專利名稱：Bpi-免疫球蛋白融合蛋白質(zhì)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是1992年5月19日申請的共同待批美國專利申請No.07/885，911的后續(xù)申請。
本發(fā)明總的來說涉及用于治療人體細(xì)菌感染的重組雜交融合蛋白質(zhì)，編碼這種蛋白質(zhì)的DNA順序，制備該蛋白質(zhì)的重組方法，和含有該重組產(chǎn)物的藥物制劑。本發(fā)明的雜交融合蛋白質(zhì)是編碼殺菌/通透性增強蛋白質(zhì)或其生物活性片段的DNA和編碼一個或多個免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)之DNA的直接轉(zhuǎn)錄融合的表達(dá)產(chǎn)物，該融合體已經(jīng)被摻入到合適的質(zhì)粒載體中并轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)胞中。重組產(chǎn)生的BPI-免疫球蛋白融合蛋白質(zhì)表達(dá)產(chǎn)物(以下稱為“rBPI-Ig”)可用作內(nèi)毒素結(jié)合蛋白和殺菌劑。
殺菌/通透性增強蛋白質(zhì)(以下稱為“BPI”)是一種與細(xì)菌脂多糖(以后稱“LPS”)的脂A部分結(jié)合的陽離子蛋白質(zhì)。BPI蛋白質(zhì)與細(xì)菌LPS的結(jié)合可以增強敏感性革蘭氏陰性細(xì)菌的包膜通透性[Ooi，et al.，J.Biol.Chem.，26214891(1987)]。BPI也與可溶性LPS結(jié)合。通過酸提取并結(jié)合離子交換層析或大腸桿菌(E.coli)親和層析已從多形核中性白細(xì)胞(以下稱為“PMNS”)中分離出人BPI蛋白質(zhì)(Elsbach，et al.，J.Biol.Chem.，25411000(1979);Weiss，et al.，Blood，69652(1987))。
從人PMNs中分離的完整BPI蛋白質(zhì)對革蘭氏陰性細(xì)菌具有廣譜的強殺菌活性(Elsbach，et al.，J.Biol.Chem.，25411000(1979))。這種抗菌活性似乎與分離的人全BPI蛋白質(zhì)的氨基末端區(qū)有關(guān)。相反，分離的人BPI蛋白質(zhì)的C-末端區(qū)只表現(xiàn)出少許可檢測出的抗菌活性(Ooi，et al.，J.Exp.Med.，174649(1991))。已經(jīng)克隆出編碼BPL的人DNA，并推斷出所編碼蛋白質(zhì)的氨基酸順序(Gray et al.，J.Biol.Chem.，2649505-9509(1989);美國專利No.5，198，541)。
免疫球蛋白包括一個具有許多相似結(jié)構(gòu)但重要結(jié)構(gòu)不同的蛋白家族，這些不同的重要結(jié)構(gòu)導(dǎo)致不同的抗原結(jié)合特性和其他生物學(xué)活性。例如，IgG同型抗體具有最長的血清半衰期并且易于穿過胎盤。最強的抗病毒活性與IgA同型抗體有關(guān);而IgM同型抗體具有最大的抗菌效率(Stites，et al.，Basic and Clinical Immunology，P.32(Appleton & Lange，6th ed.1987))。在免疫球蛋白家族中的每個抗體同型中還存在著幾種亞類和異型變異體(文獻(xiàn)同上)。
所謂“免疫球蛋白基因總家族”的成員一般都具有細(xì)胞外區(qū)，該區(qū)域的特征在于因二硫橋鍵形成而成多個環(huán)。這種成環(huán)出現(xiàn)在免疫球蛋白分子的重鏈恒定區(qū)中(命名為CH1，CH2，CH3和CH4)。也存在具有與免疫球蛋白總家族成員中的多成環(huán)區(qū)同源的多成環(huán)區(qū)的非免疫球蛋白化合物，這些化合物中的某些已被稱為“粘著物”(如參見PCT申請No.Wo 89102922，公布于1989年4月6號;Capon et al.，Nature，337525-531(1989))。
對于本發(fā)明特別有意義的報告是重組合成包括以粘著物部分為融合的第一成份和以免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)作為融合的第二成份的雜交融合蛋白質(zhì)。例如Harris，Eur.J，Biol.Chem.194611-620(1990)和Capon et al.，(文獻(xiàn)同上)中敘述了CD4/IgG融合的形成。這種分子的結(jié)構(gòu)設(shè)計基本原理是基于下述發(fā)現(xiàn)，即融合的粘著成份具有與免疫球蛋白成份相似的結(jié)構(gòu)，并且可望能以與免疫球蛋白成份的結(jié)構(gòu)互補的方式折疊。如Gascoigne，et al.，P.N.A.S.(USA)，842936-2940(1987)中敘述了重組嵌合T細(xì)胞受體-免疫球蛋白蛋白質(zhì)。還參見Mariuzza，et al.，J.Biol.Chem.，264(13)7310-7316(1989);Goverman，et al.，Cell 60929-939(1990);Grcgoine，et al.，P.N.A.S.(USA)，888077-8081(1991);Bismuth，et al.，Molecular lmmunol.，27(11)1127-1136(1990)(敘述了類似的T細(xì)胞受體-免疫球蛋白融合)。還報道了一種可溶性CD44-免疫球蛋白融合蛋白質(zhì)(Aruffo，et al.，Cell 611303-1313(1990))。
Ashkenazi等人(P.N.A.S.(USA)，881035(1991))，報道了使用作為腫瘤壞死因子(TNF)拮抗劑的嵌合免疫-粘著蛋白質(zhì)(一種粘著物的變體)防止內(nèi)毒素性休克。該文報道的TNF拮抗劑是一種雜交融合蛋白質(zhì)，其中TNF受體(TNFR)蛋白質(zhì)的細(xì)胞外部分融合到人IgG重鏈的恒定區(qū)上。據(jù)報道這種TNFR-IgG融合體可以結(jié)合并阻斷TNF對放線菌素D處理之細(xì)胞的細(xì)胞毒作用，并且在內(nèi)毒素之前使用它可以提供抗內(nèi)毒素攻擊的保護(hù)作用。
上述的所有融合蛋白顯然都包括了在細(xì)胞表面以整合膜蛋白形式表達(dá)的分子，并且除CD44和TNF受體之外，它們還具有免疫球蛋白基因總家族的結(jié)構(gòu)特征。
已公開的PCT申請WO 92/03535報道了BPI的氨基末端部分與編碼IgG恒定區(qū)的cDNA相融合的結(jié)構(gòu)。盡管如此，該報道還沒有說明怎樣制備這種蛋白-cDNA結(jié)構(gòu)，而且也沒有教導(dǎo)怎樣構(gòu)建許多其他類型的BPI-Ig融合體。
本發(fā)明提供了用于治療細(xì)菌感染及其后遺癥的新的雜交融合蛋白質(zhì)。還提供了編碼這種蛋白質(zhì)的DNA順序，制備該蛋白質(zhì)的重組方法，和含有該重組產(chǎn)物的藥物制劑。
根據(jù)本發(fā)明的一個方面，所提供的雜交融合蛋白質(zhì)在其氨基末端含有殺菌/通透性增強蛋白質(zhì)或其生物活性片段，它融合到形成融合蛋白質(zhì)之羧基末端的免疫球蛋白重鏈或其異型變體的至少一個恒定區(qū)上。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選方案中，該融合蛋白質(zhì)的免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)部分含有重鏈恒定區(qū)的兩個區(qū)，且最優(yōu)選的是CH2和CH3區(qū)。本發(fā)明的融合蛋白質(zhì)在免疫球蛋白和BPI區(qū)之間還具有一個免疫球蛋白絞鏈區(qū)。
用于形成本發(fā)明雜交蛋白質(zhì)的免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)可以屬于任何同型，但最好是以IgG、IgGA或IgM同型或這些同型的異變體為基礎(chǔ)的。
在本發(fā)明的此優(yōu)選方案中，雜交融合蛋白質(zhì)的氨基末端片段包括成熟人BPI蛋白質(zhì)的176至199個起始氨基末端殘基。而且，融合蛋白質(zhì)的BPI部分可以包含一個BPI類似物，其中在天然BPI序列132和135位之一或兩者的半胱氨酸被另一個氨基酸取代，較好是被丙氨酸和絲氨酸取代。如果以重組方法制備時，則以單體或同型二聚體的形式分離融合蛋白質(zhì)。
根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供了編碼上述雜交融合蛋白質(zhì)的DNA序列。還提供了包括這種DNA序列的自動復(fù)制DNA質(zhì)粒載體，以及用該DNA序列以允許其表達(dá)的方式穩(wěn)定轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞。優(yōu)選能最大程度表達(dá)蛋白質(zhì)產(chǎn)物的DNA摻入到rBPI-Ig融合載體中。本發(fā)明的轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞適用于大量生產(chǎn)融合蛋白質(zhì)的方法中，該方法包括在一種合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)宿主使之生長，并從細(xì)胞或其生長培養(yǎng)基中分離蛋白質(zhì)。
本發(fā)明還提供了含有本發(fā)明的雜交融合蛋白質(zhì)和藥學(xué)上可接受的稀釋劑、佐劑及載體物的新的藥物組合物。該組合物本身可用于治療革蘭氏陰性細(xì)菌感染及其并發(fā)癥，包括內(nèi)毒素性休克以及與之相關(guān)的一種或多種疾病如彌散性血管內(nèi)凝血、貧血、血小板減少癥，白細(xì)胞減少、成人呼吸窘迫癥、腎衰竭、高血壓、發(fā)燒及代謝性酸中毒。將BPI蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)片段或類似蛋白質(zhì)作為融合的一部分與免疫球蛋白(Ig)重鏈恒定區(qū)融合，其提供了Fc受體結(jié)合、與LPS的雙價結(jié)合、補體結(jié)合及增加胎盤穿透能力等潛在優(yōu)點。
