí)施方案中，酰脲可以選自尿素、乙內(nèi)酰脲和尿囊素 (allantoin)〇
[0073] 在一個(gè)或更多的每個(gè)前面的實(shí)施方案中，該方法可以在將樣品與填充色譜柱接觸 的步驟之前，還包括將樣品與抗病毒劑接觸。
[0074] 在一個(gè)或更多的每個(gè)前面的實(shí)施方案中，抗病毒劑可以是具有至少一個(gè)正電荷的 有機(jī)陽咼子。
[0075] 在一個(gè)或更多的每個(gè)前面的實(shí)施方案中，抗病毒劑可以缺乏正電荷。
[0076] 在一個(gè)或更多的每個(gè)前面的實(shí)施方案中，抗病毒劑可以以小于大約1% (w/v)的 非零的量存在。
[0077] 在一個(gè)或更多的每個(gè)前面的實(shí)施方案中，抗病毒劑可以以小于大約0. 1% (w/v) 的非零的量存在。
[0078] 在一個(gè)或更多的每個(gè)前面的實(shí)施方案中，抗病毒劑可以以小于大約0.01% (w/v) 的非零的量存在。
[0079] 在一個(gè)或更多的每個(gè)前面的實(shí)施方案中，抗病毒劑可以以小于大約0.001% (w/ v)的非零的量存在。
[0080] 在一個(gè)或更多的每個(gè)前面的實(shí)施方案中，該方法可以在將樣品與填充色譜柱接觸 的步驟之前，還包括以下的額外步驟：將樣品與足夠使得酰脲在樣品中過飽和的量的酰脲 接觸，并將含有期望的蛋白的上清與樣品的固體或不溶解部分分開。
[0081] 在一個(gè)或更多的每個(gè)前面的實(shí)施方案中，將樣品與酰脲接觸的步驟，可以在將樣 品與有機(jī)陽離子接觸的步驟之前發(fā)生。
[0082] 在一個(gè)或更多的每個(gè)前面的實(shí)施方案中，將樣品與酰脲接觸的步驟，可以與將樣 品與有機(jī)陽離子接觸的步驟基本上同時(shí)發(fā)生。
[0083] 在一個(gè)或更多的每個(gè)前面的實(shí)施方案中，將樣品與酰脲接觸的步驟，在將樣品與 混合化學(xué)性質(zhì)的可溶性有機(jī)陽離子接觸的步驟之后發(fā)生。
[0084] 在一個(gè)或更多的每個(gè)前面的實(shí)施方案中，酰脲可以選自：尿素、尿酸、乙內(nèi)酰脲、尿 囊素、尿囊素氯羥鋁、尿囊素鋁、Hemocane(-種含尿囊素的藥）、脲基乙內(nèi)酰脲、5-脲基乙 內(nèi)酰脲、乙醛基酰脲、乙醛酸二酰脲、2, 5-二氧代基-4-咪唑烷基脲和嘌呤。
[0085] 在一個(gè)或更多的每個(gè)前面的實(shí)施方案中，酰脲可以包含尿囊素。
[0086] 在一個(gè)或更多的每個(gè)前面的實(shí)施方案中，酰脲可以包含尿酸。
[0087] 在一個(gè)或更多的每個(gè)前面的實(shí)施方案中，尿囊素可以以大于0.5% (w/v)的量存 在。
[0088] 在一個(gè)或更多的每個(gè)前面的實(shí)施方案中，尿囊素可以以大于大約1% (w/v)的量 存在。
[0089] 在一個(gè)或更多的每個(gè)前面的實(shí)施方案中，尿酸可以以大于0. 0025%(w/v)的量存 在。
[0090] 在一個(gè)或更多的每個(gè)前面的實(shí)施方案中，尿酸可以以大于大約0. 01% (w/v)的量 存在。
[0091] 在一個(gè)或更多的每個(gè)前面的實(shí)施方案中，尿酸可以以大于大約0. 1% (w/v)的量 存在。
[0092]在一個(gè)或更多的每個(gè)前面的實(shí)施方案中，尿酸可以以大于大約1% (w/v)的量存 在。
[0093] 在一個(gè)或更多的每個(gè)前面的實(shí)施方案中，該方法可以在將樣品與填充色譜柱接觸 的步驟之前，還包括去除不溶性固體的額外步驟。
[0094] 在一個(gè)或更多的每個(gè)前面的實(shí)施方案中，可以在將樣品與有機(jī)調(diào)節(jié)劑、抗病毒劑 或過飽和的酰脲中的一個(gè)或更多接觸之后，進(jìn)行去除不溶性固體的步驟。
[0095] 在一個(gè)或更多的每個(gè)前面的實(shí)施方案中，在將樣品與有機(jī)調(diào)節(jié)劑、抗病毒劑或過 飽和的酰脲中的一個(gè)或更多接觸之后，可以將樣品與具有化學(xué)部分的固體材料接觸，其中 所述化學(xué)部分能夠吸附至少一部分的加至樣品的有機(jī)調(diào)節(jié)劑、抗病毒劑和酰脲。
[0096] 在一個(gè)或更多的每個(gè)前面的實(shí)施方案中，固體材料可以由加至樣品的顆粒組成， 并隨后從樣品分離。
[0097] 在一個(gè)或更多的每個(gè)前面的實(shí)施方案中，固體材料可以由樣品穿過或跨過的膜、 單塊材料或顆粒填充柱組成。
[0098] 在一個(gè)或更多的每個(gè)前面的實(shí)施方案中，固體材料上的化學(xué)部分可以包括一個(gè)或 多個(gè)具有陽離子交換、陰離子交換、疏水相互作用、氫鍵結(jié)合、JI-JI相互作用或金屬螯合的 能力的基團(tuán)。
[0099] 在一個(gè)或更多的每個(gè)前面的實(shí)施方案中，該方法在將樣品與具有化學(xué)部分的固體 材料接觸的步驟之后，其中所述化學(xué)部分能夠吸附至少一部分的加至樣品的有機(jī)調(diào)節(jié)劑、 抗病毒劑和酰脲，和將樣品與填充色譜柱接觸的步驟之前，還包括從樣品分離或從樣品去 除不溶性固體的額外步驟。
[0100] 在一個(gè)或更多的每個(gè)前面的實(shí)施方案中，樣品可以含有聚集體，其中更純狀態(tài)的 期望的蛋白與樣品相比具有降低的聚集體含量。
[0101 ] 在一個(gè)或更多的每個(gè)前面的實(shí)施方案中，聚集體可以包括期望的蛋白的同源聚集 體。
[0102] 在一個(gè)或更多的每個(gè)前面的實(shí)施方案中，在樣品中期望的蛋白的同源聚集體的存 在，可以通過進(jìn)行本文所公開的方法基本上被消除。
[0103] 在一個(gè)或更多的每個(gè)前面的實(shí)施方案中，聚集體可以包括期望的蛋白和污染物的 異源聚集體。
[0104] 在一個(gè)或更多的每個(gè)前面的實(shí)施方案中，異源聚集體可以是與期望的蛋白基本上 相同的流體動(dòng)力學(xué)大小。
[0105] 在一個(gè)或更多的每個(gè)前面的實(shí)施方案中，污染物可以是核酸、核苷酸、內(nèi)毒素、金 屬離子、蛋白、脂質(zhì)、細(xì)胞培養(yǎng)基成分或它們的組合。
[0106] 在一個(gè)或更多的每個(gè)前面的實(shí)施方案中，期望的蛋白和污染物的異源聚集體的存 在，可以通過進(jìn)行本文所公開的方法基本上被消除。
[0107] 在一個(gè)或更多的每個(gè)前面的實(shí)施方案中，樣品可以含有一種或更多污染物，其中 作為進(jìn)行本文所公開的方法的結(jié)果，更純狀態(tài)的期望的蛋白與樣品相比具有降低的污染物 的含量。
[0108] 能夠便利地實(shí)施前述任何實(shí)施方案的方法的試劑盒。
[0109] 盡管本文所公開的實(shí)施方案可以主要參照IgG型抗體和它們的異源聚集體來例 舉，本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，其它蛋白（如IGM型和其它抗體、組蛋白和有利地任何其它 堿性蛋白）的純化的各種實(shí)施方案的可適用性。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)認(rèn)識(shí)到這些和其它優(yōu) 點(diǎn)。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0110] 圖1顯示了以35 %的柱體積的樣品體積上樣至UNOsphereQ的過濾的細(xì)胞培養(yǎng)物 上清（CCS)(左圖）和蛋白A純化的曲妥單抗（右圖）的并排色譜圖，其中兩個(gè)柱被平衡至 50mMTris、pH8. 0。實(shí)線表示UV吸光度。虛線表示電導(dǎo)率。
[0111] 圖2顯示的曲線圖表示了通過本發(fā)明方法的宿主細(xì)胞蛋白的降低，在沒有NaCl的 情況下（左圖）以pH為函數(shù)和在pH8. 0的情況下（右圖）以鹽濃度為函數(shù)。實(shí)線和黑菱 形表示來自上樣的曲妥單抗細(xì)胞培養(yǎng)上清的值。虛線和白菱形表示來自上樣的蛋白A純化 的曲妥單抗的值。黑三角表示在進(jìn)行本發(fā)明的方法之前細(xì)胞培養(yǎng)上清中的宿主細(xì)胞蛋白。 白二角表不蛋白A純化的樣品中的宿主細(xì)胞蛋白。
[0112] 圖3顯示了來自細(xì)胞培養(yǎng)上清的過濾的曲妥單抗（左圖）、細(xì)胞培養(yǎng)上清的空體積 分級(jí)分離（中圖）和由陽離子交換接著進(jìn)行空體積分區(qū)純化的曲妥單抗（右圖）的分析型 尺寸排阻色譜（SEC)圖譜。
[0113] 圖4顯示了木瓜蛋白酶消化的Rituxan的分級(jí)分離的分析型SEC圖譜，接著是空 體積分區(qū)后第一個(gè)和第二個(gè)峰的分析型SEC圖譜。SEC圖譜中的數(shù)值代表以分鐘顯示的洗 脫時(shí)間。實(shí)線是UV吸光度。虛線是電導(dǎo)率。
[0114] 圖5顯示的SEC圖譜表示不適合用于空體積分區(qū)的陰離子交換所分區(qū)的受損抗 體。QFF:快流速Q(mào)瓊脂糖凝膠。FDHC:FractogelDEAEHighCap。P50HQ:P0R0S50HQ。實(shí) 線是UV吸光度。虛線是電導(dǎo)率。
[0115] 圖6顯示了以鹽濃度為函數(shù)的pH漂移的圖。將UNOsphereQ平衡至50mMTris、 pH8.0。蛋白A純化的曲妥單抗。實(shí)線：UV吸光度。簡(jiǎn)單虛線：電導(dǎo)率。復(fù)合虛線：pH。開 始于大約13mL的電導(dǎo)率峰是來自在上樣的抗體樣品中的鹽。開始于大約45mL的電導(dǎo)率增 加相應(yīng)于2. 0MNaCl清除步驟。
[0116] 發(fā)明詳述
[0117] 在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及用電正性多孔顆粒填充的柱，其中抗體可以，獨(dú)立 于或結(jié)合孔的空間位阻排斥或僅通過孔的空間位阻排斥，基本上由靜電排斥力限制在顆粒 之間空間（即顆粒之間或空隙空間）。如果不是僅穿過空隙空間，這可以造成抗體基本上穿 過（transit)柱。特別地，空間位阻排斥是指這樣的機(jī)制，使得抗體分子在阻止它們克服物 理阻力的條件下不能進(jìn)入孔的空間，所述物理阻力是由孔內(nèi)的帶正電的配體的構(gòu)型所施加 的。許多污染性蛋白（包括由產(chǎn)生抗體的宿主細(xì)胞所產(chǎn)生的那些）、DNA片段和細(xì)胞培養(yǎng)基 成分，包括鹽、非離子和兩性離子種類能夠進(jìn)入顆粒的孔，其被認(rèn)為（不被任何特定理論所 束縛）是延緩它們通過柱的傳輸，并造成當(dāng)緩沖液流過所述柱時(shí)它們從更快速迀移的IgG 分離。酸性污染物（包括DNA、內(nèi)毒素、病毒和許多蛋白）可以通過與電正性表面的結(jié)合被 進(jìn)一步延緩。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，該方法允許在不管樣品條件的情況下、不管大多數(shù)污染物的化學(xué)特 征的情況下，和不管上樣后緊接著樣品上樣以促使抗體通過柱的緩沖液的組成的情況下， 特別是IgG的有效分離。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是它可以在寬范圍的條件（pH、 鹽濃度、電導(dǎo)率等）下實(shí)施，并因此可以針對(duì)本發(fā)明方法的便利性能，在期望的IgG抗體或 片段的制造和純化過程中結(jié)合本發(fā)明的方法之前或之后的過程，選擇那些條件。在某些實(shí) 施方案中，這些獨(dú)特的操作特征和結(jié)果可以通過限制樣品上樣至不超過所述柱內(nèi)帶正電的 顆粒的顆粒間體積的體積而實(shí)現(xiàn)。此外，在某些實(shí)施方案中，該方法既不用其它類型的帶正 電的材料（包括非多孔顆粒、膜或單塊材料）上樣，也不在樣品內(nèi)通過分散帶正電的多孔或 非多孔的顆粒或可溶性帶正電的聚合物來上樣。相反，在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，該方法 用多孔顆粒的填充柱進(jìn)行。
[0118] 還已發(fā)現(xiàn)，在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的某些方法的固有的分級(jí)分離的能力可以 通過包括在柱床內(nèi)顆粒上的其它表面官能性得以增強(qiáng)，只要將所述柱被平衡至不會(huì)引起抗 體被那些其它官能性保持或顯著延緩的條件。這樣的官能性可以包括但不限于：帶負(fù)電的 基團(tuán)、疏水基團(tuán)、鍵基團(tuán)、氫鍵基團(tuán)或金屬螯合基團(tuán)。這些其它官能性可以位于與帶 正電的基團(tuán)相同的化學(xué)結(jié)構(gòu)上、與帶正電的基團(tuán)相同的多孔顆粒上，或可以是多孔或非多 孔的不同的顆粒上。在二級(jí)官能性是通過額外顆粒的包含（inclusion)被加入的情況下， 可以上樣的樣品的體積被限制到相應(yīng)于僅在柱中的帶正電的多孔顆粒間存在的顆粒間空 間的體積。該體積被估計(jì)為柱中的帶正電的多孔顆粒的重力沉降（gravity-settled)體積 的大約40%，但如果顆粒床是物理壓縮的也可能更小，并且可以由實(shí)驗(yàn)定量確定。
[0119] 在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的優(yōu)點(diǎn)是，該方法允許大幅度減少樣品中抗體聚 集體的比例。這是令人驚訝的，因?yàn)轭A(yù)計(jì)聚集體具有與天然抗體相同的電荷性質(zhì)。因此，預(yù) 計(jì)聚集體與天然抗體共洗脫。不被任何特定理論所束縛，據(jù)信在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的 方法解離聚集體而不是去除它們。
[0120] 在某些實(shí)施方案中，聚集體減少可以進(jìn)一步通過將樣品用促進(jìn)聚集體解離的試劑 處理來得到增強(qiáng)。這樣的試劑尤其包括多價(jià)陽離子如依沙吖啶，并可進(jìn)一步包括各種有機(jī) 調(diào)節(jié)劑，包括升高濃度的鹽、酰脲、氨基酸、非離子有機(jī)聚合物、有機(jī)溶劑和表面活性劑等 等。在該方法的常規(guī)實(shí)踐過程中，用樣品中的其它小分子去除解離劑。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，樣品 預(yù)處理與帶正電的聚集體解離劑的組合，接著如上所述將樣品上樣至柱，比僅用任何一種 方法實(shí)現(xiàn)了更大程度的聚集體減少。用于其它目的（例如但不限于病毒滅活）可以加入其 它有機(jī)或無機(jī)化合物，包括但不限于抗病毒劑，例如苯扎氯銨、亞甲基藍(lán)和三（正丁基）磷 酸酯。
