多肽、抗體可變域和拮抗劑的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及多肽、抗體可變域和拮抗劑。本發(fā)明涉及能抵抗蛋白酶降解的抗-TNFR多肽和抗體單可變域(dAb)，以及含有這些的拮抗劑。多肽、dAb和拮抗劑可作為可能在被給藥于患者時遇到蛋白酶的治療劑和/或預(yù)防劑，例如用于肺部給藥、口服給藥，遞送至患者的肺和遞送至患者的GI道，以及用于治療癌癥和炎癥，如關(guān)節(jié)炎或COPD。
【專利說明】多肽、抗體可變域和拮抗劑
[0001] 本申請是國際申請日為2008年6月4日的國際申請PCT/GB2008/050405進(jìn)入中 國、申請?zhí)枮?00880102207. 2的題為"多肽、抗體可變域和拮抗劑"的發(fā)明專利申請的分案 申請。

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002] 本發(fā)明涉及蛋白酶抗性多肽、免疫球蛋白（抗體）單可變域和包含這些的抗腫瘤 壞死因子I (TNFR1，p55, CD120a，P60, TNF受體超家族成員1A，TNFRSF1A)拮抗劑。本發(fā)明 進(jìn)一步涉及含有該抗-TNFRl配體的用途、制劑、組合物和裝置。

【背景技術(shù)】
[0003] 多肽和肽日益成為各種應(yīng)用中的重要制劑，這些應(yīng)用包括工業(yè)應(yīng)用和用作醫(yī)學(xué)、 治療和診斷試劑。然而，在特定的生理學(xué)情況中，如炎癥（例如，C0PD)狀況和癌癥中，組織、 器官或動物（例如，在肺中，在腫瘤中或鄰近腫瘤）中存在的蛋白酶含量將增加。這種蛋白 酶的增加會導(dǎo)致內(nèi)源蛋白質(zhì)以及給藥來治療疾病的治療肽、多肽和蛋白質(zhì)加速的降解和失 活。因此，對體內(nèi)使用（例如，用于治療、診斷或預(yù)防疾?。┚哂袧撃艿囊恍┧巹﹥H僅具有 有限的功效，因為它們受到蛋白酶的快速降解和滅活。
[0004] 蛋白酶抗性多肽提供了若干優(yōu)勢。例如，蛋白酶抗性多肽在體內(nèi)能比蛋白酶敏感 性藥劑保持更長時間的活性，因此，能將功能保持足以產(chǎn)生生物效應(yīng)的時間段。對于選擇能 抵抗蛋白酶降解并且還具有理想生物活性的多肽的改進(jìn)方法還存在著需求。
[0005] TNFRl
[0006] TNFRl是一種跨膜受體，其含有結(jié)合配體的胞外區(qū)和缺少固有信號轉(zhuǎn)導(dǎo)活性但能 夠結(jié)合信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域。TNFRl與所結(jié)合的TNF的復(fù)合物含有三條TNFRl鏈和 三條 TNF 鏈。（Banner 等人，Cell，73 (3) 431-445 (1993).) TNF 配體作為被三條 TNFRl 鏈結(jié) 合的三聚體而存在（同上）。在受體-配體復(fù)合物中，三條TNFRl鏈被緊密聚簇（cluster) 在一起，而這種聚簇是TNFRl介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的先決條件。事實上，結(jié)合TNFRl的多價試 劑例如抗-TNFRl抗體能夠在不存在TNF時誘導(dǎo)TNFRl聚簇和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，并且通常被用作 TNFRl 激動劑（參見例如，Belka 等人，ΕΜΒ0,14 (6) :1156-1165(1995) ;Mandik-Nayak 等人， J. Immunol，167 :1920-1928(2001).)。因此，結(jié)合TNFRl的多價試劑通常不是有效的TNFRl 拮抗劑，甚至即使它們阻斷TNFa與TNFR 1的結(jié)合時。
[0007] TNFRl的胞外區(qū)包含十三個氨基酸的氨基末端區(qū)段（SEQ ID NO :603(人）的氨基 酸1-13 ;SEQ ID NO :604(小鼠）的氨基酸1-13)、結(jié)構(gòu)域1(SEQ ID NO :603(人）的氨基酸 14-53 ;SEQ ID NO :604(小鼠）的氨基酸14-53)、結(jié)構(gòu)域2(SEQ ID NO :603(人）的氨基酸 54-97 ;SEQ ID NO :604(小鼠）的氨基酸 54-97)、結(jié)構(gòu)域 3(8 SEQ ID NO :603(人）的氨基 酸 98-13 ;SEQ ID NO :604(小鼠）的氨基酸 98-138)、和結(jié)構(gòu)域 4 (SEQ ID NO :603(人）的 氨基酸139-167 ;SEQ ID NO :604(小鼠）的氨基酸139-167)，后面是近膜區(qū)（SEQ ID NO: 603_(人）的氨基酸 168-182 ;SEQ ID NO :604(小鼠）的氨基酸 168-183) (SMBanner 等人，Cell73(3)431-445(1993)和 Loetscher 等人，Cell61 (2)351-359(1990)·)。結(jié)構(gòu)域 2 和 3 與所結(jié)合的配體（TNFP，TNFa)接觸（Banner 等人，Cell，73(3)431-445(1993)·)。 TNFRl的胞外區(qū)還含有一個區(qū)域，其被稱為前-配體結(jié)合組裝結(jié)構(gòu)域（pre-ligand binding assembly domain)或 PLAD 結(jié)構(gòu)域（SEQ ID NO:6〇3_(人）的氨基酸 1_53;SEQ ID NO: 604(小鼠）的氛基酸 1-53)(美國政府，WO 01/58953 ;Deng 等人，Nature Medicine，doi : 10. 1038/nml304(2005))〇
[0008] 在體內(nèi)通過一種處理將TNFRl從細(xì)胞的表面除去，該處理包括在結(jié)構(gòu)域4或在近 膜區(qū)（SEQ ID NO :603 的氨基酸 168-182 ;SEQ ID NO :604 的氨基酸 168-183)中 TNFRl 的 蛋白質(zhì)水解，以產(chǎn)生可溶形式的TNFR1?？扇艿腡NFRl保持了結(jié)合TNFa的能力，進(jìn)而能夠 作為TNF a活性的內(nèi)源性抑制劑。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 在一個方面中，本發(fā)明提供了含有與DOM lh-131-206的氨基酸序列（顯示于圖3 中）為至少93%同一性的氨基酸序列的多肽。在一個實施方案中，同一性百分比為至少94、 95、96、97、98或99%。在一個實施方案中，多肽是0011111-131-206。本發(fā)明進(jìn)一步提供了 (基本上）純的DOM lh-131-206單體。在一個實施方案中，DOM lh-131-206為至少98、99、 99. 5 %純或100 %純的單體。
[0010] 在一個方面中，本發(fā)明提供了一種多肽是由與DOM lh-131-206的核苷酸序列（顯 不于圖19中）為至少80%同一'丨生的核苷酸序列編碼的。在一個實施方案中，同一'I"生百分 比為至少 70、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98 或 99%。
[0011] 在一個方面中，本發(fā)明提供了由與DOM lh-131-206的核苷酸序列（顯示于圖19 中）為至少57%同一性的核苷酸序列編碼的多肽，并且其中該多肽包含與DOM lh-131-206 的氨基酸序列（顯示于圖3中）為至少93%同一性的氨基酸序列。在一個實施方案中， 核苷酸序列的同一性百分比為至少 60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、 98或99%。在一個實施方案中，氨基酸序列的同一性百分比為至少94、95、96、97、98或 99%或100%。例如，核苷酸序列可以是DOM lh-131-206核苷酸序列（顯示于圖19中） 的密碼子優(yōu)化形式。序列的密碼子優(yōu)化是本領(lǐng)域已知的。在一個實施方案中，對于在 細(xì)菌（例如，大腸桿菌（E. coli)或假單胞菌屬（Pseudomonas)，例如，熒光假單胞菌（P fluorescens))、哺乳動物（例如，CH0)或酵母宿主細(xì)胞（例如，畢赤酵母屬（Picchia)或酵 母屬（Saccharomyces)，例如，巴斯德畢赤酵母（P. pastoris)或釀酒酵母（S. cerevisiae)) 中的表達(dá)，將核苷酸序列優(yōu)化。
[0012] 在一個方面中，本發(fā)明提供了含有本發(fā)明多肽的融合蛋白。