在制備藥品級BPI產(chǎn)物過程中所遇到的問題是形成可降低產(chǎn)物均一性及活性的宏觀顆粒。因此，優(yōu)選的含rBPI-Ig融合蛋白質(zhì)的藥物組合物包含組合的Poloxamer(聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物)表面活性劑和(聚氧乙烯脫水山梨醇脂肪酸酯)表面活性劑。有關(guān)這種結(jié)合的教導(dǎo)可參見未決待審的Mc Gregor的美國專利申請No.08/012，360，這種結(jié)合在穩(wěn)定藥物活性多肽抗顆粒形成方面具有協(xié)同作用。最優(yōu)選的組合物中rBPI-Ig融合體以1mg/ml的濃度存在于枸櫞酸緩沖鹽溶液中(0.02M枸櫞酸鹽，0.15M NaCl，PH5.0)，并含有0.1%重量比Poloxamer 188(Pluronic F-68，BASF Wyandotte，Parsippany，NJ)和0.002%重量單位的聚山梨醇酯80(吐溫80，IcI americas Inc.，Wilmington，DE)。
在考慮到下文對本發(fā)明優(yōu)選實施方案所作詳細(xì)描述的情況下，本領(lǐng)域中的熟練技術(shù)人員可以顯而易見地認(rèn)識到本發(fā)明的許多其他方面內(nèi)容和優(yōu)越性。


圖1顯示了對含有本發(fā)明融合蛋白質(zhì)的柱洗脫物所作SDS-PAGE分析的結(jié)果。
圖2和3顯示可溶性的、重組產(chǎn)生的BPI(“rBPI”)和rBPI-Ig與LPS的結(jié)合。
圖4顯示固相化的rBPI-Ig與可溶性LPS的結(jié)合。
圖5顯示本發(fā)明產(chǎn)物對E.coli J5細(xì)胞的殺菌活性。
圖6和7顯示用羊抗人γ過氧化物酶測定的本發(fā)明產(chǎn)物與U937細(xì)胞的結(jié)合。
圖8顯示本發(fā)明產(chǎn)物與U937細(xì)胞表面的不同結(jié)合情況。
圖9顯示rBPI(1-199)-Ig融合蛋白質(zhì)和rBPI(1-199)與3H肝素的結(jié)合。
圖10顯示125I rBPI(1-199)-Ig融合蛋白質(zhì)和125I rBPI(1-199)在大鼠體內(nèi)的血清清除情況。
圖11顯示涉及rBPI(1-199)和rBPI(1-199)-Ig融合蛋白質(zhì)的LAL抑制檢測的結(jié)果。
下面詳細(xì)描述本發(fā)明BPI-Ig融合蛋白質(zhì)生產(chǎn)。更具體地說，實施例1涉及構(gòu)建表達(dá)本發(fā)明各種rBPI-Ig融合蛋白質(zhì)的DNA序列。實施例2涉及將實施例1的DNA導(dǎo)入到宿主細(xì)胞中并表達(dá)所編碼的蛋白質(zhì)。實施例3涉及產(chǎn)生、擴大生產(chǎn)、并分離本發(fā)明的融合蛋白質(zhì)。實施例4提供了本發(fā)明融合蛋白質(zhì)的免疫學(xué)和活性特征。實施例5提供了本發(fā)明融合蛋白質(zhì)的特性，包括結(jié)合特性、藥物動力學(xué)特性和體內(nèi)性質(zhì)。
實施例1構(gòu)建rBPI-Ig表達(dá)載體A.構(gòu)建用于表達(dá)包括IgG區(qū)的rBPI-Ig融合蛋白的載體構(gòu)建用于表達(dá)雜交融合蛋白的幾個載體，這些融合蛋白一般包括編碼BPI部分的DNA與人免疫球蛋白γ-1重鏈恒定區(qū)(IgG1HC;Fc區(qū))的一個或多個區(qū)域的直接轉(zhuǎn)錄融合體。這些載體中BPI和IgG編碼序列間連接點的確切位置各不相同。
基于起初制備的用于表達(dá)免疫球蛋白重鏈基因的載體(例如，pING 2227)構(gòu)建本文所述的用于在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)rBPI-Ig融合蛋白質(zhì)的質(zhì)粒載體。有關(guān)構(gòu)建pING 2227的描述可參見Robinson et al.，Ham.Antibod.Hybridoma)284-93，(1991)。該載體包含下述特征性結(jié)構(gòu)小鼠免疫球蛋白重鏈增強子成份，來源于小鼠Abelson病毒DNA的LTR增強子-啟動子，所要表達(dá)之基因5′末端的Sv40 16S切接點，以及在3′末端的人基因組γ-1多聚腺苷酸化序列。該載體具有可以插入所要表達(dá)之基因的SalI和SstII克隆位點。該載體還含有一個在SV40早期啟動子控制下的可選擇標(biāo)志(neo)，以及用于在大腸桿菌中生長所必需的pBR322序列。衍生于pING2227的載體pING2237N含有一個在獨特AatII位點處被導(dǎo)入到衍生于pBR322的pING2227序列中的唯一NotI位點。pING2237N并不含有所說的neo可選擇標(biāo)志基因，而是含有一個如Simonsen等人(P.N.A.S.(USA)，802495-2499(1983))所述的改變了的小鼠二氫葉酸還原酶(“DHFR”)基因序列。用于下述某些rBPI-Ig構(gòu)建的質(zhì)粒pMB27基本上相同于pING2237N，其中結(jié)合了一個對嵌合H65的重鏈編碼區(qū)具有特異性的DNA插頭，后者是一個抗由小鼠可變區(qū)和人IgG1恒定區(qū)組成的CD5的抗體。
用表達(dá)載體pING4503作為編碼重組表達(dá)產(chǎn)物的DNA的一個來源，所說的重組表達(dá)產(chǎn)物被命名為“rBPI(1-199)”，即一個具有如SEQ ID Nos1和2中所列出的成熟人BPI之N末端31殘基信號序列和前199個氨基酸的多肽，不同的只是在151位的纈氨酸以GTG表示而不是GTC，且185位殘基是谷氨酸(由GAG表示)而不是賴氨酸(由AAG表示)。本文定名的BPI產(chǎn)物“rBPI(1-199)”以往稱為“rBPI-23”，并且全rBPI蛋白質(zhì)以前被稱為“rBPI-50”(如參見Gazzano-Santoro，et al.，Infection and Immunity，604754-4761(1992)、共同申請人的未決待審美國專利申請No.07/885，911)。將pING4503中的BPI編碼DNA插入到該載體中的獨特SalI和SstII位點中。質(zhì)粒pING4503除了以一個gpt可選擇性標(biāo)志代替DHFR以外，基本上是與pING 2237N相同的。
設(shè)計兩個載體，質(zhì)粒pING4511和質(zhì)粒pING4512，用于使編碼LBPI的30bp 5′非翻譯區(qū)、信號序列和前191個氨基酸的DNA在讀碼內(nèi)以平頭接點與IgG HC DNA序列相融合。
1.構(gòu)建pING4511為了構(gòu)建pING4511，用AlwNI切割質(zhì)粒pING4503，并用T4 DNA聚合酶將其末端填成平頭，然后再用SalI切割此DNA。所得到的約700 bp SalI/平頭DNA片段包含有30 bp 5′未翻譯序列和編碼BPI之信號及前191個氨基酸的DNA，并用凝膠純化該片段。使用下列引物從質(zhì)粒pMB27(如上所述)中PCR擴增IgG HC序列(1)設(shè)計具有序列5′-CGTATGGCCAGCACCTGAACTCCT-3′(SEQ.I.D.NO.3)的引物CH2-Msc，以用于進(jìn)行上鏈擴增，并在擴增的CH2區(qū)之5′端導(dǎo)入一個MscI位點(IGGCCA)。
(2)設(shè)計具有序列5′-GAGGGCTTTGTTGGAGA-3′(SEQ.I.D.NO.4)的引物KAQ-γ3，以用于從pMB27中IgG HC的SstII位點序列下游(3′)開始下鏈擴增。
使用GeneAmp PCR Kit藥盒(Perkin-Elmer Cetus，Norwalk，CT)按照廠商提供的程序完成PCR擴增。典型的PCR擴增反應(yīng)運行30個循環(huán)，包括在94℃下變性1分鐘，在55℃下退火2分鐘，在72℃下延伸3分鐘，最后在72℃下延伸10分鐘。用MscI和SstII消化用上述引物擴增的DNA，并凝膠純化所產(chǎn)生的約1856p片段。該片段的5′(平頭)端被設(shè)計為相當(dāng)于緊接在鉸鏈區(qū)之后的位于IgG HC之CH2區(qū)5′端的序列“PAPELL……”(SEQ ID NO5);3′端則與CH2區(qū)內(nèi)的獨特SstII位點相對應(yīng)。將此片段與SalI/平頭BPI DNA片段(如上述)一起連接到來源于pMB27的SalI/SstII消化的載體片段中，以產(chǎn)生質(zhì)粒pING4511。測定pING 4511中平頭BPI-IgG連接處的序列后，發(fā)現(xiàn)MscI位點沒有被消化，并因而可知融合蛋白質(zhì)的IgG部分與BPI部分不在同一的翻譯閱讀框架中。因此不用該質(zhì)粒轉(zhuǎn)染哺乳動物細(xì)胞，但用它作為下述其他載體構(gòu)建中的片段來源。
2.構(gòu)建pING4512使用與構(gòu)建pING4511所用方法相似的方法構(gòu)建pING4512，包括將編碼30 bp 5′未翻譯區(qū)的DNA序列、信號序列和BPI的前191個氨基酸與IgG HC序列融合，后者還包括IgG HC的鉸鏈區(qū)。使用引物KAOγ3和具有序列5′-CAGTTTAAAACTCACACATGCCCACC-3′(SEQ.I.D.NO.6)的引物CH2-ZC-Dra對來源于pMB27的IgG部分進(jìn)行PCR擴增，并設(shè)計為在擴增片段的5′端導(dǎo)入一個DraI位點(TTTAAA)。用DraI和SstII消化擴增的PCR片段，并凝膠純化所產(chǎn)生的約210 bp的片段。將此片段的5′(平頭)末端設(shè)計為與序列“KTHTCPPC……”(SEQ.I.D.NO.7)(也即IgG重鏈鉸鏈區(qū)的上游4個殘基)相對應(yīng);3′端則與CH2區(qū)中的獨特SstII位點相對應(yīng)。然后將此片段與來源于pING 4503的約700 bp SalI/平頭BPI片段(如上述)一起連接到來源于pMB27的SalI/SstII切割的載體上以產(chǎn)生pING 4512。根據(jù)對pING 4512中平頭BPI-IgG連接點的序列測定，發(fā)現(xiàn)DraI位點沒有被消化。該IgG部分與BPI部分位于同一的閱讀框架中，并且在BPI和IgG HC間的連接處插入了編碼氨基酸Gln-Phe的序列5′-CAGTTT-3′。質(zhì)粒pING 4512已寄存于美國典型培養(yǎng)物保藏中心，12301 Parklawn Drive，Rockville，MD 20852 USA，保藏日期1992年5月12日，登記號ATCC 75239。
