一種樟芝菌中腺苷的提取方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種樟芝菌中腺苷的提取方法。所述的提取方法包括以下步驟：先將樟芝菌接種于PDA培養(yǎng)基中進(jìn)行菌種活化，再將活化后的樟芝菌接種于液體種子培養(yǎng)基中，搖床培養(yǎng)得到搖床培養(yǎng)后的樟芝菌搖床培養(yǎng)，再取2%-5%的搖床培養(yǎng)后的樟芝菌接種于發(fā)酵罐中培養(yǎng)，得到深層發(fā)酵后的樟芝菌發(fā)酵液，最后制備樟芝菌菌絲體干粉，并將其溶于加有有機(jī)溶劑的水中在40-50°C的恒溫水浴鍋里浸提40-60min，離心取沉淀用水洗滌，取洗滌液即為腺苷的提取液。本發(fā)明中先對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理，在有機(jī)溶劑提取時(shí)，將提取溫度控制在40-5CTC，提取時(shí)間控制在40-60min,大大縮短了提取時(shí)間，同時(shí)也使腺苷,提取率明顯增加，還能維護(hù)腺苷結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。
【專利說(shuō)明】一種樟芝菌中腺苷的提取方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種真菌有效成份的提取，具體涉及一種樟芝菌中腺苷的提取方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 樟芝Antrodia camphorata又稱牛樟芝或牛樟燕，是臺(tái)灣特有珍貴真菌。研究發(fā) 現(xiàn)樟芝成分復(fù)雜，含有很多生理活性物質(zhì)具有多種生理活性，如抗氧化、保肝、抗癌、解毒、 消炎等，對(duì)食物中毒等危急病癥具有神奇的療效。腺苷也是牛樟芝重要成分中的一種，其是 一種內(nèi)源性嘌呤核苷酸，具有廣泛的生理活性，如可以減少心肌漏出酶，維持細(xì)胞膜完整， 降低冠狀動(dòng)脈阻力和肺動(dòng)脈壓，并能促進(jìn)造血等功能。另外，腺苷在炎癥中由大量ATP降解 而成，局部濃度可達(dá)1200nm 〇L/L，腺苷濃度在此水平時(shí)具抗炎作用。目前ATP已廣泛用于心 功能不全及血管動(dòng)脈硬化等疾病的治療。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)腺苷的提取方法主要包括超聲提 取、冷凝回流提取及水浴提取，提取介質(zhì)主要包括水、甲醇、乙醇等，提取時(shí)采用的提取介質(zhì) 不同、提取方法不同時(shí)，腺苷提取率也不同，但上述方法存在操作繁瑣或提取率低等缺點(diǎn)。 為此，本發(fā)明對(duì)水浴浸提的方法進(jìn)行了進(jìn)一步改進(jìn)，提供一種操作簡(jiǎn)單，腺苷提取率高的提 取方法。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供一種對(duì)樟芝菌中腺苷進(jìn)行有效提取的方 法。
[0004] 本發(fā)明的技術(shù)方案如下： 一種樟芝菌中腺苷的提取方法，包括以下步驟： (1) 菌種活化：將樟芝菌接種于PDA培養(yǎng)基中，培養(yǎng)活化得到活化后的樟芝菌； (2) 搖床培養(yǎng)：將步驟（1)中得到的活化后的樟芝菌接種于液體種子培養(yǎng)基中，搖床培 養(yǎng)得到搖床培養(yǎng)后的樟芝菌； (3) 發(fā)酵培養(yǎng)：取2%-5%的步驟（2)中得到的搖床培養(yǎng)后的樟芝菌接種于發(fā)酵罐中培 養(yǎng)，得到深層發(fā)酵后的樟芝菌發(fā)酵液； (4) 樟芝菌干粉制備：取步驟（3)中得到的深層發(fā)酵后的樟芝菌發(fā)酵液離心，取沉淀加 水洗滌，再次離心，洗滌，將洗滌液在45-55°C條件下真空冷凍干燥，粉碎過(guò)篩，制得樟芝菌 菌絲體干粉； (5) 腺苷提取及腺苷含量測(cè)定：將步驟（4)中制得的樟芝菌菌絲體干粉溶于加有有機(jī) 溶劑的水中，在40-50°C的恒溫水浴鍋里浸提40-60min，離心，棄上清液，取沉淀用水洗滌， 取洗滌液即為腺苷的提取液。
