鴨疫里默氏桿菌表面抗原d15截短重組蛋白致敏乳膠試劑及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種鴨疫里默氏桿菌(RA)表面抗原D15截短重組蛋白致敏乳膠試劑，為表面包被有氨基酸序列如SEQ?ID?No.1所示的RA表面抗原D15截短重組蛋白的乳膠顆粒，該致敏乳膠試劑可通過(guò)乳膠凝集試驗(yàn)對(duì)RA抗體進(jìn)行快速檢測(cè)，且檢測(cè)特異性、重復(fù)性和敏感性良好，可用于制備RA抗體檢測(cè)試劑特別是RA抗體乳膠凝集檢測(cè)試劑盒；本發(fā)明還公開(kāi)了RA表面抗原D15截短重組蛋白致敏乳膠試劑的制備方法，并對(duì)偶聯(lián)條件(如羧化乳膠偶聯(lián)濃度、RA表面抗原D15截短重組蛋白偶聯(lián)濃度、偶聯(lián)時(shí)間、封閉液濃度等)進(jìn)行了探索和優(yōu)化，所建立的制備方法偶聯(lián)效率高，產(chǎn)品凝集效果好。
【專(zhuān)利說(shuō)明】鴨疫里默氏桿菌表面抗原D15截短重組蛋白致敏乳膠試劑及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物工程和檢測(cè)【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種致敏乳劑試劑及其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]鴨疫里默氏桿菌(Riemerella Anatipestifer, RA)病是一種主要侵害鴨、火雞和多種其它鳥(niǎo)類(lèi)的接觸性傳染疾病，又稱(chēng)為新鴨病、鴨疫綜合癥、鴨疫巴氏桿菌病和鴨傳染性漿膜炎等，是目前危害養(yǎng)鴨業(yè)的主要傳染病之一。該病呈急性或慢性敗血癥過(guò)程，病理變化主要是纖維素性心包炎、肝周炎、氣囊炎、腦膜炎、干酪性輸卵管炎等。1-8周齡鴨高度敏感，惡劣的環(huán)境條件或并發(fā)感染更易引起該病的發(fā)生和流行，死亡率高。耐過(guò)鴨常生長(zhǎng)不良，增重緩慢，失去飼養(yǎng)價(jià)值，而且該病在發(fā)病場(chǎng)能持續(xù)存在，引起不同批次的鴨感染發(fā)病，難于根治，給養(yǎng)鴨業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。
[0003]除藥物防治以外，目前已成功研制出弱毒疫苗、滅活疫苗和亞單位疫苗來(lái)控制RA病。因用藥物防治易造成菌株的耐藥性，鴨群反復(fù)發(fā)病，難于根治，而用疫苗來(lái)免疫接種，可以獲得較好的預(yù)防效果。由于RA的血清型多而復(fù)雜，國(guó)際公認(rèn)有21個(gè)血清型，我國(guó)也存在10多個(gè)血清型，且各血清型之間缺乏有效的交叉免疫保護(hù)，這給RA的疫苗防治帶來(lái)一定困難。比較有效的方法是針對(duì)當(dāng)?shù)刂饕餍醒逍停x取相應(yīng)菌株研制疫苗，以達(dá)到更有效的防治效果。
[0004]外膜蛋白(OMPs)是革蘭陰性菌特有的一種結(jié)構(gòu)蛋白，很多革蘭陰性菌的OMPs具有良好的免疫原性，是亞單位疫苗的候選組成部分，是目前的研究熱點(diǎn)。RA的D15蛋白與副豬嗜血桿菌和流感嗜血桿菌外膜蛋白D15—樣，均屬于0mp85家族。0mp85為暴露于細(xì)菌表面且相對(duì)保守的外膜蛋白，為其他外膜蛋白的定位和折疊于外膜所必需；除細(xì)菌外膜外，0mp85在真核生物線(xiàn)粒體和葉綠體的外膜中也存在。0mp85家族蛋白在結(jié)構(gòu)上具有兩個(gè)重要特征:氨基酸序列N端位于周質(zhì)區(qū)，富含多肽轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)區(qū)域片段(polyp印tidetransport-associated domain, POTRA);而其C端的β桶狀區(qū)域則包埋于外膜中。多殺性巴氏桿菌、流感嗜血桿菌、腦膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌、杜克雷嗜血桿菌、痢疾桿菌等細(xì)菌均有屬于0mp85家族的外膜蛋白，并且在氨基酸序列上具有較高的相似性。近十年來(lái)，屬于0mp85家族的多種細(xì)菌外膜蛋白被確認(rèn)與致病機(jī)理和免疫性相關(guān)。
[0005]對(duì)RA抗體的檢測(cè)是評(píng)價(jià)RA疫苗免疫效果及制定合理的免疫程序的關(guān)鍵。乳膠凝集試驗(yàn)是以乳膠顆粒為載體，將抗原或抗體通過(guò)物理吸附法或化學(xué)交聯(lián)法等固定至載體上制得致敏乳膠試劑，再用以檢測(cè)對(duì)應(yīng)抗體或抗原的方法。由于具有快速敏感、簡(jiǎn)單易行、無(wú)需昂貴儀器等優(yōu)點(diǎn)，該方法已廣泛用于多種動(dòng)物疾病抗原抗體的檢測(cè)和流行病學(xué)調(diào)查。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]有鑒于此，本發(fā)明的目的之一在于提供一種RA表面抗原D15截短重組蛋白致敏乳膠試劑，可通過(guò)乳膠凝集試驗(yàn)檢測(cè)RA抗體，檢測(cè)具有特異性、重復(fù)性和敏感性；目的之二在于提供該致敏乳膠試劑的制備方法，偶聯(lián)效率高，產(chǎn)品凝集效果好；目的之三在于提供該致敏乳膠試劑在制備檢測(cè)試劑中的應(yīng)用。