[0013] 在一個方面中，本發(fā)明提供了抗-TNFa I型受體（TNFR1 ;p55)免疫球蛋白單可變 域，其包含與DOM lh-131-206的氨基酸序列（顯示于圖3中）為至少93%同一性的氨基酸 序列。在一個實施方案中，同一性百分比為至少94、95、96、97、98或99%。
[0014] 在一個方面中，本發(fā)明提供了抵抗蛋白酶的抗-TNFa I型受體（TNFR1 ;p55)免疫 球蛋白單可變域，其包含與DOM lh-131-206的氨基酸序列為至少90 %同一性的氨基酸序 列。在這些方面的一個實施方案中，同一性百分比為至少80、85、90、91、92、93、94、95、96、 97、98 或 99%。
[0015] 在一個實施方案中，免疫球蛋白單可變域在位置53包含天冬氨酸，其中編號是根 據(jù) Kabat ("Sequences of Proteins of Immunological Interest"（免疫學(xué)重要性蛋白的 序列），US Department of Health and Human Services (美國衛(wèi)生和人類服務(wù)部），1991)。
[0016] 在一個實施方案中，免疫球蛋白單可變域在位置91包含組氨酸，其中編號是根據(jù) Kabat0
[0017] 在一個方面中，本發(fā)明提供了抗-TNFa I型受體（TNFR1 ;p55)免疫球蛋白單可變 域，其包含與DOM lh-131-206的氨基酸序列相同的氨基酸序列。
[0018] 在一個方面中，本發(fā)明提供了由與DOM lh-131-206的核苷酸序列（顯示于圖19 中）為至少80%同一性的核苷酸序列編碼的抗-TNF a I型受體（TNFR1 ;p55)免疫球蛋白 單可變域。在一個實施方案中，同一性百分比為至少70、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、 98 或 99%。
[0019] 在一個方面中，本發(fā)明提供了由與DOM lh-131-206的核苷酸序列（顯示于圖19 中）為至少57%同一性的核苷酸序列編碼的抗-TNFa I型受體（TNFR1 ;p55)免疫球蛋白 單可變域，并且其中可變域包含與D0Mlh-131-206的氨基酸序列（顯示于圖3中）為至 少93%同一'丨生的氨基酸序列。在一個實施方案中，核苷酸序列的同一'I"生百分比為至少60、 65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98 或 99%。在一個實施方案中，氨基酸序列 的同一性百分比為至少94、95、96、97、98或99%或100%。例如，核苷酸序列可以是00皿 lh-131-206核苷酸序列（顯示于圖19中）的密碼子優(yōu)化形式。序列的密碼子優(yōu)化是本領(lǐng) 域已知的。在一個實施方案中，對于在細(xì)菌（例如，大腸桿菌或假單胞菌屬，例如，熒光假單 胞菌）、哺乳動物（例如，CH0)或酵母宿主細(xì)胞（例如，畢赤酵母屬或酵母屬，例如，巴斯德 畢赤酵母或釀酒酵母）中的表達(dá)，將核苷酸序列優(yōu)化。
[0020] 在一個方面中，本發(fā)明提供了由與DOM lh-131-206的核苷酸序列（顯示于圖19 中）相同的序列編碼的抗-TNFa I型受體（TNFR1 ;p55)免疫球蛋白單可變域。
[0021] 在一個方面中，本發(fā)明提供了含有根據(jù)本發(fā)明的抗-TNFR免疫球蛋白單可變域的 抗-TNFa I型受體（TNFR1 ;p55)拮抗劑。在一個實施方案中，拮抗劑包含第一和第二免疫 球蛋白單可變域，其中每個可變域是根據(jù)本發(fā)明的。例如，其中拮抗劑包含所述單可變域的 單體或所述單可變域的同型二聚體。在一個實施方案中，那個或每個單可變域的氨基酸序 列與DOM lh-131-206的氨基酸序列（顯示于圖3中）相同。
[0022] 在一個方面中，本發(fā)明提供了含有與DOM lh-131-206的氨基酸序列（顯示于圖3 中）相同或在不超過25個氨基酸位置不同于DOM lh-131-206的氨基酸序列并具有與DOM lh-131-206的⑶Rl序列為至少50%同一性的⑶Rl序列的氨基酸序列的抗-TNFa I型受 體（TNFR1 ;p55)免疫球蛋白單可變域。在一個實施方案中，差異不超過24、23、22、21、20、 19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2 或 1 個氨基酸位置。在一個實施方案 中，CDR 序列同一性為至少 55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98 或 99%。
[0023] 在一個方面中，本發(fā)明提供了含有與DOM lh-131-206的氨基酸序列（顯示于圖3 中）相同或在不超過25個氨基酸位置不同于D0Mlh-131-206的氨基酸序列并具有與DOM lh-131-206的⑶R2序列為至少50%同一性的⑶R2序列的氨基酸序列的抗-TNF a I型受 體（TNFR1 ;p55)免疫球蛋白單可變域。在一個實施方案中，差異不超過24、23、22、21、20、 19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2 或 1 個氨基酸位置。在一個實施方案 中，CDR 序列同一性為至少 55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98 或 99%。
[0024] 在一個方面中，本發(fā)明提供了含有與DOM lh-131-206的氨基酸序列（顯不于圖3 中）相同或在不超過25個氨基酸位置不同于D0Mlh-131-206的氨基酸序列并具有與DOM lh-131-206的⑶R3序列為至少50%同一性的⑶R3序列的氨基酸序列的抗-TNFa I型受 體（TNFR1 ;p55)免疫球蛋白單可變域。在一個實施方案中，差異不超過24、23、22、21、20、 19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2 或 1 個氨基酸位置。在一個實施方案 中，CDR 序列同一性為至少 55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98 或 99%。
[0025] 在一個方面中，本發(fā)明提供了含有與DOM lh-131-206的氨基酸序列（顯示于圖3 中）相同或在不超過25個氨基酸位置不同于D0Mlh-131-206的氨基酸序列并具有與DOM lh-131-206的CDRl序列為至少50%同一性的CDRl序列和與DOM lh-131-206的CDR2序 列為至少50%同一性的⑶R2序列的氨基酸序列的抗-TNF a I型受體（TNFR1 ;p55)免疫球 蛋白單可變域。在一個實施方案中，差異不超過24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、 12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1個氨基酸位置。在一個實施方案中，一個或兩個⑶R序列 同一性各自為至少 55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98 或 99%。
[0026] 在一個方面中，本發(fā)明提供了含有與DOM lh-131-206的氨基酸序列（顯示于圖3 中）相同或在不超過25個氨基酸位置不同于D0Mlh-131-206的氨基酸序列并具有與DOM lh-131-206的CDRl序列為至少50%同一性的CDRl序列和與DOM lh-131-206的CDR3序 列為至少50%同一性的⑶R3序列的氨基酸序列的抗-TNF a I型受體（TNFR1 ;p55)免疫球 蛋白單可變域。在一個實施方案中，差異不超過24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、 12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1個氨基酸位置。在一個實施方案中，一個或兩個⑶R序列 同一性各自為至少 55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98 或 99%。
[0027] 在一個方面中，本發(fā)明提供了含有與DOM lh-131-206的氨基酸序列（顯示于圖3 中）相同或在不超過25個氨基酸位置不同于D0Mlh-131-206的氨基酸序列并具有與DOM lh-131-206的CDR2序列為至少50%同一性的CDR2序列和與DOM lh-131-206的CDR3序 列為至少50%同一性的⑶R3序列的氨基酸序列的抗-TNFa I型受體（TNFR1 ;p55)免疫球 蛋白單可變域。在一個實施方案中，差異不超過24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、 12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1個氨基酸位置。在一個實施方案中，一個或兩個⑶R序列 同一性各自為至少 55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98 或 99%。
