一種從樟芝菌固態(tài)發(fā)酵粉中提純安卓奎諾爾的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種從樟芝菌固態(tài)發(fā)酵粉中提純安卓奎諾爾的方法，屬于生物制藥領(lǐng)域。所述分離制備方法是以樟芝固態(tài)發(fā)酵粉末物為原料，通過有機溶劑萃取、濃縮、初步除雜、粗提液的一次柱層析、半制備色譜、二次柱層析及濃縮去溶劑的步驟，得到高純度的安卓奎諾爾產(chǎn)品，所述方法操作簡單，能有效從粗提物中得到安卓奎諾爾，其純度為90％以上，并且可實現(xiàn)大規(guī)模制備。
【專利說明】一種從樟芝菌固態(tài)發(fā)酵粉中提純安卓奎諾爾的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種從樟芝菌固態(tài)發(fā)酵粉中提純安卓奎諾爾的方法，屬于生物制藥領(lǐng)域。

【背景技術(shù)】
[0002]安卓奎諾爾,英文名稱為(Antroquinonol),是一種潛在的抗癌藥物。安卓奎諾爾是發(fā)現(xiàn)于牛樟芝子實體中的化合物，分子式C24H38O4，分子量為390g/mol。純化的安卓奎諾爾為淡黃色油狀，具有低水溶性之特性(〈0.lmg/ml)，具有高度穩(wěn)定性，可于室溫(25°C)或低溫環(huán)境(4°C )維持穩(wěn)定性至少長達24個月。
[0003]生理活性物質(zhì)安卓奎諾爾是2007年Lee等人利用正己烷從樟芝子實體中萃取并鑒定一種新化合物，屬于泛醌類的衍生物。2010年Chiang等人研究表明安卓奎諾爾可以通過活化AMPK來抑制胞內(nèi)蛋白質(zhì)的合成途徑，進而抑制細胞周期，從而產(chǎn)生抗癌效果。2012年Tsai等研究發(fā)現(xiàn)安卓奎諾爾具有抗氧化應(yīng)激和抗炎等活性。由于安卓奎諾爾具有顯著的抗癌活性，并且，它對于癌細胞與正常細胞具有選擇性，目前已進入FDA 二期臨床實驗，是具有優(yōu)良前景的抗癌化合物。
[0004]高純度的安卓奎諾爾不僅在保健品、醫(yī)藥領(lǐng)域有著廣闊的應(yīng)用潛力，而且對于其生理功能方面的深入研究具有很重要的價值。目前，安卓奎諾爾的提純僅以牛樟芝的菌絲體為原料，采用柱層析結(jié)合半制備色譜的方法進行提純，但安卓奎諾爾的純度仍不高，不能達到做參照標(biāo)準(zhǔn)品的要求。本發(fā)明以樟芝固態(tài)發(fā)酵粉為原料，制備獲得了高純度的安卓奎諾爾。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種從樟芝固態(tài)發(fā)酵粉中提純安卓奎諾爾的方法，以樟芝菌固態(tài)發(fā)酵粉末為原料，通過萃取、濃縮除雜、一次柱層析、半制備色譜、二次柱層析、濃縮等步驟，得到高純度的含安卓奎諾爾的產(chǎn)品。
[0006]所述方法主要包括以下步驟:
[0007](I)萃取:將樟芝固態(tài)發(fā)酵粉末，以無水乙醇反復(fù)浸提多次，然后合并濾液得到安卓奎諾爾粗提濃縮液；
[0008](2)濃縮除雜:除去步驟(1)粗提濃縮液中的乙醇，以體積分?jǐn)?shù)50% -90%的乙酸乙酯水溶液反復(fù)萃取3次；收集合并乙酸乙酯相，除去乙酸乙酯，得到濃縮液I ;
[0009](3) 一次柱層析:柱層析填料為60-80目或100-200目的硅膠，或非極性或中極性的大孔樹脂，采用梯度洗脫，以乙醇水溶液或選自酯類、醇類、烷類或鹵烷所組成的族群中的兩種物質(zhì)混合作為洗脫劑進行梯度洗脫，洗脫后的流分分段收集，合并含安卓奎諾爾的流分，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得到濃縮液2 ；
[0010](4)半制備色譜:將濃縮液2以半制備色譜分離純化，流動相為體積分?jǐn)?shù)80-100%的乙腈水溶液，流速:2mL/min，采用普通C18的制備色譜柱，柱溫20_40°C ;UV檢測器，檢測波長為254nm ;根據(jù)出峰時間收集物質(zhì)，收集液濃縮后得到濃縮液3 ；