[0121] 在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于純化含有期望的蛋白的樣品的方法，包括以 下步驟：（i)提供包含帶正電的多孔顆粒的填充色譜柱，（ii)將所述柱平衡至樣品中期望 的蛋白待洗脫的條件，（iii)將樣品與所述柱接觸使得上樣至所述柱的樣品體積小于或等 于所述柱內(nèi)帶正電的多孔顆粒的顆粒間空間，（iv)從所述柱洗脫期望的蛋白，其中期望的 蛋白處在更純的狀態(tài)并處在平衡所述柱的條件；其中期望的蛋白是IgG抗體、IgG抗體片 段、IgG抗體衍生物或IgG抗體融合蛋白。
[0122] 在某些實(shí)施方案中，期望的蛋白是源于選自以下形式的IgG抗體：Fab片段、 F(ab'）2片段、微抗體、雙抗體、VHH結(jié)構(gòu)域、Fc-融合蛋白或具有與IgG抗體相似電荷性質(zhì) 的IgG衍生物。在某些實(shí)施方案中，樣品可以是未純化的、中等純度水平或高度純化的。
[0123] 在其它實(shí)施方案中，抗體可以是IgM、IgD、IgA或IgE或這些抗體的衍生物形式如 Fab片段、F(ab'）2片段、ScFV;或化合物構(gòu)建體如Fc-融合蛋白或免疫綴合物。
[0124] 在某些實(shí)施方案中，顆粒間空間大于大約兩倍的樣品體積。在某些實(shí)施方案中，含 有多孔電正性顆粒的柱部分的顆粒間空間大于樣品體積。在某些實(shí)施方案中，具有僅填充 帶正電的多孔顆粒的柱的樣品體積是填充柱的體積的大約40%或更少；在具有用帶正電 的多孔顆粒和其他顆粒填充的柱的某些實(shí)施方案中，樣品體積是柱中重力沉降的帶正電的 多孔顆粒的體積的大約40 %或更少。
[0125] 在某些實(shí)施方案中，填充在柱中的帶正電的多孔顆粒的顆粒間空間是大約與樣品 相同的體積，或比樣品體積大10 %，或比樣品大20 %、30 %、40 %、50 %、60 %、70 %、80 %、 90%或100%，或比樣品大1. 5、或2、或2. 5、或3、或4、或5、或更多倍。
[0126] 在某些實(shí)施方案中，在將樣品與柱接觸之前，用平衡緩沖液平衡所述柱。在某些實(shí) 施方案中，柱被平衡至pH大約4至大約9的。在某些這樣的實(shí)施方案中，所述柱被用pH大 約6. 5至大約7. 5的緩沖液平衡。在某些實(shí)施方案中，柱被平衡至大約lmS/cm至大約30mS/ cm的電導(dǎo)率值。在某些實(shí)施方案中，選擇用于所述柱的PH、鹽濃度和電導(dǎo)率條件，使得電正 性多孔顆粒與來自樣品的組分而不是期望的蛋白之間的靜電相互作用被暫停（suspend)。 在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，可以選擇用于平衡緩沖液和或洗脫緩沖液的PH、鹽濃度和電 導(dǎo)率條件，使得電正性多孔顆粒與來自樣品的組分而不是期望的蛋白之間的靜電相互作用 被暫停（suspend)。在某些實(shí)施方案中，平衡過的柱的電導(dǎo)率為大約0. 1至大約15mS/cm。 在某些實(shí)施方案中，所述柱可以被平衡至在或接近于用于要對(duì)洗出液進(jìn)行的后續(xù)純化步驟 的相同上樣條件的條件。
[0127] 在某些實(shí)施方案中，樣品條件可為大約2至大約10的pH范圍。在某些實(shí)施方案 中，樣品的電導(dǎo)率值可為大約〇.lmS/cm至大約250mS/cm的范圍。在某些實(shí)施方案中，樣品 條件可為大約2至大約10的pH范圍，并且在某些實(shí)施方案中，樣品的電導(dǎo)率值可為大約 0.lmS/cm至大約250mS/cm的范圍。
[0128] 在某些實(shí)施方案中，洗脫條件可為大約2至大約10的pH范圍。在某些實(shí)施方案 中，緊接著樣品上樣的緩沖液的電導(dǎo)率可為大約〇.lmS/cm至大約250mS/cm的范圍。在某 些實(shí)施方案中，緊接著樣品上樣的緩沖液具有比樣品或平衡緩沖液更低的電導(dǎo)率。在某些 實(shí)施方案中，緊接著樣品上樣的緩沖液具有比樣品或平衡緩沖液更高的電導(dǎo)率。
[0129] 在某些實(shí)施方案中，柱平衡緩沖液可以具有大約8. 0的pH和小于lmS/cm的電導(dǎo) 率，例如由50mM或更低濃度的Tris在不添加鹽的情況下介導(dǎo)的。在一些實(shí)施方案中，Tris 的濃度可為大約20mM至大約50mM的范圍。
[0130] 在某些實(shí)施方案中，緊接著樣品上樣的緩沖液具有與平衡緩沖液相同的組成。在 某些實(shí)施方案中，緊接著樣品上樣的緩沖液具有與平衡緩沖液不同的組成。在某些實(shí)施方 案中，緊接著樣品上樣的緩沖液具有比平衡緩沖液高得多的電導(dǎo)率，目的是去除可能會(huì)結(jié) 合至帶正電顆粒的帶負(fù)電的材料。
[0131] 在某些實(shí)施方案中，過量的鹽或其它添加劑可以被包括于樣品中，以清潔柱以準(zhǔn) 備用于隨后的使用周期。應(yīng)該理解的是，這樣的添加劑也可以介導(dǎo)解離在抗體和污染物種 類之間的非特異性相互作用的有益效果，其結(jié)果是提高純度和或由該技術(shù)所實(shí)現(xiàn)的聚集體 減少。
[0132] 在某些實(shí)施方案中，帶正電的多孔顆粒是陰離子交換顆粒。在某些實(shí)施方案中，陰 離子交換顆粒具有正電性，其部分由諸如伯氨基、仲氨基、叔氨基、季氨基、亞乙基二氨基、 二亞乙基氨基乙基、叔氨基乙基、季氨基乙基、三（2-氨基乙基）胺、聚烯丙胺、聚精氨酸、聚 賴氨酸、聚乙烯亞胺的部分所賦予。在某些實(shí)施方案中，所述柱含有除電正性多孔顆粒之外 的顆粒。在某些實(shí)施方案中，電正性多孔顆粒和額外顆粒中的至少一種，具有一個(gè)或更多選 自以下的二級(jí)化學(xué)官能性：陽離子交換、疏水相互作用、氫鍵結(jié)合、31-31相互作用和金屬 螯合。
[0133] 在某些實(shí)施方案中，該技術(shù)利用了在顆粒的孔內(nèi)產(chǎn)生帶電基團(tuán)的致密網(wǎng)絡(luò)的所謂 的接枝配體，使得該網(wǎng)絡(luò)物理阻礙或防止缺乏強(qiáng)負(fù)電的蛋白的進(jìn)入。
[0134] 在某些實(shí)施方案中，該技術(shù)利用了帶正電的多孔顆粒色譜介質(zhì)，其具有阻止IgG 或其片段的有效進(jìn)入的孔尺寸。可用于阻止IgG或其片段進(jìn)入的示例性孔尺寸包括大約 10nm至大約100nm的范圍，包括在其之間和其分?jǐn)?shù)的任意值，取決于IgG或其片段的尺寸。 本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，也可以采用小于l〇nm的孔尺寸，包括但不限于：1、2、3、4、5、6、7、 8或9nm。同樣，本領(lǐng)域技術(shù)人員還將理解，可以采用大于lOOnm的孔尺寸，包括但不限于： 120、150、200、300和500nm，包括在其之間和其分?jǐn)?shù)的任意值。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)認(rèn)識(shí)到 基于要被純化的抗體或其片段的孔尺寸的合理選擇。這樣的多孔顆?？梢詷?gòu)成整個(gè)樣品體 積，或其任意較小的比例。
[0135] 在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了在將樣品與柱接觸的步驟之前，用于將樣品與 聚集體解離劑接觸的額外步驟。在某些這樣的實(shí)施方案中，聚集體解離劑是有機(jī)陽離子。 在某些實(shí)施方案中，這樣的有機(jī)陽離子可以是依沙吖啶、9-氨基吖啶（aminoacridine/ &111；[仙(31'；[116)、3,6-卩丫啶二胺（普魯黃素）、卩丫啶鎖辛（3(31^801'(3；[11)、卩丫啶氯（3(31^23116)(酷 口丫啶（phenacridane))、卩丫啶橙、喹B丫因、樂殺螨（acricide)、卩丫啶酮、B丫啶-9-羧酸、氯甲氧 吖胺（acranil) (1-[(6_氯-2-甲氧基-9-吖啶基）氨基]_3_(二乙基氨基）-2_丙醇二鹽 酸鹽）、吩番紅、吩噁嗪、吩噻嗪、叮啶黃（3, 6-二氨基-10-甲基吖啶氯化物和3, 6-二氨基 吖啶）或氯己定。在某些實(shí)施方案中，有機(jī)陽離子是精氨酸、依沙吖啶、或氯己定或它們的 鹽。在本發(fā)明的某些方面，有機(jī)陽離子是依沙吖啶或其鹽。在某些這樣的實(shí)施方案中，有 機(jī)陽離子是以從大約0. 01 %至大約0. 05%的量、或以小于大約0. 01 %的非零的量、或以小 于大約0. 005 %的非零的量、或以小于大約0. 001 %的非零的量、或以從大約0. 020至大約 0. 025 %的量存在。
[0136] 在某些實(shí)施方案中，在將樣品與柱接觸步驟之前，用超過一種選自以下的有機(jī)陽 離子處理樣品：精氨酸、依沙吖啶和氯己定及它們的鹽。在某些這樣的實(shí)施方案中，在將 樣品與柱接觸步驟之前，用于處理樣品的有機(jī)陽離子以小于1%的非零的濃度、或以大約 0. 01 %至大約0. 05%的濃度、或以小于大約0. 01 %的非零的濃度、以小于大約0. 005%的 非零的濃度、以小于大約〇. 001 %的非零的濃度、以大約〇. 020至大約0. 025%的濃度提供。
[0137] 在某些實(shí)施方案中，在將樣品與柱接觸步驟之前，將樣品額外地與選自以下的可 溶性有機(jī)調(diào)節(jié)劑接觸：非離子有機(jī)聚合物、有機(jī)溶劑、表面活性劑和酰脲。在某些這樣的實(shí) 施方案中，將樣品與有機(jī)調(diào)節(jié)劑接觸的步驟，可以在將樣品與有機(jī)陽離子接觸的步驟之前 發(fā)生。在其它中，將樣品與有機(jī)調(diào)節(jié)劑接觸的步驟，可以與將樣品與有機(jī)陽離子接觸的步驟 基本上同時(shí)發(fā)生。在其它中，將樣品與有機(jī)調(diào)節(jié)劑接觸的步驟，可以在將樣品與有機(jī)陽離子 接觸的步驟之后發(fā)生。在某些這樣的實(shí)施方案中，有機(jī)調(diào)節(jié)劑是選自以下的非離子有機(jī)聚 合物：聚乙二醇、聚丙二醇和聚丁二醇。在某些這樣的實(shí)施方案中，非離子有機(jī)聚合物具有 大約500D或更小的平均分子量。在某些這樣的實(shí)施方案中，有機(jī)調(diào)節(jié)劑是選自以下的有機(jī) 溶劑：乙二醇、丙二醇、丁二醇、二甲亞砜、乙醇、異丙醇和苯氧基乙醇。在某些這樣的實(shí)施方 案中，有機(jī)調(diào)節(jié)劑以大約1% (w/v)或更大的濃度提供。
[0138] 在某些實(shí)施方案中，有機(jī)調(diào)節(jié)劑是選自以下的表面活性劑：Tween、Triton、CHAPS、 CHAPS0和辛基葡糖苷。在某些這樣的實(shí)施方案中，表面活性劑以大約1% (w/v)或更小的非 零的濃度、或以大約0.1% (w/v)或更小的非零的濃度提供。在某些實(shí)施方案中，有機(jī)調(diào)節(jié) 劑是以亞飽和量提供的酰脲。在某些這樣的實(shí)施方案中，酰脲是尿素、乙內(nèi)酰脲和尿囊素。
[0139] 在某些實(shí)施方案中，在將樣品與填充色譜柱接觸的步驟之前，額外地將樣品與抗 病毒劑接觸。在某些這樣的實(shí)施方案中，抗病毒劑是非多價(jià)有機(jī)陽離子，如苯扎氯銨、亞甲 基藍(lán)、三（正丁基）磷酸酯或辛酸（也稱為羊脂酸）。在某些這樣的實(shí)施方案中，抗病毒劑 以小于大約1% (W/V)的非零的量、或以小于大約0.1% (W/V)的非零的量、或以小于大約 0.01% (w/v)的非零的量、或以小于大約0.001% (w/v)的非零的量存在。
[0140] 在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明在將樣品與柱接觸的步驟之前，包括以下的額外步驟： 將樣品與足夠使得酰脲在樣品中過飽和的量的酰脲接觸，并將含有期望的蛋白的上清與樣 品的固體或不溶解部分分開。在某些這樣的實(shí)施方案中，將樣品與酰脲接觸的步驟，在將樣 品與有機(jī)陽離子接觸的步驟之前發(fā)生。在其它中，將樣品與酰脲接觸的步驟，與將樣品與有 機(jī)陽離子接觸的步驟基本上同時(shí)發(fā)生。還在其它中，將樣品與酰脲接觸的步驟，在將樣品與 混合化學(xué)性質(zhì)的可溶性有機(jī)陽離子接觸的步驟之后發(fā)生。在某些這樣的實(shí)施方案中，酰脲 是尿素、尿酸、乙內(nèi)酰脲、尿囊素、尿囊素氯羥鋁、尿囊素鋁、Hemocane、脲基乙內(nèi)酰脲、5-脲 基乙內(nèi)酰脲、乙醛基酰脲、乙醛酸二酰脲、2, 5-二氧代基-4-咪唑烷基脲或嘌呤。在某些實(shí) 施方案中，酰脲是尿囊素或尿酸。在某些酰脲是尿囊素的實(shí)施方案中，尿囊素以大于〇. 5 % (w/v)的量、或以大于大約1% (w/v)的量存在。在某些酰脲是尿酸的實(shí)施方案中，尿酸以 大于0.0025% (w/v)的量、或以大于大約0.01% (w/v)的量、或以大于大約0. 1% (w/v)的 量、或以大于大約1% (w/v)的量、或以大于大約10% (w/v)的量存在。
[0141] 在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了在將樣品與柱接觸的步驟之前，包括去除不溶 性固體的額外步驟的方法。在某些這樣的實(shí)施方案中，在將樣品與有機(jī)調(diào)節(jié)劑、抗病毒劑或 過飽和的酰脲接觸的一個(gè)或多個(gè)步驟之后，進(jìn)行去除不溶性固體的步驟。在某些實(shí)施方案 中，在將樣品與有機(jī)調(diào)節(jié)劑、抗病毒劑或過飽和的酰脲接觸的一個(gè)或多個(gè)步驟之后，將樣品 與具有化學(xué)部分的固體材料接觸，其中所述化學(xué)部分能夠吸附至少一部分的加至樣品的有 機(jī)調(diào)節(jié)劑、抗病毒劑和酰脲。在某些這樣的實(shí)施方案中，固體材料由加至樣品的顆粒組成， 并隨后從樣品分離或固體材料由樣品穿過或跨過的膜、單塊材料或顆粒填充柱組成。在某 些這樣的實(shí)施方案中，固體材料上的化學(xué)部分包括一個(gè)或多個(gè)具有陽離子交換、陰離子交 換、疏水相互作用、氫鍵結(jié)合、相互作用或金屬螯合的能力的基團(tuán)。在某些實(shí)施方案 中，本發(fā)明提供了包括在樣品與具有化學(xué)部分的固體材料接觸的步驟之后，其中所述化學(xué) 部分能夠吸附至少一部分的加至樣品的有機(jī)調(diào)節(jié)劑、抗病毒劑和酰脲，和在將樣品與填充 色譜柱接觸的步驟之前，從樣品分離或從樣品去除不溶性固體的額外步驟的方法。
[0142] 在某些實(shí)施方案中，樣品含有聚集體，其中通過實(shí)施本方法產(chǎn)生的更純狀態(tài)的期 望的蛋白與樣品相比具有降低的聚集體含量。在某些這樣的實(shí)施方案中，聚集體可以包括 期望的蛋白的同源聚集體，和在某些這樣的實(shí)施方案中，在樣品中期望的蛋白的同源聚集 體的存在通過進(jìn)行本文所公開的方法基本上被消除。在某些實(shí)施方案中，聚集體包括期望 的蛋白和污染物的異源聚集體，和在某些這樣的實(shí)施方案中，異源聚集體具有與期望的蛋 白基本上相同的流體動(dòng)力學(xué)大小。在某些這樣的實(shí)施方案中，污染物是核酸、核苷酸、內(nèi)毒 素、金屬離子、蛋白、脂質(zhì)或細(xì)胞培養(yǎng)基成分。在某些這樣的實(shí)施方案中，期望的蛋白和污染 物的異源聚集體的存在基本上被消除。