[0005] 步驟（1)中所述的PDA培養(yǎng)基由以下重量份的組分組成：牛樟木萃取的營(yíng)養(yǎng)液 5%-10%，葡萄糖10-30%，蛋白胨5-10%，酵母粉2-5%，瓊脂5%-8%，水余量。
[0006] 步驟（1)中所述的PDA培養(yǎng)基的制成方法具體為：將5%_10%牛樟木萃取的營(yíng)養(yǎng) 液，10-30%的葡萄糖，5-10%的蛋白胨，2-5%的酵母粉，5%-8%的瓊脂，水余量，加熱融化，裝 試管，滅菌。
[0007] 所述的滅菌方法具體為：121°C條件下濕熱滅菌30_45min。
[0008] 優(yōu)選的，步驟（1)中所述的培養(yǎng)溫度為25_28°C，培養(yǎng)時(shí)間為5-7d。
[0009] 步驟（2)中所述的液體種子培養(yǎng)基及步驟（3)中所述的發(fā)酵罐中的培養(yǎng)基均由以 下重量份的組分制成：牛樟木萃取的營(yíng)養(yǎng)液5%_10%，葡萄糖10-30%，蛋白胨5-10%，酵母粉 2-5%，水余量。
[0010] 優(yōu)選的，步驟（2)中所述的搖床培養(yǎng)的培養(yǎng)溫度為25-28°C，培養(yǎng)時(shí)間為5-10d，搖 床速度為 150_180r/min。
[0011] 優(yōu)選的，步驟（3)中所述的培養(yǎng)溫度為25-28°C，培養(yǎng)時(shí)間為3-5d，通氣量為lvvm。
[0012] 優(yōu)選的，步驟（4)及步驟（5)中所述的離心速度為3000-5000r/min，離心溫度為 25-28°C ;所述的過(guò)篩為過(guò)60-80目篩。
[0013] 優(yōu)選的，步驟（5)中所述的溶劑選自乙醇或甲醇中的一種；所述的溶劑與水的體 積比為（3-5) : (11-17) 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，有益效果體現(xiàn)在以下幾點(diǎn)： 1.研究顯示，真菌中腺苷的提取溫度對(duì)腺苷的提取率具有顯著的影響，提取溫度在 40-50°C時(shí)，腺苷提取率有所增加，而當(dāng)超過(guò)50°C時(shí)，腺苷提取率明顯下降，因此，本發(fā)明中， 在對(duì)腺苷進(jìn)行恒溫水浴浸提時(shí)，將溫度控制在40-50°C，更加利于樣品中腺苷的有效提取， 此外，在溫度控制在40-50 °C時(shí)還有利于維護(hù)腺苷結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。
[0014] 2.研究顯示，采用有機(jī)溶劑進(jìn)行腺苷提取時(shí)，提取時(shí)間在2. 5h左右時(shí)，腺苷提取 率最高，本發(fā)明中，先對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理制得樟芝菌干粉，在采用有機(jī)溶劑提取時(shí)，將溶劑 與水的體積比限定為（3-5) : (11-17)，在保證提取效果的基礎(chǔ)上，可明顯縮短提取時(shí)間。

【具體實(shí)施方式】
[0015] 下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明。