[0007]經(jīng)研究，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案:
[0008]1.RA表面抗原D15截短重組蛋白致敏乳膠試劑，為表面包被有RA表面抗原D15截短重組蛋白的乳膠顆粒，所述RA表面抗原D15截短重組蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0009]2.RA表面抗原D15截短重組蛋白致敏乳膠試劑的制備方法，是利用水溶性碳二亞胺將RA表面抗原D15截短重組蛋白偶聯(lián)到羧化乳膠顆粒的表面而得。
[0010]進(jìn)一步，所述RA表面抗原D15截短重組蛋白致敏乳膠試劑的制備方法具體包括以下步驟:取10界1:%乳膠原液,用0.lmol/L、pH9.6的碳酸鹽緩沖液離心洗漆,再用0.0lmol/L、pH7.4的磷酸鹽緩沖液離心洗滌并重懸，加入2wt% EDAC溶液，37°C振搖反應(yīng)使乳膠顆粒表面的羧基活化，離心棄上清，沉淀用0.0lmol/L、pH8.0的硼酸鹽緩沖液離心洗滌并重懸至濃度為0.5?2wt%，再加入等體積0.1125?0.225mg/mL的RA表面抗原D15截短重組蛋白溶液，37°C振搖反應(yīng)2?12小時(shí)使羧化乳膠與RA表面抗原D15截短重組蛋白偶聯(lián)，加Λ 0.lmol/L甘氨酸終止反應(yīng)，離心棄上清，沉淀用lwt%牛血清白蛋白(BSA)溶液封閉后，懸浮于含有穩(wěn)定劑、封閉劑和防腐劑的緩沖液中，即得RA表面抗原D15截短重組蛋白致敏乳膠試劑。
[0011]進(jìn)一步，所述RA表面抗原D15截短重組蛋白致敏乳膠試劑的制備方法具體包括以下步驟:取10界1:%乳膠原液,用0.lmol/L、pH9.6的碳酸鹽緩沖液離心洗漆,再用0.0lmol/L、pH7.4的磷酸鹽離心洗滌并重懸，加入2wt% EDAC溶液，37°C振搖反應(yīng)使乳膠顆粒表面的羧基活化，離心棄上清，沉淀用0.0lmol/L、pH8.0的硼酸鹽緩沖液離心洗滌并重懸至濃度為lwt%，再加入等體積0.225mg/mL的RA表面抗原D15截短重組蛋白溶液，37°C振搖反應(yīng)6小時(shí)使羧化乳膠與RA表面抗原D15截短重組蛋白偶聯(lián)，加入0.lmol/L甘氨酸終止反應(yīng)，離心棄上清，沉淀用Iwt % BSA溶液封閉后，懸浮于含有5vol%甘油、lwt% BSA和0.1wt %疊氮鈉的0.01M、pH7.4的磷酸鹽緩沖液中，即得RA表面抗原D15截短重組蛋白致敏乳膠試劑。
[0012]進(jìn)一步，所述RA表面抗原D15截短重組蛋白采用以下方法制備:將核苷酸序列如SEQID N0.2所示的RA表面抗原D15截短重組蛋白的編碼基因克隆入原核表達(dá)質(zhì)粒pET28a(+)中得到重組表達(dá)載體，將該重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)中得到工程菌，將該工程菌接種于含卡那霉素即Kan的LB液體培養(yǎng)基中，37 °C培養(yǎng)過(guò)夜，次日取菌液按體積比1:50接入含Kan的LB液體培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)至OD6tltl = 0.4，加入IPTG至終濃度為0.6mmol，37°C誘導(dǎo)培養(yǎng)4小時(shí)，收集菌液，離心，沉淀用20mmol pH8.0的Tris-HCl緩沖液懸浮，置-20°C過(guò)夜后，加溶菌酶至終濃度為lmg/mL，4°C攪拌30分鐘，冰浴條件下超聲波間歇破碎菌體，離心，沉淀用洗液離心洗滌后，用尿素溶液溶解，進(jìn)行鎳瓊脂糖凝膠親和層析純化，以含有300mmol咪唑的洗脫緩沖液為洗脫劑，收集蛋白洗脫液，透析復(fù)性，獲得攜帶組氨酸標(biāo)簽的RA表面抗原D15截短重組蛋白。
[0013]3.RA表面抗原D15截短重組蛋白致敏乳膠試劑在制備RA抗體檢測(cè)試劑中的應(yīng)用。
[0014]4.RA抗體乳膠凝集檢測(cè)試劑盒，含有RA表面抗原D15截短重組蛋白致敏乳膠試劑。
[0015]本發(fā)明的有益效果在于:本發(fā)明將RA表面抗原D15截短重組蛋白通過(guò)化學(xué)交聯(lián)法與羧化乳膠偶聯(lián)，制備了 RA表面抗原D15截短重組蛋白致敏乳膠試劑，該致敏乳膠試劑可通過(guò)乳膠凝集試驗(yàn)對(duì)RA抗體進(jìn)行快速檢測(cè)，且檢測(cè)特異性、重復(fù)性和敏感性良好，可用于制備RA抗體檢測(cè)試劑特別是RA抗體乳膠凝集檢測(cè)試劑盒；本發(fā)明對(duì)RA表面抗原D15截短重組蛋白致敏乳膠試劑的制備方法特別是偶聯(lián)條件(如羧化乳膠偶聯(lián)濃度、RA表面抗原D15截短重組蛋白偶聯(lián)濃度、偶聯(lián)時(shí)間、封閉液濃度等)進(jìn)行了探索和優(yōu)化，所建立的制備方法偶聯(lián)效率高，產(chǎn)品凝集效果好。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0016]為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和有益效果更加清楚，本發(fā)明提供如下附圖進(jìn)行說(shuō)明:
[0017]圖1為D15截短基因PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖；其中I為D15截短基因PCR產(chǎn)物，M 為 DNA Marker。