[0143] 在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了這樣的方法，其中樣品含有一種或更多污染物， 其中實(shí)施該方法產(chǎn)生的更純狀態(tài)的期望的蛋白與樣品相比具有降低的這樣的污染物的含 量。例如，在一些實(shí)施方案中，其中污染物是聚集體，聚集體的濃度可以從大約20%被減少 至大約0. 1%，如下面的實(shí)施例1 一 10所證實(shí)的。在一些實(shí)施方案中，一些污染物如游離輕 鏈污染物可以如示例性實(shí)施例13和14所示的在檢測(cè)限被名義上消除。相似地，99%的宿主 細(xì)胞蛋白、DNA、內(nèi)毒素和病毒的減少可以通過例如在實(shí)施例20和21中所示的本發(fā)明方法 的方式被消除。本發(fā)明的方法還有利地與現(xiàn)有技術(shù)中已知的純化方法進(jìn)行了比較。例如， 如實(shí)施例23中所示，在曲妥珠單抗（Herceptin)純化中通過蛋白A可以實(shí)現(xiàn)濃度123ppm 的宿主細(xì)胞蛋白。相反，本發(fā)明的方法能夠?qū)⑺拗骷?xì)胞的含量減少至大約3ppm。
[0144] 在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于便利地實(shí)施本發(fā)明方法的試劑盒，包括實(shí) 施本發(fā)明所需的一些或所有的材料，優(yōu)選以便利地實(shí)施本發(fā)明方法的量和濃度。這樣的試 劑盒還可以包括針對(duì)使用在試劑盒中提供的材料的說明書。
[0145] 定義以下術(shù)語，使得本發(fā)明可以更容易地被理解。其他定義在整個(gè)詳細(xì)說明書中 進(jìn)行闡述。
[0146] "聚集體（Aggregate(s))"是指兩種或更多分子的結(jié)合（association)，所述結(jié)合 在生理?xiàng)l件下穩(wěn)定，并可以在寬范圍的pH和電導(dǎo)率條件下保持穩(wěn)定。聚集體經(jīng)常包含至少 一種生物分子，例如蛋白、核酸或脂質(zhì)和其它分子或金屬離子。所述結(jié)合可以通過任何類型 或任意組合的化學(xué)相互作用發(fā)生?？贵w的聚集體可以被分為兩類："同源聚集體"是指兩個(gè) 或更多個(gè)抗體分子的穩(wěn)定結(jié)合；"異源聚集體"是指一個(gè)或多個(gè)抗體分子與一個(gè)或多個(gè)非抗 體分子的穩(wěn)定結(jié)合。非抗體成分可以由來自以下的一個(gè)或多個(gè)實(shí)體組成：核苷酸、內(nèi)毒素、 金屬離子、蛋白、脂質(zhì)或細(xì)胞培養(yǎng)基成分。
[0147] "抗體"是指免疫球蛋白、其復(fù)合物或片段形式。該術(shù)語可以包括但不限于：源自人 或其它哺乳動(dòng)物細(xì)胞系的184、1 §0、1§￡、1§6和1§11類型的多克隆或單克隆抗體，包括天然 的或遺傳修飾的形式，統(tǒng)稱為"抗體衍生物"，例如人源化、人、單鏈、嵌合、合成、重組、雜合 (hybrid)、突變、嫁接（grafted)和體外產(chǎn)生的抗體。"抗體"還可以包括復(fù)合物形式，包括 但不限于：含有免疫球蛋白部分的融合蛋白。示例性抗體融合蛋白包括但不限于：與其它 抗體融合的抗體、與具有針對(duì)其它靶標(biāo)的結(jié)合特異性的其它蛋白融合的抗體，或與具有治 療性、成像或診斷價(jià)值的其它蛋白融合。"抗體"還可以包括抗體片段，例如Fab、F(ab'）2、 Fv、scFv、Fd、dAb、Fc和其它組合物，無論它們是否保留抗原結(jié)合功能。
[0148] "IgG抗體"尤其指免疫球蛋白、其復(fù)合物、片段或衍生物形式。該術(shù)語可以包括但 不限于，源自人或其它哺乳動(dòng)物細(xì)胞系的任何亞類的單克隆或多克隆抗體，包括天然的或 遺傳修飾的形式如人源化、人、單鏈、嵌合、合成、重組、雜合、突變、嫁接和體外產(chǎn)生的抗體。 它還可以包括抗體片段如Fab、F(ab'）2、Fv、scFv、Fd、dAb、Fc、VHH、微抗體、雙抗體和其它 組合物，無論它們是否保留抗原結(jié)合功能。它還可以包括復(fù)合物形式，包括但不限于含有免 疫球蛋白部分的融合蛋白。
[0149] "柱平衡"是指在用色譜介質(zhì)填充的柱中實(shí)現(xiàn)期望的緩沖液的穩(wěn)定的和均等的分 布。在平衡狀態(tài)下，在柱出口處測(cè)得的洗脫液的PH、電導(dǎo)率和UV吸光度基本上與所述柱入 口處所引入的洗脫液相同。
[0150] "柱體積"是指在稱為柱的通常為圓柱的裝置內(nèi)填充的顆粒的總體積。術(shù)語柱體積 通常被理解為對(duì)應(yīng)于所謂的總柱體積，其由三部分組成，那些顆粒間空間稱為空隙體積，孔 內(nèi)的體積稱為孔體積，并且由顆粒的固體基質(zhì)所占據(jù)的體積通常稱為基質(zhì)體積。
[0151] "電導(dǎo)率值"是指電解質(zhì)溶液傳導(dǎo)電的能力。例如，可以通過確定由固定距離分開 的兩個(gè)電極之間溶液的電阻來測(cè)量電解質(zhì)的溶液的電導(dǎo)率。
[0152] "污染物"是指降低期望的蛋白（例如期望的抗體）純度的任何不期望的無機(jī)或有 機(jī)實(shí)體。污染物包括可以與期望的蛋白形成聚集體（尤其是異源聚集體）的實(shí)體。本發(fā)明 的方法可以提供這樣的聚集體的活性解離，以從形成聚集體的污染物回收期望的蛋白。示 例性的污染物包括蛋白、DNA、細(xì)胞成分等。其它污染物可以包括在之前純化步驟中所采用 的試劑。
[0153] "電正性多孔顆粒"或"帶正電的多孔顆粒"是指可以是大致球形或非球形的不溶 性固體，并且可以具有任何尺寸的孔。任選地，顆粒的尺寸范圍可為小于10至大于100微 米，并且平均孔尺寸范圍可為小于l〇nm(微孔）至大于100nm(大孔）。顆粒的電正性可由 以下化學(xué)基團(tuán)賦予，包括但不限于：弱陰離子交換基團(tuán)如氨基、亞乙基二氨基、二乙基氨基 乙基、聚烯丙胺、聚乙烯亞胺，強(qiáng)陰離子交換基團(tuán)如季氨基團(tuán)，組合弱-強(qiáng)交換劑如聚賴氨 酸、聚精氨酸或三（2_氨基乙基）胺、二亞乙基三胺、三亞乙基四胺、四亞乙基五胺、聚丙烯 亞胺四胺、PAMAM樹枝狀聚合物（乙二胺核心）或前述的任意組合。在帶正電的表面上產(chǎn) 生混合化學(xué)性質(zhì)的二級(jí)官能性，可以由帶負(fù)電或帶正電的基團(tuán)、疏水基團(tuán)、鍵基團(tuán)、氫 鍵基團(tuán)或金屬螯合基團(tuán)組成。二級(jí)官能性可以作為合成顆粒的制造材料或過程的無意的副 產(chǎn)物存在于電正性顆粒上，或它們可以通過有意的設(shè)計(jì)存在。二級(jí)官能性的濃度可為小于 1毫當(dāng)量/mL顆粒至大于100毫當(dāng)量/mL的范圍。術(shù)語電正性多孔顆粒包括被稱為陰離子 交換劑和鹽耐受性陰離子交換劑的商業(yè)化多孔顆粒色譜材料，并且可以包括電正性的所謂 的混合模式色譜材料。
[0154] "內(nèi)毒素"是指存在于革蘭氏陰性細(xì)菌外膜中的從裂解后的細(xì)胞釋放的有毒熱穩(wěn) 定脂多糖物質(zhì)。由于高含量的磷酸鹽和羧基殘基，內(nèi)毒素一般是酸性的，并且由于脂質(zhì)A區(qū) 域的脂肪酸含量其可以是高度疏水的。內(nèi)毒素可以為氫鍵結(jié)合提供廣泛的機(jī)會(huì)。
[0155] "顆粒間體積"或"空隙體積"是指柱內(nèi)不由顆粒自身占據(jù)的體積；顆粒之間空間。 這經(jīng)常被稱為柱的空隙體積。對(duì)于類似尺寸的大致球形的顆粒，當(dāng)顆粒由于重力而沉降并 且沒有通過機(jī)械方式被物理壓縮時(shí)，空隙體積通常構(gòu)成用這些顆粒填充的柱的大約40%。
[0156] "孔體積"是指多孔顆粒的孔內(nèi)的體積?？卓赡芪锢砩贤〞?，具有主要在孔壁上分 布的帶正電的基團(tuán)，或部分地被在孔內(nèi)駐留（reside)的聚合物網(wǎng)絡(luò)上或內(nèi)分布的帶正電 的基團(tuán)所堵塞。當(dāng)孔被部分地堵塞時(shí)，表觀堵塞程度可以隨抗體或其它樣品成分的電荷特 征發(fā)生改變，和/或作為緩沖液條件如pH和電導(dǎo)率的函數(shù)。
[0157] "非離子有機(jī)聚合物"是指由相連的缺乏帶電基團(tuán)的重復(fù)有機(jī)亞單位組成的天然 存在的或合成的烴。它可以是線性的、主要為線性并具有一定的分支或主要為分支的。適 合實(shí)踐本發(fā)明的例子包括但不限于：聚乙二醇（PEG)、聚丙二醇和聚乙烯吡咯烷酮（PVP)。 PEG具有結(jié)構(gòu)式H〇-(CH2-CH2-〇)n-H。例子包括但不限于，具有范圍為小于100至大于1000 道爾頓的平均聚合物分子量的組合物。
[0158] "有機(jī)陽離子"是指具有至少一個(gè)正電荷的天然或合成來源的有機(jī)分子、陽離子或 鹽，并且可以含有多個(gè)正電荷。有機(jī)陽離子還可以具有負(fù)電荷，使得它具有凈正電或凈中 性電荷。當(dāng)有機(jī)陽離子是凈正電時(shí)，它可以與陰離子如氯化物、溴化物、硫酸鹽、有機(jī)酸、乳 酸鹽和與該方法不相抵觸的任何其它陰離子一起提供。在某些實(shí)施方案中，有機(jī)陽離子的 某些正電荷由胺、酰亞胺或其他氮部分提供。有機(jī)陽離子可以額外地具有混合化學(xué)性質(zhì)， 并包括疏水性殘基、其它功能部分，和/或它可以具有參與其它類型的化學(xué)相互作用的能 力，包括例如參與氫鍵結(jié)合、疏水相互作用、鍵、金屬配位和嵌入的能力。在某些實(shí)施 方案中的有機(jī)陽離子的例子，包括但不限于氨基酸、二氨基酸、氯己定和依沙吖啶。依沙吖 啶的變體和衍生物被理解為包括9-氨基卩丫啶（aminoacridine/aminacrine)、3, 6-卩丫啶二 胺（普魯黃素）、B丫啶鎖辛（acrisorcin)、B丫啶氯（acrizane)(酷B丫啶（phenacridane))、 口丫啶橙、喹P丫因、樂殺螨（acricide)、叮啶酮、叮啶-9-羧酸、氯甲氧叮胺（acranil) (1_[ (6-氯-2-甲氧基-9-吖啶基）氨基]-3-(二乙基氨基）-2-丙醇二鹽酸鹽）、吩番紅、 吩噁嗪、吩噻嗪、叮啶黃（3, 6-二氨基-10-甲基吖啶氯化物和3, 6-二氨基吖啶）和其鹽 (例如氯化物、溴化物、硫酸鹽、乳酸鹽、葡萄糖酸鹽）。有機(jī)陽離子可以包括其它化學(xué)基團(tuán) 和官能性，只要主要靜電官能性是正的。
[0159] "有機(jī)調(diào)節(jié)劑"是指可以通過促進(jìn)要純化的期望的蛋白的聚集體解離，從而減少或 與其它試劑聯(lián)合幫助減少聚集體污染的有機(jī)化合物。有機(jī)調(diào)節(jié)劑可以包括但不限于：鹽、酰 脲、氨基酸、非離子有機(jī)聚合物、有機(jī)溶劑和表面活性劑，等等。
[0160] "有機(jī)溶劑"是指以液體狀態(tài)存在的天然存在的或合成的有機(jī)化合物。適合實(shí)踐本 發(fā)明的例子包括但不限于：乙二醇、丙二醇、二甲基亞砜、乙醇和苯氧基乙醇。
[0161] "多核苷酸"是指由共價(jià)鍵合在鏈中的多個(gè)核苷酸單體組成的生物聚合物。DNA(脫 氧核糖核酸）和RNA(核糖核酸）是多核苷酸的例子。多核苷酸可以具有形成氫鍵的高傾 向。
[0162] "蛋白"是指任意一組含有碳、氫、氧、氮以及通常含有硫的，并且主要由通過肽鍵 (peptidebound)連接的氨基酸的一條或多條鏈組成的復(fù)雜有機(jī)大分子。蛋白可為天然或 重組的來源。蛋白可以用非氨基酸部分（例如通過糖基化、聚乙二醇化或與其它化學(xué)部分 綴合）進(jìn)行修飾。蛋白的例子包括但不限于：抗體、凝血因子、酶和肽激素。
[0163] "蛋白制劑"是指含有目的蛋白的任何水溶液或大部分水溶液，例如含有細(xì)胞的細(xì) 胞培養(yǎng)收獲物、（基本上）不含細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物上清或含有來自純化階段的目的蛋白的 溶液。
[0164] "樣品上樣條件"是指含有期望的蛋白的樣品是如何上樣的，并且包括例如樣品濃 度、洗脫液電導(dǎo)率等。樣品上樣條件一般可選擇為在該條件下柱被平衡以確保進(jìn)行純化的 條件。
[0165] "固體材料"是指不溶性有機(jī)固體，其可以是顆粒狀的、結(jié)晶的、聚合的、纖維狀的、 多孔中空纖維狀的、單塊的或膜的性質(zhì)。它可以由非多孔或多孔顆粒、多孔膜、多孔濾器或 多孔單塊組成。如果是顆粒狀的，顆粒可以是大致球形或非球形，并且尺寸范圍可為小于 100nm至大于100微米。多孔顆粒的平均孔尺寸范圍可為小于10nm(微孔）至大于100nm(大 孔）的。膜中的平均孔尺寸范圍可為小于lOOnm至大于1微米。膜或單塊中的平均通道尺 寸范圍可為小于1微米至大于10微米。固體材料還可由化合物構(gòu)建組成，例如其中顆粒被 嵌入在網(wǎng)狀基質(zhì)，在膜之間形成三明治狀，或二者均有。
[0166] "過飽和的酰脲"是指在特定蛋白制劑中普遍存在的條件下含有超過其最大溶解 度的量的酰脲的溶液。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了其中的酰脲以大于在這樣的樣品 中的溶解度的量而存在的樣品，其所處的條件對(duì)于這樣的樣品來說使得這樣的酰脲的某些 部分在所述樣品中以未溶解的形式存在。
[0167] "表面活性劑（surfactant) "包括"表面活性劑（surfaceactiveagent) "例如 一類通常包含疏水部分和親水部分的有機(jī)分子，使得它們被稱為兩性的。在水溶液中的 足夠濃度下，表面活性劑可以自我結(jié)合成簇，疏水部分集中在中心處以盡量減少與水的接 觸，并且親水部分向外輻射以盡可能與水接觸。在生物制劑的存在下，尤其是那些含有具 有疏水性質(zhì)或具有疏水性質(zhì)區(qū)域的材料，表面活性劑的疏水部分傾向于自發(fā)地與疏水性材 料的一些部分結(jié)合，并通過表面活性劑的親水部分的影響增加它們的溶解度。它們還可以 被用于調(diào)節(jié)均溶解于水溶劑中的不同疏水性材料之間發(fā)生的疏水相互作用。適合實(shí)踐本 發(fā)明的某些實(shí)施方案的表面活性劑的例子包括但不限于：非離子表面活性劑如聚山梨酯 表面活性劑（例如，Tween20,聚氧乙?。?0)脫水山梨醇單月桂酸和Tween80,聚氧乙稀 (20)脫水山梨醇單月桂酸）和Triton(例如，聚乙二醇對(duì)-(1，1，3, 3-四甲基丁基）-苯 基醚），和兩性離子表面活性劑如CHAPS(3-[ (3-膽酰胺丙基）二甲氨基]-1-丙磺酸鈉）、 CHAPS0(3-[(3-膽酰胺丙基）二甲氨基]-2-羥基-1-丙磺酸鈉），和辛基葡糖苷（例如， (2R，3S，4S，5R，6R) -2-(羥甲基）-6-辛氧基環(huán)氧乙烷-3, 4, 5-三醇）。