[0011](5) 二次柱層析:柱層析填料為200-300目的硅膠，以選自酯類、醇類、烷類或鹵烷所組成的族群的兩種物質(zhì)混合作為洗脫劑進行梯度洗脫，洗脫后的流分分段收集；
[0012](6)濃縮:對收集的含安卓奎諾爾的樣品進行常壓濃縮或真空濃縮。
[0013]所述方法優(yōu)選以下步驟:
[0014](I)萃取:將安卓奎諾爾含量范圍在300mg/kg~1000mg/kg的樟芝固態(tài)發(fā)酵粉末，按照料液比Ig: 5mL-lg: 15mL的比例加入無水乙醇,20-40V下,浸提、過濾，反復(fù)3次,然后合并濾液得到安卓奎諾爾粗提濃縮液。
[0015](2)濃縮除雜:在40_50°C下真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇得到安卓奎諾爾粗提浸膏，粗提浸膏按18:51^-18:201^的比例加入50%-90% (v/v)乙酸乙酯水溶液進行萃取，靜置分層，萃取3次。收集合并乙酸乙酯相，在40-50°C下真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙酸乙酯，得到濃縮液
1
[0016](3) 一次柱層析:柱層析填料為60-80目或100-200目的硅膠，或非極性或中極性的大孔樹脂，采用梯度洗脫，以乙醇水溶液或選自酯類、醇類、烷類或鹵烷所組成的族群中的兩種物質(zhì)以體積比0-100%混合作為洗脫劑進行梯度洗脫，洗脫后的流分分段收集，合并含安卓奎諾爾的流分，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得到濃縮液2。
[0017](4)半制備色譜:將濃縮液2以半制備色譜分離純化，流動相為體積分?jǐn)?shù)80-100%的乙腈水溶液，流速:2mL/min，采用普通C18的制備色譜柱，柱溫20_40°C ；UV檢測器:檢測波長為254nm ;根據(jù)出峰時間收集物質(zhì)，收集液濃縮后得到濃縮液3。
[0018](5) 二次柱層析:以選自酯類、醇類、烷類或鹵烷所組成的族群的兩種物質(zhì)混合作為洗脫劑，進行梯度洗脫，洗脫后的流分分段收集。
[0019](6)濃縮:采用常壓濃縮、真空濃縮等方法對收集的含安卓奎諾爾的樣品進行濃縮。
[0020]所述步驟⑶中非極性或中極性的大孔樹脂優(yōu)選HPD100、HPD400、HPD700、HPD750、HPD826 或 D101。
[0021]所述步驟(3)優(yōu)選以大孔樹脂HPD100、HPD400、HPD700、HPD750、HPD826 或 DlOl為柱層析填料，以 0%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、80%、100% (v/v)的乙醇水溶液為洗脫劑進行梯度洗脫。
[0022]所述步驟(3)還優(yōu)選以60-80目或100-200目的硅膠為柱層析填料，以O(shè) %、10%、20%,30%,40%,50%,60%,80%,100% (v/v)的丙酮的苯溶液為洗脫劑進行梯度洗脫。
[0023]所述步驟(3)還進一步優(yōu)選以大孔樹脂HPD100或HPD400為柱層析填料，水溶液沖洗HPD100或HPD400大孔樹脂后，以流速為0.5BV/h注入安卓奎諾爾濃縮液1，待吸附結(jié)束后，用 0%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、80%、100% (v/v)的乙醇水溶液為洗脫劑進行梯度洗脫，每個濃度洗脫I個柱體積。
[0024]所述步驟(3)還優(yōu)選柱層析填料60-80目或100-200目的硅膠，用苯?jīng)_洗60-80目或100-200目的硅膠，以流速為0.5BV/h注入安卓奎諾爾濃縮液I，待吸附結(jié)束后，用O %、10%,20%,30%,40%,50%,60%,80%UOO% (v/v)丙酮的苯溶液為洗脫劑進行梯度洗脫，每個濃度洗脫I個柱體積。