[0028] 在一個方面中，本發(fā)明提供了含有與DOM lh-131-206的氨基酸序列（顯示于圖3 中）相同或在不超過25個氨基酸位置不同于D0Mlh-131-206的氨基酸序列并具有與DOM lh-131-206的CDRl序列為至少50%同一性的CDRl序列和與DOM lh-131-206的CDR2序 列為至少50%同一性的⑶R2序列和與DOM lh-131-206的⑶R3序列為至少50%同一性的 ⑶R3序列的氨基酸序列的抗-TNFa I型受體（TNFR1 ;p55)免疫球蛋白單可變域。在一個 實施方案中，差異不超過 24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、 4、3、2或1個氨基酸位置。在一個實施方案中，一個或兩個或每個CDR序列同一性各自為至 少 55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98 或 99%。
[0029] 在一個方面中，本發(fā)明提供了具有與DOM lh-131-206(顯示于圖3中）的⑶Rl序 列為至少50%同一性的⑶Rl序列的抗-TNFa I型受體（TNFR1 ;p55)拮抗劑。在一個實施 方案中，CDR序列同一性為至少 55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98 或 99%。例如，在 本文所述的一組條件下，拮抗劑可以抵抗蛋白酶，例如，本文所述的一種或更多種蛋白酶。
[0030] 在一個方面中，本發(fā)明提供了具有與DOM lh-131-206(顯示于圖3中）的⑶Rl序 列為至少50%同一性的⑶R2序列的抗-TNFa I型受體（TNFR1 ;p55)拮抗劑。在一個實施 方案中，CDR序列同一性為至少 55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98 或 99%。例如，在 本文所述的一組條件下，拮抗劑可以抵抗蛋白酶，例如，本文所述的一種或更多種蛋白酶。
[0031] 在一個方面中，本發(fā)明提供了具有與DOM lh-131-206(顯示于圖3中）的⑶Rl序 列為至少50%同一性的⑶R3序列的抗-TNFa I型受體（TNFR1 ;p55)拮抗劑。在一個實施 方案中，CDR序列同一性為至少 55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98 或 99%。例如，在 本文所述的一組條件下，拮抗劑可以抵抗蛋白酶，例如，本文所述的一種或更多種蛋白酶。
[0032] 在一個方面中，本發(fā)明提供了具有與DOM lh-131-206(顯示于圖3中）的⑶Rl序 列為至少50%同一性的⑶Rl序列和與DOM lh-131-206的⑶R2序列為至少50%同一性的 ^1?2序列的抗1即〇1型受體〇'即1?1;?55)拮抗劑。在一個實施方案中，一個或兩個^1? 的 CDR 序列同一性各自為至少 55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98 或 99%。例如，在 本文所述的一組條件下，拮抗劑可以抵抗蛋白酶，例如，本文所述的一種或更多種蛋白酶。
[0033] 在一個方面中，本發(fā)明提供了具有與DOM lh-131-206(顯示于圖3中）的⑶Rl序 列為至少50%同一性的⑶Rl序列和與DOM lh-131-206的⑶R3序列為至少50%同一性的 ⑶R3序列的抗-TNFa I型受體（TNFR1 ;p55)拮抗劑。在一個實施方案中，一個或兩個⑶R 的 CDR 序列同一性各自為至少 55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98 或 99%。例如，在 本文所述的一組條件下，拮抗劑可以抵抗蛋白酶，例如，本文所述一種或更多種的蛋白酶。
[0034] 在一個方面中，本發(fā)明提供了具有與DOM lh-131-206(顯示于圖3中）的⑶R2序 列為至少50%同一性的⑶R2序列和與DOM lh-131-206的⑶R3序列為至少50%同一性的 ⑶R3序列的抗-TNFa I型受體（TNFR1 ;p55)拮抗劑。在一個實施方案中，一個或兩個⑶R 的 CDR 序列同一性各自為至少 55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98 或 99%。例如，在 本文所述的一組條件下，拮抗劑可以抵抗蛋白酶，例如，本文所述的一種或更多種蛋白酶。
[0035] 在一個方面中，本發(fā)明提供了具有與DOM lh-131-206(顯示于圖3中）的⑶Rl序 列為至少50%同一性的⑶Rl序列和與DOM lh-131-206的⑶R2序列為至少50%同一性的 CDR2序列和與DOM lh-131-206的CDR3序列為至少50%同一性的CDR3序列的抗-TNF a I 型受體（TNFR1 ;p55)拮抗劑。在一個實施方案中，一個或兩個或每個⑶R的⑶R序列同一 性各自為至少55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98或99%。例如，在本文所述的一組 條件下，拮抗劑可以抵抗蛋白酶，例如，本文所述的一種或更多種蛋白酶。
[0036] 在一個方面中，本發(fā)明提供了含有免疫球蛋白單可變域的抗-TNFa I型受體 (TNFR1 ;p55)拮抗劑，該免疫球蛋白單可變域含有D0Mlh-131-206(顯示于圖3中）的CDR1、 〇0尺2和/或0?3的序列（例如，001?1，0)1?2,001?3,0)1?1和2,0)1?1和3,0)1?2和3，或0)1?1、 2和3)。例如，在本文所述的一組條件下，拮抗劑可以抵抗蛋白酶，例如，本文所述的一種或 更多種蛋白酶。
[0037] 在一個方面中，本發(fā)明提供了與DOM lh-131-206競爭與TNFRl結(jié)合的TNFa I型 受體（TNFR1 ;p55)拮抗劑。因此，拮抗劑可以結(jié)合與DOM lh-131-206相同的表位或重疊的 表位。在一個實施方案中，拮抗劑包含具有與DOM lh-131-206 (顯不于圖3中）的氨基酸 序列為至少93%同一性的氨基酸序列的免疫球蛋白單可變域。在一個實施方案中，同一性 百分比為至少94、95、96、97、98或99%。例如，在本文所述的一組條件下，拮抗劑可以抵抗 蛋白酶，例如，本文所述的一種或更多種蛋白酶。在一個實施方案中，拮抗劑是抗體或其抗 原結(jié)合片段，如具有TNFRl結(jié)合特異性的單價抗原結(jié)合片段（例如，scFv、Fab、Fab'、dAb)。 拮抗劑的其他實例是本文所述的結(jié)合TNFRl的配體。配體可以包含具有TNFRl結(jié)合特異性 的免疫球蛋白單可變域或結(jié)構(gòu)域抗體（dAb)，或以合適形式的該dAb的互補性決定區(qū)。在一 些實施方案中，配體是基本上由具有TNFRl結(jié)合特異性的免疫球蛋白單可變域或dAb組成 或由具有TNFRl結(jié)合特異性的免疫球蛋白單可變域或dAb組成的dAb單體。在其他實施方 案中，配體是包含合適形式如抗體形式的dAb (或dAb的CDR)的多肽。
[0038] 本發(fā)明的某些TNFRl的拮抗劑不抑制TNF α與TNFRl的結(jié)合，而是抑制通過TNFRl 介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。例如，TNFRl的拮抗劑能夠抑制在通過TNFRl的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)之前的TNFa -誘 導(dǎo)的TNFRl的聚簇。這些拮抗劑提供了某些優(yōu)點。例如，在存在這類拮抗劑時，TNFa能夠 結(jié)合在細(xì)胞表面上所表達(dá)的以及從細(xì)胞環(huán)境移除的TNFR1，但是TNFRl介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)不 能被激活。因此，TNFRl信號誘導(dǎo)的其他TNF a以及其他炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生將被抑制。類似 地，結(jié)合TNFRl并抑制通過TNFRl所介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)但不會抑制TNF a結(jié)合TNFRl的TNFRl 拮抗劑，將不會抑制內(nèi)源產(chǎn)生的可溶TNFRl的TNF a-結(jié)合并抑制活性。因此，為有此需要 的哺乳動物給藥這類拮抗劑能夠補充抑制體內(nèi)TNFa活性和TNFRl活性的內(nèi)源調(diào)控途徑。 