[0168] "酰脲"是指包含一個(gè)或多個(gè)脲部分或其衍生物的天然或合成來源的環(huán)狀或非環(huán) 狀分子。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了酰脲如尿素、尿酸、乙內(nèi)酰脲、尿囊素（CAS號(hào) 97-59-6 ;尿囊素氯輕錯(cuò)、尿囊素錯(cuò)、Hemocane、脈基乙內(nèi)酰脈、5-脈基乙內(nèi)酰脈、乙酸基酰 脲、乙醛酸二酰脲、2, 5-二氧代基-4-咪唑烷基脲）、嘌呤和其衍生物。在某些實(shí)施方案中， 本發(fā)明提供了式 1?-〇)-順-(：〇-順2或1?-〇)-順-(：〇-順-(：〇-1?' 或R'R"NH-CO-NR" 'R""的 有機(jī)分子，其中相關(guān)的"R-基團(tuán)"可以是H或任何有機(jī)部分。
[0169] "病毒"或"病毒顆粒"是指只在活的宿主（主要是細(xì)菌、植物和動(dòng)物）的細(xì)胞內(nèi)復(fù) 制的超微結(jié)構(gòu)的（直徑大致為20至300nm)、代謝惰性的感染劑：由RNA或DNA核心、蛋白 外殼和（在更復(fù)雜的類型中的）周圍包膜組成。
[0170] 在某些實(shí)施方案中，抗體可以在與樣品上樣前柱被平衡的相同的緩沖液中被洗 脫。在這樣的實(shí)施方案中，本發(fā)明可以提供的優(yōu)點(diǎn)是，它可以被用于交換樣品駐留于其中的 緩沖液的目的，從其初始制劑至更適合通過其它方法進(jìn)行的后續(xù)工藝（process)的制劑。 在除了需要避免損壞抗體之外，樣品最初駐留于其中的緩沖液的組成（composition)不受 限制的同時(shí)，柱平衡緩沖液的組成必須處于不在足以引起相當(dāng)大比例的抗體結(jié)合至帶正電 的顆粒的水平的抗體上產(chǎn)生負(fù)電荷的范圍內(nèi)。合適的平衡條件，根據(jù)帶正電的多孔顆粒的 選擇和特定抗體的具體特征而改變。一般而言，柱平衡條件可為但不限于，小于〇.lmS/cm 至大于30mS/cm的電導(dǎo)率值，和小于4. 0至大于9. 0的pH值范圍。
[0171] 在某些實(shí)施方案中，其技術(shù)的目的是降低污染物水平，采用不會(huì)引起抗體基本上 結(jié)合至帶正電的顆粒的最高pH和/或最低電導(dǎo)率將是有利的。應(yīng)該理解的是，最高的pH 值和/或最低導(dǎo)電性的指導(dǎo)方針，可以根據(jù)抗體的溶解度和穩(wěn)定性的要求來調(diào)節(jié)。
[0172] 在某些實(shí)施方案中，其中電正性顆粒具有其它化學(xué)官能性，采用較低的pH值或包 括調(diào)節(jié)抗體與顆粒表面的交互性以實(shí)施本方法的添加劑可能是有必要的或有益的。最簡(jiǎn)單 的這種變體可以是加入NaCl或其它鹽。最有效的水平可以通過評(píng)估不同的NaCl濃度增量 (例如，25禮、5〇1111、10〇1111、20〇1111等）來以實(shí)驗(yàn)確定。一旦確定了有效范圍，其可以用在更 精細(xì)的增量下進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)或通過統(tǒng)計(jì)學(xué)方法的方式例如所謂的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)0)〇E)來細(xì)化。 也可以考慮替代的鹽，以及其它添加劑，包括糖、離液劑、有機(jī)溶劑和表面活性劑，等等。還 可以評(píng)估添加劑的組合，包括與各種pH值的組合。
[0173] 在某些實(shí)施方案中，在柱內(nèi)駐留的帶正電的顆?？梢跃哂袉蝹€(gè)類型或具有多個(gè)類 型，包括多孔和非多孔顆粒的組合，或具有不同孔尺寸的多孔顆粒的組合。其中，本發(fā)明采 用具有不同尺寸的孔的顆粒的組合，一個(gè)子集的顆?？梢跃哂形锢砩吓懦贵w的尺寸的 孔，而另一個(gè)子集的顆?？梢跃哂胁慌懦贵w的孔尺寸。在這樣的情況下，具有足夠大而不 排除抗體的孔的子集，可以物理上阻礙缺乏強(qiáng)負(fù)電的抗體進(jìn)入孔的方式呈遞配體。
[0174] 在某些實(shí)施方案中，該方法的緩沖液交換能力提供的優(yōu)點(diǎn)是，它尤其去除了可能 會(huì)干擾后續(xù)工藝方法的低分子量樣品成分。這顯示出本發(fā)明的某些實(shí)施方案的另一個(gè)不期 望的特征。因?yàn)橐郎尺灌ぃǜ咝Ь奂w解離劑），預(yù)計(jì)它被帶正電的多孔顆粒表面排斥。但 是，它并不與IgG抗體共洗脫。而其它帶正電的添加劑，例如聚乙烯亞胺和其它陽離子聚合 物如預(yù)期的被排斥，并在某些實(shí)施方案中確實(shí)與IgG共洗脫，它們可以通過在柱中將小增 量的帶負(fù)電顆粒與電正性多孔顆?；旌?，而相對(duì)于IgG被選擇性保留。
[0175] 在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法可以被等效應(yīng)用于IgG片段的純化，例如Fab和 F(ab'）2，以及微抗體、雙抗體、所謂的單鏈VHH結(jié)構(gòu)域、Fc融合蛋白，和可以包含與IgG類 似的電荷性質(zhì)的其它IgG衍生物構(gòu)建體。
[0176] 在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明可被用于從粗樣品或處于任何純化階段抗體的初始分 級(jí)分離；在任何情況下，示出的是本發(fā)明可以與其它純化方法組合，以實(shí)現(xiàn)特定抗體應(yīng)用所 需的整體純化程度。
[0177] 對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來說將是明顯的是，本發(fā)明還將賦予以下優(yōu)點(diǎn)：無論在樣品中 是包含還是不包含聚集體解離劑和或病毒沉淀劑或滅活劑，實(shí)現(xiàn)宿主細(xì)胞蛋白、DNA、內(nèi)毒 素和病毒的高效減少。同樣將是明顯的是，當(dāng)洗脫緩沖液的制劑落入推薦的柱平衡緩沖液 的范圍時(shí)，這些污染物的去除將被進(jìn)一步增強(qiáng)。如果所述柱想要被用于多個(gè)循環(huán)，這將需要 隨后應(yīng)用清潔緩沖液，以從柱去除仍然結(jié)合的DNA、內(nèi)毒素和/或病毒。
[0178] 本發(fā)明的其他目的和優(yōu)點(diǎn)將在接下來的說明書中被部分地闡述，并且部分地從說 明書中是明顯的，或可以通過實(shí)踐本發(fā)明而獲知。本發(fā)明的目的和優(yōu)點(diǎn)將會(huì)通過在權(quán)利要 求中指明的要素和組合的方式得以實(shí)現(xiàn)和獲得。
[0179] 應(yīng)該理解的是，前述一般性說明和接下來的詳細(xì)描述均僅為示例性的和說明性 的，并且不限制所要求保護(hù)的發(fā)明。
[0180] 在準(zhǔn)備使用本發(fā)明的某些實(shí)施方案時(shí)，必須確定相對(duì)于柱的可使用的樣品體積。 在其最簡(jiǎn)單的模式中，其中柱中所有的顆粒是帶正電的多孔顆粒，可以通過將未壓縮的重 力沉降的填充色譜床的總體積乘以〇. 4估算該值。可以通過簡(jiǎn)單的實(shí)驗(yàn)精確地確定允許的 最大樣品體積，其中柱被平衡至于適度（moderate)pH的低鹽緩沖液，并且將高鹽緩沖液中 的IgG樣品上樣，然后是接著額外的平衡緩沖液。標(biāo)記抗體開始洗脫的點(diǎn)，如在280nm處UV吸光度的增加所表明的。標(biāo)記高鹽開始洗脫的點(diǎn)，如在電導(dǎo)率的增加所表明的。在這兩處 標(biāo)記之間的體積代表所述柱每個(gè)循環(huán)的最大樣品體積。
[0181] 適合針對(duì)包括額外的顆粒而不是多孔電正性顆粒（例如具有二級(jí)化學(xué)表面的那 些）的柱實(shí)施本發(fā)明的某些實(shí)施方案的樣品體積，可以僅由帶正電荷的多孔顆粒的體積相 乘進(jìn)行估算。上面的實(shí)驗(yàn)可以被用于特異性定義最大樣品。將會(huì)明顯的是，對(duì)于給定的混 合正電和其它顆粒的柱的最大樣品體積，將會(huì)從只有正電的多孔顆粒的柱相對(duì)由非正電顆 粒占據(jù)的相對(duì)柱體積成比例地減少。
[0182] 在某些實(shí)施方案中，用于特定抗體的純化的方法的開發(fā)一般將從最簡(jiǎn)單的選項(xiàng) 的評(píng)估開始，其將會(huì)是完全以帶正電的多孔顆粒填充的柱。合適的顆?？梢杂墒袌?chǎng)上 銷售的用于實(shí)踐所謂的陰離子交換色譜技術(shù)的商業(yè)化色譜介質(zhì)組成。數(shù)十個(gè)這樣的產(chǎn) 品的例子包括Capto_Q、CaptoDEAE、QAESephadex、DEAESephadex(GEHealthcare); GigaCapQ和Q-Toyopearl(TosohBioseparations)；MacroprepDEAE、MacroprepHigh-Q、 UNOsphereQ和NuviaQ(Bio-RadLaboratories);EshmunoQ、DEAEFractogel、TMAE Fractogel(Merck)和Q-HyperD(Pall)。這樣的產(chǎn)品當(dāng)前不會(huì)在其表面標(biāo)記上其身份或二 級(jí)官能性的濃度，也沒有孔尺寸、沒有排阻極限、沒有來自它們各自采用的配體嫁接方法以 增強(qiáng)其官能性的虛擬孔尺寸、也沒有一般可從供應(yīng)商獲得的信息。應(yīng)當(dāng)預(yù)期的是，所有這樣 的產(chǎn)品包括多個(gè)物理和化學(xué)官能性，并且將會(huì)謹(jǐn)慎評(píng)估超過一個(gè)產(chǎn)品以確定哪種是固有地 最適合特定抗體的純化。在一個(gè)實(shí)施方案中，評(píng)估將會(huì)由UNOsphereQ和NuviaQ或僅由 UNOsphereQ開始。
[0183] 對(duì)于任何給定的抗體，評(píng)估柱最初被平衡至的pH和電導(dǎo)率值的范圍將是明智的。 一般來說，聚集和污染物減少最好在最高pH和最低電導(dǎo)率，其中抗體保持可溶性和穩(wěn)定， 因此，微堿性緩沖液例如20 - 50mMTris、pH8. 0的初始條件可能是起始的方便位置?？?以隨后評(píng)估更低和更高的pH值，隨著pH值低至2. 0或大于9. 0,電導(dǎo)率值范圍從小于0. 1 到大于30mS/cm。
[0184] 在某些實(shí)施方案中，評(píng)估使得洗脫的樣品適合應(yīng)用于后續(xù)純化步驟而不要求進(jìn)一 步的樣品制備的條件可能是有用的。例如，如果洗脫的樣品隨后要在pH6.0被上樣至陽離 子交換柱，可能需要將柱平衡至pH6.0。如果洗脫的樣品隨后要被上樣至羥基磷灰石柱， 采用中性pH并設(shè)置緩沖液的磷酸鹽濃度在羥基磷灰石柱所需的水平，并省略螯合劑（例如 EDTA或檸檬酸鹽）可能是合適的。在選擇平衡緩沖液用于后續(xù)分級(jí)分離方法的連續(xù)性的任 意情況下，一般將仍然評(píng)估高pH低電導(dǎo)率條件以確保在本步驟中不犧牲純化潛力。
[0185] 不被任何特定理論所束縛，據(jù)信，該方法實(shí)際上是獨(dú)立于樣品組成的。因此，在某 些實(shí)施方案中，樣品可以含有各種試劑，單獨(dú)地或組合地，以增強(qiáng)抗體聚集體或抗體一污染 物復(fù)合物的解離，或以減少DNA、內(nèi)毒素或病毒污染。在某些實(shí)施方案中，所述試劑可以包括 高達(dá)8M的尿素、高達(dá)6M的胍、還原劑、表面活性劑、有機(jī)溶劑、依沙吖啶、氯己定、苯扎氯銨、 三（正丁基）磷酸酯和亞甲基藍(lán)，等等。這些情況中的限制因素將是所加入的試劑不損壞 或沉淀抗體。取決于抗體的特征和樣品的組成，可以從小于0.001%至1%的濃度范圍有效 地應(yīng)用例如依沙吖啶和氯己定的試劑。一般來說，因?yàn)楦邼舛瓤梢砸鸪恋淼男纬桑ㄆ湓?將它們上樣至電正性多孔顆粒的柱之前，需要額外的步驟來去除它們），在大多數(shù)情況下低 濃度將會(huì)是優(yōu)選的。關(guān)于UNOsphereQ的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示0. 01至0. 05的濃度可以實(shí)現(xiàn)該構(gòu) 想，并且特別是范圍從〇. 020至0. 025%的濃度。
[0186] 在某些實(shí)施方案中，其中樣品中的抗體之前已被用如上述的試劑處理過；或是如 果該方法要針對(duì)未純化的細(xì)胞培養(yǎng)上清進(jìn)行實(shí)踐，可以通過采用具備大量二級(jí)官能性的帶 正電的多孔顆粒來增強(qiáng)該方法的性能。例子可以包括基于多孔顆粒的商業(yè)化色譜產(chǎn)品，其 包含穩(wěn)定地與二級(jí)官能性組合的正電荷。這樣的介質(zhì)通常稱為混合模式。Captoadhere(GE healthcare)是將賦予參與疏水相互作用、it-Jr鍵和氫鍵結(jié)合的能力的官能性與正電荷 組合的商業(yè)化混合模式色譜產(chǎn)品的例子。類似的組合在文獻(xiàn)中是已知的，并且可以預(yù)期其 他商業(yè)化項(xiàng)目（entries)。顯然對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來說，平衡緩沖液的制劑可能需要被修飾 以防止由二級(jí)官能性帶來的滯留或延滯。例如，在Captoadhere的情況下，可能需要比市 場(chǎng)上出售的用于陰離子交換的色譜介質(zhì)所要求的更低的pH和更高的電導(dǎo)率。但是包含二 級(jí)官能性不會(huì)損害本發(fā)明的在不管樣品組成的情況下容納（accommodate)樣品的能力，包 括在本領(lǐng)域很好理解的極高電導(dǎo)率，以直接并顯著干擾其它利用帶電色譜表面（包括帶正 電的色譜表面）的方法的功能。
[0187] 在某些實(shí)施方案中，其中樣品包括如上所述的組成，替代性地，將多孔電正性顆粒 與具備二級(jí)化學(xué)官能性的不同顆粒組合，并將兩種或幾種顆粒類型一起裝于同一柱中也可 以是有用的。具有二級(jí)官能性的顆?？梢允嵌嗫椎幕蚍嵌嗫椎?。如上，方法保持獨(dú)立于樣 品組成。同樣，平衡條件會(huì)被需要暫停抗體和二級(jí)官能性之間的相互作用所限制。例如，如 果存在具有負(fù)電荷官能性的顆粒，并且特定抗體具有結(jié)合這樣電荷的強(qiáng)烈傾向，則可能需 要提高pH和/或電導(dǎo)率。在上述情況中有利的折衷是，包含一種或更多二級(jí)官能性可能帶 來較高程度的純化。
[0188] 在某些實(shí)施方案中，其中多孔電正性顆粒與包含二級(jí)官能性的不同顆粒組合，后 者可以被層疊于電正性顆粒床的頂部之上或填充于分離的柱中，所述分離的柱可以緊接在 電正性顆粒的柱之前或緊接在其后進(jìn)行檢測(cè)。在一些實(shí)施方案中，多孔電正性顆粒可以與 具有二級(jí)官能性的分離的顆?；旌?。