[0016] 實(shí)施例1 一種樟芝菌中腺苷的提取方法，包括以下步驟： (1) 菌種活化：將樟芝菌接種于PDA培養(yǎng)基中，在25°C條件下培養(yǎng)5d，培養(yǎng)活化得到活 化后的樟芝菌； (2) 搖床培養(yǎng)：將步驟（1)中得到的活化后的樟芝菌接種于液體種子培養(yǎng)基中，在 25°C，150r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)5d，得到搖床培養(yǎng)后的樟芝菌； (3) 發(fā)酵培養(yǎng)：取2%的步驟（2)中得到的搖床培養(yǎng)后的樟芝菌接種于發(fā)酵罐中在25°C 條件下培養(yǎng)3d，通氣量為lvvm，得到深層發(fā)酵后的樟芝菌發(fā)酵液； (4) 樟芝菌干粉制備：取步驟（3)中得到的深層發(fā)酵后的樟芝菌發(fā)酵液在25°C條件下 采用3000r/min離心，取沉淀加水洗滌，以3000r/min再次離心，洗滌，將洗滌液在45°C條件 下真空冷凍干燥，粉碎過(guò)60目篩，制得樟芝菌菌絲體干粉； (5) 腺苷提取及腺苷含量測(cè)定：將步驟（4)中制得的樟芝菌菌絲體干粉溶于加有乙醇 的水中，乙醇與水的體積比為3:11，在40°C的恒溫水浴鍋里浸提40min，在25°C條件下以 3000r/min離心，棄上清液，取沉淀用水洗滌，取洗滌液即為腺苷的提取液。
[0017] 步驟（1)中所述的PDA培養(yǎng)基由以下重量份的組分組成：牛樟木萃取的營(yíng)養(yǎng)液5%， 葡萄糖10%，蛋白胨5%，酵母粉2%，瓊脂5%，水余量。
[0018] 步驟（1)中所述的PDA培養(yǎng)基的制成方法具體為：將5%牛樟木萃取的營(yíng)養(yǎng)液，10% 的葡萄糖，5%的蛋白胨，2%的酵母粉，5%的瓊脂，水余量，加熱融化，裝試管，在121°C條件下 濕熱滅菌30min。
[0019] 步驟（2)中所述的液體種子培養(yǎng)基及步驟（3)中所述的發(fā)酵罐中的培養(yǎng)基均由以 下重量份的組分制成：牛樟木萃取的營(yíng)養(yǎng)液5%，葡萄糖10%，蛋白胨5%，酵母粉2%，水余量。
[0020] 實(shí)施例2 一種樟芝菌中腺苷的提取方法，包括以下步驟： (1) 菌種活化：將樟芝菌接種于PDA培養(yǎng)基中，在28°C條件下培養(yǎng)7d，培養(yǎng)活化得到活 化后的樟芝菌； (2) 搖床培養(yǎng)：將步驟（1)中得到的活化后的樟芝菌接種于液體種子培養(yǎng)基中，在 28°C，180r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)10d，得到搖床培養(yǎng)后的樟芝菌； (3) 發(fā)酵培養(yǎng)：取5%的步驟（2)中得到的搖床培養(yǎng)后的樟芝菌接種于發(fā)酵罐中在28°C 條件下培養(yǎng)5d，通氣量為lvvm，得到深層發(fā)酵后的樟芝菌發(fā)酵液； (4) 樟芝菌干粉制備：取步驟（3)中得到的深層發(fā)酵后的樟芝菌發(fā)酵液在28°C條件下 采用5000r/min離心，取沉淀加水洗滌，以5000r/min再次離心，洗滌，將洗滌液在55°C條件 下真空冷凍干燥，粉碎過(guò)80目篩，制得樟芝菌菌絲體干粉； (5) 腺苷提取及腺苷含量測(cè)定：將步驟（4)中制得的樟芝菌菌絲體干粉溶于加有甲醇 的水中，甲醇與水的體積比為5:17,在50°C的恒溫水浴鍋里浸提60min，在28°C條件下以 5000r/min離心，棄上清液，取沉淀用水洗滌，取洗滌液即為腺苷的提取液。
[0021] 步驟（1)中所述的PDA培養(yǎng)基由以下重量份的組分組成：牛樟木萃取的營(yíng)養(yǎng)液 10%，葡萄糖30%，蛋白胨10%，酵母粉5%，瓊脂8%，水余量。
[0022] 步驟（1)中所述的PDA培養(yǎng)基的制成方法具體為：將10%牛樟木萃取的營(yíng)養(yǎng)液， 30%的葡萄糖，10%的蛋白胨，5%的酵母粉，8%的瓊脂，水余量，加熱融化，裝試管，在121°C條 件下濕熱滅菌45min。