[0018]圖2為重組質(zhì)粒pJETl.2-tD15的瓊脂糖凝膠電泳圖；其中M為DNA Marker, I為PJET1.2-tD15用BamH I和Hind III雙酶切后的產(chǎn)物，2為PCR產(chǎn)物。
[0019]圖3為重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a_tD15的酶切產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖；其中M為DNAMarker，I 為 pE T28a_tD15 用 BamH I 和 Hind III雙酶切后的產(chǎn)物。
[0020]圖4為重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a_tD15轉(zhuǎn)化菌株表達(dá)的RA表面抗原D15截短重組蛋白的SDS-PAGE電泳圖；其中I為用IPTG誘導(dǎo)的pET_28a_tD15轉(zhuǎn)化菌株BL21經(jīng)超聲破碎后收集的上清；2為用IPTG誘導(dǎo)的pET-28a-tD15轉(zhuǎn)化菌株BL21經(jīng)超聲破碎后收集的沉淀；3為用IPTG誘導(dǎo)的pET-28a_tD15轉(zhuǎn)化菌株Rosetta經(jīng)超聲破碎后收集的上清；4為用IPTG誘導(dǎo)的pET-28a-tD15轉(zhuǎn)化菌株Rosetta經(jīng)超聲破碎后收集的沉淀；5為用IPTG誘導(dǎo)的pET-28a-tD15轉(zhuǎn)化菌株P(guān)lysS經(jīng)超聲破碎后收集的上清；6為用IPTG誘導(dǎo)的pET_28a_tD15轉(zhuǎn)化菌株P(guān)lysS經(jīng)超聲破碎后收集的沉淀；7為蛋白質(zhì)Marker ；8為空載體pET28a (+)轉(zhuǎn)化菌株BL21未用IPTG誘導(dǎo)；9為用IPTG誘導(dǎo)的空載體pET28a(+)轉(zhuǎn)化菌株BL21經(jīng)超聲破碎后收集的上清；10為用IPTG誘導(dǎo)的空載體pET28a(+)轉(zhuǎn)化菌株BL21經(jīng)超聲破碎后收集的沉淀。
[0021]圖5為不同IPTG濃度下pET28a-tD15轉(zhuǎn)化菌株BL21表達(dá)RA表面抗原D15截短重組蛋白的SDS-PAGE電泳圖；其中M為蛋白質(zhì)Marker，1-6的IPTG終濃度依次為0.2,0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mmol/L0
[0022]圖6為不同誘導(dǎo)溫度下pET28a_tD15轉(zhuǎn)化菌株BL21表達(dá)RA表面抗原D15截短重組蛋白的SDS-PAGE電泳圖；其中M為蛋白質(zhì)Marker，1-3的誘導(dǎo)溫度依次為37、30、25°C。
[0023]圖7為不同誘導(dǎo)時(shí)間下pET28a_tD15轉(zhuǎn)化菌株BL21表達(dá)RA表面抗原D15截短重組蛋白的SDS-PAGE電泳圖；其中M為蛋白質(zhì)1&^1?^，1-6依次為誘導(dǎo)6、5、4、3、2、0小時(shí)。
[0024]圖8為Western blot檢測(cè)RA表面抗原D15截短重組蛋白的特異性，其中I為RA表面抗原D15截短重組蛋白，2為空載體pET-28a (+)的IPTG誘導(dǎo)產(chǎn)物，M為蛋白質(zhì)Marker。
[0025]圖9為鎳瓊脂糖凝膠(Ni2+-NAT)親和層析純化RA表面抗原D15截短重組蛋白的SDS-PAGE電泳圖，其中M為蛋白質(zhì)Marker，I為純化前的蛋白，2為純化后的RA表面抗原D15截短重組蛋白。
[0026]圖10為羧化乳膠最佳偶聯(lián)濃度的選擇，其中從左至右依次為乳膠濃度2%、乳膠濃度I %、陰性對(duì)照。
[0027]圖11為RA表面抗原D15截短重組蛋白最佳偶聯(lián)濃度的選擇，其中a從左至右依次為蛋白濃度0.9mg/mL、空白對(duì)照、蛋白濃度0.45mg/mL ；b從左至右依次為蛋白濃度0.225、0.1125、0.05625mg/mL。
[0028]圖12為封閉液最佳濃度的選擇，其中a從左至右依次為0% BSA封閉、0.01% BSA封閉、空白對(duì)照；b從左至右依次為0.1 % BSA封閉、I % BSA封閉、空白對(duì)照。
[0029]圖13為最佳偶聯(lián)時(shí)間的選擇，其中a從左至右依次為偶聯(lián)2h、4h、6h ；b從左至右依次為偶聯(lián)8h、10h、12h。
[0030]圖14為RA表面抗原D15截短重組蛋白致敏乳膠試劑與不同RA陽(yáng)性血清的凝集反應(yīng)，其中從左至右依次為RA ATCCl 1845株鴨陽(yáng)性血清、抗RA表面抗原D15截短重組蛋白鴨陽(yáng)性血清、RA CH-1株鴨陽(yáng)性血清。
【具體實(shí)施方式】
[0031]下面將結(jié)合附圖，對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)的描述。優(yōu)選實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第三版，J.薩姆布魯克等著，黃培堂等譯，科學(xué)出版社，2002年)中所述的條件，或按照試劑制造廠商所建議的條件進(jìn)行。