[0189] 當(dāng)開發(fā)顆?；旌衔镆詢?yōu)化針對(duì)本發(fā)明的某些實(shí)施方案的特定抗體的純化時(shí)，可以 選擇二級(jí)官能性以容納特定類型污染物的增高的存在。例如，疏水二級(jí)官能性可以改善去 除疏水但不帶電的成分（例如三（正丁基）磷酸酯）的效率。電負(fù)性官能性可以改善去除 帶正電的試劑（例如依沙吖啶）的效率。電負(fù)性-疏水性二級(jí)官能性的組合可以改善去除 帶正電的疏水性污染物（例如依沙吖啶、苯扎氯銨和亞甲基藍(lán)）的效率。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，當(dāng) 它們?cè)跇悠分歇?dú)立存在時(shí)，在這樣的情況下的改善不會(huì)反映本發(fā)明天生無法去除這些污染 物；相反，它們顯示增強(qiáng)的官能性衍生自它們從其它具有抗體的穩(wěn)定復(fù)合物競(jìng)爭(zhēng)性解離這 些試劑的能力，和/或二級(jí)官能性去除能夠飽和并中和初級(jí)顆粒上的正電荷的污染物的量 的能力，所述初級(jí)顆粒是將抗體排斥進(jìn)入顆粒間空間所需要的。在某些備選實(shí)施方案中，可 以實(shí)施該方法以使得二級(jí)顆?？梢员恢苯蛹又令A(yù)先清除潛在的問題污染物的樣品，然后從 樣品分離顆粒以使得部分純化的樣品接著與柱接觸。
[0190] 當(dāng)開發(fā)顆?；旌衔镆詢?yōu)化特定抗體的純化時(shí)，可以替代性地選擇二級(jí)官能性或另 外地根據(jù)它們的能力以增強(qiáng)pH控制和/或減少將柱滴定至其期望的操作pH所需的緩沖液 體積。例如，已知當(dāng)保留于升高的電導(dǎo)率時(shí)，陰離子交換劑產(chǎn)生不受控制的暫時(shí)pH增加。當(dāng) 電導(dǎo)率降低時(shí)，它們產(chǎn)生不受控制的暫時(shí)pH降低。這些作用的幅度和持續(xù)時(shí)間隨著步驟間 的電導(dǎo)率差異、交換劑的電荷特征和緩沖液能力發(fā)生改變。陽離子交換劑遭受同樣的問題， 但是不受控制的pH偏移的方向與陰離子交換劑發(fā)生的相反。因此，將二級(jí)電負(fù)性官能性與 一級(jí)電正性官能性組合，降低了pH偏移的幅度和持續(xù)時(shí)間。官能性理想的混合可以通過實(shí) 驗(yàn)很容易地確定。
[0191] 在某些實(shí)施方案中，采用具有不同于電正性顆粒的官能性的額外顆粒，并且其中 那些不同顆粒在電正性顆粒之前混合或填充于柱中，可能需要將初始樣品從將要上樣至專 門電正性顆粒的柱的量下調(diào)至引起由于抗體擴(kuò)散進(jìn)出不同顆粒中的孔的抗體分散而發(fā)生 的樣品體積的增加。如果有的話，初始樣品體積的減少的必要程度，可以很容易地由簡(jiǎn)單實(shí) 驗(yàn)確定，其中標(biāo)準(zhǔn)是平衡緩沖液內(nèi)抗體的洗脫。
[0192] 在某些實(shí)施方案中，該方法區(qū)別于帶正電的多孔顆粒的其他應(yīng)用，是由于其有效 性獨(dú)立于緊接樣品上樣之后施加的緩沖液的組成。在許多情況下，緊接樣品上樣的是旨在 完全洗脫結(jié)合至多孔顆粒的材料的緩沖液組合物，這將是有利的。例如柱可以被平衡至大 致生理?xiàng)l件，例如50mMlfepes、0. 1MNaCl、pH7. 0。將含有1. 0M氯化鈉、pH8. 0的抗體細(xì) 胞培養(yǎng)上清以占柱體積35%的體積上樣，然后接著是2M氯化鈉、pH4.0?；旧霞兓目?體在生理Ifepes-鹽水緩沖液中洗脫。如上所述，這個(gè)的發(fā)生是因?yàn)榭贵w專門通過顆粒間空 間行進(jìn)，而Chase-緩沖液必須也通過顆粒內(nèi)孔隙空間行進(jìn)。這種方法引人注目的特點(diǎn)是， 它支持同時(shí)洗脫污染物和清潔柱的獨(dú)特能力，并具有縮短工藝循環(huán)、減少工藝時(shí)間和材料 使用的實(shí)際好處。這使得在小柱上進(jìn)行多個(gè)循環(huán)而不是在大柱上進(jìn)行單個(gè)循環(huán)很有吸引 力，其進(jìn)一步減少材料使用。
[0193] 在某些實(shí)施方案中，可能有利的是，樣品之后接著是平衡緩沖液，或較低電導(dǎo)率的 緩沖液，例如50mMTris、pH8. 0,明確目的是增強(qiáng)具有大于電正性多孔顆粒平均孔直徑的 流體動(dòng)力學(xué)尺寸的酸性污染物（例如病毒）的滯留，因?yàn)樗鼈兛赡芤云渌绞皆诳贵w的尾 部邊界洗脫，并潛在地污染它至過量和不必要的程度。達(dá)到所述柱可以包括電負(fù)性顆粒的 增量的程度，這也可以增強(qiáng)電正性污染物的去除。低電導(dǎo)率Chase-緩沖液的理想體積可以 由實(shí)驗(yàn)確定，從大約50%的填充柱體積開始。
[0194] 在某些實(shí)施方案中，該方法支持比一般用于多孔顆粒上的色譜更快的流速。這是 因?yàn)楫?dāng)質(zhì)量傳輸是對(duì)流時(shí)，抗體專門通過顆粒間空間行進(jìn)，并因此不受抗體的慢擴(kuò)散常數(shù) 的影響，也不受流速或樣品粘度的影響。因此，相比于150 - 300cm/hr的多孔顆粒色譜平常 操作，該方法可以在高達(dá)l〇〇〇cm/hr或更高的線性流速下高效實(shí)施。但是超過300cm/hr的 流速可能需要減少的樣品體積。這是因?yàn)獒槍?duì)未結(jié)合的污染物的質(zhì)量傳輸是擴(kuò)散的，隨著 流速或樣品粘度的增加變成更低的效率。過高的流速使污染物得到較少的機(jī)會(huì)來實(shí)現(xiàn)多孔 顆粒的孔中的擴(kuò)散平衡。實(shí)驗(yàn)將揭示針對(duì)任何給定抗體的理想流速和緩沖液組成的設(shè)定。
[0195] 在某些實(shí)施方案中，其中電正性多孔顆粒在具有其它表面化學(xué)性質(zhì)的多孔顆粒的 柱中被組合，通常將最大樣品體積僅基于電正性顆粒的體積是有用的。即使是這樣，可謹(jǐn)慎 地通過實(shí)驗(yàn)確定最大樣品體積，因?yàn)槿狈﹄娬员砻娴念w粒的存在，可能具有在柱中稀釋 樣品的作用。
[0196] 在某些實(shí)施方案中，具有不是電正性的表面化學(xué)性質(zhì)的顆?？梢员惶畛溆诜蛛x的 柱中，其已被與電正性顆粒的柱串聯(lián)安裝。在這樣的配置中，同樣需要注意的是關(guān)于其它化 學(xué)顆粒在具有電正性顆粒的相同柱中混合的情形所討論的那些。
[0197] 在某些實(shí)施方案中，本文所公開的方法可以被用于接著樣品制備后的初始純化步 驟。在其它實(shí)施方案中，它可以被用于中間體純化，或它可以被用于最終純化。對(duì)本領(lǐng)域 技術(shù)人員來說將是明顯的是，在任何該方法沒有被用作工藝中的最后步驟的情況下，憑借 其緩沖交換樣品的同時(shí)減少聚集體和/或污染物的能力，它具有促進(jìn)整個(gè)工藝連續(xù)性的能 力。
[0198] 在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明可以與其他純化方法組合實(shí)施。具體地，它可以與尺寸 排阻、陰離子交換、陽離子交換、疏水相互作用、優(yōu)先排阻、羥基磷灰石或其它形式或混合模 式色譜、或生物親和性色譜任意組合使用；還與沉淀、結(jié)晶和雙水相分配的方法組合。
[0199] 在獲得處理過的IgG之后，可以丟棄柱的內(nèi)容物。可選地，可以用高濃度鹽清潔 柱，然后通過再平衡恢復(fù)至起始條件，這樣它可被用于額外的循環(huán)?？梢杂煤线m的試劑（例 如氫氧化鈉）清潔所述柱。
[0200] 在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明可以是機(jī)械化和自動(dòng)化的，以增加吞吐量。例如，在某 些這樣的實(shí)施方案中，方法可以包括自動(dòng)多柱系統(tǒng)，如用于進(jìn)行模擬移動(dòng)床色譜。
[0201] 在某些實(shí)施方案中，本文所公開的方法可以有效地用于非抗體蛋白，特別是包括 具有堿性等電點(diǎn)的蛋白，如某些血漿蛋白，像補(bǔ)體Clq和間-a胰蛋白酶抑制劑或組蛋 白。在組蛋白的情況下，本發(fā)明的方法特別有利，因?yàn)闃悠房梢耘c一種或種多強(qiáng)化學(xué)解離劑 (如但不限于高濃度胍）組合，以從DNA和其它它們可能結(jié)合的污染物分離組蛋白。然后 可以根據(jù)如用于抗體的相同指導(dǎo)方針選擇平衡緩沖液。這些非IgG應(yīng)用也揭示該方法適合 用于純化其它蛋白，其中目的蛋白在混合物中是最堿性的成分，或在混合物中的最堿性成 分中，或比至少一種特定污染物更堿性，使得可以開發(fā)條件，其中目的蛋白對(duì)流通過空隙體 積，而一種或多種污染物通過顆粒的孔體積擴(kuò)散行進(jìn)或結(jié)合至顆粒表面。 實(shí)施例
[0202] 實(shí)施例1?用電正性多孔顆粒（NuviaQ,Bio-RadLaboratories)填充10mL柱，并 用50mM的組氨酸、pH7. 5進(jìn)行平衡。含有大約2mg的單克隆IgG(克隆her2)的、含有超過 20%的聚集體的2mL澄清細(xì)胞培養(yǎng)上清，以300cm/hr的流速上樣至所述柱。于平衡緩沖液 中洗脫蛋白峰，然后大量材料在樣品于其中被上樣的緩沖液通過所述柱時(shí)流穿。所述柱用 50mMH印es、2M氯化鈉的步驟洗脫，產(chǎn)生濃縮的污染物峰。在初始峰的洗脫過程中pH是穩(wěn) 定的，但在流穿材料通過過程中pH增加至8. 1，然后在鹽洗脫步驟開始時(shí)跳至大約pH8.7。 通過尺寸排阻色譜分析初始峰、后續(xù)流穿峰和洗脫峰。初始峰含有具有小于0. 1%的聚集 體濃度的大約80%的純IgG。污染物主要包含游離的過量抗體輕鏈。IgG的回收率估計(jì)大 于95%。后續(xù)流穿材料含有宿主細(xì)胞蛋白和小分子細(xì)胞培養(yǎng)基成分。洗脫峰含有DNA、一 些宿主蛋白污染物和細(xì)胞培養(yǎng)基成分。在后面的流穿和鹽洗脫級(jí)分中沒有IgG。
[0203] 實(shí)施例 2?用電正性多孔顆粒（UNOsphereQ,Bio-RadLaboratories)填充 10mL 柱，并用50mM的組氨酸、pH7. 2進(jìn)行平衡。含有大約2mg的單克隆IgG(克隆her2)的、含 有超過20%的聚集體的2mL澄清細(xì)胞培養(yǎng)上清，以300cm/hr的流速上樣至所述柱。于平 衡緩沖液中洗脫蛋白峰，然后大量材料在樣品于其中被上樣的緩沖液通過所述柱時(shí)流穿。 所述柱用50mMHepes、2M氯化鈉、pH7. 0的步驟洗脫，產(chǎn)生濃縮峰。通過尺寸排阻色譜分析 初始峰、后續(xù)流穿峰和洗脫峰。初始峰含有具有小于0. 1 %的聚集體濃度的大約80%的純IgG，和大約20%游離的過量抗體輕鏈。后續(xù)流穿材料含有宿主細(xì)胞蛋白和小分子細(xì)胞培養(yǎng) 基成分。洗脫峰含有DNA、一些宿主蛋白污染物和細(xì)胞培養(yǎng)基成分。在后面的流穿和鹽洗脫 級(jí)分中沒有IgG。
[0204] 實(shí)施例3.用電正性多孔顆粒（NuviaQ和UNOsphereQ，各5mL)填充柱并用50mM Ifepes、pH7.0進(jìn)行平衡。含有大約2mg的單克隆IgG(克隆her2)的、含有超過20%的聚集 體的2mL澄清細(xì)胞培養(yǎng)上清，以300cm/hr的流速上樣至所述柱。于平衡緩沖液中洗脫蛋白 峰，然后大量材料在樣品于其中被上樣的緩沖液通過所述柱時(shí)流穿。所述柱用50mMHepes、 2M氯化鈉的步驟洗脫，產(chǎn)生濃縮峰。通過尺寸排阻色譜分析初始峰、后續(xù)流穿峰和洗脫峰。 初始峰含有具有小于〇. 1 %的聚集體濃度的大約80%的純IgG，和大約20%游離的過量抗 體輕鏈。后續(xù)流穿材料含有宿主細(xì)胞蛋白和小分子細(xì)胞培養(yǎng)基成分。洗脫峰含有DNA、一些 宿主蛋白污染物和細(xì)胞培養(yǎng)基成分。在后面的流穿和鹽洗脫級(jí)分中沒有IgG。
[0205] 實(shí)施例4.重復(fù)實(shí)施例3的實(shí)驗(yàn)，除了用50mMH印es、50mMNaCl、pH7. 0平衡柱。 初始峰的回收率和組成與實(shí)施例3中所獲得的那些相同。
[0206] 實(shí)施例5?重復(fù)實(shí)施例3的實(shí)驗(yàn)，除了用50mMIfepes、100mMNaCl、pH7. 0平衡柱。 初始峰的回收率和組成與實(shí)施例3中所獲得的那些相同。
[0207] 實(shí)施例6?重復(fù)實(shí)施例3的實(shí)驗(yàn)，除了用50mMH印es、150mMNaCl、pH7. 0平衡柱。 初始峰的回收率和組成與實(shí)施例3中所獲得的那些相同。實(shí)施例3 - 6的結(jié)果令人驚訝地 顯示，在初始峰中所獲得IgG純度和回收率并沒有隨著平衡緩沖液鹽濃度的增加而下降。 后續(xù)實(shí)驗(yàn)顯示，回收率和純度也令人驚訝地基本上不受降低操作pH至6.0 (50mMMES)的影 響。在pH8. 0(50mMTris)也沒有發(fā)生性能的顯著改善。
[0208] 實(shí)施例7.用10mL的電正性多孔顆粒介質(zhì)（MacroprepHigh-Q)填充柱，并用50mM Hepes、pH7. 0進(jìn)行平衡。含有大約lmg的單克隆IgG(克隆her2)的澄清細(xì)胞培養(yǎng)上清， 以300cm/hr的線性流速上樣至所述柱。于平衡緩沖液中開始洗脫蛋白峰。所述峰的剩余 部分與來自原樣品的鹽一起離開柱，并還含有pH指示劑染料酚紅。在兩個(gè)峰中均發(fā)現(xiàn)了大 于95%純IgG。所有其它污染物與持續(xù)流動(dòng)的平衡緩沖液在后面洗脫，并由50mMHepes、2M NaCl、pH7.0洗脫。這表明在不同電正性介質(zhì)中分離性能的差異。
[0209] 實(shí)施例8?用10mL的電正性多孔顆粒（UNOsphereQ)與2mL還包括強(qiáng)電負(fù)性、氫 鍵結(jié)合和疏水性官能性的螯合多孔顆粒（Chelex-100)混合填充柱。用50mMHepes、200mM NaCl、pH7. 0(電導(dǎo)率21mS/cm)平衡柱。含有大約2mg的單克隆IgG(克隆her2)的2mL 澄清細(xì)胞培養(yǎng)上清，以300cm/hr的流速上樣至所述柱。于平衡緩沖液中洗脫蛋白峰，然后 大量材料隨樣品被上樣于其中的緩沖液流穿。隨后大峰被洗脫于50mMHepes、2MNaCl中。 分析SEC顯示初始峰具有小于0. 1 %的聚集體含量的大于95%的純IgG?？贵w回收率大于 95%。在11、16和31mS/cm的電導(dǎo)率值重復(fù)幾次實(shí)驗(yàn)。性能與21mS/cm和以下的所有電導(dǎo) 率值的相同。聚集體的減少與31mS的相同，但是IgG峰上升側(cè)的斜率更淺，并且回收率被 降低至90%。