本發(fā)明還涉及配體，所述配體（i)結(jié)合TNFRl (例如，在結(jié)構(gòu)域1中），（ii)拮抗TNFR 1介 導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的激活，和（iii)不抑制TNF a與TNFRl的結(jié)合。這類配體結(jié)合可溶TNFRl 而不防止可溶受體結(jié)合TNF a，進(jìn)而為有此需要的哺乳動物給藥這類拮抗劑，能夠通過提高 血清中可溶受體半衰期而補充體內(nèi)抑制TNF a活性的內(nèi)源調(diào)節(jié)通路。這些優(yōu)點與一些配體 特別相關(guān)，這些配體已經(jīng)通過連接PEG基團(tuán)、血清白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白受體或至少 轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合部分、抗體Fc區(qū)，或通過綴合抗體結(jié)構(gòu)域，而被格式化，以具有較大的流體動 力學(xué)大小。例如，（i)結(jié)合TNFRl (如在結(jié)構(gòu)域1中），（ii)拮抗TNFRl介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)活 動和（iii)沒有抑制TNF a與TNFRl如dAb單體的結(jié)合的物質(zhì)（例如，多肽、可變域或拮抗 齊U)可以格式化（formatted)成較大的抗體的抗原結(jié)合片段或格式化為抗體（例如，格式 化成Fab、Fab'、F(ab) 2、F(ab'）2、IgG、scFv)。還可以通過將TNFRl結(jié)合劑（拮抗劑、可變 域）綴合或連接結(jié)合提高體內(nèi)半衰期的抗原或表位的結(jié)合域（例如，抗體或抗體片段）來 提高配體的流體動力學(xué)大小及其血清半衰期，如本文所述的（參見，W02006038027的附錄 1，在此將其整體引入作為參考）。例如，可以將TNFRl結(jié)合劑（例如，多肽，例如，dAb)綴合 或連接抗-血清白蛋白或抗-新生兒Fc受體抗體或抗體片段，例如，抗-SA或抗新生兒Fc 受體dAb、Fab、Fab'或scFv,或抗-SA親和體（affibody)或抗-新生兒Fc受體親和體。
[0039] 用于根據(jù)本發(fā)明的TNFRl-結(jié)合配體中的合適的白蛋白、白蛋白片段或白蛋白變 體的實例描述于W02005/077042A2和W02006038027中，在此將其整體引入作為參考。
[0040] 在整個說明書中描述的本發(fā)明的其他實施方案中，替代本發(fā)明的拮抗劑或配體中 "dAb"的使用，設(shè)想本領(lǐng)域技術(shù)人員可以使用含有結(jié)合TNFRl的dAb的CDR的結(jié)構(gòu)域（例 如，嫁接于合適的蛋白質(zhì)支架或骨架上的CDR，支架或骨架例如為親和體、SpA支架、LDL受 體A類結(jié)構(gòu)域或EGF結(jié)構(gòu)域）或可以是含有TNFRl結(jié)合位點的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域，例如，其中結(jié) 構(gòu)域選自親和體、SpA結(jié)構(gòu)域、LDL受體A類結(jié)構(gòu)域或EGF結(jié)構(gòu)域。因此認(rèn)為本文公開內(nèi)容 作為整體提供了使用這樣的結(jié)構(gòu)域替代dAb的拮抗劑、配體和方法的公開內(nèi)容。
[0041] 本發(fā)明的多肽、免疫球蛋白單可變域和拮抗劑可以抵抗以下的一種或更多種：絲 氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、巰基蛋白酶、基質(zhì)金屬蛋白酶、羧肽酶（例 如，羧肽酶A、羧肽酶B)、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、彈性蛋白酶、 leukozyme、胰酶、凝血酶、血纖維蛋白溶酶、組織蛋白酶（例如，組織蛋白酶G)、蛋白酶（例 如，蛋白酶1、蛋白酶2、蛋白酶3)、嗜熱菌蛋白酶、凝乳酶、腸肽酶、胱天蛋白酶（caspase) (例如，胱天蛋白酶1、胱天蛋白酶2、胱天蛋白酶4、胱天蛋白酶5、胱天蛋白酶9、胱天蛋白 酶12、胱天蛋白酶13)、鈣激活中性蛋白酶、無花果蛋白酶（ficain)、梭菌蛋白酶、奇異果蛋 白酶（actinidain)、菠蘿蛋白酶和分離酶。在特定的實施方案中，蛋白酶是胰蛋白酶、彈性 蛋白酶或leucozyme。還可以通過生物提取物、生物勻楽或生物制劑來提供蛋白酶。在一 個實施方案中，蛋白酶是在痰液、粘液（例如，胃粘液、鼻粘液、支氣管粘液）、支氣管肺泡灌 洗、肺勻漿、肺提取物、胰腺提取物、胃液、唾液或眼淚中發(fā)現(xiàn)的蛋白酶。在一個實施方案中， 蛋白酶是在眼睛和/或眼淚中發(fā)現(xiàn)的。在一個實施方案中，蛋白酶是非細(xì)菌蛋白酶。在一 個實施方案中，蛋白酶是動物蛋白酶，例如，哺乳動物蛋白酶，例如，人蛋白酶。在一個實施 方案中，蛋白酶是GI道蛋白酶或肺組織蛋白酶，例如，在人體中發(fā)現(xiàn)的GI道蛋白酶或肺組 織蛋白酶。在此所列的這些蛋白酶也可以用于本文所述的涉及蛋白酶庫組（repertoire) 暴露于蛋白酶的方法中。
[0042] 在一個方面中，本發(fā)明提供了包含TNFa I型受體（TNFR1 ;p55)結(jié)合位點的蛋白酶 抗性免疫球蛋白單可變域，其中與以下溫育時，可變域能抵抗蛋白酶例如胰蛋白酶：
[0043] ⑴在37°C下用濃度（c)為至少10微克/ml的蛋白酶溫育至少一個小時的時間 ⑴；或
[0044] (ii)在30°C下用濃度（c'）為至少40微克/ml的蛋白酶溫育至少一個小時的時 間⑴，
[0045] 其中所述可變域包含與D0Mlh-131-206的氨基酸序列（顯示于圖3中）為至少 90 %同一性的氨基酸序列。
[0046] 在一個實施方案中，蛋白酶例如胰蛋白酶與可變域的比例（以摩爾/摩爾為基礎(chǔ)） 為8, 000至80, 000蛋白酶：可變域，例如，C為10微克/ml時，比例為800至80, 000蛋白 酶：可變域；或C或C'為100微克/ml時，比例為8, 000至80, 000蛋白酶：可變域。在一 個實施方案中，蛋白酶（例如，胰蛋白酶）與可變域的比例（以重量/重量為基礎(chǔ)，例如微 克/微克）為16, 000至160, 000蛋白酶：可變域，例如，C為10微克/ml時，比例為1，600 至160, 000蛋白酶：可變域；或C或C'為100微克/ml時，比例為16, 000至160, 000蛋 白酶：可變域。在一個實施方案中，濃度（c或c'）為至少100或1000微克/ml蛋白酶。 在一個實施方案中，濃度（c或c'）為至少100或1000微克/ml蛋白酶。參照在此對使用 肽或多肽的組或文庫工作時適于蛋白酶使用的蛋白水解活性的條件的描述（例如，w/w參 數(shù)）。這些條件可以用于測定特定免疫球蛋白單可變域的蛋白酶抗性的條件。在一個實施方 案中，時間（t)為或約為一、三或24小時或過夜（例如，約12-16小時）。在一個實施方案 中，可變域在條件（i)下是有抗性的，并且濃度（c)為或約為10或100微克/ml蛋白酶，而 時間（t)為1小時。在一個實施方案中，可變域在條件（ii)下是有抗性的，并且濃度（c'） 為或約為40微克/ml蛋白酶，而時間（t)為或約為3小時。在一個實施方案中，蛋白酶選 自胰蛋白酶、彈性蛋白酶、Ieucozyme和胰酶。在一個實施方案中，蛋白酶是胰蛋白酶。在一 個實施方案中，蛋白酶是在痰液、粘液（例如，胃粘液、鼻粘液、支氣管粘液）、支氣管肺泡灌 洗、肺勻漿、肺提取物、胰腺提取物、胃液、唾液或眼淚中發(fā)現(xiàn)的蛋白酶。在一個實施方案中， 蛋白酶是在眼睛和/或眼淚中發(fā)現(xiàn)的。在一個實施方案中，蛋白酶是非細(xì)菌蛋白酶。在一 個實施方案中，蛋白酶是動物蛋白酶，例如，哺乳動物蛋白酶，例如，人蛋白酶。在一個實施 方案中，蛋白酶是GI道蛋白酶或肺組織蛋白酶，例如，在人體中發(fā)現(xiàn)的GI道蛋白酶或肺組 織蛋白酶。在此所列的這些蛋白酶也可以用于本文所述的涉及蛋白酶庫組暴露于蛋白酶的 方法中。
[0047] 在一個實施方案中，可變域能抵抗胰蛋白酶和/或選自彈性蛋白酶、Ieucozyme 和胰酶中的至少一種其他蛋白酶。例如，能抵抗胰蛋白酶和彈性蛋白酶；胰蛋白酶和 Ieucozyme ;胰蛋白酶和胰酶；胰蛋白酶、彈性蛋白酶和Ieucozyme ;胰蛋白酶、彈性蛋白酶 和胰酶；胰蛋白酶、彈性蛋白酶、胰酶和Ieucozyme ;或胰蛋白酶、胰酶和leucozyme。
[0048] 在一個實施方案中，在條件⑴或（ii)下溫育后，例如，在106至IO13的噬菌體文 庫大小，例如IO 8至IO12復(fù)制單位（傳染性病毒粒子），在噬菌體上展示可變域。