[0025]所述步驟(5)優(yōu)選200-300目的硅膠，以體積比70-75: 25-30的苯:甲醇為洗脫劑，以0.6BV/h流速洗脫，洗脫后的流分分段收集。
[0026]本發(fā)明方法得到的純化的安卓奎諾爾為淡黃色油狀物，其純度達91%以上，產(chǎn)品的HPLC圖譜為附圖1，為單一峰；板層析圖譜為附圖2，TLC層析呈單一點。
[0027]本發(fā)明采用硅膠或大孔樹脂層析結(jié)合半制備色譜分離純化安卓奎諾，最后再采用硅膠層析純化。其操作簡單、易實施，能有效從目標(biāo)產(chǎn)物含量較低的樟芝固態(tài)發(fā)酵粉末中得到安卓奎諾爾純度為90%以上的產(chǎn)品，所得產(chǎn)品可以作為對照品用于檢測或其它生理活性、穩(wěn)定性試驗的研究及應(yīng)用等方面。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0028]圖1:實施例3分離制備的安卓奎諾爾HPLC檢測圖譜。
[0029]圖2:實施例3分離制備的安卓奎諾爾板層析圖譜，A圖為254nm下的檢測圖譜，B圖為365nm下的檢測圖譜，樣品1:濃縮液I ;樣品2:濃縮液2 ;樣品3:濃縮液3 ;樣品4:_.次柱層析后的安卓奎諾爾產(chǎn)品。
[0030]圖3:實施例3分離制備的安卓奎諾爾的核磁共振H譜。
[0031]圖4:實施例3分離制備的安卓奎諾爾的核磁共振C譜。

【具體實施方式】
[0032]樟芝固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)安卓奎諾爾、及安卓奎諾爾的檢測方法均采用本領(lǐng)域現(xiàn)有常規(guī)方法，在此不作贅述。
[0033]實施例1
[0034]樟芝固態(tài)發(fā)酵粉末(安卓奎諾爾的含量為300mg/kg) 500g與5L乙醇混合，在35°C下浸提1.5h ;浸提后經(jīng)布氏漏斗抽濾，濾液在45°C下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇，得到安卓奎諾爾粗提浸膏，所述粗提浸膏與70% (v/v)乙酸乙酯水溶液按Ig: 20mL的比例加入乙酸乙酯水溶液萃取，靜置分層，萃取3次，收集合并乙酸乙酯相，在45°C下真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮安卓奎諾爾，得到安卓奎諾爾濃縮液I。
[0035]用水溶液沖洗HPD100大孔樹脂后，以流速為0.5BV/h注入安卓奎諾爾濃縮液1，待吸附結(jié)束后，用 0%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、80%、100% (v/v)的乙醇水溶液為洗脫劑進行梯度洗脫，每個濃度洗脫I個柱體積。洗脫后的流分分段收集，合并含安卓奎諾爾的流分，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮得到濃縮液2。
[0036]半制備色譜柱分離安卓奎諾爾:米用SapphireC18(10.0X250mm,5um, 100A)的制備色譜柱，流動相為體積分?jǐn)?shù)80-100 %的乙腈水溶液，流速為2mL/min，柱溫28°C ；UV檢測器:檢測波長為254nm ;根據(jù)出峰時間收集物質(zhì)。收集液濃縮后得到濃縮液3。
[0037]濃縮液3的柱層析分離:第二次硅膠柱層析用200-300目的硅膠，采用體積比75: 25的苯:甲醇為洗脫劑，以0.6BV/h流速洗脫，洗脫后的流分分段收集。
[0038]合并含安卓奎諾爾的流分采用常壓濃縮或真空濃縮，制得的安卓奎諾爾的得率為71' %。根據(jù)安卓奎諾爾在254nm的最大吸收峰面積與全部物質(zhì)在254nm最大吸收峰面積總和的比值，可計算安卓奎諾爾的純度為91%。
[0039]實施例2