[0032]主要材料:質(zhì)粒pJETl.2-T購(gòu)自加拿大富酶泰斯(fermentas)公司；質(zhì)粒pET28a(+)為Novagen公司產(chǎn)品;克隆宿主菌E.coli DH5 α、表達(dá)宿主菌E.coli BL21(DE3)和鴨疫里默氏桿菌RA CH-1株(血清I型)由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)禽病研究中心提供。鴨疫里默氏桿菌RA ATCCl 1845株(血清6型)購(gòu)自ATCC。
[0033]本實(shí)施例中出現(xiàn)的除特別說(shuō)明外，均為質(zhì)量百分比)。Vol%表示體積百分比。
[0034]實(shí)施例1、RA表面抗原D15截短重組蛋白的制備
[0035]本發(fā)明擬制備的RA表面抗原D15截短重組蛋白(命名為tD15)的氨基酸序列如SEQ IDN0.1所示(即登錄號(hào)為AFR36094.1的RA D15第94位至第384位氨基酸序列)，其編碼基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示(即登錄號(hào)為CP003787的RA D15基因第280位至第1152位核苷酸序列)。
[0036]1、RA tD15基因的克隆
[0037]根據(jù)RA tD 15 基因序列設(shè)計(jì)引物，上游引物 RA tD 15_F: 5 ’ -CGGATCCACAGAATATA-TGACCTACCCTAAC-3，(SEQ ID N0.3，劃線(xiàn)部分為 BamH I 位點(diǎn));下游引物 RA tD15_R:5’_CCAAGCTTGGCGCCTATACATCTAAAATAC-3，(SEQ ID N0.4，劃線(xiàn)部分為 Hind III位點(diǎn))。
[0038]提取RA基因組DNA:將RA CH-1株接種于含5%牛血清的胰蛋白胨大豆瓊脂(TSA)平板培養(yǎng)基中，37°C恒溫培養(yǎng)過(guò)夜，挑單個(gè)菌落于含5%牛血清TSB液體培養(yǎng)基中，37°C劇烈振蕩培養(yǎng)12h，取l-3mL培養(yǎng)液，5000g離心IOmin，棄上清，沉淀加入567 μ L TE，反復(fù)吹打，再加入30 μ L10% SDS和3 μ L20mg/mL蛋白酶K溶液，混勻，37°C水浴lh，再加入100 μ L5M NaCl,混勻,65°C水浴IOmin,再加入等體積氯仿/異戍醇，混勻，12000r/min離心5min,上清再加入等體積酚/氯仿/異戊醇，混勻，12000r/min離心5min，上清再加入0.6倍體積異丙醇，輕輕混勻，沉淀DNA30min, 12000r/min離心15min,棄上清,用lmL75vol %乙醇洗滌DNA，12000r/min離心5min，棄上清，37°C干燥后，用50 μ L TE溶解，_20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0039]以RA基因組DNA為模板，采用前述上、下游引物PCR擴(kuò)增RA tD15基因。PCR反應(yīng)體系為:ddH207 y L，2XPCR mastermixlO μ L，模板 DNAl μ L, 10ymol/L 上、下游引物各 I μ L,總體積為 20 μ L0 PCR 反應(yīng)參數(shù)為:首先 950C 5min,然后 94°C 50s,58.4°C lmin、72°C lmin,共30個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸IOmin。取PCR產(chǎn)物，進(jìn)行I %瓊脂糖凝膠電泳鑒定，結(jié)果如圖1所示，獲得了一條約873bp的特異性DNA條帶，與目標(biāo)DNA片段大小相符。將PCR產(chǎn)物用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒進(jìn)行切膠回收純化。
[0040]將純化的PCR產(chǎn)物在T4DNA連接酶的作用下與質(zhì)粒pJETl.2_T連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5a大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽(yáng)性克隆，抽提質(zhì)粒，獲得重組質(zhì)粒pJET1.2-tD15。對(duì)重組質(zhì)粒pJETl.2-tD15進(jìn)行BamH I /Hind III雙酶切鑒定，結(jié)果如圖2所示，pJETl.2_tD15用BamH I和Hind III雙酶切得到三條DNA片段，其中一條DNA片段與873bp的目的DNA片段大小相符，另一 DNA小片段與pJETl.2-tD15上另一個(gè)Hind III位點(diǎn)酶切下來(lái)的片段大小相符。將酶切鑒定正確的重組質(zhì)粒PJETl.2-tD15送上海英駿生物有限公司進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果顯示，T克隆所得的RA tD15基因序列如SEQ ID N0.2所示，與目標(biāo)序列完全一致。
[0041]2、重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