3.構(gòu)建pING 4514和pING 4515構(gòu)建兩個rBPI-IgG融合載體，即質(zhì)粒pING 4514和pING 4515，它們都含有融合到IgG序列上的30 bp 5′未翻譯序列、信號序列和人BPI的起始199個氨基末端氨基酸。使用位于成熟BPI序列前199個氨基酸內(nèi)的引物BPI-55′-AGCTTCCCAGTTCCCAG-3′(SEQ.I.D.NO.8)和與BPI片段序列的3′端相對應(yīng)的(也即穿過殘基199的)BPI-115′-TATTTTGGTCATTACTGGCAGAGT-3′(SEQ.I.D.NO.9)在pING 4503內(nèi)對BPI片段DNA插入物的3′端進(jìn)行PCR擴增來完成對上述兩個載體的構(gòu)建。用Bst BI(載體中唯一的BPI編碼區(qū)中的一個位點)切割所產(chǎn)生的PCR片段，然后純化該代表通過氨基酸199的BPI氨基末端片段之3′端的100bp DNA片段。為了構(gòu)建pING 4514(它代表了BPI片段DNA與不帶免疫球蛋白鉸鏈區(qū)之IgG HC的融合)，將下列3個片段連接在一起100bp BstBI/平頭BPI 3′末端片段、來源于pING 4511的MscI-SstII IgG HC片段和來源于pING 4511的BstBI-SstII載體。質(zhì)粒pING 4511已寄存于美國典型培養(yǎng)物保藏中心，12301 Parklawn Drive，Rockville，MD 20852 USA，保藏日期1992年5月12日，登記號ATCC 75240。為了構(gòu)建pING 4515(代表BPI片段DNA與包括鉸鏈區(qū)之IgG HC序列的融合)，將下列3個片段連接在一起100bp BstBI/平頭rBPI(1-199)3′端片段;來源于pING 4512的DraI/SstII IgG HC片段和來源于載體pING 4511的BstBI-SstII片段。質(zhì)粒pING 4515已寄存于美國典型培養(yǎng)物保藏中心，12301 Parklawn Drive，Rockville，MD 20852 USA，保藏日期1992年5月12日，登記號ATCC 75241。
4.構(gòu)建pING 4528構(gòu)建一個BPI-IgG融合載體，其中BPI信號序列置于rBPI的殘基61-191(也即缺失成熟BPI的1-60位殘基)的編碼區(qū)之前，并且與編碼IgG HC之鉸鏈-CH2-CH3區(qū)的DNA融合。為了獲得編碼BPI信號序列的片段，用EagI消化一種含有與pING 4503中相同的BPI DNA插入物的質(zhì)粒PIC110，該質(zhì)粒分別在5′和3′端帶有SalI和SstII位點，并已克隆到pT7T3 18U(Pharmacia，Uppsala，Sweden)的SmaI位點中。用T4 DNA聚合酶將該末端修成平頭，再用SalI消化該DNA。對產(chǎn)生的大約123 bp SalI/平頭片段(代表30 bp的5′未翻譯DNA和BPI信號序列)進(jìn)行凝膠純化。用質(zhì)粒pING 4512(如上述)獲得一個含有融合到IgG HC序列上的BPI殘基61-191之編碼區(qū)的片段。用EcoRI消化pING 4512以在編碼殘基60-61(Glu-Phe，GAATTC)的區(qū)域切割該BPI序列。這樣產(chǎn)生一個46p的5′突出端AATT。為了使該片段的5′端變成平頭，并且使之在讀碼內(nèi)以殘基61位(Phe，TTC)開始，只在脫氨三磷酸腺苷存在的情況下用T4 DNA聚合酶填充下鏈的3′縮入端，而留下一個2堿基對5′突出端AA。用綠豆核酸酶處理以去掉5′突出端，產(chǎn)生所需平頭。用DraⅢ(位于3′聚腺苷酸化區(qū)中的唯一位點)從載體中切下包括某些3′旁側(cè)載體序列的所需rBPI-Ig編碼DNA片段。對所產(chǎn)生的平端/DraⅢ 1963 bp片段進(jìn)行凝膠純化。然后連接下列3個片段以構(gòu)建pING 4528約123 bp SalI/平端BPI信號序列片段，含平端/DraⅢ rBPI-Ig的片段，和來源于pING 4506(基本上相似于上述rBPI表達(dá)載體pING 4503，但含有一個gpt標(biāo)志)的SalI/DraⅢ載體片段。
5.構(gòu)建其他載體上述的載體pING 4511，pING 4512，pING 4514和pING 4515均含有小鼠二氫葉酸還原酶(DHFR)基因作為選擇標(biāo)志。可構(gòu)建含有rBPI-IgG融合和其他可選擇標(biāo)志的相似載體。例如，pING 4529含有一個與pING 4512所含插入物相同的DNA插入物，但該載體含有g(shù)pt選擇標(biāo)志而不是DHFR。
使用本文所述的方法可以構(gòu)建其他的可在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)的載體(代表編碼BPI序列之DNA與編碼IgG重鏈序列之DNA的融合)。例如，融合的BPI部分可以包括BPI序列的任何部分缺失，而不是上述的特定缺失。另外，BPI序列的部分又可以是被取代、改變或突變的，或者是利用它們的組合。IgG部分可由重鏈恒定區(qū)序列的任何部分組成。
B.構(gòu)建載體以用于表達(dá)包括IgM區(qū)的rBPI-Ig融合蛋白質(zhì)使用含有在pBR 322中克隆的人IgM重鏈基因組DNA的質(zhì)粒pJB 123作為IgM HC恒定區(qū)DNA序列的來源。從EMBL數(shù)據(jù)庫中獲得人IgM HC恒定區(qū)的DNA序列，登錄號X14940。從pJB 123(得自P.Leder)中切下一個1672 bp PstI片段，并將其亞克隆到質(zhì)粒pTTT3 18U(Pharmacia)的PstI位點中，以產(chǎn)生質(zhì)粒pICI09。切下的PstI片段包括IgM HC的部分DNA序列，該序列從正好在CH2區(qū)之前的內(nèi)含子的3′端開始，并延伸到位于IgM序列的CH4區(qū)和第一膜外顯子之間內(nèi)含子中。切下的PstI序列還進(jìn)一步編碼外顯子，以編碼IgM HC的CH2，CH3和CH4區(qū)，包括干擾序列。按下述方法獲得用于構(gòu)建rBPI-IgM融合載體的部分Ig M DNA序列。用PstI切割質(zhì)粒pICI09。用T4 DNA聚合酶將末端修成平頭，然后用BanI切下插入物的3′端。用凝膠純化所產(chǎn)生的1456 bp片段。該片段的5′平頭包括一個額外的GTG，用于編碼纈氨酸，它位于CH2外顯子的編碼區(qū)之前。因BanI在該片段的3′端消化，而將DNA在位于CH4外顯子末端的終止密碼子上游切掉11個堿基對。為了再構(gòu)建CH4的3′端并置入一個SstII位點以有利于克隆到哺乳動物表達(dá)載體中，合成兩個互補的寡核苷酸具有序列5′-GCACCTGCTACTGACCGC-3′(SEQ.I.D.NO.10)的“IgM-BS接頭”和具有序列5′-GGTCAGTAGCAG-3′(SEQ.I.D.NO.11)的“IgM-SB接頭”。使這兩個寡核苷酸退火，產(chǎn)生一個帶BanI和SstII粘性末端的小接頭片段。為了得到最后的表達(dá)載體，將平端/BanI IgM片段(含CH2，CH3和CH4區(qū))和BanI/SstII接頭片段與100bp Bst BI/平頭BPI 3′末端片段(如上文3，A部分中所述)一起連接到來源于pING 4506的Bst BI-SstII載體片段上;其中pING 4506是一個結(jié)合有特異性限定信號肽的DNA插入物和rBPI(1-199)殘基并且包括gpt選擇基因的表達(dá)載體。所得到的載體被命名為pING 4517。質(zhì)粒pING 4517已寄存于美國典型培養(yǎng)物保藏中心，12301 Parklawn Drive，Rockville，MD 20852 USA，保藏日期1992年5月12日，登記號ATCC 75242。
C.構(gòu)建用于表達(dá)rBPIala132-Ig融合蛋白質(zhì)的載體構(gòu)建含有BPI N末端片段的表達(dá)載體，其中第132位殘基的半胱氨酸被丙氨酸取代。重組產(chǎn)生的這種類型的類似物一般命名為“rBPIala132”，而含有這種類似物并已融合到免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)的融合蛋白質(zhì)一般定名為“rBPIala132-Ig”。構(gòu)建用于表達(dá)rBPIala132-IgG融合蛋白質(zhì)的三個載體，其中融合蛋白質(zhì)的rBPIala132部分包含BPI N末端的前191或176個氨基酸(分別命名為“rBPI(1-191)ala132-Ig”和“rBPI(1-176)ala132”。
1.構(gòu)建pING 4531為了獲得含有已融合到IgG重鏈恒定區(qū)上之“rBPI”(1-191)ala132的pING 4531，首先構(gòu)建質(zhì)粒pING 4519。有關(guān)pING 4519的構(gòu)建在共同申請人的未決待審美國專利申請No.08/013，801(Theofan)中已作了詳細(xì)描述。簡言之，就是使用只在編碼rBPI(1-191)的DNA中出現(xiàn)過一次并位于132和135位半胱氨酸殘基之間的PvuII位點(CAGCTG)構(gòu)建pING4519。用SalI和SstII消化pING 4530，以獲得編碼BPI(1-199)片段并包括一個31氨基酸信號序列的DNA，其中pING 4503是一個含有位于特有SalI和SstII位點之間的BPI(1-199)片段、小鼠免疫球蛋白重鏈增強子成份、來源于Abelso小鼠白血病病毒(A-MuLv)DNA的LTR增強子-啟動子成份，位于待表達(dá)基因5′端的SV40 19 S/16S切接接頭，和位于待表達(dá)基因3′端的人基因組γ-1聚腺苷酸化位點的載體。
純化含有BPI(1-199)的SalI-SstII片段并用PvuII消化，產(chǎn)生一個大約529 bp的SalI-PvuII片段和一個大約209 bp的PvuII-SstII片段，然后分別純化這兩個片段。