[0049] 在一個實施方案中，在條件（i)或（ii)下溫育后，可變域特異性地結(jié)合TNFR1，例 如，使用BiaCore?或ELISA來測定，例如，噬菌體ELISA或單克隆噬菌體ELISA。
[0050] 在一個實施方案中，本發(fā)明的可變域特異性地結(jié)合蛋白A或蛋白L。在一個實施方 案中，在條件（i)或（ii)下溫育后，存在與蛋白A或L的特異性結(jié)合。
[0051] 在一個實施方案中，例如，在條件（i)或（ii)下溫育后，本發(fā)明的可變域在ELISA 中，例如，在噬菌體ELISA或單克隆噬菌體ELISA中，具有至少0. 404的OD45tl讀數(shù)。
[0052] 在一個實施方案中，例如，在條件（i)或（ii)下溫育后，本發(fā)明的可變域在凝膠電 泳中（基本上）展示出單條條帶。
[0053] 在特定的實施方案中，本發(fā)明提供了為雙特異性配體的TNFRl拮抗劑，其含有 根據(jù)本發(fā)明的結(jié)合TNFRl的第一 dAb和具有與第一 dAb相同或不同結(jié)合特異性的第二 dAb。第二 dAb 可以結(jié)合選自 ApoE、Apo-SAA、BDNF、心肌營養(yǎng)素-1、CEA、CD40、CD40 配 體、⑶56、⑶38、⑶138、EGF、EGF受體、ENA-78、嗜酸粒細(xì)胞趨化蛋白、嗜酸粒細(xì)胞趨化 蛋白-2、Exodus-2、FAPa、FGF-酸性、FGF-堿性、成纖維細(xì)胞生長因子-10、FLT3配體、 卩四(^&11^1^(〇父3〇、〇)嚦、6-〇5卩、6厘-〇5卩、6卩-0 1、人血清白蛋白、胰島素、正^^、16卩-1、 IGF-II、IL-I a、IL-I β、IL-I 受體、IL-II 型受體、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、 IL-8(72a.a·)、IL-8(77a.a·)、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、 IL_18(IGIF)、抑制素 α、抑制素 β、IP-10、角化細(xì)胞生長因子-2(KGF_2)、KGF、瘦蛋白 (Leptin)、LIF、淋巴細(xì)胞趨化因子、繆勒管抑制物質(zhì)、單核細(xì)胞集落抑制因子、單核細(xì)胞引 誘蛋白、M-CSF、MDC (67a. a.)、MDC (69a. a.)、MCP-I (MCAF)、MCP-2、MCP-3、MCP-4、MDC (67a. a. )、MDC(69a. a. )、MIG、MIP-I a、MIP-I β、MIP-3 α、MIP-3 β、MIP-4、脊髓源祖細(xì)胞抑制 劑因子-I (MPIF-I)、NAP-2、神經(jīng)營養(yǎng)因子、神經(jīng)生長因子、β -NGF、NT-3、NT-4、制瘤素 Μ、 PDGF-AA、PDGF-AB、PDGF-BB、PF-4、RANTES、SDFl a、SDFl β、SCF、SCGF、干細(xì)胞因子（SCF)、 TARC、TGF-a、TGF-P、TGF-P2、TGF-P3、腫瘤壞死因子（TNF)、TNF-a、TNF-P、TNF 受體 I、 TNF 受體 II、TNIL-1、TP0、VEGF、VEGFA、VEGFB、VEGFC、VEGFD、VEGF受體1、VEGF受體2、 VEGF 受體 3、GCP-2、GRO/MGSA、GRO- β、GRO- γ、HCCl、1-309、HERl、HER2、HER3、HER4、血清 白蛋白、vWF、淀粉樣蛋白（例如，淀粉樣蛋白a)、MMP12、PDKl、IgE、IL_13Ra l、IL_13Ra2、 IL-15、 IL-15R、 IL-16、 IL-17R、 IL-17、 IL-18、 IL-18R、 IL-23、 IL-23R、 IL-25、 CD2、 CD4、 CDl la、CD23、CD25、CD27、CD28、CD30、CD40、CD40L、CD56、CD138、ALK5、EGFR、FcERl、TGFb、 CCL2、CCL18、CEA、CR8、CTGF、CXCL12 (SDF-1)、糜蛋白酶、FGF、Fur i n、內(nèi)皮縮血管肽-1、嗜酸 粒細(xì)胞趨化蛋白（例如，嗜酸粒細(xì)胞趨化蛋白、嗜酸粒細(xì)胞趨化蛋白-2、嗜酸粒細(xì)胞趨化蛋 白-3)、GM-CSF、ICAM-1、ICOS、IgE、IFNa、1-309、整聯(lián)蛋白、L-選擇蛋白、MIF、MIP4、MDC、 MCP-1、MMP、嗜中性彈性蛋白酶、骨橋蛋白、0X-40、PARC、PD-l、RANTES、SCF、SDF-l、siglec8、 TARC、TGFb、凝血酶、Tim-1、TNF、TRANCE、類胰蛋白酶、VEGF、VLA-4、VCAM、α 4β 7、CCR2、 CCR3、CCR4、CCR5、CCR7、CCR8、ανβ6、ανβ8、cMET、CD8、vWF、淀粉樣蛋白（例如，淀粉樣 蛋白a)、MMP12、PDKl和IgE的目標(biāo)物。
[0054] 在一個實例中，雙特異性配體包含結(jié)合TNFRl上第一表位的第一 dAb和結(jié)合不同 目標(biāo)上表位的第二dAb。在另一個實例中，第二dAb結(jié)合血清白蛋白上的表位。
[0055] 在其他實施方案中，配體是包含具有TNFRl結(jié)合特異性的第一表位結(jié)合域和至 少一個具有不同于第一表位結(jié)合域的結(jié)合特異性的其他抗原結(jié)合域的多特異性配體。例 如，第一表位結(jié)合域可以是結(jié)合TNFRl的dAb或可以是包含結(jié)合TNFRl的dAb的⑶R (例如， 嫁接于合適的蛋白質(zhì)支架或骨架上的CDR，支架或骨架例如為親和體、SpA支架、LDL受體A 類結(jié)構(gòu)域或EGF結(jié)構(gòu)域）的結(jié)構(gòu)域或可以是結(jié)合TNFRl的結(jié)構(gòu)域，其中結(jié)構(gòu)域選自親和體、 SpA結(jié)構(gòu)域、LDL受體A類結(jié)構(gòu)域或EGF結(jié)構(gòu)域。
[0056] 在特定的實施方案中，多肽、拮抗劑、配體或抗-TNFRldAb單體的特征在于以 下的一個或更多個：1)與人TNFRl解離，具有50nM至20pM的解離常數(shù)（K d)和5ΧΚΓ1 至IXKT7iT1的Ktjff速度常數(shù)；如通過表面等離子共振所測定的；2)抑制腫瘤壞死因子 a (TNFa )與TNFRl的結(jié)合，具有500nM至50pM的IC50 ;3)在標(biāo)準(zhǔn)L929細(xì)胞測試中中和人 TNFR1，具有500nM至50pM的ND50 ;4)在標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞測試中對抗TNFRl的活性，具有彡IOOnM 的ND5tl，并且在該測試中濃度< 10 μ M的dAb激動TNFRl的活性< 5 % ;5)抑制在小鼠 LSP/ D-半乳糖胺誘導(dǎo)的敗血病性休克模型中的致死力；6)抵抗聚集；7)當(dāng)在大腸桿菌或畢赤酵 母屬種（例如，巴斯德畢赤酵母）中表達(dá)時，以至少約〇. 5mg/L的量分泌；8)可逆地去折疊 (unfold) ;9)在選自小鼠膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎模型、小鼠 AARE關(guān)節(jié)炎模型、小鼠 AARE炎性 腸病模型、小鼠葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)的炎性腸病模型、小鼠煙草煙霧慢性梗阻性肺病模型和 適當(dāng)?shù)撵`長動物模型（例如靈長動物膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎模型）的慢性炎癥疾病的模型中具 有功效；或10)在治療、抑制或預(yù)防慢性炎癥疾病中具有功效。對于適用于條件（1)至（10) 的測定和測試以及參數(shù)的詳細(xì)內(nèi)容，參考W02006038027,并且在此將其引入作為參考。