[0042]用BamH I和Hind III雙酶切重組質(zhì)粒pJETl.2_tD15，回收目的DNA片段，與經(jīng)相同酶切的原核表達(dá)載體pET28a(+)連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5a大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽(yáng)性克隆，抽提質(zhì)粒，獲得重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a-tD15。對(duì)重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a_tD15進(jìn)行BamH I和Hind III雙酶切鑒定，結(jié)果如圖3所示，pET28a_tD15經(jīng)BamH I和Hind III雙酶切后得到兩條DNA片段，其中DNA小片段與873bp的目的DNA片段大小相符。
[0043]3、重組表達(dá)工程菌的構(gòu)建
[0044]挑取含重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a_tD15的DH5 α大腸桿菌，劃線(xiàn)接種于含Kan的LB瓊脂平板上，37°C培養(yǎng)過(guò)夜，次日取單個(gè)菌落接種于LB液體培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)10?16小時(shí)，離心收集菌液，抽提質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌E.coli BL2KDE3)感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽(yáng)性克隆，獲得含重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a-tD15的BL21工程菌。
[0045]同法，將重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a_tD15分別轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌E.coli Rosetta(DE3)感受態(tài)細(xì)胞與E.coli BL21(DE3)plysS感受態(tài)細(xì)胞，獲得含重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a_tD15的Rosetta工程菌與含重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a_tD15的PlysS工程菌。
[0046]4、重組表達(dá)工程菌的誘導(dǎo)表達(dá)
[0047]取含重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a_tD 15的工程菌，同時(shí)設(shè)置空載體pET28a⑴轉(zhuǎn)化菌株為對(duì)照，接種于含Kan的LB液體培養(yǎng)基中，37 °C振搖培養(yǎng)過(guò)夜,次日取菌液按體積比1:50轉(zhuǎn)接種于含Kan的LB液體培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)至OD6tltl = 0.4時(shí)，加入IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)，收集培養(yǎng)菌液，4°C、13000r/min離心5min,棄上清，菌體沉淀用20mL20mmolTris-HCl (pH8.0)懸浮，置_20°C過(guò)夜后，加溶菌酶至終濃度為lmg/mL，4°C攪拌30min，超聲波(冰浴)間歇破碎菌體(600w, 30sec/次，10次),4°C、10000r/min離心IOmin,取上清備用;沉淀用 IOmL 洗液(10mmol/L PBS+2mol/L 尿素+0.2% Triton X-100)于 4°C、10000r/min離心洗漆IOmin,重復(fù)洗漆三次后,用尿素溶液(10mmol/L PBS+8mol/L尿素)溶解備用。分別取前述備用的上清和用尿素溶液溶解的沉淀，加入40 μ L超純水和10 μ LlO X SDS上樣緩沖液，100°C水浴加熱變性lOmin，進(jìn)行12% SDS-PAGE凝膠電泳，考馬斯亮藍(lán)染色。結(jié)果如圖4所示，空載體pET28a(+)轉(zhuǎn)化菌株BL21未用IPTG誘導(dǎo)時(shí)沒(méi)有特異性蛋白條帶出現(xiàn)，用IPTG誘導(dǎo)后也沒(méi)有特異性蛋白條帶出現(xiàn)，說(shuō)明載體本身很小(可忽略不計(jì))；PET28a-tD15轉(zhuǎn)化菌株Rosetta用IPTG誘導(dǎo)后也沒(méi)有特異性蛋白條帶出現(xiàn)，而pET28a_tD15轉(zhuǎn)化菌株BL21與pET28a-tD15轉(zhuǎn)化菌株P(guān)lysS用IPTG誘導(dǎo)后均在約34kDa處出現(xiàn)一條特異性蛋白條帶，與重組tD15/His-tag融合蛋白大小相符(由于pET28a(+)載體在多克隆位點(diǎn)的N端有6個(gè)His-tag，因此pET28a-tD15的表達(dá)產(chǎn)物實(shí)際為tD15與His_tag的融合蛋白)，其中pET28a-tD15轉(zhuǎn)化菌株BL21的重組tD15/His_tag融合蛋白表達(dá)量較高，說(shuō)明E.coliBL21 (DE3)為優(yōu)選的表達(dá)宿主菌；此外，由于重組tD15/His-tag融合蛋白主要存在于經(jīng)超聲波破碎后收集的沉淀中，說(shuō)明重組tD15/His-tag融合蛋白在菌體中是以不溶的包涵體形式存在。