[0023] 步驟（2)中所述的液體種子培養(yǎng)基及步驟（3)中所述的發(fā)酵罐中的培養(yǎng)基均由以 下重量份的組分制成：牛樟木萃取的營(yíng)養(yǎng)液10%，葡萄糖30%，蛋白胨10%，酵母粉5%，水余 量。
[0024] 實(shí)施例3 一種樟芝菌中腺苷的提取方法，包括以下步驟： (1) 菌種活化：將樟芝菌接種于PDA培養(yǎng)基中，在26°C條件下培養(yǎng)6d，培養(yǎng)活化得到活 化后的樟芝菌； (2) 搖床培養(yǎng)：將步驟（1)中得到的活化后的樟芝菌接種于液體種子培養(yǎng)基中，在 26°C，160r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)8d，得到搖床培養(yǎng)后的樟芝菌； (3) 發(fā)酵培養(yǎng)：取3%的步驟（2)中得到的搖床培養(yǎng)后的樟芝菌接種于發(fā)酵罐中在26°C 條件下培養(yǎng)4d，通氣量為lvvm，得到深層發(fā)酵后的樟芝菌發(fā)酵液； (4) 樟芝菌干粉制備：取步驟（3)中得到的深層發(fā)酵后的樟芝菌發(fā)酵液在26°C條件下 采用4000r/min離心，取沉淀加水洗漆，以4000r/min再次離心，洗漆，將洗漆液在50°C條件 下真空冷凍干燥，粉碎過(guò)80目篩，制得樟芝菌菌絲體干粉； (5)腺苷提取及腺苷含量測(cè)定：將步驟（4)中制得的樟芝菌菌絲體干粉溶于加有甲醇 的水中，甲醇與水的體積比為4:15,在45°C的恒溫水浴鍋里浸提50min，在26°C條件下以 4000r/min離心，棄上清液，取沉淀用水洗滌，取洗滌液即為腺苷的提取液。
[0025] 步驟（1)中所述的PDA培養(yǎng)基由以下重量份的組分組成：牛樟木萃取的營(yíng)養(yǎng)液8%， 葡萄糖20%，蛋白胨8%，葡萄糖12%，酵母粉3%，瓊脂6%，水余量。
[0026] 步驟（1)中所述的PDA培養(yǎng)基的制成方法具體為：將8%牛樟木萃取的營(yíng)養(yǎng)液，20% 的葡萄糖，8%的蛋白胨，3%的酵母粉，6%的瓊脂，水余量，加熱融化，裝試管，在121°C條件下 濕熱滅菌40min。
[0027] 步驟（2)中所述的液體種子培養(yǎng)基及步驟（3)中所述的發(fā)酵罐中的培養(yǎng)基均由以 下重量份的組分制成：牛樟木萃取的營(yíng)養(yǎng)液8%，葡萄糖20%，蛋白胨8%，酵母粉3%，水余量。
[0028] 上述實(shí)施例僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，并不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的限定，本領(lǐng)域 技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的揭示，不脫離本發(fā)明范疇所做出的改進(jìn)和修改都應(yīng)該在本發(fā)明的保 護(hù)范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1. 一種樟芝菌中腺苷的提取方法，其特征于，包括以下步驟： (1) 菌種活化：將樟芝菌接種于PDA培養(yǎng)基中，培養(yǎng)活化得到活化后的樟芝菌； (2) 搖床培養(yǎng)：將步驟（1)中得到的活化后的樟芝菌接種于液體種子培養(yǎng)基中，搖床培 養(yǎng)得到搖床培養(yǎng)后的樟芝菌； (3) 發(fā)酵培養(yǎng)：取2%-5%的步驟（2)中得到的搖床培養(yǎng)后的樟芝菌接種于發(fā)酵罐中培 養(yǎng)，得到深層發(fā)酵后的樟芝菌發(fā)酵液； (4) 樟芝菌干粉制備：取步驟（3)中得到的深層發(fā)酵后的樟芝菌發(fā)酵液離心，取沉淀加 水洗滌，再次離心，洗滌，將洗滌液在45-55°C條件下真空冷凍干燥，粉碎過(guò)篩，制得樟芝菌 菌絲體干粉； (5) 腺苷提取及腺苷含量測(cè)定：將步驟（4)中制得的樟芝菌菌絲體干粉溶于加有有機(jī) 溶劑的水中，在40-50°C的恒溫水浴鍋里浸提40-60min，離心，棄上清液，取沉淀用水洗滌， 取洗滌液即為腺苷的提取液。