[0057] 在特定的實施方案中，多肽、拮抗劑、配體或dAb單體與人TNFRl解離，具有50nM 至20pM的解離常數(shù)（Kd)和5X KT1至IXKT7iT1的Ktjff速度常數(shù)，如通過表面等離子共振 所測定的；抑制腫瘤壞死因子a (TNF a )與TNFRl的結(jié)合，具有500nM至50pM的IC50 ;在 標(biāo)準(zhǔn)L929細(xì)胞測試中中和人TNFR1，具有500nM至50pM的ND50。在其他特定的實施方案 中，多肽、拮抗劑、配體或dAb單體與人TNFRl解離，具有50nM至20pM的解離常數(shù)（K d)和 5X KT1至IX KT7iT1的Ktjff速度常數(shù)；抑制腫瘤壞死因子a (TNFa)與TNFRl的結(jié)合，具 有500nM至50pM的IC50 ;并且在選自小鼠膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎模型、小鼠 AARE關(guān)節(jié)炎模 型、小鼠 AARE炎性腸病模型、小鼠葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)的炎性腸病模型、小鼠煙草煙霧慢性 梗阻性肺病模型和適當(dāng)?shù)撵`長動物模型（例如靈長動物膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎模型）的慢性炎 癥疾病的模型中具有功效。在其他特定的實施方案中，多肽、拮抗劑、配體或dAb單體與人 TNFRl解離，具有50nM至20pM的解離常數(shù)（Kd)和5 X KT1至I X ΙΟ?的Ktjff速度常數(shù)，如 通過表面等離子共振所測定的；在標(biāo)準(zhǔn)L929細(xì)胞測試中中和人TNFR1，具有500nM至50pM 的ND50 ;并且在標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞測試中拮抗TNFRl的活性，具有彡IOOnM的ND5tl，并且濃度彡10 μ M 的dAb在測試中激動TNFRl的活性彡5%。
[0058] 本發(fā)明的蛋白酶抗性多肽、免疫球蛋白單可變域和拮抗劑在哺乳動物例如人的疾 病或病癥的治療、預(yù)防和診斷中具有實用性。特別地，由于給藥于患者如人時藥物很可能遇 到蛋白酶，因此它們具有實用性。例如，給藥于GI道（例如，口服、舌下、直腸給藥）時，在 該情況中，多肽、免疫球蛋白單可變域和拮抗劑可能遇到上GI道、下GI道、口、胃、小腸和大 腸中的一個或更多個中的蛋白酶。因此，一個實施方案提供了口服、舌下或直腸給藥于患者 GI道的蛋白酶抗性多肽、免疫球蛋白單可變域或拮抗劑，以治療和/或預(yù)防患者的疾病或 病癥。例如，口服給藥于患者（例如，人患者），用于治療和/或預(yù)防TNFa-介導(dǎo)的病癥或 疾病，如關(guān)節(jié)炎（例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎）、IBD、牛皮癬或克羅恩氏病（Crohn' s disease)。
[0059] 在另一個實例中，給藥于（例如，通過吸入或鼻內(nèi)）肺部組織（例如，肺或氣道） 時，多肽、可變域或拮抗劑很可能遇到蛋白酶。因此，一個實施方案提供了通過吸入或鼻內(nèi) 將蛋白酶抗性多肽、免疫球蛋白單可變域或拮抗劑給藥于患者（例如，人）的肺部組織，以 治療和/或預(yù)防患者的疾病或病癥。這樣的病癥可以是哮喘（例如，過敏性哮喘）、C0PD、 流感或W02006038027中公開的任何其他肺部疾病或病癥，在此引入作為參考。在另一個實 例中，給藥于（例如，通過眼內(nèi)注射或作為滴眼劑）患者眼睛時，多肽、可變域或拮抗劑很可 能遇到蛋白酶。因此，一個實施方案提供了將蛋白酶抗性多肽、免疫球蛋白單可變域或拮抗 劑通過眼睛給藥于患者（例如，人），以治療和/或預(yù)防患者的疾病或病癥（例如，眼睛的疾 病或病癥）。給藥可以是局部給藥于眼睛，以滴眼劑的形式，或通過注入眼睛中，例如進(jìn)入 玻璃體中。
[0060] 根據(jù)本發(fā)明的拮抗劑、多肽和免疫球蛋白單可變域可以呈現(xiàn)出提高的或相對高的 解鏈溫度（Tm),提供提高的穩(wěn)定性。高親和性目標(biāo)結(jié)合也是或者是可替換地是拮抗劑、多肽 和可變域的特征。這些特征中的一個或更多個，結(jié)合蛋白酶抗性，使得拮抗劑、可變域和多 肽可以用作哺乳動物如人的藥物，其中，例如對于GI道或肺部組織給藥，很可能遇到蛋白 酶。
[0061] 因此，在一個方面中，本發(fā)明提供了用于口服遞送的TNFRl拮抗劑。在一個方面 中，本發(fā)明提供了用于遞送至患者GI道的TNFRl拮抗劑。在一個方面中，本發(fā)明提供了 TNFRl拮抗劑在制造用于口服遞送的藥物中的用途。在一個方面中，本發(fā)明提供了 TNFRl 在制造用于遞送至患者GI道的藥物中的用途。在一個實施方案中，可變域能抵抗胰蛋白 酶和/或至少一種選自彈性蛋白酶、Ieucozyme和胰酶的其他蛋白酶。例如，能抵抗胰蛋 白酶和彈性蛋白酶；胰蛋白酶和Ieucozyme ;胰蛋白酶和胰酶；胰蛋白酶、彈性蛋白酶和 Ieucozyme ;胰蛋白酶、彈性蛋白酶和胰酶；胰蛋白酶、彈性蛋白酶、胰酶和Ieucozyme ;或胰 蛋白酶、胰酶和Ieucozyme。
[0062] 在一個方面中，本發(fā)明提供了用于肺部遞送的TNFRl拮抗劑。在一個方面中，本發(fā) 明提供了 TNFRl拮抗劑用于遞送到患者的肺。在一個方面中，本發(fā)明提供了 TNFRl拮抗劑 在制造用于肺部遞送的藥物中的用途。在一個方面中，本發(fā)明提供了 TNFRl拮抗劑在制造 用于遞送至患者肺部的藥物中的用途。在一個實施方案中，可變域能抵抗leucozyme。
[0063] 在一個方面中，本發(fā)明提供了口服遞送或遞送藥物至患者的GI道或至患者的肺 或肺部組織的方法，其中該方法包括將藥物學(xué)上有效量的本發(fā)明的TNFRl拮抗劑給藥于患 者。
[0064] 在一個方面中，本發(fā)明提供了本發(fā)明的TNFRl拮抗劑用于治療和/或預(yù)防炎癥。在 一個方面中，本發(fā)明提供了 TNFRl拮抗劑在制造用于治療和/或預(yù)防炎癥的藥物中的用途。 在一個實施方案中，病癥選自關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化、炎性腸病和慢性梗阻性肺病。例如，所述 關(guān)節(jié)炎是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎或幼年型類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。例如所述炎性腸病選自克羅恩氏病和 潰瘍性結(jié)腸炎。例如，所述慢性梗阻性肺病選自慢性支氣管炎、慢性梗阻性支氣管炎和肺 氣腫。例如所述肺炎是細(xì)菌性肺炎。例如所述細(xì)菌性肺炎是葡萄球菌性肺炎。
[0065] 在一個方面中，本發(fā)明提供了 TNFRl拮抗劑用于治療和/或預(yù)防呼吸道疾病。在 一個方面中，本發(fā)明提供了 TNFRl拮抗劑在制造用于治療和/或預(yù)防呼吸道疾病的藥物中 的用途。例如，所述呼吸道疾病選自肺炎、慢性梗阻性肺病、哮喘、肺炎、超敏性肺炎、肺嗜酸 性粒細(xì)胞浸潤癥、環(huán)境性肺病、肺炎、支氣管擴張、囊性纖維化、間質(zhì)性肺病、原發(fā)性肺動脈 高壓、肺血栓栓塞癥、胸膜病癥、縱隔病癥、橫膈膜病癥、肺換氣不足、換氣過度、睡眠窒息、 急性呼吸窘迫綜合癥、間皮瘤、肉瘤、移植排斥、移植對抗宿主疾病、肺癌、過敏性鼻炎、過敏 癥、石綿沉著病、曲霉腫、曲霉病、支氣管擴張、慢性支氣管炎、肺氣腫、.嗜酸細(xì)胞性肺炎、特 發(fā)性肺纖維化、入侵性肺炎球菌病、流感、非結(jié)核性分枝桿菌病、胸腔積液、肺塵癥、肺孢子 蟲病、肺炎、肺放線菌病、肺泡蛋白沉著癥、肺炭疽、肺水腫、肺栓子、肺炎、肺組織細(xì)胞增生 癥X、肺動脈高壓、肺諾卡菌病、肺結(jié)核、肺靜脈閉塞癥、類風(fēng)濕性肺病、結(jié)節(jié)病和韋格內(nèi)氏肉 芽腫癥。例如，疾病是慢性梗阻性肺?。–OPD)。例如，疾病是哮喘。
[0066] 可以使用任何合適的方法將本發(fā)明含有抑制TNFRl的藥劑（例如，其中藥劑選自 抗體片段（例如，F(xiàn)ab片段、Fab'片段、Fv片段（例如，scFv、二硫化物鍵合的Fv)、F(ab'）2 片段、dAb)、配體以及dAb單體和多聚體（例如，同型-或雜二聚體））的拮抗劑局部給藥 于對象肺組織（例如，肺）。例如，可以通過吸入或鼻內(nèi)給藥將藥劑局部給藥于肺部組織。 對于吸入或鼻內(nèi)給藥，可以使用噴霧器、吸入器、霧化器、煙霧器、彌霧器、干粉吸入器、計量 吸入器、計量噴霧器、計量彌霧器、計量霧化器或其他合適的吸入器或鼻內(nèi)遞送裝置來給藥 TNFRl的拮抗劑。因此，在一個實施方案中，本發(fā)明提供了含有TNFRl拮抗劑的肺遞送裝置。 在一個實施方案中，裝置是吸入器或鼻內(nèi)遞送裝置。
[0067] 在一個方面中，本發(fā)明提供了含有TNFRl拮抗劑的口服制劑。該制劑可以是片劑、 丸劑、膠囊、液體或糖楽。
[0068] 在一個方面中，本發(fā)明提供了用于遞送至肺的肺制劑，其中制劑含有本發(fā)明的 拮抗劑、多肽或可變域，粒徑范圍小于5微米，例如，小于4. 5、4、3. 5或3微米（例如，在 Britton-Robinson緩沖液中時，例如，在6. 5至8. 0的pH,例如在7至7. 5的pH,例如在 pH7 或 ρΗ7· 5)。
[0069] 在一個實施方案中，在6. 5至8. 0的pH下提供本發(fā)明的制劑和組合物，例如7至 7. 5,例如7,例如7. 5。