質(zhì)粒pING 4519含有一個BPI編碼插入物，其中132位編碼半胱氨酸的密碼子被該位點編碼丙氨酸的密碼子所取代。為了造成這一取代，使用引物BPI-6，AAGCTTGTCGACCAGGCCTTGAGGT(SEQ ID NO.12)和BPI-14，CTGGAGGCGGTGATGGTG(SEQ ID NO.13)對上述BPI編碼序列進(jìn)行PCR擴增，其中所說的引物已摻入了編碼132位丙氨酸所必需的堿基取代。使用Gene Amp PCR藥盒(Perkin Elmer Cetus，Norwalk，CT)，按照廠方推薦的程序完成PCR擴增。用SalI消化所產(chǎn)生的PCR片段得到一個526 bp SalI平端片段，將該片段與上述的大約209 bp的PvuII-SstII片段和用SalI-SstII消化pING 4503所得到的大載體片段相連接，以產(chǎn)生pING 4519。
用AlwNI消化pING 4519，用T4聚合酶處理，并用SalI消化產(chǎn)生一個含有rBPI(1-199)ala132之殘基(1-191)的約700 bp片段，從而構(gòu)建成有意義質(zhì)粒pING 4531。然后，用DraI和DraⅢ消化pING 4512，產(chǎn)生一個大約1565 bp片段，它含有融合蛋白質(zhì)的免疫球蛋白部分和額外的下游載體序列。最后，用DraⅢ和SalI消化pING 4513，并純化含有g(shù)pt標(biāo)志的大載體片段。連接上述的3個載體片段產(chǎn)生pING 4531。
2.構(gòu)建pING 4534和pING 4535質(zhì)粒pING 4534含有BPI-Ig融合體，該融合體包含一個截短形式的rBPI，其中包括BPI N末端的起始176個氨基酸，并且其中存在有132位丙氨酸對半胱氨酸的取代(命名為“rBPI”(1-176)ala132)。另外，pING 4534只含有IgG重鏈的CH2和CH3區(qū)。為了獲得截短的rBPI(1-176)ala132類似物，用BstBI消化編碼rBPI(1-199)的DNA，以在167位氨基酸之后切斷之。使用兩個已退火的互補寡核苷酸，BPI-24，5′-CGAAACAAGATGAACAGCCAGGTCTGCGAG-3′(SEQ ID NO14)和BPI-25，5′-CTCGCAGACCTGGCTGTTCATCTTGTTT-3′(SEQ ID NO15)取代額外的BPI序列(即168-176位氨基酸)。
連接下列片段以構(gòu)建含有編碼rBPI(1-176)ala132-Ig融合蛋白質(zhì)之DNA的載體pING 4534來源于含有全部載體序列和編碼rBPI(1-176)ala132DNA之pINF 4531的SstII-BstI片段，來源于pING 4511的大約186 bp MscI-SstII片段和經(jīng)退火B(yǎng)PI-24和BPI-25所產(chǎn)生的BstBI平頭片段。
質(zhì)粒pING 4535除還含有一個免疫球蛋白鉸鏈區(qū)外與pING 4534相同。使用下列3個片段構(gòu)建質(zhì)粒pING 4535含有SstII-Bst BI載體和來源于pING 4531之BPI的片段，來源于pING 4512的約210 bp的DraI-SstII免疫球蛋白編碼片段，和通過退火B(yǎng)PI-24和BPI-25所產(chǎn)生的BstBI平頭片段。
D.構(gòu)建用于表達(dá)rBPI-Ig融合蛋白質(zhì)的最佳載體1.構(gòu)建具有最佳表達(dá)所需之成份的含rBPI的載體構(gòu)建含有適于最佳表達(dá)rBPI-Ig融合蛋白質(zhì)所需之DNA序列的質(zhì)粒。為了完成此過程，使用以前公開于共同申請人(Theofan等人)的未決待審美國專利申請No.08/013，801中的幾個質(zhì)粒作為最佳表達(dá)融合蛋白質(zhì)所需成份的來源。這種所需成份包括但不限于最佳化Kozak翻譯起始序列和小鼠輕鏈轉(zhuǎn)錄終止序列。
質(zhì)粒pING 4533含有rBPI(1-199)ala132，它帶有一個起始ATG，與相符Kozak翻譯起始序列GCCACCRCCATGG(SEQ ID NO16)[Kozak，Nucl.Acids Res.，158125(1982)]相連。使用已在BPI信號的-27位ATG(蛋氨酸)之前摻入SalI限制性位點和核苷酸GCCACC的PCR引物BPI-23ACTGTCGACGCCACCATGGCCAGGGGC(SEQ ID NO17)和與rBPI(1-199)編碼序列之3′端相對應(yīng)的引物BPI-2CCGCGGCTCGAGCTATATTTTGGTCAT(SEQ ID NO18)，從含有全長度BPI cDNA[在pGEM-7zf(+)中)的質(zhì)粒進(jìn)行BPI序列的PCR擴增而制得該載體。
用SalI和EcoRI消化約700 bp PCR擴增的DNA，并純化所得的包含大約前3個BPI(1-199)編碼序列的270 bp片段。將SalI-EcoRI片段連接到兩個其他片段上(1)來源于pING 4519的420 bp EcoRI-SstII片段，它編碼BPI(1-199)的剩余部分，其中在132位丙氨酸取代半胱氨酸;和(2)來源于pING 4502的約800 bp SstII-SalI載體片段(一個基本上相似于pING 4503的載體，不同的是它不包含有30 bp 5′未翻譯序列并且具有一個gpt標(biāo)志而不是DHFR標(biāo)志)，以產(chǎn)生含有g(shù)pt標(biāo)志的pING 4533。
還構(gòu)建另一個載體系列，這些載體含有在構(gòu)建用于最佳化表達(dá)基因產(chǎn)物的含BPI-Ig融合體之載體過程中所用的成份。這些載體以pING 4537為基礎(chǔ)，后者是一個與pING 4533基本相似的載體，但它含有人輕鏈聚腺苷酸化序列和小鼠輕鏈轉(zhuǎn)錄終止序列而不是pING 4533中的人重鏈序列。從pING 3170中獲得小鼠κ3′序列，該載體編碼人輕鏈cDNA并包含小鼠基因組輕鏈3′轉(zhuǎn)錄終止序列。完成這一過程需要用SstI消化，切下小鼠輕鏈終止密碼子的35 bp下游，用T4 DNA聚合酶處理以造成平頭，然后用BamHI切割，并純化包括小鼠κappa 3′序列的約1350堿基對片段。所得到的片段包括大約250 bp的人輕鏈恒定區(qū)cDNA的3′部分和聚腺苷酸化信號，后接如Lui等人在J.lmmunol.1393521(1987)中所述稱為△8構(gòu)件的BamHI接頭。該約1350堿基對片段的剩余部分包括一個BglII-BamHI小鼠κ3′基因組片段，即Xu等人在J.Biol.Chem.，2613838(1986)中所述的“D”片段，并且由它提供轉(zhuǎn)錄終止序列。此片段可用于與下述來源于pING 4533的兩個片段進(jìn)行的三段連接-3044堿基對片段，它包括所有的BPI插入物和經(jīng)用SstII消化、T4聚合酶處理及NotI消化獲得之載體的一部分，以及一個約4574 bp的Bam HI-NotI片段。所產(chǎn)生的載體pING 4537除了上述的在基因組3′未翻譯區(qū)中的差異外，基本相同于pING 4533。
使用pING 4537作為κ3′片段的來源構(gòu)建含κ3′未翻譯序列的其他載體。用XhoI(它在緊跟BPI終止密碼子之后的特有XhoI位點切割)和BamHI消化pING 4537并分離這樣的片段。將產(chǎn)生的約1360 bp XhoI-BamHI片段用于一系列的3片段連接以產(chǎn)生兩個載體，這兩個載體在信號序列的-27位殘基處都含最佳化Kozak翻譯起始序列。其中的第一個載體pING 4543含有g(shù)pt標(biāo)志，并可通過將來源于pING 4223的4574 bp BamHI-NotI片段與大約3019 bp的含NotI-XhoI BPI插入物的片段及pING 4537 XhoI-BamHI片段相連接而得到。第二個載體pING 4146含有DHFR標(biāo)志，并可通過將pING 4222約4159堿基對的BamHI-NtoI片段與約3019堿基對的含pING 4223 NotI-XhoI BPI插入物的片段及pING 4537的XhoI-BamHI片段相連接而得到。
2.構(gòu)建用于表達(dá)rBPI-Ig融合蛋白質(zhì)的載體構(gòu)建含有編碼rBPI-Ig融合蛋白質(zhì)之DNA的表達(dá)載體，它包含上部分所述質(zhì)粒最佳化表達(dá)融合蛋白質(zhì)所需的成份。
這些載體中的第一個載體pING 4156包含如pING 4512中的相同BPI編碼區(qū)，并可使用來自下列三個其他構(gòu)造的載體片段構(gòu)建而成1)來源于pING 4143的270 bp SalI-EcoRI片段，它包含KozaK序列和BPI編碼區(qū)的大約前三分之一;
2)通過用XhoI消化，用T4聚合酶修成平頭和用SalI切割而從pING 4143獲得的載體序列;以及3)來源于pING 4512的大約1092 bp EcoRI-NaeI片段，其含有經(jīng)過氨基酸191的BPI序列之剩余部分和免疫球蛋白序列。
第二個載體，pING 4157，含有一個已融合到免疫球蛋白鉸鏈-CH2-CH3區(qū)上的編碼rBPI(1-176)的DNA插入物，其可通過三片段連接組裝而成。第一片段是一個來源于pING 4145(一個除在132位含有野生型半胱氨酸外基本上與上述的pING 4143相同的載體)的590 bp SalI-BstBI片段。將此片段連接到用XhoI消化pING 4145并用T4聚合酶將末端修成平頭，再用SalI切割而獲得的載體序列上。第三個連接片段是來源于pING 4535的約720 bp BstBI-NaeI片段。由于pING 4156和pING 4157都含有g(shù)pt標(biāo)志，故可根據(jù)已知技術(shù)構(gòu)建含其他標(biāo)志，如his或DHFR的構(gòu)件，如包括前部分所述的那些。這樣的兩個載體是pING 4158和pING 4159，它們除了都含有DHFR標(biāo)志而取代gpt外，分別與pING 4156和pING 4157相同。
現(xiàn)將含有rBPI-Ig融合蛋白質(zhì)的所有前述載體構(gòu)建總結(jié)于下列表1中。