[0040]樟芝固態(tài)發(fā)酵粉末(安卓奎諾爾的含量為300mg/kg) 500g與5L乙醇混合，在35°C下浸提1.5h ;浸提后經(jīng)布氏漏斗抽濾，濾液在45°C下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇，得到安卓奎諾爾粗提浸膏，所述粗提浸膏:70% (v/v)乙酸乙酯水溶液按Ig: 20mL的比例加入乙酸乙酯水萃取，靜置分層，萃取3次。收集合并乙酸乙酯相，在45°C下真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮安卓奎諾爾，得到安卓奎諾爾濃縮液I。
[0041]用水溶液沖洗HPD400大孔樹脂，以流速為0.5BV/h注入安卓奎諾爾濃縮液1，待吸附結(jié)束后，用 0%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、80%、100% (v/v)乙醇水溶液為洗脫劑進行梯度洗脫，每個濃度洗脫I個柱體積。洗脫后的流分分段收集，合并含安卓奎諾爾的流分，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮得到濃縮液2。
[0042]半制備色譜柱分離安卓奎諾爾:米用SapphireC18(10.0X250mm,5um, 100A)的制備色譜柱，流動相為體積分?jǐn)?shù)80-100%的乙腈水溶液，流速為2mL/min，柱溫28°C ；UV檢測器:檢測波長為254nm ;根據(jù)出峰時間收集物質(zhì)。收集液濃縮后得到濃縮液3。
[0043]濃縮液3的柱層析分離:第二次硅膠柱層析用200-300目的硅膠采用苯:甲醇體積比75: 25為洗脫劑，以0.6BV/h流速洗脫，洗脫后的流分分段收集。
[0044]合并含安卓奎諾爾的流分采用常壓濃縮或真空濃縮，制得的安卓奎諾爾的得率為69%。根據(jù)安卓奎諾爾在254nm的最大吸收峰面積與全部物質(zhì)在254nm最大吸收峰面積總和的比值，可計算安卓奎諾爾的純度為91%。
[0045]實施例3
[0046]樟芝固態(tài)發(fā)酵粉末(安卓奎諾爾的含量為300mg/kg) 500g與5L乙醇混合，在35°C下浸提1.5h ;浸提后經(jīng)布氏漏斗抽濾，濾液在45°C下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇，得到安卓奎諾爾粗提浸膏，所述粗提浸膏:70% (v/v)乙酸乙酯水溶液按Ig: 20mL的比例加入乙酸乙酯水萃取，靜置分層，萃取3次，收集合并乙酸乙酯相，在45°C下真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮安卓奎諾爾，得到安卓奎諾爾濃縮液I。
[0047]用苯?jīng)_洗60-80目硅膠，以流速為0.5BV/h注入安卓奎諾爾濃縮液1，待吸附結(jié)束后，用 0%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、80%、100% (v/v)丙酮的苯溶液為洗脫劑進行梯度洗脫，每個濃度洗脫I個柱體積，洗脫后的流分分段收集，合并含安卓奎諾爾的流分，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮得到濃縮液2。
[0048]半制備色譜柱分離安卓奎諾爾:米用SapphireC18(10.0X250mm,5um, 100A)的制備色譜柱，流動相為體積分?jǐn)?shù)80-100 %的乙腈水溶液，流速為2mL/min，柱溫28°C ；UV檢測器:檢測波長為254nm ;根據(jù)出峰時間收集物質(zhì)。收集液濃縮后得到濃縮液3。
[0049]濃縮液3的柱層析分離:第二次硅膠柱層析用200-300目的硅膠采用苯:甲醇體積比75: 25為洗脫劑，以0.6BV/h流速洗脫，洗脫后的流分分段收集。
[0050]合并含安卓奎諾爾的流分采用常壓濃縮或真空濃縮，制得的安卓奎諾爾的得率為73%。根據(jù)安卓奎諾爾在254nm的最大吸收峰面積與全部物質(zhì)在254nm最大吸收峰面積總和的比值，可計算安卓奎諾爾的純度為91%。
[0051]實施例4