[0210] 實(shí)施例9.將來自1 %水溶液的溶解的依沙吖啶攪拌加入10mL含有IgG單克隆抗 體（克隆her2)的細(xì)胞培養(yǎng)基，產(chǎn)生強(qiáng)黃色0. 02%依沙吖啶溶液。實(shí)施例8的柱用50mM 組氨酸、PH7. 5進(jìn)行平衡。將2mL黃色但光學(xué)上透明的上清上樣至柱并收集。然后用25mM Ifepes、3MNaCl、pH7.0洗脫柱，然后用25mMH印es、3M胍、pH7.0進(jìn)行清潔。收集在平衡液 中洗脫的初始峰。通過SEC分析所述級(jí)分加依沙吖啶處理的材料的樣品。在第一個(gè)峰中回 收了超過95%的IgG，純度大約80%，并且聚集體含量小于0. 1%。3MNaCl的柱洗脫去除 了大量污染物，但是依沙吖啶保持與柱結(jié)合，并被隨后用胍去除。
[0211] 實(shí)施例10.將50mg依沙吖啶攪拌加入10mL含有IgG單克隆抗體（克隆her2) 的細(xì)胞培養(yǎng)基，獲得0.5%的溶液。這引起中間體形成和致密黃色沉淀的沉降，其由過濾去 除。實(shí)施例8的柱用50mM組氨酸、pH7. 5進(jìn)行平衡。2mL來自依沙吖啶處理的黃色但光學(xué) 上透明的上清被流過柱并收集。然后用25mMH印es、3MNaCl、pH7.0洗脫柱，然后用25mM H印es、3M胍、pH7. 0進(jìn)行清潔。收集在平衡液中洗脫的初始峰。通過SEC分析所述級(jí)分加 依沙吖啶處理的材料的樣品，并與上面實(shí)施例們獲得的結(jié)果進(jìn)行比較。高濃度的依沙吖啶 導(dǎo)致IgG回收率23%的降低，和在純度上小于5%的改善，但聚集體濃度仍然被降低至小于 0. 1 %，并且如在365nm處的UV吸光度所示IgG的依沙吖啶含量為零。
[0212] 實(shí)施例11.在一系列工藝循環(huán)中制備105mL含有IgG的細(xì)胞培養(yǎng)上清，每個(gè)循環(huán) 由用 50mMH印es、100mMNaCl、pH7. 0 平衡 60mLUNOsphereQ柱，上樣 15mL的樣品，然后 上樣50mMHepes、2MNaCl、pH7. 0組成。處理的IgG隨后被上樣至固定蛋白A的柱，用于 進(jìn)行親和色譜。將蛋白A純化的結(jié)果與由105mL過濾后的細(xì)胞培養(yǎng)上清組成的未處理樣品 獲得的結(jié)果進(jìn)行對(duì)比。本發(fā)明處理的材料含有更低10倍多的DNA和宿主細(xì)胞蛋白污染物。
[0213]實(shí)施例I2?最初由約束共水合色譜（constrainedcohydrationchromatography) 純化，接著是陽離子色譜純化的IgG抗體，由本發(fā)明在以50mMTris、pH8.0平衡 的UNOshpereQ柱上進(jìn)行處理。結(jié)果與由UNOsphere上的流穿色譜（flow-through chromatography)處理的樣品進(jìn)行比較。由本發(fā)明處理的材料的宿主細(xì)胞含量，比流穿色譜 處理的材料低8倍。至于DNA去除的相對(duì)改善是不可能計(jì)算的，因?yàn)镈NA水平低于由本發(fā) 明處理的樣品中測(cè)定的檢出限。在由流穿色譜處理的樣品中測(cè)得DNA為每百萬大約23份。
[0214] 實(shí)施例13.由本發(fā)明在被平衡至50mMH印es、100mMNaCl、pH7. 0的UNOsphere Q上從細(xì)胞培養(yǎng)上清純化的IgG抗體（her2)，被上樣至輕基磷灰石柱（CHTI型，40微米）， 并用磷酸鹽梯度洗脫。這消除了游離輕鏈污染物，留下接近99%的純度的抗體。
[0215] 實(shí)施例14.由本發(fā)明在被平衡至50mMH印es、100mMNaCl、pH7. 0的UNOsphere Q上從細(xì)胞培養(yǎng)上清純化的IgG抗體（her2)，被用4份50mMMES、pH6. 0稀釋，被上樣至 陽離子交換劑（NuviaS)，并在pH6. 0被鹽梯度洗脫。這消除了游離輕鏈污染物，留下接近 99%的純度的抗體。
[0216] 實(shí)施例15.將含有IgGFab蛋白的大腸桿菌裂解物上樣至被平衡至50mMHepes、 100mMNaCl、pH7. 0的UNOsphereQ柱。如SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳所顯示，超過90%的 蛋白污染物被從Fab去除。
[0217] 實(shí)施例16.評(píng)估了各種商業(yè)化陰離子交換劑的適用性。將單個(gè)1.6cm直徑柱用 20mL每種以下介質(zhì)填充：UNOsphereQ、NuviaQ、CaptoQ、GigaCapQ、PorosHQ、快流速Q(mào) 瓊脂糖凝膠和FractogeltentacleDEAE。每個(gè)柱被平衡至50mMTris、pH8.0。將多達(dá) 5mL的50mMHepes、100mMNaCl、pH7. 0中純化的曲妥珠單抗（Herceptin)IgG的樣品上樣 至每個(gè)柱。對(duì)于UNOsphereQ和NuviaQ，觀察到IgG的完全空的分區(qū)。分區(qū)對(duì)CaptoQ是 大約95%，并且對(duì)GigaCapQ是大約85%。分區(qū)對(duì)FractogelDEAE是大約75%、對(duì)Q瓊脂 糖凝膠是大約65 %，并且對(duì)POROSHQ是50 %。
[0218] 實(shí)施例17.通過將不同抗體和片段的樣品上樣至用50mMTris、pH8.0平衡的 UNOsphereQ柱確定適用性的廣度。樣品由包括曲妥珠單抗、利妥昔單抗、阿瓦斯汀和阿達(dá) 木單抗的純化的IgG單克隆抗體組成。除了阿瓦斯汀之外，所有均有效分配（portion)。柱 用50mMTris、100mMNaCl、pH8. 0再平衡，其中所有抗體有效分區(qū)。
[0219] 實(shí)施例18.通過將來自利妥昔單抗的Fab和F(ab'）2片段上樣至實(shí)施例17中所 述的柱，來進(jìn)一步評(píng)估適用性的廣度。在50mMTris、pH8. 0中二者均有效分區(qū)。Fab樣品 的上樣，酶消化處理后其還含有殘留的Fc片段，還提供了額外的去除Fc片段的優(yōu)點(diǎn)，憑借 它們結(jié)合至交換劑并隨后因NaCl濃度的升高被洗脫。
[0220] 實(shí)施例19.通過將單克隆IgM抗體上樣至實(shí)施例17中所述的柱，來進(jìn)一步評(píng)估適 用性的廣度。所述IgM具有9.0以上的等電點(diǎn)，其意味著它將在50mMTris、pH8.0分區(qū) 良好。它并沒有這樣做，而是在當(dāng)200mMNaCl被加入平衡緩沖液中時(shí)確實(shí)有效分區(qū)。這歸 因于抗體上電荷的不均勻分布，其也可以揭示為何阿瓦斯?。▽?shí)施例17)在50mMTris、pH 8. 0中沒有分區(qū)完全。
[0221] 實(shí)施例20.曲妥珠單抗的兩步純化。將未純化的曲妥珠單抗上樣至用50mMTris、 pH8.0平衡的UNOsphereQ柱，導(dǎo)致大于99%的污染宿主細(xì)胞蛋白和DNA的去除，但與抗體 的過量游離輕鏈共洗脫。通過陽離子交換色譜、輕基磷灰石色譜或Captoadhere上的混合 模式色譜去除游離輕鏈。在陽離子交換色譜的情況下，在pH6.0所施加的NaCl梯度中去除 輕鏈，其中陽離子交換步驟在本發(fā)明或者之前或者之后運(yùn)行。在羥基磷灰石的情況下，在磷 酸鹽梯度中去除輕鏈。在Captoadhere的情況下，通過在50mMHepes、lMNaCl、pH7.0中 結(jié)合樣品，然后用其中NaCl濃度被降至最終濃度為零的線性梯度進(jìn)行洗脫柱來去除輕鏈。
[0222] 實(shí)施例21.pH和電導(dǎo)率條件的檢查。在范圍從3.0至10. 0的pH值和范圍從0至 2M的NaCl濃度，評(píng)估純化的曲妥珠單抗的分區(qū)行為。在UNOsphereQ上進(jìn)行這些實(shí)驗(yàn)。在 不加入NaCl的情況下，曲妥珠單抗在所有高達(dá)并包括pH8. 0的pH值進(jìn)行了分區(qū)。在50mM 或更高的NaCl存在下它在所有的pH值中進(jìn)行了分區(qū)。通過在范圍從4-8的pH值和范圍 從0至4M的NaCl濃度上樣未純化的曲妥珠單抗，來評(píng)估該方法的純化潛力。在最高pH和 最低電導(dǎo)率獲得最佳純化性能。在50mMTrispH8.0獲得大于99%的宿主細(xì)胞蛋白、DNA、 內(nèi)毒素和病毒的減少?？贵w回收率也大于99%。在不存在NaCl的情況下降低pH導(dǎo)致降低 的污染物減少。在pH8. 0增加NaCl濃度也導(dǎo)致降低的污染物減少。
[0223] 實(shí)施例22.電正性多孔顆粒與疏水性帶負(fù)電顆粒的組合。將20mL的UNOsphereQ 柱直接接著5mL的MacroprepT-butyl柱安裝，其被認(rèn)為是含有疏水性和陽離子交換官能 性的組合。將陽離子交換處理過的曲妥珠單抗樣品上樣。將相同的樣品僅上樣至UNOsphere Q柱。由串聯(lián)柱純化的樣品的宿主細(xì)胞蛋白含量，比專門上樣至UNOsphereQ的樣品低44% (每百萬1559份（ppm)vs2822ppm)。在后續(xù)系列中，MacroprepT-butyl改變的百分比直 接與UNOsphereQ組合：0? 5%、1 %和1.5%。無明顯顯著改善。
[0224] 實(shí)施例23.多步抗體純化。通過在0.025%的依沙吖啶存在下用1%的尿囊素處 理，從澄清的細(xì)胞培養(yǎng)上清中純化曲妥珠單抗，接著通過用三（2-氨基乙基）胺和亞氨基 二乙酸取代的顆?；旌衔镞^濾，然后通過在聚乙二醇中的空間排阻色譜捕獲初始抗體，接 著進(jìn)行陽離子交換，接著時(shí)所要求保護(hù)的發(fā)明。陽離子交換步驟之后的宿主蛋白濃度是 17ppm。本發(fā)明，于pH8.25在50mMTris中上樣，降低宿主蛋白濃度至2ppm。重復(fù)該工藝， 除了以硫酸銨取代空間排阻色譜。陽離子交換之后宿主蛋白濃度是158ppm。于pH8.25 上樣本發(fā)明，降低宿主蛋白至9ppm。由蛋白A對(duì)相同抗體的純化將宿主蛋白濃度降低至 123ppm。所要求保護(hù)的發(fā)明將其從123ppm降低至3ppm。由亞氨基二乙酸去除大多數(shù)的依 沙吖啶。在最終材料中未檢測(cè)到依沙吖啶。
[0225] 實(shí)施例24.IgG的多步純化。按照實(shí)施例23的步驟，除了將細(xì)胞培養(yǎng)上清的pH降 低至5. 5和用0. 1%的辛酸取代依沙吖啶。在將樣品流穿三（2-氨基乙基）胺和亞氨基二 乙酸的柱之后，樣品滴定至pH8.0,用于空間排阻步驟。由固定的三（2-氨基乙基）胺去除 大多數(shù)的辛酸。在最終步驟之后在抗體中未檢測(cè)到辛酸。
[0226] 實(shí)施例25.從抗體制劑去除抗病毒化合物。在分開的實(shí)驗(yàn)中，于pH8. 0向純化的 曲妥珠單抗中加入0.025 %的依沙吖啶，并且于pH5. 5向純化的曲妥珠單抗中加入0. 1% 的辛酸。通過上樣構(gòu)成被平衡至50mMTris、pH8. 25的UNOsphereQ柱體積的35%的樣 品來處理樣品。如在頂部的致密黃色帶的積累所示，依沙吖啶強(qiáng)烈結(jié)合至柱。類似地去除 了辛酸，但由于其無色的性質(zhì)而沒有明顯顯現(xiàn)。在兩種情況下，通過3M胍、pH5. 5的洗脫 再生所述柱。
[0227] 實(shí)施例26.多峰帶正電的顆粒的使用。將在50mMMES、25mMNaCl、pH6. 0中的 4mL體積含有每百萬589份污染宿主細(xì)胞蛋白的單克隆抗her2IgG的部分地純化樣品，上 樣至20mL被平衡至50mM乙酸、pH4. 0的Captoadhere柱。大約92%的抗體分區(qū)至空隙 體積。分區(qū)的IgG的宿主蛋白含量是每百萬5份，代表降低大約99%?？贵w回收率是大約 92%。從如實(shí)施例21中所述篩選的pH和鹽條件范圍中選擇操作條件。在本實(shí)施例和實(shí)施 例21中高度不同的條件突出顯示出，該方法在廣范圍的化學(xué)選擇性中有效工作，只要存在 正電荷。這兩個(gè)實(shí)施例還突出顯示，該方法跨色譜介質(zhì)類型的范圍的實(shí)用性，和簡(jiǎn)單而系統(tǒng) 化篩選以鑒定最合適的條件的能力。
[0228] 實(shí)施例27.帶正電的微多孔顆粒的使用。將在50mMH印es、50mMNaCl、pH7. 0中 的部分地純化的4mL樣品上樣至含有20mL被平衡至50mMTris、pH8. 0的QAESephadex A25。色譜圖表明抗體洗脫于空隙體積中，但鹽也開始洗脫于所述空隙體積中。推測(cè)在空隙 體積中的鹽洗脫發(fā)生是因?yàn)樵谠紭悠分衼碜喳}的鈉離子的離子排阻。45ppm的宿主細(xì)胞 蛋白也與抗體一起洗脫。隨著在每次迭代中增加鹽濃度將實(shí)驗(yàn)進(jìn)行幾次迭代重復(fù)。隨著 增加平衡鹽濃度，樣品-鹽峰更局限于所包括的體積，使得在200mMNaCl，洗脫譜基本上與 UNOsphereQ觀察到的相同。這看來與離子排阻推測(cè)一致。令人驚訝的是，污染物的去除還 隨著增加平衡鹽而增加，直到在200mMNaCl檢測(cè)不到宿主蛋白污染物的點(diǎn)。因此，這種顆 粒材料的操作特征完全遵循與UNOsphereQ在增加鹽中觀察到的相反反應(yīng)。UNOsphereQ 沒有機(jī)會(huì)早期展示如QAESephadex所觀察到的鹽離子洗脫。通過ELISA測(cè)量在該實(shí)驗(yàn)中 宿主細(xì)胞蛋白。
[0229] 實(shí)施例28.配體嫁接的帶正電的顆粒的使用。
[0230] 一般實(shí)驗(yàn)條件。
[0231] 緩沖液、鹽和試劑獲取自Sigma-Aldrich(St.Louis，MO)。在5%胎牛血清中由 SP2/0細(xì)胞產(chǎn)生大鼠IgM雜交瘤，克隆60A9。在無蛋白培養(yǎng)基中，由中國(guó)倉鼠卵巢細(xì)胞采 用三順反子載體產(chǎn)生嵌合和人源化生物相似IgG單克隆抗體（Hoetal.，J.Biotechnol. (2012) 157:130-6〖869.)。用固定化酶消化制備利妥昔單抗？(&13'）2和？313(63811〇116七al. ,J.Sep.Sci. (2009) 32:3857-etseq. ) 〇
[0232] UNOSPHERE?Q、NUVIA?Q和陶瓷羥基磷灰石CHT? 型 140ym購自Bio-Rad Laboratories(Hercules,CA)。GIGACAP?Q購自TosohBioscience(Tokyo,Japan)〇 FractogelDEAEHi-Cap購自Merck(Darmstadt,Germany)。QSEPHAROSE?快 流速、CAPTO?Q、Captoadhere、MABSELECT?(蛋白A)和SEPHADEX?G25 購自GEHealthcare(Uppsala,Sweden)。POROS?HQ-50 和XS獲取 自AppliedBiosystems(FosterCity,CA)。CIM?QA單塊獲取自BIA Separations(Klagenfurt,Austria)。SARTOBIND?Q納米膜過濾單元獲取自Sartorius-S tedim(Goettingen,Germany)。PR0SEP?-Va(蛋白A)購自Millipore(Billerica,MA) 〇