實施例2A.轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞以生產(chǎn)rBPI-Ig融合蛋白質(zhì)哺乳動物細(xì)胞是生產(chǎn)本發(fā)明蛋白質(zhì)的優(yōu)選宿主細(xì)胞，因為這種細(xì)胞可以分泌雜二聚體和多聚體蛋白質(zhì)并使之合適地折疊，還可以提供翻譯后修飾如原序列(pro-sequence)加工和糖基化。
可以用作生產(chǎn)本發(fā)明rBPI-IgG融合體之宿主的哺乳動物細(xì)胞包括淋巴源細(xì)胞，如雜交瘤Sp2/0-Ag14(ATCC CRL 1581)和成纖維細(xì)胞源細(xì)胞，如Vero細(xì)胞(ATCC CRL 81)，CHO-K1，CHO-DXB11，或CHO-DG44。后一個細(xì)胞系(從Dr.Lawrence Chasin，Columbia University處獲得的CHO Toronto的一種DHFR突變體)保存于加有10%胎牛血清并補充有谷氨酰胺/青霉素/鏈霉素的Ham's F12培養(yǎng)基中(Irvine Scientific，Irvine，CA)。
運用Wigler等人(Cell，11223(1977))的磷酸鈣方法用線性化的pING 4512，pING 4514或pING 4515 DNA(40μg，用PvuI消化，酚-氯仿提取和乙醇沉淀)轉(zhuǎn)染CHO-DG 44細(xì)胞。磷酸鈣處理之后，將細(xì)胞置于T75燒瓶中，使其在含有無核苷之αMEM培養(yǎng)基(Irvine Scientific)和補充有透析的胎牛血清(用4L冷的0.15 NaCl在4℃下以6000-800截留分子量將100ML血清透析16小時)的選擇性培養(yǎng)基中生長獲得轉(zhuǎn)染體。未轉(zhuǎn)染的CHO-DG 44細(xì)胞不能在這種培養(yǎng)基中生長，因為它們具有DHFR突變，并在連續(xù)補充選擇性培養(yǎng)基過程中被除去。在1.5至2周時，只觀察到由轉(zhuǎn)染細(xì)胞組成的小菌落。對于pING 4512和pING 4514來說，通過胰酶消化和在96孔平板中限制性稀釋進(jìn)行亞克隆而從燒瓶中除去轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。對于pING 4515來說，使轉(zhuǎn)染的細(xì)胞在補充有0.1μM氨甲蝶呤的選擇性培養(yǎng)基中以混合培養(yǎng)物的形式生長。然后通過胰酶消化和在96孔平板中限制性稀釋進(jìn)行亞克隆而從燒瓶中除去氨甲蝶呤抗性細(xì)胞。
用抗γELISA法分析亞克隆是否在培養(yǎng)上清中含有IgG反應(yīng)性蛋白質(zhì)。在該項分析中，用羊α-人γ抗血清預(yù)包被Immulon-II96孔平板(Dynatech)。然后加入上清液樣品，并用過氧化物酶標(biāo)記的羊抗人γ抗血清檢測結(jié)合的α人γ反應(yīng)性蛋白質(zhì)。對于pING 4512和pING 4515轉(zhuǎn)染體來說，在選擇性αMEM培養(yǎng)基中擴展15個有最好生產(chǎn)能力的陽性克隆。然后使pING 4512轉(zhuǎn)染體在補充有0.1μM氨甲蝶呤的選擇性培養(yǎng)基上生長。對于pING 4514來說，使最佳生產(chǎn)能力的15個陽性克隆在補充有0.1μM氨甲蝶呤的選擇性αMEM培養(yǎng)基中擴展。用α-γELISA法在不活動的48孔培養(yǎng)物中再次估測亞克隆的生產(chǎn)能力。對于pING 4512和pING 4515轉(zhuǎn)染體來說，根據(jù)γELISA測定結(jié)果，最佳分離物分別分泌大約5和10μg/ml。由γELISA測得pING 4514轉(zhuǎn)染體的單個最佳亞克隆分泌了大約10μg/ml。用γELISA法測知最佳pING 4512亞克隆的上清液在抗BPI ELISA分析中也表現(xiàn)陽性。從pING4512和pING 4515轉(zhuǎn)染體的每個中選擇三個分離物，并從pING 4514轉(zhuǎn)染體中選擇四個分離物以用于進(jìn)一步研究。每一組中有最佳生產(chǎn)能力的亞克隆產(chǎn)生的rBPI-IgG融合蛋白質(zhì)均按比例增加。最佳生產(chǎn)克隆是pING 4512(克隆100M，菌株C1551)，pING 4514(克隆8D7，菌株C1552)和pING 4515(克隆4E6，菌株C1549)。這三個細(xì)胞系已寄存于美國典型培養(yǎng)物保藏中心，12301 Parklawn Drive，Rockville，MD20852 USA，保藏時期1992年5月12日，登記號分別是ATCC CRL 11043，ATCC CRL11044，和ATCC CRL 11042。
實施例35.在滾軸瓶中成比例地增殖并產(chǎn)生BPI-IgG融合蛋白質(zhì)利用在滾軸瓶中生長來產(chǎn)生含rBPI-IgG融合蛋白質(zhì)的細(xì)胞。使用質(zhì)粒pING 4512進(jìn)行下面的生長，分離和測定步驟，并且是作為一舉例給出的?？梢詫㈩愃频姆椒ㄓ糜诒景l(fā)明的其他質(zhì)粒，這對于本領(lǐng)域中的普通熟練技術(shù)人員來說是顯而易見的。對于每個滾軸瓶，均用轉(zhuǎn)染的細(xì)胞接種T150燒瓶(含59ml無核苷的αMEM和10%透析的胎牛血清)，并使細(xì)胞生長會合(約3-4天)。然后用胰酶消化該細(xì)胞，并轉(zhuǎn)移到含500ml Ham's F12培養(yǎng)基和10%胎牛血清的900cm2滾軸瓶中，使之生長會合(約3天)。一旦細(xì)胞會合，去除Ham's F12培養(yǎng)基，并更換500ml HB-CHO無血清培養(yǎng)基(Irvine Scientific，Irvine CA)。以前曾發(fā)現(xiàn)，向滾軸瓶中的HB-CHO培養(yǎng)基中加入無菌S-Sepharose小珠(Pharmacia，fast-flow ＃17-0511-01)可以達(dá)到從滾軸瓶中最佳純化重組BPI片段的目的(參見共同申請人Grinna的未決待審美國專利申請No.07/885，501;也可參見共同申請人最近提交的美國專利請No._(代理案卷號No.27129/31405)，其公開內(nèi)容作為參考被本發(fā)明引用)。首先清洗小珠并高壓滅菌(121℃滅菌20分鐘，10ml一份)，然后無菌操作加入到各滾軸瓶內(nèi)的HB-CHO培養(yǎng)基中。將細(xì)胞在37℃下保溫3天，此時去除培養(yǎng)基/小珠。按下述方法從無菌小珠上純化rBPI-IgG融合產(chǎn)物。還可以用回收的細(xì)胞在含Sepharose小珠的新鮮HB-CHO培養(yǎng)基中進(jìn)行第二次和第三次生產(chǎn)循環(huán)(2天/循環(huán))，以便增加每個滾軸瓶中的rBPI-IgG產(chǎn)量?？梢杂肨燒瓶替代滾軸瓶來完成類似步驟。
B.分離rBPI-Ig融合體從滾瓶中取出生長培養(yǎng)基和S-Sepharose樹脂，收集在一起并放置至少15分鐘使S-Sepharose沉降在容器底部。傾出大量培養(yǎng)基和澄清的樹脂，并通過過濾裝置如多孔過濾盤進(jìn)行過濾，以除去細(xì)胞，并保留S-Sepharose。傾去培養(yǎng)基后，將S-Sepharose懸浮于醋酸鹽緩沖液中(該緩沖液含20mM醋酸鈉/醋酸，PH4.0，并含0.1M NaCl)輕輕攪拌，使之沉降10分鐘。然后傾去緩沖液，將小量S-Sepharose轉(zhuǎn)移到合適大小的液相層析柱上。用Econocolumn柱(BioRad，Richmond，CA)(2.5×10cm)分析從3-5個滾瓶中收集的20-40克S-Sepharose樹脂樣品。用0.1M NaCl-醋酸鹽緩沖液洗填充的S-Sepharose柱直到洗脫物的A280吸收值等于0.1M NaCL-醋酸鹽緩沖液的吸收值。用0.7M NaCL-乙酸鹽緩沖液、1.0M NaCL-乙酸鹽緩沖液和1.5M NaCL-乙酸鹽緩沖液連續(xù)洗柱。收集各部分。主要在1.5M NaCL-乙酸鹽緩沖液部分中洗脫出rBPI-IgG融合蛋白質(zhì)。
實施例4A.產(chǎn)生抗rBPI(1-199)的多克隆抗血清為了舉例說明，將由pING 4512 DNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞表達(dá)的BPI-Ig融合蛋白質(zhì)用于本實施例的方法。用純化的rBPI(1-199)片段作為抗原在兔(Cocalico Biologicals，Reamstown，PA)體內(nèi)產(chǎn)生多克隆抗血清。發(fā)現(xiàn)兔抗血清與激發(fā)抗原和重組BPI全蛋白質(zhì)(“rBPI-50”)以及rBPI-IgG融合蛋白質(zhì)(pING 4512的表達(dá)產(chǎn)物)具有交叉反應(yīng)活性，不過對激發(fā)抗原的免疫反應(yīng)活性要比對全蛋白質(zhì)rBPI或融合蛋白質(zhì)的免疫反應(yīng)活性大。該抗體可有效地用于ELISA，Western印跡分析和免疫沉淀，并且在大多數(shù)情況下以大于1∶2000的稀釋度使用。