[0052] 樟芝固態(tài)發(fā)酵粉末(安卓奎諾爾的含量為300mg/kg) 500g與5L乙醇混合，在35°C下浸提1.5h ;浸提后經(jīng)布氏漏斗抽濾，濾液在45°C下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇，得到安卓奎諾爾粗提浸膏，所述粗提浸膏:70% (v/v)乙酸乙酯水溶液按Ig: 20mL的比例加入乙酸乙酯水萃取，靜置分層，萃取3次，收集合并乙酸乙酯相，在45°C下真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮安卓奎諾爾，得到安卓奎諾爾濃縮液I。
[0053]用苯?jīng)_洗60-80目硅膠，以流速為0.5BV/h注入安卓奎諾爾濃縮液1，待吸附結(jié)束后，用 0%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、80%、100% (v/v)丙酮的苯溶液為洗脫劑進行梯度洗脫，每個濃度洗脫I個柱體積，洗脫后的流分分段收集，合并含安卓奎諾爾的流分，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮得到濃縮液2。
[0054]半制備色譜柱分離安卓奎諾爾:米用SapphireC18(10.0X250mm,5um, 100A)的制備色譜柱，流動相為體積分?jǐn)?shù)80-100 %的乙腈水溶液，流速為2mL/min，柱溫28°C ；UV檢測器:檢測波長為254nm ;根據(jù)出峰時間收集物質(zhì)。收集液濃縮后得到濃縮液3。
[0055]濃縮液3的柱層析分離:第二次硅膠柱層析用200-300目的硅膠，采用體積比70: 30的苯:甲醇為洗脫劑，以0.6BV/h流速洗脫，洗脫后的流分分段收集。
[0056]合并含安卓奎諾爾的流分采用常壓濃縮或真空濃縮，制得的安卓奎諾爾的得率為75%。根據(jù)安卓奎諾爾在254nm的最大吸收峰面積與全部物質(zhì)在254nm最大吸收峰面積總和的比值，可計算安卓奎諾爾的純度為85%。
[0057]實施例5
[0058]樟芝固態(tài)發(fā)酵粉末(安卓奎諾爾的含量為300mg/kg) 500g與5L乙醇混合，在35°C下浸提1.5h ;浸提后經(jīng)布氏漏斗抽濾，濾液在45°C下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇，得到安卓奎諾爾粗提浸膏，所述粗提浸膏:70% (v/v)乙酸乙酯水溶液按Ig: 20mL的比例加入乙酸乙酯水萃取，靜置分層，萃取3次。收集合并乙酸乙酯相，在45°C下真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮安卓奎諾爾，得到安卓奎諾爾濃縮液I。
[0059]用苯?jīng)_洗100-200目硅膠，以流速為0.5BV/h注入安卓奎諾爾濃縮液1，待吸附結(jié)束后，用 0%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、80%、100% (v/v)丙酮的苯溶液為洗脫劑進行梯度洗脫，每個濃度洗脫I個柱體積，洗脫后的流分分段收集，合并含安卓奎諾爾的流分，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮得到濃縮液2。
[0060]半制備色譜柱分離安卓奎諾爾:米用SapphireC18(10.0X250mm,5um, 100A)的制備色譜柱，流動相為體積分?jǐn)?shù)80-100 %的乙腈水溶液，流速為2mL/min，柱溫28°C ；UV檢測器:檢測波長為254nm ;根據(jù)出峰時間收集物質(zhì)。收集液濃縮后得到濃縮液3。
[0061]濃縮液3的柱層析分離:第二次硅膠柱層析用200-300目的硅膠，采用體積比75: 25的苯:甲醇為洗脫劑，以0.6BV/h流速洗脫，洗脫后的流分分段收集。
[0062]合并含安卓奎諾爾的流分采用常壓濃縮或真空濃縮，制得的安卓奎諾爾的得率為70%。根據(jù)安卓奎諾爾在254nm的最大吸收峰面積與全部物質(zhì)在254nm最大吸收峰面積總和的比值，可計算安卓奎諾爾的純度為89%。