[0070] 根據(jù)本發(fā)明任一方面的可變域可以具有至少50°C的Tm,或至少55°C，或至少 60°C，或至少65°C，或至少70°C。本發(fā)明的拮抗劑、用途、方法、裝置或制劑可以含有這樣的 可變域。
[0071] 在本發(fā)明的一個方面中，本發(fā)明的多肽、可變域、拮抗劑、組合物或制劑在 Britton-Robinson緩沖液中在37至50°C下溫育14天后（在lmg/ml的多肽或可變域濃 度下）基本上是穩(wěn)定的。在一個實施方案中，在37°C下這樣的溫育后，至少65、70、75、80、 85、86、87、88、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99%的多肽、拮抗劑或可變域保持未聚集。在 一個實施方案中，在37°C下這樣的溫育后，至少65、70、75、80、85、86、87、88、90、91、92、93、 94、95、96、97、98、99%的多肽或可變域保持單體。在一個實施方案中，在501：下這樣的溫 育后，至少 5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、86、87、88、90、91、92、 93、94、95、96、97、98、99%的多肽、拮抗劑或可變域保持未聚集。在一個實施方案中，在501： 下這樣的溫育后，至少 5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、86、87、 88、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99%的多肽或可變域保持單體。在一個實施方案中，在 任一個這樣的溫育后，未看到多肽、可變域、拮抗劑的聚集。在一個實施方案中，在37°C下在 Britton-Robinson緩沖液中以lmg/ml的多肽或可變域濃度溫育后，多肽或可變域的pi保 持未改變或基本上未改變。
[0072] 在本發(fā)明的一個方面中，本發(fā)明的多肽、可變域、拮抗劑、組合物或制劑在 Britton-Robinson緩沖液在7至7. 5的pH(例如，在pH7或ρΗ7· 5)在4°C下溫育7天后 (在100mg/ml的多肽或可變域濃度下）基本上是穩(wěn)定的。在一個實施方案中，在這樣的溫 育后，至少95、95. 5、96、96. 5、97、97. 5、98、98. 5、99或99. 5%的多肽、拮抗劑或可變域保持 未聚集。在一個實施方案中，在這樣的溫育后，至少95、95. 5、96、96. 5、97、97. 5、98、98. 5、 99或99. 5%的多肽或可變域保持單體。在一個實施方案中，在任一個這樣的溫育后，未看 到多肽、可變域、拮抗劑的聚集。
[0073] 在本發(fā)明的一個方面中，本發(fā)明的多肽、可變域、拮抗劑、組合物或制劑在例如噴 射噴霧器，例如在Pari LC+杯中，例如，在室溫、20°C或37°C下噴霧1小時后（在40mg/ml的 多肽或可變域濃度下）基本上是穩(wěn)定的。在一個實施方案中，在這樣的噴霧后，至少65、70、 75、80、85、86、87、88、90、91、92、93、94、95、95· 5、96、96· 5、97、97· 5、98、98·5、99 或 99. 5 % 的多肽、拮抗劑或可變域保持未聚集。在一個實施方案中，在這樣的噴霧后，至少65、70、75、 80、85、86、87、88、90、91、92、93、94、95、95· 5、96、96· 5、97、97· 5、98、98· 5、99 或 99. 5% 的多 肽或可變域保持單體。在一個實施方案中，在任一個這樣的噴霧后，未看到多肽、可變域、拮 抗劑的聚集。
[0074] 根據(jù)本發(fā)明任何方面的可變域可以在MRC-5細(xì)胞測試中中和TNFa刺激的IL-8 釋放，其具有2nM?50pM的ND50。本發(fā)明的拮抗劑、用途、方法、裝置或制劑可以包含這類 可變域。
[0075] 在一個方面中，本發(fā)明提供了編碼含有根據(jù)本發(fā)明任一方面的免疫球蛋白單可變 域的多肽或編碼根據(jù)本發(fā)明任一方面的多肽、拮抗劑或可變域的分離的或重組的核酸。在 一個方面中，本發(fā)明提供了含有核酸的載體。在一個方面中，本發(fā)明提供了含有核酸或載體 的宿主細(xì)胞。在一個方面中，本發(fā)明提供了生產(chǎn)含有免疫球蛋白單可變域的多肽的方法，該 方法包括在適于所述核酸或載體表達(dá)的條件下維持宿主細(xì)胞，由此產(chǎn)生含有免疫球蛋白單 可變域的多肽。該方法進(jìn)一步包括分離多肽、可變域或拮抗劑，并任選產(chǎn)生比分離的多肽可 變域或拮抗劑具有提高的親和性和/或ND50的變體，例如，突變體。用于提高免疫球蛋白 單可變域的結(jié)合親和性的技術(shù)是本領(lǐng)域已知的，例如，用于親和性突變的技術(shù)。
[0076] 在一個方面中，本發(fā)明提供了含有本發(fā)明任一方面的免疫球蛋白單可變域、多肽 或拮抗劑和藥物學(xué)上可接受的載體、賦形劑或稀釋劑的藥物組合物。
[0077] 在一個實施方案中，本發(fā)明任一方面的免疫球蛋白單可變域或拮抗劑含有抗體恒 定域，例如，抗體Fe,任選其中Fc的N-端連接（任選直接連接）可變域的C-端。
[0078] 本發(fā)明的多肽或可變域可以是分離的和/或重組的。
[0079] 本文描述了用于選擇蛋白酶抗性肽或多肽的方法。該方法包括提供一組肽或多 肽，在適于蛋白酶活性的條件下混合組和蛋白酶，并回收具有理想生物活性（例如特異性 結(jié)合TNFR1)的肽或多肽，由此選擇蛋白酶抗性肽或多肽。
[0080] 通常將組和蛋白酶溫育至少約30分鐘的時間段。在該方法中可以使用任何所需 的蛋白酶，如以下的一種或更多種，絲氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、巰基 蛋白酶、基質(zhì)金屬蛋白酶、羧肽酶（例如，羧肽酶A、羧肽酶B)、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胃 蛋白酶、木瓜蛋白酶、彈性蛋白酶、leukozyme、胰酶、凝血酶、血纖維蛋白溶酶、組織蛋白酶 (例如，組織蛋白酶G)、蛋白酶（例如，蛋白酶1、蛋白酶2、蛋白酶3)、嗜熱菌蛋白酶、凝乳 酶、腸肽酶、胱天蛋白酶（例如，胱天蛋白酶1、胱天蛋白酶2、胱天蛋白酶4、胱天蛋白酶5、 胱天蛋白酶9、胱天蛋白酶12、胱天蛋白酶13)、|丐激活中性蛋白酶、無花果蛋白酶（ficain)、 梭菌蛋白酶、奇異果蛋白酶（actinidain)、菠蘿蛋白酶和分離酶。在特定的實施方案中，蛋 白酶是胰蛋白酶、彈性蛋白酶或leucozyme。還可以通過生物提取物、生物勻楽或生物制劑 來提供蛋白酶。如果需要，該方法進(jìn)一步包括在完成溫育后將蛋白酶抑制劑加入組和蛋白 酶的混合物中。
[0081] 在一些實施方案中，基于結(jié)合活性回收具有所需生物活性的肽或多肽。例如，可 以基于結(jié)合通用配體（如蛋白A、蛋白G或蛋白L)來回收肽或多肽。結(jié)合活性還可以是對 目標(biāo)配體的特異性結(jié)合。示例性目標(biāo)配體包括ApoE、Apo-SAA、BDNF、心肌營養(yǎng)素-1、CEA、 CD40、CD40配體、CD56、CD38、CD138、EGF、EGF受體、ENA-78、嗜酸粒細(xì)胞趨化蛋白、嗜酸粒 細(xì)胞趨化蛋白-2、Exodus-2、FAP a、FGF-酸性、FGF-堿性、成纖維細(xì)胞生長因子-10、FLT3 配體、Fractalkine(CX3C)、⑶NF、G-CSF、GM-CSF、GF-β 1、人血清白蛋白、胰島素、IFN-γ、 IGF-I、IGF-II、IL-I a、IL-I β、IL-I 受體、IL-II 型受體、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、 IL-7、IL-8(72a.a·)、IL-8(77a.a·)、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-15、IL-16、 IL-17、IL-18(IGIF)、抑制素 α、抑制素 β、IP-10、角化細(xì)胞生長因子-2(KGF-2)、KGF、瘦 蛋白、LIF、淋巴細(xì)胞趨化因子、繆勒管抑制物質(zhì)、單核細(xì)胞集落抑制因子、單核細(xì)胞引誘 蛋白、M-CSF、MDC(67a. a. )、MDC(69a. a. )、MCP-I (MCAF)、MCP-2、MCP-3、MCP-4、MDC(67a. a. )、MDC(69a. a. )、MIG、MIP-I a、MIP-I β、MIP-3 α、MIP-3 β、MIP-4、脊髓源祖細(xì)胞抑制 劑因子-I (MPIF-I)、NAP-2、神經(jīng)營養(yǎng)因子、神經(jīng)生長因子、β-NGF、NT-3、NT-4、制瘤素 