B.SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳和Western印跡分析步驟在還原條件下用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)方法分離從S-Sepharose柱(如實施例2所述)的1.5M NaCL-乙酸鹽緩沖液洗脫物中得到的含有由pING 4512分泌之融合蛋白質(zhì)的蛋白樣品。首先調(diào)整樣品至含有小于0.5ml NaCl，然后加入冰冷的丙酮達(dá)到最終75%的丙酮濃度使之沉淀。然后以大于10，000rpm的轉(zhuǎn)速離心5到10分鐘使得到的蛋白沉淀物沉淀成團塊。除去上清，將沉淀物懸浮于凝膠樣品緩沖液中，該緩沖液含有8M尿素、2%SDS、60mM Tris HCl，PH6.8，加有或不加50mM二硫蘇糖醇。將懸浮樣品和合適的蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)品(BioRad，Richmond，CA and BRL，Bethesda，MD)分別加熱至95℃ 3-5分鐘，然后裝到均一百分比或線性百分比的聚丙烯酰胺凝膠(BioRad)上，并使用小Protean II型凝膠電泳設(shè)備(BioRad)進(jìn)行分離。電泳之后，對凝膠直接進(jìn)行考馬斯(Coomassie)染色(0.5%考馬斯亮蘭-R，25%異丙醇，10%乙酸，染色1小時，用10%甲醇，10%乙醇脫色)，或者將其用于電轉(zhuǎn)移。將SDS-PAGE分離的蛋白質(zhì)在硝化纖維素(BA85，Schleicher and Schuell，keene，NH)或PVDF(lmmobilon-P，Millipore，Bedford，MA)膜上與合適的預(yù)染色的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)(BioRad)一起進(jìn)行電遷移。在10% CAPS(環(huán)己氨基-1-丙磺酸)，10%甲醇，PH11.5中以0.5安培轉(zhuǎn)移20分鐘。將產(chǎn)生的印跡用于氨基酸測序，或者用蛋白-A-金處理以檢測IgG重鏈，或用1∶2000稀釋度的兔抗rBPI抗體處理再用1-1000稀釋度的過氧化物酶結(jié)合的羊抗兔抗體處理以檢測rBPI。為了進(jìn)行rBPI Western印跡分析，使用Western Lite Chemiluminescent Detection System(Tropix System，Bed ford，MA)根據(jù)廠家的說明展現(xiàn)印跡。使用0.25%的明膠代替Tropix I-Blook，并且在電轉(zhuǎn)移時不使膜干燥。將處理過的膜暴露于Cronex 4膠片(Dupont，Wilmington，DE)。
圖1顯示從pING 4512產(chǎn)生的BPI-Ig融合蛋白質(zhì)的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳的結(jié)果。左泳道是考馬斯蘭染色的凝膠。將中間和右泳道的譜帶電轉(zhuǎn)稀到PVDF膜上，并按Western印跡分析處理方式進(jìn)行處理。中間泳道是用蛋白-A-金產(chǎn)生的印跡用于檢測人IgG。右側(cè)泳道是用兔抗BPI抗體處理接著用過氧化物酶結(jié)合的羊抗兔抗體處理并用Western Lite Chemiluminescent Detection Kit藥盒檢測而產(chǎn)生的印跡(如實施例4所述)。
C.分子量測定按B部分所述，用SDS-PAGE和繼后的考馬斯染色對用1.5M NaCL-乙酸鹽緩沖液從S-Sepharose上洗脫的樣品進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)作為主要成份，是具有表觀分子量95，000至110，000道爾頓并與rBPI-IgG融合蛋白質(zhì)的高二聚體大小相對應(yīng)的蛋白質(zhì)。在還原條件下，該100kd蛋白質(zhì)具有表觀分子量45，000至50，000道爾頓，與所說融合蛋白的單體大小相符。
D.氨基末端氨基酸序列將實施例2所述的S-Sepharose柱的1.5M NaCL-乙酸鹽緩沖液洗脫物加在12% SDS-聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳，并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上進(jìn)行考馬斯染色，觀察到100kd蛋白譜帶，然后從膜上切下該譜帶，用氣相序列測定儀(Applied Biosystems，Model 470A)對其進(jìn)行氨基末端氨基酸序列測定。測定該100kd蛋白質(zhì)的氨基末端氨基酸序列是Val-Asn-Pro-Gly-Val-Val(SEQ.I.D.No.19)。這個序列與由體內(nèi)分泌途徑在信號序列的氨基酸-1和+1之間裂解信號序列所產(chǎn)生的氨基末端序列相一致。
E.融合蛋白質(zhì)之雜交特性的證據(jù)將相同的1.5M NaCL-乙酸鹽緩沖液洗脫物樣品在SDS聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳，電轉(zhuǎn)移到PVDF膜上用于Western印跡分析。用蛋白-A-金進(jìn)行Western分析直接檢測融合蛋白質(zhì)的IgG重鏈部分。結(jié)果表明100kd譜帶含有IgG蛋白序列。對使用兔抗-BPI(1-199)抗體處理過的同一電轉(zhuǎn)移的樣品進(jìn)行Western分析以檢測rBPI-IgG融合蛋白質(zhì)的BPI部分。此Western分析表明在95kd至110kd區(qū)中存在BPI免疫反應(yīng)活性蛋白質(zhì)，而在小于95KD和大于110KD的區(qū)內(nèi)只有很小量的BPI特異性免疫反應(yīng)活性。對由質(zhì)粒pING 4512產(chǎn)生的rBPI-IgG融合蛋白質(zhì)進(jìn)行的Western印跡分析示于圖1中，其中左泳道是考馬斯染色的，中間泳道是用蛋白-A-金產(chǎn)生的，而右側(cè)泳道是用兔抗體產(chǎn)生的。
F.活性檢測與BPI氨基末端區(qū)相對應(yīng)的片段呈現(xiàn)有BPI的臨床相關(guān)活性。這些活性包括革蘭氏陰性細(xì)胞中的通透增強活性和殺菌活性(Elsbach，et al.J.Biol.Chem.，26214891(1987))，以及它結(jié)合可溶性脂多糖(LPS)和中和中性白細(xì)胞之激活作用的能力。rBPI-IgG融合蛋白質(zhì)具有這些活性表明該融合蛋白質(zhì)的BPI部分是處于正確的折疊狀態(tài)。融合蛋白質(zhì)的CH2-CH3(Fc)部分應(yīng)表現(xiàn)出Fc受體和補體結(jié)合活性。這些活性的存在表明融合蛋白質(zhì)的Fc區(qū)也是處于正確的折疊狀態(tài)。進(jìn)行幾種試驗以檢測由CHO細(xì)胞純化的各種融合蛋白質(zhì)的BPI和Fc相關(guān)活性。
1.脂多糖-Western分析法使用上述用于蛋白質(zhì)SDS-PAGE的15% SDS-聚丙烯酰胺凝膠以凝膠電泳法將大腸桿菌(菌株0111-B4)或明尼蘇達(dá)沙門氏菌(Rd突變體)脂多糖(LPS，Sigma，st.Louis，MO)樣品分成每份20μg至60μg的劑量范圍。電泳之后，按照上述轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)的方法用CAPS緩沖液將LPS樣品與預(yù)染色的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)樣品(BioRad)一起從聚丙烯酰胺凝膠上電轉(zhuǎn)移到硝化纖維素(BA 85，SChleicher和Schuell)上。將該膜于37℃在30mg/ml BAS、50mM Tris、0.2M NaCl、PH7.4(TBS)中浸漬30分鐘，然后將此膜于21°-24℃下在含有2-4μg部分純化的rBPI-IgG融合蛋白質(zhì)或?qū)φ罩亟M蛋白質(zhì)[rBPI(1-199)或全rBPI]的TBS溶液中保溫12-18小時以處理這些LPS印跡。然后用TBS洗滌該膜，在30分鐘內(nèi)更換至少3次溶液。然后將該膜在1∶1000稀釋度的兔抗rBPI(1-199)抗體在TBS、1mg/ml BSA中制成的溶液中保溫3小時。洗滌至少3次后，使用上述B部分所述的Western Lite ChemiLuminescent Detection System處理該膜。對LPS凝膠的一式兩個泳道進(jìn)行銀染色，在圖2和3中分別給出了Rd.明尼蘇達(dá)沙門氏菌(S.minnesota)和(0111-B4)結(jié)合的結(jié)果。每個凝膠最左側(cè)的泳道是銀染色的LPS。如圖所示，從質(zhì)粒pING 4512產(chǎn)生的rBPI-IgG融合蛋白質(zhì)與固定在硝化纖維素上的LPS的結(jié)合相同或更好于對照重組蛋白質(zhì)，rBPI(1-199)及全rBPI。
2.脂多糖俘獲試驗將終體積50μl有不同稀釋度的rBPI-IgG樣品和重組BPI蛋白質(zhì)[rBPI(1-199)或全rBPI]結(jié)合到含PBS的96孔1mmulon-2型干底多孔平板(Dynetech Labs)上。結(jié)合之后，用0.05%吐溫-20和PBS洗平板，并在37℃下與含大腸桿菌0111-B4或明尼蘇達(dá)沙門氏菌Rd脂多糖(20pg)的0.05%吐溫-20、BPS一起保溫2小時。然后用0.05%吐溫-20、BPS強烈地洗該平板，用Limulus Amebocyte Lysate藥盒(Whitlaker，Walkersville，MD)顯影，在EL309微平板自動閱讀器(Bioteck Instruments，Winooski，VT)上于405nm處讀數(shù)。結(jié)果圖示于圖4中，該結(jié)果顯示固相化的rBPI-IgG與可溶性LPS的結(jié)合相同或更好于對照重組蛋白質(zhì)，rBPI(1-199)或全rBPI。
具體地講，圖4顯示了不含LPS的樣品(柱A)、不含BPI的樣品(柱B)，只含LPS的樣品(柱C)，含pING 4512產(chǎn)生的rBPI-IgG融合蛋白質(zhì)的樣品(柱D)，含rBPI(1-199)的樣品(柱E)或含全rBPI(柱F)樣品的LPS俘獲試驗結(jié)果。
3.大腸桿菌生長檢測法可以幾種方法測定BPI的殺菌活性。在所有這些方法中，加入大約100mM氯化鎂可以減小或消除BPI的殺菌效果。一種測試方法是對本發(fā)明的rBPI-IgG融合蛋白質(zhì)進(jìn)行培養(yǎng)液生長抑制試驗。