[0063]實施例6
[0064]樟芝固態(tài)發(fā)酵粉末(安卓奎諾爾的含量為300mg/kg) 500g與5L乙醇混合，在35°C下浸提1.5h ;浸提后經(jīng)布氏漏斗抽濾，濾液在45°C下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇，得到安卓奎諾爾粗提浸膏，所述粗提浸膏:70% (v/v)乙酸乙酯水溶液按Ig: 20mL的比例加入乙酸乙酯水萃取，靜置分層，萃取3次。收集合并乙酸乙酯相，在45°C下真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮安卓奎諾爾，得到安卓奎諾爾濃縮液I。
[0065]用苯?jīng)_洗100-200目硅膠，以流速為0.5BV/h注入安卓奎諾爾濃縮液1，待吸附結(jié)束后，用 0%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、80%、100% (v/v)丙酮的苯溶液為洗脫劑進行梯度洗脫，每個濃度洗脫I個柱體積，洗脫后的流分分段收集，合并含安卓奎諾爾的流分，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮得到濃縮液2。
[0066]半制備色譜柱分離安卓奎諾爾:米用SapphireC18(10.0X250mm,5um, 100A)的制備色譜柱，流動相為體積分?jǐn)?shù)80-100 %的乙腈水溶液，流速為2mL/min，柱溫28°C ；UV檢測器:檢測波長為254nm ;根據(jù)出峰時間收集物質(zhì)。收集液濃縮后得到濃縮液3。
[0067]濃縮液3的柱層析分離:第二次硅膠柱層析用200-300目的硅膠，采用體積比70: 30苯:甲醇為洗脫劑，以0.6BV/h流速洗脫，洗脫后的流分分段收集。
[0068]合并含安卓奎諾爾的流分采用常壓濃縮或真空濃縮，制得的安卓奎諾爾的得率為70%。根據(jù)安卓奎諾爾在254nm的最大吸收峰面積與全部物質(zhì)在254nm最大吸收峰面積總和的比值，可計算安卓奎諾爾的純度為85%。
[0069]雖然本發(fā)明已以較佳實施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動與修飾，因此本發(fā)明的保護范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書所界定的為準(zhǔn)。
【權(quán)利要求】
1.一種從樟芝固態(tài)發(fā)酵粉中提純安卓奎諾爾的方法，其特征在于，以樟芝固態(tài)發(fā)酵粉末為原料，通過萃取、濃縮除雜、一次柱層析、半制備色譜、二次柱層析、濃縮得到高純度的含安卓奎諾爾的產(chǎn)品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)萃取:將樟芝固態(tài)發(fā)酵粉末，以無水乙醇反復(fù)浸提多次，然后合并濾液得到安卓奎諾爾粗提濃縮液； (2)濃縮除雜:除去步驟(1)粗提濃縮液中的乙醇，以體積分?jǐn)?shù)50%-90%的乙酸乙酯水溶液反復(fù)萃取3次；收集合并乙酸乙酯相，除去乙酸乙酯，得到濃縮液I ; (3)一次柱層析:柱層析填料為60-80目或100-200目的硅膠，或非極性或中極性的大孔樹脂，采用梯度洗脫，以乙醇水溶液或選自酯類、醇類、烷類或鹵烷所組成的族群中的兩種物質(zhì)混合作為洗脫劑進行梯度洗脫，洗脫后的流分分段收集，合并含安卓奎諾爾的流分，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得到濃縮液2 ； (4)半制備色譜:將濃縮液2以半制備色譜分離純化，流動相為體積分?jǐn)?shù)80-100%的乙腈水溶液，流速:2mL/min，采用普通C18的制備色譜柱，柱溫20_40°C ;UV檢測器，檢測波長為254nm ;根據(jù)出峰時間收集物質(zhì)，收集液濃縮后得到濃縮液3 ； (5)二次柱層析:柱層析填料為200-300目的硅膠，以選自酯類、醇類、烷類或鹵烷所組成的族群的兩種物質(zhì)混合作為洗脫劑進行梯度洗脫，洗脫后的流分分段收集； (6)濃縮:對收集的含安卓奎諾爾的樣品進行常壓濃縮或真空濃縮。