[0233] 將用于陰離子交換的基于顆粒的介質(zhì)以300cm/hr的線性流速填充于XK?16/20柱 (20mL，10cm床高；GEHealthcare)。將適配器小心放置到床的表面以避免軸向壓縮。到這 些柱的樣品被通過超容量環(huán)（superloop)嚴(yán)格上樣，以盡量減少在樣品邊界的預(yù)柱分散。 蛋白A介質(zhì)被填充于XK或TRICORN?系列柱。在200cm/hr運(yùn)行實(shí)驗(yàn)。在AKTA?Explorer 100(GEHealthcare)上進(jìn)行柱填充和色譜實(shí)驗(yàn)。
[0234] 在一些陰離子交換實(shí)驗(yàn)中，向樣品加入500mMNaCl以突出顯示抗體和鹽的相對(duì)分 布。在pH3. 0運(yùn)行的實(shí)驗(yàn)用50mM檸檬酸鹽進(jìn)行緩沖；于pH4. 0用50mM醋酸鹽；于pH5 用 25mM醋酸鹽、25mMMES;于pH6. 0 用 50mMMES;于pH7. 0 用 50mMH印es;于pH8. 0 用 50mMTris，于pH9. 0和10. 0用50mM硼酸鹽。通過將過濾的細(xì)胞培養(yǎng)上清（CCS)上樣至 用50mM磷酸鹽、100mMNaCl、pH7. 2平衡的蛋白A親和介質(zhì)來制備純化的IgG。裝載平衡 緩沖液之后洗滌柱，然后用100mM精氨酸、100mM醋酸鹽、pH3. 5(MABSELECT?)或100mM檸 檬酸鹽、pH3. 0(PR0SEP?)洗脫。在一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，通過陽離子交換色譜在POROSHSX上進(jìn)行 曲妥珠單抗的初始純化。滴定至pH6. 0的細(xì)胞培養(yǎng)上清被稀釋至2. 5mS/cm的電導(dǎo)率，并 被上樣至用50mMMES、pH6. 0平衡的柱上。這接著用平衡緩沖液洗滌，然后以線性梯度洗 脫至 50mMMES、200mMNaCl、pH6.0。
[0235] 在一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，通過如上所述的陽離子交換色譜，去除在細(xì)胞培養(yǎng)上清的陰離子 交換處理之后保留于曲妥珠單抗中的污染的游離輕鏈和輕鏈二聚體。在另一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，通 過將樣品于1MNaCl、50mMHepes、pH7.0結(jié)合至Captoadhere，然后用下降的線性梯度洗 脫至50mMIfepes、pH7.0來去除輕鏈污染物。在另一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，通過將樣品于50mMIfepes、 5mM磷酸鈉、pH7. 0結(jié)合至輕基磷灰石，然后用線性梯度洗脫至1MNaCl、5mM磷酸鹽、pH 7. 〇,再用500mM磷酸鹽、pH7. 0清潔來去除輕鏈污染物。
[0236] 在具有用50mMMES、200mM精氨酸、5mMEDTA、0. 05 %疊氮化鈉、pH6. 5平衡 的G3000SWxl柱（TosohBioscience)的ShimadzuHPLC系統(tǒng)上，由尺寸排阻色譜（SEC) 以0. 6mL/min監(jiān)測(cè)抗體聚集體。注入100yL樣品。根據(jù)制造商的建議，用來自Cygnus TechnologiesInc.CHOHCP試劑盒（Southport,NC)，由ELISA監(jiān)測(cè)宿主細(xì)胞蛋白（HCP)。根 據(jù)制造商的建議，用ACCUBLUE?高度敏感dsDNA定量試劑盒（Biotium，Inc.，Hayward,CA)， 由嵌入染料分析來測(cè)量宿主細(xì)胞DNA。采用ENDOSAFEENDOCHROME-K?LAL試劑（Charles RiverLaboratoriesInc.，Wilmington,MA)，由標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)力學(xué)顯色豐變形細(xì)胞溶解物分析來 測(cè)量?jī)?nèi)毒素水平。由CharlesRiverLaboratories(Cologne,Germany)進(jìn)行針對(duì)小鼠細(xì)小 病毒（MVM)和小鼠白血病病毒（MuLV)的感染性測(cè)試。
[0237] 曲妥珠單抗純化。在UNOsphereQ上生物相似的曲妥珠單抗的流-穿陰離子交換 色譜過程期間，在穿透級(jí)分的前緣觀察到明確界定的肩峰。肩峰的電導(dǎo)率和pH匹配柱平衡 條件。鑒于操作的pH7.0和抗體等電點(diǎn)（pl)8. 45,其結(jié)論為抗體被從交換劑表面排除并被 迫只通過空隙體積迀移。當(dāng)柱被上樣至其總體積的35%或更少時(shí)，單個(gè)群體的高度純化的 曲妥珠單抗在空隙體積內(nèi)完全洗脫，具有從如圖1中所示的大部分污染物的良好分離。
[0238] 觀察到隨著NaCl濃度高達(dá)4M峰寬逐漸增加，但分區(qū)基本上保持完整。在pH9和 10沒有觀察到分區(qū)，其歸因于抗體的凈電荷逆轉(zhuǎn)，但當(dāng)緩沖液包括50mM或更高的NaCl時(shí)其 完全恢復(fù)。這些結(jié)果表明，實(shí)現(xiàn)分區(qū)，靜電排斥不是必須的，相反分區(qū)似乎依賴于暫停靜電 引力。
[0239] 如圖1所示，在空隙體積之后鹽洗脫。這提供了緩沖液交換IgG進(jìn)入平衡緩沖液 的方式，和使分區(qū)獨(dú)立于樣品組成的并行益處，即使當(dāng)IgG被應(yīng)用于3M胍、pH5.5。由于大 多數(shù)宿主細(xì)胞蛋白（HCP)比IgG更加酸性，宿主細(xì)胞蛋白水平可以用作非IgG蛋白行為的 指標(biāo)（index)。在用50mMTris、pH8.0平衡的柱上，UNOSPHERE?Q空隙體積分區(qū)從曲妥 珠單抗細(xì)胞培養(yǎng)上清（CCS)去除99. 1 %的宿主細(xì)胞蛋白，從ProSep蛋白A純化的IgG去除 99. 5%，以及從陽離子交換純化的IgG去除99. 6%。從細(xì)胞培養(yǎng)上清的宿主細(xì)胞蛋白的去 除，隨著如圖2所示的平衡緩沖液的pH降低和NaCl濃度增加而下降。
[0240] UNOSPHERE?Q空隙體積分區(qū)還實(shí)現(xiàn)了在pH7. 0和8. 0、在低于250mM的NaCl濃 度從曲妥珠單抗細(xì)胞培養(yǎng)上清和蛋白A純化的曲妥珠單抗的99. 5%的DNA降低。在50mM Hepes、50mMNaCl、pH7.0中內(nèi)毒素降低了 99.7%。在相同條件下分級(jí)分離的樣品的病毒 感染性測(cè)試表明了，3. 5的對(duì)數(shù)降低值的小鼠細(xì)小病毒（MVM)和3. 0的對(duì)數(shù)降低值的小鼠白 血病病毒（MuLV)。
[0241] 如圖3中所示，在UNOSPHERE?Q空隙體積分區(qū)中，曲妥珠單抗與游離輕鏈和輕 鏈二聚體共洗脫（中圖）。用升高的NaCl梯度與羥基磷灰石可以去除輕鏈污染物，Capto adhere則IgG結(jié)合于1MNaCl并在下降的鹽梯度中洗脫，以及陽離子交換色譜則用升高 的NaCl梯度。在兩步步驟中，在用50mMTris、pH8.0平衡柱的情況下，陽離子交換后 接著UNOSPHERE?Q空隙體積分區(qū)將宿主細(xì)胞蛋白降低至14ppm，提供了從細(xì)胞培養(yǎng)上清 99. 99%的減少，如圖3中所示（右圖）。后面洗脫樣品-鹽-結(jié)合的肩峰的宿主細(xì)胞蛋白 含量是大約678ppm。IgG回收率高于99%。
[0242] 其它抗體和抗體片段。阿達(dá)木單抗（pi8. 25)和利妥昔單抗通過空隙體積分區(qū)與 50mMTris、pH8. 0中的曲妥珠單抗一樣有效地分區(qū)。貝伐珠單抗（pi8. 3)通過空隙體積 分區(qū)在100mMNaCl存在下有效地分區(qū)，但不是在鹽不存在的情況下。衍生自利妥昔單抗的 胃蛋白酶消化的F(ab'）2和自木瓜蛋白酶消化的Fab，通過空隙體積分區(qū)與完整的抗體一 樣有效地分區(qū)。對(duì)于Fab，與樣品-鹽共洗脫的第二個(gè)峰和后續(xù)更高鹽洗脫峰證實(shí)了如圖4 所示的殘留的Fc片段。
[0243] 該觀察結(jié)果與被認(rèn)為是空隙體積分區(qū)的基本機(jī)制是一致的，因?yàn)閬碜岳孜魡慰?的胃蛋白酶消化的Fc片段之前被顯示含有比Fab更高比例的羧基。不被任何特定理論所 束縛，已經(jīng)假定更高的羧基含量?jī)A向于結(jié)合至配體嫁接交換劑介質(zhì)中的陰離子交換基團(tuán)， 并干擾或阻止分區(qū)至空隙體積。Fc片段可以與Fab在200mMNaCl、50mMTris中被分區(qū)至 空隙體積，提供證據(jù)表明無效化靜電引力是實(shí)現(xiàn)分區(qū)的重要因素。
[0244] 鑒于空隙體積分區(qū)部分地取決于填充的多孔顆粒中低密度聚合物區(qū)域的尺寸排 阻特征，預(yù)計(jì)缺乏該特征的陰離子交換劑在空隙體積分區(qū)中就不會(huì)表現(xiàn)良好。這是用快流 速Q(mào)瓊脂糖凝膠所示出的，其通常被理解為在開放可進(jìn)入的空表面包含單層帶電基團(tuán)。只 有大約65%的曲妥珠單抗分區(qū)至空隙體積，如圖5中所示，大部分其余部分與來自所上樣 樣品的殘留的鹽共洗脫（左圖）。灌注（perfusive)顆粒陰離子交換劑支持小于50%的分 區(qū)。該觀察結(jié)果可以反映在嫁接中的區(qū)別，或可選地，橫切顆粒的對(duì)流通道的影響。膜和 單塊材料陰離子交換也不能表現(xiàn)良好，其據(jù)信是因?yàn)樗鼈內(nèi)鄙倏贵w要被排除進(jìn)入的空隙體 積。如圖5中所示，F(xiàn)ractogelDEAEHiCap實(shí)現(xiàn)大約75%的分區(qū)（中圖）。GigaCapQ實(shí) 現(xiàn)大約85%的分區(qū)；CAPTOQ大約95%。由NuviaQ和UNOSPHEREQ(圖1)實(shí)現(xiàn)完整的分 區(qū)，后者支持在IgG和樣品-鹽峰之間的最佳分離。各種交換劑的這些觀察結(jié)果表明，嫁接 可以具有對(duì)缺乏對(duì)交換劑的強(qiáng)靜電吸引的生物分子施加尺寸排阻限制的一般作用。
[0245] 曲妥珠單抗MAbSelect蛋白A洗脫液的pH被滴定至pH7. 0,然后將6. 5mL上樣 至被平衡至50mMTris、pH8. 0的UNOsphereQ的20mL柱。另一份用水單獨(dú)稀釋大約4. 5 倍以實(shí)現(xiàn)5mS/cm的電導(dǎo)率，然后使達(dá)100mg的IgG的樣品流過被平衡至50mMTris、50mM NaCl、pH8. 0的UNOsphereQ的lmL柱。HCP被空隙體積分區(qū)降至2ppm，以及被流-穿降 至3ppm。當(dāng)空隙體積分區(qū)采用每抗體單位更大體積的緩沖液和色譜介質(zhì)，它還產(chǎn)生不可預(yù) 料的將聚集體從〇. 45%降低至小于0. 05%的益處，而流-穿降低它們至僅0. 35%。
[0246] 采用空隙體積分區(qū)的本發(fā)明的方法可以提供額外的好處，這樣的方法相比其他陰 離子交換形式支持更好的工藝控制。例如，在離子交換過程中不受控制的pH偏移已經(jīng)在本 領(lǐng)域中被注意到。鹽濃度的增加從離子交換表面置換緩沖抗衡離子如H+或0IT，并可以產(chǎn) 生pH中的不受控制的增加或降低。這樣的偏移可以在幅度上超過2個(gè)pH單位，并持續(xù)幾 個(gè)柱體積。鹽濃度的降低介導(dǎo)相似的作用，具有相反的特征（sign)。在典型的流-穿陰離 子交換中，鹽濃度的變化發(fā)生于樣品上樣的開始和結(jié)束。它們的影響可以在某些情況下被 耐受，但是仍然代表主要工藝變量的失控。在采用空隙體積分區(qū)的本發(fā)明的方法中，鹽尾隨 于抗體后，因而pH偏移并不發(fā)生直到IgG已經(jīng)從柱洗脫之后，如圖6中的圖所示。這種在 鹽洗脫中的延遲和所得pH偏移可以促進(jìn)更好的性能和更好的再現(xiàn)性。
[0247] 本文所公開的和在實(shí)施例中示例的方法表明了減少大于99%的宿主蛋白、DNA和 內(nèi)毒素污染物的能力。病毒污染物可以被降低超過99. 9%，并且聚集體一般可被降低至小 于0. 05%。廣范圍樣品條件的耐受和實(shí)現(xiàn)緩沖液交換與高度的污染物去除的組合，增加了 配體嫁接陰離子交換色譜介質(zhì)作為抗體純化工具的靈活性和實(shí)用性。
[0248] 本發(fā)明可以與其它純化方法組合以實(shí)現(xiàn)更高水平的純化。這樣的其它純化方法的 例子包括但不限于，通常用于IgG純化的其它方法，如蛋白A和親和色譜的其它形式、陰離 子交換色譜、陽離子交換色譜、疏水相互作用色譜、固定金屬親和色譜和其他混合模式色譜 方法；還有沉淀、結(jié)晶和液-液萃取的方法。開發(fā)用于各種方法的合適條件和將它們與本發(fā) 明整合以實(shí)現(xiàn)特定抗體的必要純化在本領(lǐng)域技術(shù)人員能力范圍內(nèi)。
[0249] 本文所引用的所有參考文獻(xiàn)通過引用將其整體并入本文，并用于所有目的到同樣 的程度，就像每篇單個(gè)出版物或?qū)＠驅(qū)＠暾?qǐng)被特別地和單獨(dú)地指明為了所有目的通過 引用將其整體并入本文。到通過參考引入的出版物和專利或?qū)＠暾?qǐng)與說明書中所包含的 公開內(nèi)容矛盾的程度，說明書旨在取代和/或優(yōu)先于任何這樣的矛盾材料。
[0250] 在說明書和權(quán)利要求書中所有表示成分、色譜條件等的數(shù)量的數(shù)字，應(yīng)當(dāng)被理解 為在所有實(shí)例中被術(shù)語"大約"修飾。因此，除非有相反的指示，列于說明書和所附的權(quán)利 要求書中數(shù)值參數(shù)是近似值，其可以取決于本發(fā)明所尋求獲得的期望的性能而改變。
[0251] 本發(fā)明的許多修改和變型可以在不脫離其精神和范圍的情況下進(jìn)行，這將對(duì)本領(lǐng) 域技術(shù)人員是明顯的。本文所描述的具體實(shí)施方案僅作為示例的方式提供，并且不意味著 以任何方式進(jìn)行限制。意圖是本說明書和實(shí)施例被視為僅是示例性的，本發(fā)明的真實(shí)范圍 和精神被由所附的權(quán)利要求表示。
【權(quán)利要求】
1. 純化含有期望的蛋白的樣品的方法，包括以下步驟：（i)提供具有帶正電的多孔顆 粒的填充色譜柱，（ii)將所述柱平衡至樣品的期望的蛋白待洗脫的條件，（iii)將樣品與 所述柱接觸使得上樣至所述柱的樣品體積小于或等于所述柱內(nèi)帶正電的多孔顆粒的顆粒 間空間，（iv)從所述柱洗脫期望的蛋白，其中期望的蛋白處在更純的狀態(tài)并處在平衡所述 柱的條件；其中期望的蛋白是IgG抗體、IgG抗體片段、IgG抗體衍生物或IgG抗體融合蛋 白。