該檢測法是以用BPI片段或rBPI-IgG融合蛋白質(zhì)處理大腸桿菌后的培養(yǎng)液生長抑制為基礎(chǔ)的。檢測中所用的細(xì)胞是J5細(xì)胞(一種帶有短鏈LPS的大腸桿菌“粗糙”菌株)，該細(xì)胞已在三乙醇胺緩沖的礦物鹽培養(yǎng)基(Simon，et al.，Pro.Nat′l.Acad.Sci.(USA)，51877(1964))中生長以使得該細(xì)胞對BPI的作用尤其敏感。洗滌該細(xì)胞，并再懸浮于0.9% NaCl中達(dá)到大約5×108/ml的濃度。然后將大約5×106至1×107個細(xì)胞與5μg/ml pING 4512和pING 4514 rBPI-IgG融合蛋白質(zhì)或重組蛋白質(zhì)rBPI(1-199)在總量為200-400μl的緩沖液(10% Hanks平衡鹽水、40mM Tris-HCl，pH7.5，0.1%酪蛋白氨基酸)中保溫30分鐘。還在100mM MgCl2存在下將融合蛋白質(zhì)再與大腸桿菌一起保溫。單獨與rBPI-IgG融合蛋白質(zhì)或rBPI(1-199)片段一起保溫后，用補充有0.9% NaCl的10體積營養(yǎng)培養(yǎng)液稀釋細(xì)胞，使之生長幾小時。如圖5所示，結(jié)果表明融合蛋白質(zhì)基本上保留了與rBPI(1-199)蛋白質(zhì)相關(guān)的殺菌活性，其中A線代表用pING 4512產(chǎn)生的融合蛋白質(zhì)和鎂處理;B行代表用pING 4514和鎂處理，C線代表對照組[只有緩沖液];D線代表用pING 4514產(chǎn)生的融合蛋白質(zhì)處理;E線代表用pING 4512產(chǎn)生的融合蛋白質(zhì)處理;F線代表用BPI(1-199)處理。正如所預(yù)料的，此活性可被氯化鎂抑制。用pING 4515 rBPI-IgG融合蛋白質(zhì)可以獲得類似結(jié)果。
4.Fc受體結(jié)合測試驗使用人單核細(xì)胞系U937檢查rBPI-Ig融合蛋白質(zhì)與Fc受體的結(jié)合，其中細(xì)胞系已知可表達(dá)高親和性FcR1(CD64)受體(kd＝10-8-10-9)和低親和性Fc RII(CD32)受體(kd＝10-7或更高)。
為了進(jìn)行此試驗，將存在于DMEM+1% BSA中的U937細(xì)胞在4℃下與濃度為100nM至0.8nM的兩種rBPI-Ig融合蛋白質(zhì)(來源于pING 4512和pING 4514)中的任一種或濃度為67至0.5mM的嵌合小鼠-人抗體陽性對照蛋白質(zhì)一起于V形底96孔平板中保溫3小時。然后用DMEM+1% BSA將細(xì)胞洗3次(200μl/洗滌;4℃下以1000 RPM離心平板)。向平板孔內(nèi)加入羊α-γ過氧化物酶(1/4000稀釋)或α-κ過氧化物酶(1/1000稀釋)，并將細(xì)胞在室溫下保溫1小時。按上述方法洗3次后，向各孔內(nèi)加入100μl顯色劑(溶于12.5ml枸櫞酸鹽緩沖液+5μl H2O2中的5mg鄰苯二胺二鹽酸化物[O-PD]并在室溫下將平板保溫15-20分鐘。加入100μl/孔1.8M H2SO4以終止顯色，并測定A490處的吸光率。
用α-γ和α-κ抗體測定的結(jié)果分別示于圖6和7中，結(jié)果表明rBPI-Ig融合蛋白質(zhì)和嵌合H65 IgG對照蛋白質(zhì)都結(jié)合到U937細(xì)胞上。在圖6和圖7中，線C代表嵌合H65 IgG對照蛋白質(zhì);線B代表由pING 4514產(chǎn)生的BPI-Ig融合蛋白質(zhì);線A代表pING 4512產(chǎn)生的BPI-Ig融合蛋白質(zhì)。這些蛋白質(zhì)與U937細(xì)胞的相對親和性估算如下pING 4512產(chǎn)物＝～7nM;pING 4514產(chǎn)物＝～4nM;嵌合H65 IgG＝～0.2nM。這些結(jié)果提示高親和性受體(FcRI)可被rBPI-Ig融合蛋白質(zhì)和嵌合H65 IgG兩者結(jié)合。但是，不能排除rBPI-IgG融合蛋白質(zhì)與其他受體(可能是低親合性FcRII)的結(jié)合，因為在飽和狀態(tài)下這些融合蛋白質(zhì)的吸收值(A490＝2.0)明顯地大于嵌合IgG在飽和狀態(tài)下的吸收值(A490＝0.4)。這些結(jié)果還說明融合蛋白質(zhì)可比嵌合IgG結(jié)合更多的受體或者說明對融合蛋白質(zhì)用α-γ抗體檢測結(jié)合的融合蛋白質(zhì)比檢測結(jié)合的嵌合IgG更有效。還用U937檢測了幾個其他的IgG′s(與pING 4512融合蛋白質(zhì)白比較)，并且這些IgG的行為類似于嵌合H65 IgG。用U937和pING 4512融合蛋白質(zhì)表達(dá)產(chǎn)物，嵌合H65及rBPI(1-199)進(jìn)行如上述的類似實驗，但是用兔α-人BPI抗血清檢測結(jié)合在細(xì)胞表面上的rBPI-Ig。如圖8所示，(其中A線代表pING 4512產(chǎn)生的BPI-Ig融合蛋白質(zhì);B線代表rBPI(1-199);和C線代表嵌合H65 IgG對照蛋白質(zhì))結(jié)果表明只有rBPI-Ig融合蛋白質(zhì)可在U937細(xì)胞表面上被檢測出。
實施例5rBPI-Ig融合蛋白質(zhì)的特性檢測本發(fā)明rBPI-Ig融合蛋白質(zhì)結(jié)合肝素的能力、該融合蛋白質(zhì)的藥物動力學(xué)特性、體內(nèi)活性和LAL抑制作用。
A.比較rBPI-Ig和rBPI(1-199)的肝素結(jié)合能力使用直接3H-肝素結(jié)合實驗分析rBPI(1-199)和rBPI-Ig融合蛋白質(zhì)與肝素的竟?fàn)幮越Y(jié)合。該實驗是基于衍生尼龍膜能以高容量結(jié)合蛋白質(zhì)。事先將這種膜摻入到Millipoe Corp.公司(Bedford MA)(Multiscreen IP Plates)產(chǎn)生的96孔微量滴定板的底部，并且可以從每個孔中取出以進(jìn)行閃爍計數(shù)。
為了進(jìn)行這一試驗，將用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)(PH7.4)稀釋的rBPI(1-199)或rBPI(1-191)-IgG融合蛋白質(zhì)以100pmol/孔的濃度加入到帶尼龍膜的96孔平板的孔中。當(dāng)吸收到膜上后，用含有0.1%牛血清白蛋白(BSA)的PBS封閉緩沖液封閉各孔。用此封閉緩沖液以5-4μg/ml制備3H肝素(DuPont，NEN，Wilmington，DE)的系列稀釋液，并于4℃下在rBPI(1-199)或rBPI(1-191)-IgG包被的孔中保溫1小時。1小時后，吸出未結(jié)合的肝素，并用封閉緩沖液洗滌各孔三次，干燥后取出用液體閃爍計數(shù)器測定結(jié)合的3H-肝素的量。
實驗結(jié)果示于圖9中，其中空方塊代表rBPI(1-199)與肝素的結(jié)合;菱形代表rBPI(1-191)-Ig融合蛋白質(zhì)與肝素的結(jié)合;和實心方塊代表本底。圖9所示的結(jié)果表明，當(dāng)rBPI(1-199)在所希望的BPI Kd值范圍內(nèi)(表觀親和性＝114±30nM)與肝素結(jié)合時，融合蛋白質(zhì)不能表現(xiàn)出類似的結(jié)合特性。甚至在最高3H肝素測定濃度(2.5μM)下融合蛋白質(zhì)也不能達(dá)到飽和。因此，rBPI(1-191)-IgG融合蛋白質(zhì)與肝素的結(jié)合大約比本底高3倍，但rBPI(1-199)則不是這樣。
B.rBPI-Ig融合蛋白質(zhì)的藥物動力學(xué)特性給雄性CD小鼠靜脈內(nèi)注射1mg/kg125I-BPI(1-191)-IgG融合蛋白質(zhì)或緩沖液以測定rBPI-Ig融合蛋白質(zhì)的體內(nèi)藥物動力學(xué)特性。從融合蛋白質(zhì)或緩沖液給藥后0.5分鐘至24小時收集血樣，測定125I放射活性。還用TCA沉淀法和SDS-PAGE法分析血清樣品，以確定與rBPI-Ig和較高分子量蛋白質(zhì)相關(guān)的血清放射活性量。
在下面的表2和圖10(其中三角代表rBPI-Ig融合蛋白質(zhì)，圓圈代表rBPI(1-199))中，提供了前述研究所獲得的藥物動力學(xué)參數(shù)。表格提供了從圖10曲線中獲得的定量數(shù)據(jù)。正如表2和圖10所示，融合蛋白質(zhì)的血清濃度表現(xiàn)出兩階段清除并持續(xù)達(dá)給藥后的2小時，分別為2.5±0.2分鐘的α+1/2和39±13分鐘的β-+1/2。表2還示出了平均滯留時間(MRT)(融合蛋白質(zhì)在體內(nèi)殘存時間的一種計算方法)、清除率、中心體積分布(Vc)和靜態(tài)體積分布(Vss)。該表中還給出了代表圖10中曲線下面積的數(shù)據(jù)，其提供了另一種測定體內(nèi)殘留時間的方法。在表2或圖10中所測得的rBPI(1-199)和rBPI(1-191)-IgG融合蛋白質(zhì)之間的任何藥物動力學(xué)特性均沒有統(tǒng)計學(xué)上的顯著性差異。
C、rBPI-Ig融合蛋白質(zhì)的體內(nèi)效應(yīng)在體內(nèi)致死性內(nèi)毒素血癥動物模型中進(jìn)行研究以評價rBPI-IgG融合蛋白質(zhì)的效應(yīng)。在此項研究中，對雄性ICR小鼠靜脈內(nèi)給藥，注射放線菌素D(800μg/kg)和0.1μg/kg或0.3μg/kg內(nèi)毒素(大腸桿菌0111∶B4)的混合物。注射放線菌素D和內(nèi)毒素之后，馬上給小鼠第二次靜脈內(nèi)注射rBPI-IgG融合蛋白質(zhì)或含有20mM枸櫞酸鈉，150mM氯化鈉和0.1% Poloxamer以及0.002%聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯，pH5.0的BPI配制品緩沖液(表3中的“緩沖液對照”組)。其中一組第二次注射PBS(磷酸鹽緩沖鹽水)(表3中的“陰性對照”組)。然后計算7天內(nèi)每天死亡數(shù)。此項研究的結(jié)果示于下列表3中。
此項研究的結(jié)果表明5μg/kg的rBPI-IgG融合蛋白質(zhì)可以顯著地防止以0.3μg/kg內(nèi)毒素攻擊的放線菌素D致敏的小鼠體內(nèi)內(nèi)毒素的致死性效應(yīng)。
D、LAL抑制試驗對rBPI(1-199)和rBPI(1-191)-Ig融合蛋白質(zhì)進(jìn)行鱟溶解物L(fēng)AL抑制試驗，以確定這些化合物的LPS結(jié)合特性。具體地講，將rBPI(1-199)或rBPI(1-191)-Ig融合蛋白質(zhì)在Eppendorf試管中與固定濃度的大腸桿菌0113 LPS(4ng/ml終濃度)混合，并在37℃不時振動下保溫3小時。保溫之后，向各試管內(nèi)加入360μl D-PBS以達(dá)到200pg/ml的LPS濃度用于LAL試驗。然后以每孔50μL的體積將各樣品轉(zhuǎn)移到ImmulonII條(Dynatech，Chantilly，VA)中。