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，步驟(1)將安卓奎諾爾含量為300mg/kg~1000mg/kg的樟芝固態(tài)發(fā)酵粉末,按照料液比lg:5mL_lg: 15mL的比例加入無水乙醇，20-40°C下浸提、過濾，反復(fù)3次，然后合并濾液得到安卓奎諾爾粗提濃縮液。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的方法，其特征在于，步驟(2)在40-50°C下真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇得到安卓奎諾爾粗提浸膏，粗提浸膏與體積分?jǐn)?shù)50% -90%的乙酸乙酯水溶液按lg:5mL-lg:20mL的比例加入乙酸乙酯水溶液進行萃取，靜置分層，萃取3次；收集合并乙酸乙酯相，在40-50°C下真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙酸乙酯，得到濃縮液I。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述步驟(3)中非極性或中極性的大孔樹脂為 HPD100、HPD400、HPD700、HPD750、HPD826 或 D101。
6.根據(jù)權(quán)利要求2或5所述的方法，其特征在于，所述步驟(3)以體積分?jǐn)?shù)為0%、10 %、20 %、30 %、40 %、50 %、60 %、80 %、100 %的乙醇水溶液為洗脫劑進行梯度洗脫。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述步驟(3)柱層析填料為60-80目或100-200 目的硅膠，以體積分?jǐn)?shù)為 0%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、80%、100% 的丙酮的苯溶液為洗脫劑進行梯度洗脫。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述步驟(3)柱層析填料為大孔樹脂HPD100或HPD400，水溶液沖洗HPD100或HPD400大孔樹脂后，以流速為0.5BV/h注入安卓奎諾爾濃縮液1，待吸附結(jié)束后，用體積分?jǐn)?shù)為0%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、80%、100%的乙醇水溶液為洗脫劑進行梯度洗脫，每個濃度洗脫I個柱體積。
9 .根據(jù)權(quán)利要求2或7所述的方法，其特征在于，所述步驟(3)柱層析填料為60-80目或100-200目的硅膠，用苯?jīng)_洗60-80目或100-200目的硅膠，以流速為0.5BV/h注入安卓奎諾爾濃縮液1，待吸附結(jié)束后，用體積分?jǐn)?shù)為0%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、80%、100%的丙酮的苯溶液為洗脫劑進行梯度洗脫，每個濃度洗脫I個柱體積。
10.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述步驟(5)柱層析填料為200-300目的硅膠，以體積比70-75: 25-30的苯:甲醇為洗脫劑，以0.6BV/h流速洗脫，洗脫后的流分分段收 集。
【文檔編號】C07C45/79GK104130113SQ201410323967
【公開日】2014年11月5日 申請日期:2014年7月8日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月8日
【發(fā)明者】許贛榮, 路瑞秋, 張薄博 申請人:江南大學(xué)