[0048]IPTG濃度優(yōu)化:取含重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a_tD15的BL21工程菌，接種于含Kan的LB液體培養(yǎng)基中，37°C振搖培養(yǎng)過(guò)夜，次日取菌液按體積比1:50轉(zhuǎn)接種于含Kan的LB液體培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)至0D_ = 0.4時(shí)，加入IPTG至不同終濃度(分別為0.2,0.4,0.6、
0.8、1.0、1.2mmol/L)，37°C誘導(dǎo)培養(yǎng) 4h,收集 ImL 培養(yǎng)菌液，4°C、13000r/min 離心 2min,棄上清，沉淀加入40 μ L超純水和10 μ LlO X SDS上樣緩沖液，100°C水浴加熱變性lOmin，進(jìn)行12% SDS-PAGE凝膠電泳。結(jié)果如圖5所示，隨IPTG濃度的增高，重組tD15/His_tag融合蛋白的誘導(dǎo)量有明顯變化，其中用0.6mmol/L IPTG誘導(dǎo)時(shí)表達(dá)量最高，因此優(yōu)選0.6mmol/L作為IPTG誘導(dǎo)表達(dá)濃度。
[0049]誘導(dǎo)溫度優(yōu)化:取含重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a_tD15的BL21工程菌，接種于含Kan的LB液體培養(yǎng)基中，37°C振搖培養(yǎng)過(guò)夜，次日取菌液按體積比1:50轉(zhuǎn)接種于含Kan的LB液體培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)至OD6tltl = 0.4時(shí)，加入IPTG至終濃度為0.6mmol/L，不同溫度(分別為25、30、37°C )誘導(dǎo)培養(yǎng)4h，收集ImL培養(yǎng)菌液，4°C、13000r/min離心2min，棄上清，沉淀加入40 μ L超純水和10 μ LlOX SDS上樣緩沖液，100°C水浴加熱變性lOmin，進(jìn)行12%SDS-PAGE凝膠電泳。結(jié)果如圖6所示，重組tD15/His-tag融合蛋白的表達(dá)量在誘導(dǎo)溫度為25°C時(shí)較少，在誘導(dǎo)溫度為30°C和37°C時(shí)較高，因此，按照本領(lǐng)域通常的培養(yǎng)習(xí)慣，優(yōu)選37°C作為誘導(dǎo)溫度。
[0050]誘導(dǎo)時(shí)間優(yōu)化:取含重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a_tD15的BL21工程菌，接種于含Kan的LB液體培養(yǎng)基中，37°C振搖培養(yǎng)過(guò)夜，次日取菌液按體積比1:50轉(zhuǎn)接種于含Kan的LB液體培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)至OD6tltl = 0.4時(shí)，加入IPTG至終濃度為0.6mmol/L，37°C誘導(dǎo)培養(yǎng)不同時(shí)間(分別為Oh、2h、3h、4h、5h、6h)，收集ImL培養(yǎng)菌液，4°C、13000r/min離心2min，棄上清，沉淀加入40 μ L超純水和10 μ LlO X SDS上樣緩沖液，100°C水浴加熱變性lOmin，進(jìn)行12% SDS-PAGE凝膠電泳。結(jié)果如圖7所示，誘導(dǎo)培養(yǎng)4h即有大量的重組tD15/His_tag融合蛋白表達(dá)，繼續(xù)增加誘導(dǎo)時(shí)間，蛋白表達(dá)量變化不大，因此優(yōu)選4h作為誘導(dǎo)時(shí)間。
[0051]5、重組 tD15/His_tag 融合蛋白的 Western-blot 鑒定
[0052]取含重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a_tD15的BL21工程菌的IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)菌液，同時(shí)設(shè)置空載體pET28a(+)轉(zhuǎn)化菌株BL21的IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)菌液為對(duì)照，4°C、13000r/min離心，棄上清，沉淀加入40 μ L超純水和10 μ LlO X SDS上樣緩沖液，100°C水浴加熱變性lOmin，進(jìn)行12% SDS-PAGE凝膠電泳，電泳結(jié)束后將蛋白質(zhì)樣品從PAGE凝膠中轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，力口入12ml3% BSA轉(zhuǎn)膜緩沖液于36°C輕搖2h進(jìn)行膜封閉，TBST洗膜3次，再加入0.5% BSA/PBST稀釋的兔抗RA (血清I型)血清作為一抗，37 °C溫和搖動(dòng)Ih，棄一抗，PBST洗膜2次，再加入IOml1:5000稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG作為二抗，37°C孵育lh，PBST洗膜3次，DAB顯色。結(jié)果見(jiàn)圖8，空載體pET28a(+)轉(zhuǎn)化菌株BL21的IPTG誘導(dǎo)產(chǎn)物與RA血清無(wú)特異性的反應(yīng)條帶，而含重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a-tD 15的BL21工程菌所表達(dá)的重組tD 15/Hi s-tag融合蛋白與RA血清有特異性的反應(yīng)條帶。