以每孔50μl加入鱟溶解物(Quantitative Chromogenic LAL藥盒，Whitaker Bioproducts，Inc.，Walkersville，MD)，并在室溫下保溫25分鐘。保溫后再以100μl/孔的體積加入生色底物，并充分混合。室溫下保溫20-30分鐘后，加入100μl的25%醋酸以終止反應(yīng)。然后在多平板閱讀儀(Vmax，Medical Devices Menlo Park，CA)上測定405nm處的光密度。
LAL試驗結(jié)果示于圖11中，其中實線代表用rBPI(1-191)-Ig融合蛋白質(zhì)獲得的結(jié)果，帶實圈點線代表用rBPI(1-199)蛋白質(zhì)獲得的結(jié)果，而帶空方塊的點線代表無LPS對照。如圖中所示，在對鱟變形細(xì)胞溶解物試驗中對LPS刺激的抑制能力方面rBPI(1-199)和rBPI(1-191)-Ig融合蛋白質(zhì)之間的試驗結(jié)果沒有顯著性差異。
本領(lǐng)域中的熟練技術(shù)人員在考慮到前述的本發(fā)明優(yōu)選實施方案后，實施本發(fā)明時可作出許多修改和變化。因此，對本發(fā)明的范圍內(nèi)的限制只在后面的待批權(quán)利要求中體現(xiàn)出來。
序列表(1)一般資料:
(Ⅰ)申請人:Theofan,GeorgiaGrinna,LynnsHorwite,Arnold(Ⅱ)發(fā)明名稱:BPI-免疫球蛋白融合蛋白質(zhì)(Ⅲ)序列數(shù):19(Ⅳ)聯(lián)系地址:
(A)地址:Marshall,O′Toole,Gerstin,Murray Sc Borun(B)街道:6300 Sears Tower,233 South Wacker(C)城市:Illinois inois(D)國家:USA(F)編號:60606-6402(Ⅴ)計算機閱讀形式:
(A)媒介類型:軟盤(B)計算機:IBM PC兼容(C)操作系統(tǒng):PC-DOS/MS-DOS(D)軟件:patentIn Release #1.0,Version #1.25
(Ⅵ)目前申請數(shù)據(jù)(A)申請?zhí)?
(B)申請日:
(C)分類:
(Ⅷ)代理機構(gòu)/代理人 資料(A)名稱:Meyers Thomas C.
(B)登記號:36,989(C)案卷號:30659(Ⅸ)通訊信息:
(A)電話:312/474-6300(B)傳真:312/474-0448(C)電報:25-3856(2)SEQ ID NO:1的資料(Ⅰ)序列特征:
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CTCGCAGACC TGGCTGTTCA TCTTGTTT(2)SEQ ID NO:16的資料(Ⅰ)序列特征:
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GCCACCRCCA TGG(2)SEQ ID NO:17的資料(Ⅰ)序列特征:
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ACTGTCGACG CCACCATGGC CAGGGGC
(2)SEQ ID NO:18的資料(Ⅰ)序列特征:
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CCGCGGCTCG AGCTATATTT TGGTCAT(2)SEQ ID NO:19的資料(Ⅰ)序列特征:
(A)長度:6氨基酸(B)類型:肽(C)鏈數(shù):單鏈(D)拓?fù)?線性(Ⅱ)分子類型:肽(Ⅺ)序列描述:SEQ ID NO:19:
Val Asn Pro Gly Val Val
權(quán)利要求
1.一種雜交融合蛋白質(zhì)，在其氨基末端包括有殺菌/通透性增強蛋白質(zhì)或其生物學(xué)活性片段，并且在其羧基末端含有免疫球蛋白重鏈的至少一個恒定區(qū)或其等位基因變體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的雜交融合蛋白質(zhì)，它包含有兩個免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的雜交融合蛋白質(zhì)，其中所說的兩個免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)是CH2和CH3區(qū)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的雜交融合蛋白質(zhì)，在融合體的殺菌/通透性增強蛋白質(zhì)和免疫球蛋白部分之間還包含免疫球蛋白鉸鏈區(qū)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的雜交融合蛋白質(zhì)，其主要由有殺菌/通透性增強蛋白質(zhì)的起始191個氨基酸氨基末端殘基組成。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的雜交融合蛋白質(zhì)，其主要由殺菌/通透性增強蛋白質(zhì)的起始199個氨基酸氨基末端殘基組成。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的雜交融合蛋白質(zhì)，其主要由殺菌/通透性增強蛋白質(zhì)的起始176個氨基酸氨基末端殘基組成。
8.根據(jù)權(quán)利要求1的雜交融合蛋白質(zhì)，其中在所說殺菌/通透性增強蛋白質(zhì)中第132位的半胱氨酸殘基被另一個氨基酸取代。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的雜交融合蛋白質(zhì)，其中所說的在殺菌/通透性增強蛋白質(zhì)第132位的半胱氨酸殘基被丙氨酸取代。
10.根據(jù)權(quán)利要求1、2、3、4、5、6、7、8或9的雜交融合蛋白質(zhì)，其含有人蛋白質(zhì)序列。
11.根據(jù)權(quán)利要求1的雜交融合蛋白質(zhì)，其為單二聚體形式的。
12.根據(jù)權(quán)利要求1的雜交融合蛋白質(zhì)，其中所說的免疫球蛋白重鏈的恒定區(qū)選自由IgG，IgA和IgM免疫球蛋白組成的一組中。
13.一種編碼雜交融合蛋白質(zhì)的DNA序列，在雜交融合蛋白質(zhì)的氨基末端帶有一個殺菌/通透性增強蛋白質(zhì)或其生物學(xué)活性片段，并在其羧末基端含有免疫球蛋白重鏈的至少一個恒定區(qū)或其等位基因變體。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的DNA序列，其包含編碼兩個免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)的DNA序列。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的DNA序列，其包含編碼CH2和CH3重鏈恒定區(qū)的DNA序列。
16.根據(jù)權(quán)利要求13的DNA，其包含編碼從BPI的起始176個氨基末端殘基到殺菌/通透性增強蛋白質(zhì)的起始199個氨基末端殘基的編碼區(qū)。
17.根據(jù)權(quán)利要求13的DNA，其包括編碼殺菌/通透性增強蛋白質(zhì)起始191個氨基末端殘基的編碼區(qū)。
18.根據(jù)權(quán)利要求13的DNA，其包含編碼殺菌/通透性增強蛋白質(zhì)的起始199個氨基末端殘基的編碼區(qū)。
19.一種含有權(quán)利要求13之DNA之序列的DNA載體。
20.根據(jù)權(quán)利要求19的DNA載體，其選自下列一組載體pING 4512(ATCC 75239)，pING 4514(ATCC 75240)，pING 4515(ATCC 75241)和pING 4517(ATCC 75242)。
21.一種宿主細(xì)胞，該細(xì)胞已用權(quán)利要求13的DNA序列以允許在所說宿主細(xì)胞中表達(dá)由該序列編碼的融合蛋白質(zhì)的方式穩(wěn)定地轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染。
22.一種根據(jù)權(quán)利要求21的原核宿主細(xì)胞。
23.一種根據(jù)權(quán)利要求21的真核宿主細(xì)胞。
24.一種根據(jù)權(quán)利要求21的具有保藏登記號ATCC CRL 11042的宿主細(xì)胞。
25.一種根據(jù)權(quán)利要求21的具有保藏登記號ATCC CRL 11043的宿主細(xì)胞。
26.一種根據(jù)權(quán)利要求21的具有保藏登記號ATCC CRL 11044的宿主細(xì)胞。
27.一種生產(chǎn)雜交融合蛋白質(zhì)的方法，該融合蛋白質(zhì)在其氨基末端包含殺菌/通透性增強蛋白質(zhì)或其生物學(xué)活性片段，在其羧基端包含免疫球蛋白重鏈的至少一個恒定區(qū)或其等位基因變體，所說的方法包括使權(quán)利要求21的宿主細(xì)胞在合適的培養(yǎng)基中生長;和從所說宿主細(xì)胞或所說培養(yǎng)基中分離所說的雜交融合蛋白質(zhì)。
28.一種藥物組合物，其含有權(quán)利要求1的雜交融合蛋白質(zhì)和藥學(xué)上可接受的稀釋劑、佐劑或載體。
29.一種治療人體內(nèi)細(xì)菌感染、內(nèi)毒素血癥、膿毒血癥等的方法，包括使用有效量的權(quán)利要求28的藥物組合物。
全文摘要
本發(fā)明公開了新的雜交融合蛋白質(zhì)，在其氨基末端包含有殺菌/通透性增強蛋白質(zhì)或其生物學(xué)活性片段，并在其羧基末端包含至少一種免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)，該蛋白質(zhì)可用于治療細(xì)菌感染。還公開了編碼這些蛋白質(zhì)的DNA序列，產(chǎn)生這些蛋白質(zhì)的重組方法以及含有該重組產(chǎn)物的藥物制劑。
文檔編號C12N15/13GK1096821SQ9310904
公開日1994年12月28日 申請日期1993年6月21日 優(yōu)先權(quán)日1992年5月19日
發(fā)明者G·蒂奧芬, L·S·格林納, A·霍維茨 申請人:索馬公司