2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中期望的蛋白是IgG抗體。
3. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中期望的蛋白源于選自以下形式的IgG抗體：Fab片 段、F(ab'）2片段、微抗體、雙抗體、VHH結(jié)構(gòu)域、Fc-融合蛋白或具有與IgG抗體相似電荷 性質(zhì)的IgG衍生物。
4. 如權(quán)利要求1 一 3所述的方法，其中樣品可以是未純化的、中等水平純度的或高度純 化的。
5. 如權(quán)利要求1 一 4所述的方法，其中樣品體積小于所述柱內(nèi)帶正電的多孔顆粒的顆 粒間空間的99%。
6. 如權(quán)利要求5所述的方法，其中樣品體積小于所述柱內(nèi)帶正電的多孔顆粒的顆粒間 空間的95%。
7. 如權(quán)利要求6所述的方法，其中樣品體積小于所述柱內(nèi)帶正電的多孔顆粒的顆粒間 空間的90%。
8. 如權(quán)利要求7所述的方法，其中樣品體積小于所述柱內(nèi)帶正電的多孔顆粒的顆粒間 空間的80%。
9. 如權(quán)利要求8所述的方法，其中樣品體積小于所述柱內(nèi)帶正電的多孔顆粒的顆粒間 空間的70%。
10. 如權(quán)利要求9所述的方法，其中樣品體積小于所述柱內(nèi)帶正電的多孔顆粒的顆粒 間空間的10%。
11. 如權(quán)利要求10所述的方法，其中樣品體積小于所述柱內(nèi)帶正電的多孔顆粒的顆粒 間空間的5%。
12. 如權(quán)利要求1 一 4所述的方法，其中所述柱僅用帶正電的多孔顆粒填充，并且樣品 體積小于填充的柱體積的40%。
13. 如權(quán)利要求1 一 12所述的方法，其中所述柱被平衡至pH大約4至大約9。
14. 如權(quán)利要求1 一 13所述的方法，其中所述柱被平衡至電導(dǎo)率值大約0. lmS/cm至大 約 30mS/cm。
15. 如權(quán)利要求1 一 14所述的方法，其中所述柱被用具有選自以下pH范圍的緩沖液平 衡：（1)大約6. 5至大約8. 5,⑵大約6. 5至大約7. 5,以及（3)大約7. 5至大約8. 5。
16. 如權(quán)利要求14 一 15所述的方法，其中所述柱被平衡至電導(dǎo)率值大約0. lmS/cm至 大約 15mS/cm〇
17. 如權(quán)利要求1 一 16所述的方法，其中所述柱被平衡至處在或接近用于對(duì)洗出液進(jìn) 行后續(xù)純化步驟的上樣條件的條件。
18. 如權(quán)利要求1 一 17所述的方法，其中樣品的條件可為大約2至大約10的pH范圍。
19. 如權(quán)利要求1 一 18所述的方法，其中樣品的電導(dǎo)率值可為大約0. lmS/cm至大約 250mS/cm的范圍。
20. 如權(quán)利要求1 一 19所述的方法，其中平衡緩沖液的條件可為大約4至大約9的pH 范圍。
21. 如權(quán)利要求1 一 20所述的方法，其中平衡緩沖液的電導(dǎo)率值可為大約0. lmS/cm至 大約30mS/cm的范圍。
22. 如權(quán)利要求1 一 21所述的方法，其中抗體洗脫的條件可為大約4至大約9的pH范 圍。
23. 如權(quán)利要求1 一 22所述的方法，其中抗體洗脫的條件可為大約0. lmS/cm至大約 30mS/cm的電導(dǎo)率范圍。
24. 如權(quán)利要求1 一 23所述的方法，其中帶正電的多孔顆粒是陰離子交換顆粒。
25. 如權(quán)利要求24所述的方法，其中陰離子交換顆粒具有正電性，至少部分正電性是 由選自以下的部分提供的：三（2-氨基乙基）胺、聚精氨酸、聚賴氨酸、聚乙烯亞胺、聚烯 丙胺、二亞乙基氨基乙基、亞乙基二氨基、伯氨基部分、仲氨基部分、叔氨基部分和季氨基部 分。
26. 如權(quán)利要求1 一 11和13 - 25所述的方法，其中所述柱含有除電正性多孔顆粒之 外的顆粒。
27. 如權(quán)利要求26所述的方法，其中電正性多孔顆粒和額外顆粒的至少一種具有一個(gè) 或更多個(gè)選自以下的二級(jí)化學(xué)官能性：陽離子交換、疏水相互作用、氫鍵結(jié)合、相互 作用和金屬螯合。
28. 如權(quán)利要求1 一 27所述的方法，其在將樣品與所述柱接觸的步驟之前，所述方法包 括將樣品與聚集體解離劑接觸的額外步驟。
29. 如權(quán)利要求28所述的方法，其中聚集體解離劑是有機(jī)陽離子。
30. 如權(quán)利要求29所述的方法，其中有機(jī)陽離子選自：依沙吖啶、9-氨基吖啶、3, 6-吖 啶二胺（普魯黃素）、吖啶鎖辛、吖啶氯（酚吖啶）、吖啶橙、喹吖因、樂殺螨、吖啶酮、口丫 啶-9-羧酸、氯甲氧吖胺（1 - [ (6-氯-2-甲氧基-9-吖啶基）氨基]-3-(二乙基氨基）-2-丙 醇二鹽酸鹽）、吩番紅、吩噁嗪、吩噻嗪、叮啶黃（3, 6-二氨基-10-甲基吖啶氯化物和 3, 6-二氨基吖啶）、精氨酸和氯己定。
31. 如權(quán)利要求30所述的方法，其中有機(jī)陽離子是依沙吖啶、或氯己定、或精氨酸、或 它們的鹽。
32. 如權(quán)利要求31所述的方法，其中有機(jī)陽離子是依沙吖啶或其鹽。
33. 如權(quán)利要求30 - 32所述的方法，其中有機(jī)陽離子以大約0. 01 %至大約0. 05%的 量存在。
34. 如權(quán)利要求30 - 32所述的方法，其中有機(jī)陽離子以小于大約0. 01 %的量存在。
35. 如權(quán)利要求30 - 32所述的方法，其中有機(jī)陽離子以小于大約0. 005%的量存在。
36. 如權(quán)利要求30 - 32所述的方法，其中有機(jī)陽離子以小于大約0. 001 %的量存在。
37. 如權(quán)利要求30 - 32所述的方法，其中有機(jī)陽離子以大約0. 020至大約0. 025%的 量存在。
38. 如權(quán)利要求30所述的方法，其中在將樣品與所述柱接觸的步驟之前，用超過一種 選自以下的有機(jī)陽離子處理樣品：依沙吖啶、精氨酸和氯己定及它們的鹽。
39. 如權(quán)利要求38所述的方法，其中用于在將樣品與所述柱接觸的步驟之前處理樣品 的有機(jī)陽離子以小于1%的濃度提供。
40. 如權(quán)利要求38所述的方法，其中用于在將樣品與所述柱接觸的步驟之前處理樣品 的有機(jī)陽離子以大約0. 01 %至大約0. 05%的濃度提供。
41. 如權(quán)利要求38所述的方法，其中用于在將樣品與所述柱接觸的步驟之前處理樣品 的有機(jī)陽離子以小于大約0. 01 %的濃度提供。
42. 如權(quán)利要求38所述的方法，其中用于在將樣品與所述柱接觸的步驟之前處理樣品 的有機(jī)陽離子以小于大約0. 005%的濃度提供。
43. 如權(quán)利要求38所述的方法，其中用于在將樣品與所述柱接觸的步驟之前處理樣品 的有機(jī)陽離子以小于大約0. 001 %的濃度提供。
44. 如權(quán)利要求38所述的方法，其中用于在將樣品與所述柱接觸的步驟之前處理樣品 的有機(jī)陽離子以大約0. 020至大約0. 025%的濃度提供。
45. 如權(quán)利要求1 一 44所述的方法，其中在將樣品與所述柱接觸的步驟之前，將樣品額 外地與選自以下的可溶性有機(jī)調(diào)節(jié)劑接觸：非離子有機(jī)聚合物、有機(jī)溶劑、表面活性劑和酰 脲。
46. 如權(quán)利要求45所述的方法，其中將樣品與有機(jī)調(diào)節(jié)劑接觸的步驟在將樣品與有機(jī) 陽離子接觸的步驟之前發(fā)生。
47. 如權(quán)利要求45所述的方法，其中將樣品與有機(jī)調(diào)節(jié)劑接觸的步驟與將樣品與有機(jī) 陽離子接觸的步驟基本上同時(shí)發(fā)生。
48. 如權(quán)利要求45所述的方法，其中將樣品與有機(jī)調(diào)節(jié)劑接觸的步驟在將樣品與有機(jī) 陽離子接觸的步驟之后發(fā)生。
49. 如權(quán)利要求45 - 48所述的方法，其中有機(jī)調(diào)節(jié)劑是選自以下的非離子有機(jī)聚合 物：聚乙二醇、聚丙二醇和聚丁二醇。
50. 如權(quán)利要求49所述的方法，其中非離子有機(jī)聚合物具有大約500D或更小的平均分 子量。
51. 如權(quán)利要求45 - 48所述的方法，其中有機(jī)調(diào)節(jié)劑是選自以下的有機(jī)溶劑：乙二 醇、丙二醇、丁二醇、二甲亞砜、乙醇、異丙醇和苯氧基乙醇。
52. 如權(quán)利要求45 - 51所述的方法，其中有機(jī)調(diào)節(jié)劑以大約1% (w/v)或更大的濃度 提供。
53. 如權(quán)利要求45 - 48所述的方法，其中有機(jī)調(diào)節(jié)劑是選自以下的表面活性劑： Tween、triton、CHAPS、CHAPSO 和辛基葡糖苷。
54. 如權(quán)利要求53所述的方法，其中表面活性劑以大約1% (w/v)或更小的濃度提供。
55. 如權(quán)利要求53所述的方法，其中表面活性劑以大約0.1% (w/v)或更小的濃度提 供。
56. 如權(quán)利要求45 - 48所述的方法，其中有機(jī)調(diào)節(jié)劑是以亞飽和量提供的酰脲。
57. 如權(quán)利要求56所述的方法，其中酰脲選自：尿素、乙內(nèi)酰脲和尿囊素。
58. 如權(quán)利要求1 一 56所述的方法，其中在將樣品與所述柱接觸的步驟之前，將樣品額 外地與抗病毒劑接觸。
59. 如權(quán)利要求58所述的方法，其中抗病毒劑是具有至少一個(gè)正電荷的非多價(jià)有機(jī)陽 離子。
60. 如權(quán)利要求58所述的方法，其中抗病毒劑缺乏正電荷。
61. 如權(quán)利要求58 - 60所述的方法，其中抗病毒劑以小于大約1% (w/v)的量存在。
62. 如權(quán)利要求61所述的方法，其中抗病毒劑以小于大約0. 1% (w/v)的量存在。
63. 如權(quán)利要求62所述的方法，其中抗病毒劑以小于大約0.01% (w/v)的量存在。
64. 如權(quán)利要求63所述的方法，其中抗病毒劑以小于大約0.001% (w/v)的量存在。
65. 如權(quán)利要求1 一 64所述的方法，在將樣品與所述柱接觸的步驟之前，所述方法包括 以下的額外步驟：將樣品與足夠使得酰脲在樣品中過飽和的量的酰脲接觸，并將含有期望 的蛋白的上清與樣品的固體或不溶解部分分開。
66. 如權(quán)利要求65所述的方法，其中將樣品與酰脲接觸的步驟在將樣品與有機(jī)陽離子 接觸的步驟之前發(fā)生。
67. 如權(quán)利要求65所述的方法，其中將樣品與酰脲接觸的步驟與將樣品與有機(jī)陽離子 接觸的步驟基本上同時(shí)發(fā)生。
68. 如權(quán)利要求65所述的方法，其中將樣品與酰脲接觸的步驟在將樣品與混合化學(xué)性 質(zhì)的可溶性有機(jī)陽離子接觸的步驟之后發(fā)生。
69. 如權(quán)利要求65 - 68所述的方法，其中酰脲選自：尿素、尿酸、乙內(nèi)酰脲、尿囊素、尿 囊素氯羥鋁、尿囊素鋁、Hemocane、脲基乙內(nèi)酰脲、5-脲基乙內(nèi)酰脲、乙醛基酰脲、乙醛酸二 酰脲、2, 5-二氧代基-4-咪唑烷基脲和嘌呤。
70. 如權(quán)利要求69所述的方法，其中酰脲是尿囊素。
71. 如權(quán)利要求69所述的方法，其中酰脲是尿酸。
72. 如權(quán)利要求70所述的方法，其中尿囊素是以大于0.5% (w/v)的量存在。
73. 如權(quán)利要求72所述的方法，其中尿囊素是以大于大約1% (w/v)的量存在。
74. 如權(quán)利要求71所述的方法，其中尿酸是以大于0.0025% (w/v)的量存在。
75. 如權(quán)利要求74所述的方法，其中尿酸是以大于大約0. 01% (w/v)的量存在。
76. 如權(quán)利要求74所述的方法，其中尿酸是以大于大約0. 1% (w/v)的量存在。
77. 如權(quán)利要求74所述的方法，其中尿酸是以大于大約1% (w/v)的量存在。
78. 如權(quán)利要求1 一 77所述的方法，在將樣品與所述柱接觸的步驟之前，所述方法包括 去除不溶性固體的額外步驟。
79. 如權(quán)利要求78所述的步驟，其中在將樣品與有機(jī)調(diào)節(jié)劑、抗病毒劑或過飽和的酰 脲接觸的一個(gè)或更多步驟之后，進(jìn)行去除不溶性固體的步驟。
80. 如權(quán)利要求28 - 79所述的方法，其中在將樣品與有機(jī)調(diào)節(jié)劑、抗病毒劑過或飽和 的酰脲接觸的一個(gè)或更多步驟之后，將樣品與具有化學(xué)部分的固體材料接觸，所述化學(xué)部 分能夠吸附至少一部分的加至樣品的有機(jī)調(diào)節(jié)劑、抗病毒劑和酰脲。
81. 如權(quán)利要求80所述的方法，其中固體材料由加至樣品的顆粒組成并隨后從樣品分 離。
82. 如權(quán)利要求80所述的方法，其中固體材料由樣品能穿過或跨過的膜、單塊材料或 顆粒填充柱組成。
83. 如權(quán)利要求80 - 82所述的方法，其中固體材料上的化學(xué)部分可以包括一個(gè)或多個(gè) 具有陽離子交換、陰離子交換、疏水相互作用、氫鍵結(jié)合、相互作用或金屬螯合的能力 的基團(tuán)。
84. 如權(quán)利要求80 - 83所述的方法，在將樣品與具有能夠吸附至少一部分的加至樣品 的有機(jī)調(diào)節(jié)劑、抗病毒劑和酰脲的化學(xué)部分的固體材料接觸的步驟之后，并且在將樣品與 所述柱接觸的步驟之前，所述方法包括從樣品分離或從樣品去除不溶性固體的額外步驟。
85. 如權(quán)利要求1 一 84所述的方法，其中樣品含有聚集體，其中更純狀態(tài)的期望的蛋白 與樣品相比具有降低的聚集體含量。
86. 如權(quán)利要求85所述的方法，其中聚集體包括期望的蛋白的同源聚集體。
87. 如權(quán)利要求86所述的方法，其中在樣品中期望的蛋白的同源聚集體的存在基本上 被消除。
88. 如權(quán)利要求85所述的方法，其中聚集體包括期望的蛋白和污染物的異源聚集體。
89. 如權(quán)利要求88所述的方法，其中異源聚集體具備與期望的蛋白基本上相同的流體 動(dòng)力學(xué)大小。
90. 如權(quán)利要求88所述的方法，其中污染物是核酸、核苷酸、內(nèi)毒素、金屬離子、蛋白、 脂質(zhì)、或細(xì)胞培養(yǎng)基成分。
91. 如權(quán)利要求88 - 90所述的方法，其中期望的蛋白和污染物的異源聚集體的存在基 本上被消除。
92. 如權(quán)利要求1 一 91所述的方法，其中樣品含有一種或更多污染物，其中更純狀態(tài)的 期望的蛋白與樣品相比具有降低的污染物的含量。
93. 能夠便利地實(shí)施權(quán)利要求1 一 92的方法的試劑盒。
【文檔編號(hào)】C07K1/16GK104507955SQ201380040418
【公開日】2015年4月8日 申請(qǐng)日期:2013年1月21日 優(yōu)先權(quán)日:2012年5月31日
【發(fā)明者】彼得·斯坦利·加尼翁 申請(qǐng)人:新加坡科技研究局