[0053]6、重組tD15/His_tag融合蛋白的大量制備、純化與復(fù)性
[0054]取含重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a_tD15的BL21工程菌，接種于含Kan的LB液體培養(yǎng)基中，37°C振搖培養(yǎng)過(guò)夜，次日取菌液按體積比1:50轉(zhuǎn)接種于含Kan的LB液體培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)至OD6tltl = 0.4時(shí)，加入IPTG至終濃度為0.6mmol/L，37°C誘導(dǎo)培養(yǎng)4h ;取誘導(dǎo)表達(dá)的菌液 500mL, 4°C、10000r/min 離心 lOmin,菌體沉淀用 40mL20mmol Tris-HCl (pH8.0)懸浮，置-20°C過(guò)夜后，加溶菌酶至終濃度為lmg/mL，4°C攪拌30min，超聲波(冰浴)間歇破碎菌體(200w, 30sec/次,5?10次),4 °C > 10000r/min離心IOmin,沉淀用2OmL洗液(10mmol/LPBS+2mol/L 尿素+0.2% Triton X-100)懸浮，4°C、10000r/min 離心 lOmin,沉淀用尿素溶液(lOmmol/L PBS+8mol/L尿素)溶解，4°C保存?zhèn)溆谩?br> [0055]根據(jù)重組tD15/His_tag融合蛋白中His-tag對(duì)鎳離子的特殊親和作用，將前述沉淀的尿素溶液進(jìn)行鎳瓊脂糖凝膠(Ni2+-NAT)親和層析純化。具體操作步驟為:用鎳瓊脂糖凝膠裝柱，柱床體積約為40mL ;用平衡緩沖液I約5個(gè)柱床體積平衡層析柱，流速為ImL/min ;將前述沉淀的尿素溶液約5mL加入層析柱中，流速為0.5mL/min ;用平衡緩沖液II洗2-5個(gè)柱床體積，流速為lmL/min ;分別用含50、300、500_01咪唑的洗脫緩沖液進(jìn)行梯度洗脫，流速為lmL/min，收集各梯度洗脫峰，用SDS-PAGE檢測(cè)蛋白的分子量大小和純度。結(jié)果如圖8所示，300mmol咪唑洗脫峰中含有大量高純度的重組tD15/His_tag融合蛋白。
[0056]將純化的重組tD15/His_tag融合蛋白進(jìn)行透析復(fù)性,用Bradford法測(cè)定蛋白濃度，稀釋至lmg/mL,分裝備用。
[0057]實(shí)施例2、RA表面抗原D15截短重組蛋白致敏乳膠試劑的制備與質(zhì)量鑒定
[0058]RA表面抗原D15截短重組蛋白可以作為抗原制備致敏乳膠試劑，再通過(guò)乳膠凝集試驗(yàn)檢測(cè)RA抗體。
[0059]1、乳膠凝集試驗(yàn)方法及結(jié)果判定
[0060]在一塊潔凈的凹載玻片上滴I滴(約20 μ L)待檢樣品溶液，再加I滴(約20 μ L)致敏乳膠試劑，攪拌混勻，搖動(dòng)玻片使形成直徑為1.5?2.0cm的液面，3?5min內(nèi)置黑色背景下肉眼觀察，同時(shí)設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照。++++為100%乳膠凝集，顆粒較大并聚集在液滴邊緣，液體完全透明；+++為75%乳膠凝集，顆粒明顯，液體稍有混濁；++為50%乳膠凝集，顆粒較細(xì)，液體較混濁；+為少許乳膠凝集，液體混濁；一為不凝集，液滴成原有的均勻乳狀；最終以出現(xiàn)++以上者判為陽(yáng)性。
[0061]2、致敏乳膠試劑的制備
[0062]取0.乳膠原液(乳膠直徑0.8 μ m)于1.5mL離心管中，用ImL0.lmol/L、ρΗ9.6的碳酸鹽緩沖液離心洗漆3次(每次14000g離心6min),再用ImL0.01mol/L、pH7.4的PBS同法離心洗滌3次，然后用0.625mL0.01mol/L,pH7.4的PBS重懸，轉(zhuǎn)移至2.5mL離心管中，逐滴加入0.625mL2% EDAC (以PBS為溶劑)，置水平搖床37°C低速作用不同時(shí)間后，14000g離心6min,棄上清,沉淀用ImL0.01mol/L、pH8.0的BBS離心洗漆3次(每次14000g離心6min)后,用相同BBS重懸至不同濃度,再加入等體積不同濃度的重組tD15/His_tag融合蛋白溶液，置水平搖床37°C低速作用不同時(shí)間后，加入0.05mL0.lmol/L甘氨酸(以BBS為溶劑)終止反應(yīng)，最后14000g離心10min，收集上清進(jìn)行蛋白測(cè)定，沉淀用ImL不同濃度的BSA溶液(以BBS為溶劑)封閉后，懸浮于0.5mL儲(chǔ)存液(0.01M pH7.4磷酸鹽緩沖液+5vol %甘油+0.01 % BSA+0.1 %疊氮鈉)中，即得重組tD15/His_tag融合蛋白致敏乳膠試劑。
[0063](I)羧化乳膠最佳偶聯(lián)濃度的選擇
[0064]將與EDAC作用后的羧化乳膠用BBS重懸至不同濃度(3 %、2 %、I %、0.5 %、