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種樟芝菌中腺苷的提取方法，其特征于，步驟（1)中所述的 PDA培養(yǎng)基由以下重量份的組分組成：牛樟木萃取的營(yíng)養(yǎng)液5%-10%，葡萄糖10-30%，蛋白胨 5-10%，酵母粉2-5%，瓊脂5%-8%，水余量。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種樟芝菌中腺苷的提取方法，其特征于，步驟（1)中所述的 PDA培養(yǎng)基的制成方法具體為：將5%-10%牛樟木萃取的營(yíng)養(yǎng)液，10-30%的葡萄糖，5-10%的 蛋白胨，2-5%的酵母粉，5%-8%的瓊脂，水余量，加熱融化，裝試管，滅菌。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種樟芝菌中腺苷的提取方法，其特征于，所述的滅菌方法 具體為：121°C條件下濕熱滅菌30-45min。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種樟芝菌中腺苷的提取方法，其特征于，步驟（1)中所述的 培養(yǎng)溫度為25-28°C，培養(yǎng)時(shí)間為5-7d。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種樟芝菌中腺苷的提取方法，其特征于，步驟（2)中所述的 液體種子培養(yǎng)基及步驟（3)中所述的發(fā)酵罐中的培養(yǎng)基均由以下重量份的組分制成：牛樟 木萃取的營(yíng)養(yǎng)液5%-10%，葡萄糖10-30%，蛋白胨5-10%，酵母粉2-5%，水余量。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種樟芝菌中腺苷的提取方法，其特征于，步驟（2)中所述的 搖床培養(yǎng)的培養(yǎng)溫度為25-28°C，培養(yǎng)時(shí)間為5-10d，搖床速度為150-180r/min。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種樟芝菌中腺苷的提取方法，其特征于，步驟（3)中所述的 培養(yǎng)溫度為25-28°C，培養(yǎng)時(shí)間為3-5d，通氣量為lvvm。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種樟芝菌中腺苷的提取方法，其特征于，步驟（4)及步驟 (5)中的所述的離心速度為3000-5000r/min，離心溫度為25-28°C ;所述的過(guò)篩為過(guò)60-80 目篩。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種樟芝菌中腺苷的提取方法，其特征于，步驟（5)中所述 的溶劑選自乙醇或甲醇中的一種；所述的溶劑與水的體積比為（3-5) : (11-17)。
【文檔編號(hào)】C07H1/06GK104212856SQ201410471596
【公開(kāi)日】2014年12月17日 申請(qǐng)日期:2014年9月17日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月17日
【發(fā)明者】劉巴寧, 鄭安喬 申請(qǐng)人:中山安蕎生物科技有限公司