0.1% )后與重組tD15/His-tag融合蛋白偶聯(lián)，按前述方法制備重組tD15/His-tag融合蛋白致敏乳膠試劑。再以該致敏乳膠試劑與RA陽(yáng)性血清進(jìn)行乳膠凝集試驗(yàn)，通過(guò)測(cè)定偶聯(lián)效率和觀察凝集效果選擇羧化乳膠最佳偶聯(lián)濃度。偶聯(lián)效率通過(guò)偶聯(lián)反應(yīng)前后溶液中的蛋白濃度變化求得，即偶聯(lián)效率=(初始蛋白濃度-離心上清中蛋白濃度)/初始蛋白濃度X 100%。結(jié)果如表1和圖10所示，當(dāng)羧化乳膠濃度為1%時(shí)，與重組tD15/His-tag融合蛋白的偶聯(lián)效率最高，凝集效果最好。
[0065]表1羧化乳膠最佳偶聯(lián)濃度的選擇
[0066]
【權(quán)利要求】
1.鴨疫里默氏桿菌表面抗原D15截短重組蛋白致敏乳膠試劑，其特征在于，為表面包被有鴨疫里默氏桿菌表面抗原D15截短重組蛋白的乳膠顆粒，所述鴨疫里默氏桿菌表面抗原D15截短重組蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。
2.權(quán)利要求1所述的鴨疫里默氏桿菌表面抗原D15截短重組蛋白致敏乳膠試劑的制備方法，其特征在于，是利用水溶性碳二亞胺將鴨疫里默氏桿菌表面抗原D15截短重組蛋白偶聯(lián)到羧化乳膠顆粒的表面而得。
3.如權(quán)利要求2所述的鴨疫里默氏桿菌表面抗原D15截短重組蛋白致敏乳膠試劑的制備方法，其特征在于，具體包括以下步驟:取10￥1:%乳膠原液,用0.lmol/L、pH9.6的碳酸鹽緩沖液離心洗滌，再用0.01mol/L、pH7.4的磷酸鹽緩沖液離心洗滌并重懸，加入2wt% EDAC溶液，37°C振搖反應(yīng)使乳膠顆粒表面的羧基活化，離心棄上清，沉淀用0.01mol/L、pH8.0的硼酸鹽緩沖液離心洗滌并重懸至濃度為0.5~2wt%，再加入等體積0.1125~0.225mg/mL的鴨疫里默氏桿菌表面抗原D15截短重組蛋白溶液，37°C振搖反應(yīng)2~12小時(shí)使羧化乳膠與鴨疫里默氏桿菌表面抗原D15截短重組蛋白偶聯(lián)，加入0.lmol/L甘氨酸終止反應(yīng)，離心棄上清，沉淀用lwt%牛血清白蛋白溶液封閉后，懸浮于含有穩(wěn)定劑、封閉劑和防腐劑的緩沖液中，即得鴨疫里默氏桿菌表面抗原D15截短重組蛋白致敏乳膠試劑。
4.如權(quán)利要求3所述的鴨疫里默氏桿菌表面抗原D15截短重組蛋白致敏乳膠試劑的制備方法，其特征在于，具體包括以下步驟:取10?丨％乳膠原液，用0.lmol/L、pH9.6的碳酸鹽緩沖液離心洗滌，再用0.01mol/L、pH7.4的磷酸鹽離心洗滌并重懸，加入2wt% EDAC溶液，37°C振搖反應(yīng)使乳膠顆粒表面的羧基活化，離心棄上清，沉淀用0.01mol/L、pH8.0的硼酸鹽緩沖液離心洗滌并重懸至濃度為lwt%，再加入等體積0.225mg/mL的鴨疫里默氏桿菌表面抗原D15截短重組蛋白溶液，37°C振搖反應(yīng)6小時(shí)使羧化乳膠與鴨疫里默氏桿菌表面抗原D15截短重組蛋白偶聯(lián),加入0.lmol/L甘氨酸終止反應(yīng),離心棄上清,沉淀用Iwt %牛血清白蛋白溶液封閉后，懸浮于含有5vol%甘油、lwt%牛血清白蛋白和0.1wt %置氣納的0.01M、pH7.4的磷酸鹽緩沖液中，即得鴨疫里默氏桿菌表面抗原D15截短重組蛋白致敏乳膠試劑。
5.如權(quán)利要求2至4任一項(xiàng)所述的鴨疫里默氏桿菌表面抗原D15截短重組蛋白致敏乳膠試劑的制備方法，其特征在于，所述鴨疫里默氏桿菌表面抗原D15截短重組蛋白采用以下方法制備:將核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示的鴨疫里默氏桿菌表面抗原D15截短重組蛋白的編碼基因克隆入原核表達(dá)質(zhì)粒pET28a(+)中得到重組表達(dá)載體，將該重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21 (DE3)中得到工程菌，將該工程菌接種于含卡那霉素即Kan的LB液體培養(yǎng)基中，37 °C培養(yǎng)過(guò)夜，次日取菌液按體積比1:50接入含Kan的LB液體培養(yǎng)基中，37 °C振蕩培養(yǎng)至0D_ = 0.4，加入IPTG至終濃度為0.6mmol，37°C誘導(dǎo)培養(yǎng)4小時(shí)，收集菌液，離心，沉淀用20mmol pH8.0的Tris-HCl緩沖液懸浮，置_20°C過(guò)夜后，加溶菌酶至終濃度為lmg/mL, 4°C攪拌30分鐘，冰浴條件下超聲波間歇破碎菌體，離心，沉淀用洗液離心洗滌后，用尿素溶液溶解，進(jìn)行鎳瓊脂糖凝膠親和層析純化，以含有300mmol咪唑的洗脫緩沖液為洗脫劑，收集蛋白洗脫液，透析復(fù)性，獲得攜帶組氨酸標(biāo)簽的鴨疫里默氏桿菌表面抗原D15截短重組蛋白。
6.權(quán)利要求1所述的鴨疫里默氏桿菌表面抗原D15截短重組蛋白致敏乳膠試劑在制備鴨疫里默氏桿菌抗體檢測(cè)試劑中的應(yīng)用。
7.鴨疫里默氏桿菌抗體乳膠凝集檢測(cè)試劑盒，其特征在于，含有權(quán)利要求1所述的鴨疫里默氏桿菌表面抗原 D15截短重組蛋白致敏乳膠試劑。
【文檔編號(hào)】C07K14/195GK103926414SQ201410182317
【公開(kāi)日】2014年7月16日 申請(qǐng)日期:2014年4月30日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月30日
【發(fā)明者】程安春, 奉彬, 汪銘書(shū), 朱德康, 陳孝躍 申請(qǐng)人:四川農(nóng)業(yè)大學(xué)