Μ、 PDGF-AA、PDGF-AB、PDGF-BB、PF-4、RANTES、SDFl a、SDFl β、SCF、SCGF、干細(xì)胞因子（SCF)、 TARC、TGF-a、TGF-P、TGF-P 2、TGF-P 3、腫瘤壞死因子（TNF)、TNF-a、TNF-P、TNF 受體 I、 TNF 受體 II、TNIL-1、TP0、VEGF、VEGFA、VEGFB、VEGFC、VEGFD、VEGF受體1、VEGF受體2、 VEGF 受體 3、GCP-2、GRO/MGSA、GRO- β、GRO- γ、HCCl、1-309、HERl、HER2、HER3、HER4、血清 白蛋白、vWF、淀粉樣蛋白（例如，淀粉樣蛋白a)、MMP12、PDKl、IgE、IL_13Ra l、IL_13Ra2、 IL-15、 IL-15R、 IL-16、 IL-17R、 IL-17、 IL-18、 IL-18R、 IL-23、 IL-23R、 IL-25、 CD2、 CD4、 CDl la、CD23、CD25、CD27、CD28、CD30、CD40、CD40L、CD56、CD138、ALK5、EGFR、FcERl、TGFb、 CCL2、CCL18、CEA、CR8、CTGF、CXCL12 (SDF-1)、糜蛋白酶、FGF、Fur in、內(nèi)皮縮血管肽-1、嗜酸 粒細(xì)胞趨化蛋白（例如，嗜酸粒細(xì)胞趨化蛋白、嗜酸粒細(xì)胞趨化蛋白-2、嗜酸粒細(xì)胞趨化蛋 白-3)、GM-CSF、ICAM-1、ICOS、IgE、IFNa、1-309、整聯(lián)蛋白、L-選擇蛋白、MIF、MIP4、MDC、 MCP-1、MMP、嗜中性彈性蛋白酶、骨橋蛋白、0X-40、PARC、PD-1、RANTES、SCF、SDF-1、s i g I e c8、 TARC、TGFb、凝血酶、Tim-1、TNF、TRANCE、類胰蛋白酶、VEGF、VLA-4、VCAM、α 4β 7、CCR2、 CCR3、CCR4、CCR5、CCR7、CCR8、ανβ6、ανβ8、cMET、CD8、vWF、淀粉樣蛋白（例如，淀粉樣 蛋白 a)、MMP12、PDKl 和 IgE。
[0082] 在特定的實施方案中，通過淘洗來回收肽或多肽。
[0083] 在一些實施方案中，組包括展示系統(tǒng)。例如，展示系統(tǒng)可以是噬菌體展示、核糖體 展示、乳液區(qū)室化（emulsion compartmentalization)和展示、酵母展示、噪呤霉素展示、細(xì) 菌展示、在質(zhì)粒上展示或共價展示。示例性展示系統(tǒng)與核酸的編碼功能和由核酸編碼的肽 或多肽的功能性特征相關(guān)。在特定的實施方案中，展示系統(tǒng)含有可復(fù)制的遺傳包。
[0084] 在一些實施方案中，展示系統(tǒng)包括噬菌體展示。例如，噬菌體可以是fd、M13、λ、 MS2或Τ7。在特定的實施方案中，噬菌體展示系統(tǒng)是多價的。在一些實施方案中，作為pill 融合蛋白來展示肽或多肽。
[0085] 在其他實施方案中，該方法進(jìn)一步包括擴增編碼具有所需生物活性的肽或多肽的 核酸。在特定的實施方案中，通過噬菌體擴增、細(xì)胞生長或聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)來擴增核酸。 [0086] 在一些實施方案中，組是一組免疫球蛋白單可變域。在特定的實施方案中，免疫球 蛋白單可變域是重鏈可變域。在更特別的實施方案中，重鏈可變域是人重鏈可變域。在其 他實施方案中，免疫球蛋白單可變域是輕鏈可變域。在特定的實施方案中，輕鏈可變域是人 輕鏈可變域。
[0087] 在另一個方面中，提供了從一組肽或多肽中選擇以高親和性結(jié)合目標(biāo)配體例如 TNFRl的肽或多肽的方法。該方法包括提供一組肽或多肽，在適于蛋白酶活性的條件下混合 組和蛋白酶并回收結(jié)合目標(biāo)配體的肽或多肽。
[0088] 通常將組和蛋白酶溫育至少約30分鐘的時間段。在該方法中可以使用任何所需 的蛋白酶，如以下的一種或更多種，絲氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、巰基 蛋白酶、基質(zhì)金屬蛋白酶、羧肽酶（例如，羧肽酶A、羧肽酶B)、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胃 蛋白酶、木瓜蛋白酶、彈性蛋白酶、leukozyme、胰酶、凝血酶、血纖維蛋白溶酶、組織蛋白酶 (例如，組織蛋白酶G)、蛋白酶（例如，蛋白酶1、蛋白酶2、蛋白酶3)、嗜熱菌蛋白酶、凝乳 酶、腸肽酶、胱天蛋白酶（例如，胱天蛋白酶1、胱天蛋白酶2、胱天蛋白酶4、胱天蛋白酶5、 胱天蛋白酶9、胱天蛋白酶12、胱天蛋白酶13)、|丐激活中性蛋白酶、無花果蛋白酶（ficain)、 梭菌蛋白酶、奇異果蛋白酶（actinidain)、菠蘿蛋白酶和分離酶。在特定的實施方案中，蛋 白酶是胰蛋白酶、彈性蛋白酶或leucozyme。還可以通過生物提取物、生物勻楽或生物制劑 來提供蛋白酶。如果需要，該方法進(jìn)一步包括在完成溫育后將蛋白酶抑制劑加入組和蛋白 酶的混合物中。
[0089] 可以基于結(jié)合任何所需的目標(biāo)配體如在此公開的目標(biāo)配體（例如TNFR1)來回收 肽或多肽。在特定的實施方案中，通過淘洗來回收肽或多肽。
[0090] 在一些實施方案中，組包括展示系統(tǒng)。例如，展示系統(tǒng)可以是噬菌體展示、核糖體 展示、乳液區(qū)室化（emulsion compartmentalization)和展示、酵母展示、噪呤霉素展示、細(xì) 菌展示、在質(zhì)粒上展示或共價展示。示例性展示系統(tǒng)與核酸的編碼功能和由核酸編碼的肽 或多肽的功能性特征相關(guān)。在特定的實施方案中，展示系統(tǒng)含有可復(fù)制的遺傳包。
[0091] 在一些實施方案中，展示系統(tǒng)包括噬菌體展示。例如，噬菌體可以是fd、M13、λ、 MS2或Τ7。在特定的實施方案中，噬菌體展示系統(tǒng)是多價的。在一些實施方案中，作為pill 融合蛋白來展示肽或多肽。
[0092] 在其他實施方案中，該方法進(jìn)一步包括擴增編碼具有所需生物活性的肽或多肽的 核酸。在特定的實施方案中，通過噬菌體擴增、細(xì)胞生長或聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)來擴增核酸。 [0093] 在一些實施方案中，組是一組免疫球蛋白單可變域。在特定的實施方案中，免疫球 蛋白單可變域是重鏈可變域。在更特別的實施方案中，重鏈可變域是人重鏈可變域。在其 他實施方案中，免疫球蛋白單可變域是輕鏈可變域。在特定的實施方案中，輕鏈可變域是人 輕鏈可變域。
[0094] 在另一個方面中，本文描述了生產(chǎn)一組蛋白酶抗性肽或多肽的方法。該方法包括 提供一組肽或多肽，在適于蛋白酶活性的條件下混合一組肽或多肽和蛋白酶，并回收多個 具有所需生物活性的肽或多肽，由此產(chǎn)生一組蛋白酶抗體肽或多肽。
[0095] 在一些實施方案中，將組和蛋白酶溫育至少約30分鐘的時間段。例如，在該方法 中所用的蛋白酶可以是以下的一種或更多種，絲氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋 白酶、巰基蛋白酶、基質(zhì)金屬蛋白酶、羧肽酶（例如，羧肽酶A、羧肽酶B)、胰蛋白酶、胰凝乳 蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、彈性蛋白酶、leukozyme、胰酶、凝血酶、血纖維蛋白溶酶、組 織蛋白酶（例如，組織蛋白酶G)、蛋白酶（例如，蛋白酶1、蛋白酶2、蛋白酶3)、嗜熱菌蛋白 酶、凝乳酶、腸肽酶、胱天蛋白酶（例如，胱天蛋白酶1、胱天蛋白酶2、胱天蛋白酶4、胱天蛋 白酶5、胱天蛋白酶9、胱天蛋白酶12、胱天蛋白酶13)、鈣激活中性蛋白酶、無花果蛋白酶 (ficain)、梭菌蛋白酶、奇異果蛋白酶（actinidain)、菠蘿蛋白酶和分離酶。在特定的實施方 案中，蛋白酶是胰蛋白酶、彈性蛋白酶或Ieucozyme。還可以通過生物提取物、生物勻楽或生 物制劑來提供蛋白酶。如果需要，該方法進(jìn)一步包括在完成溫育后將蛋白酶抑制劑加入組 和蛋白酶的混合物中。
[0096] 在一些實施方案中，基于結(jié)合活性回收多個具有所需生物活性的肽或多肽。例如， 可以基于結(jié)合通用配體（如蛋白A、蛋白G或蛋白L)來回收多個肽或多肽。結(jié)合活性還可 以是對目標(biāo)配體的特異性結(jié)合，如本文所述的目標(biāo)配體。在特定的實施方案中，通過淘洗回 收多個具有所需生物活性的肽或多肽。
[0097] 在一些實施方案中，組包括展示系統(tǒng)。例如，展示系統(tǒng)可以是噬菌體展示、核糖體 展示、乳液區(qū)室化（emulsion compartmentalization)和展示、酵母展示、噪呤霉素展示、細(xì) 菌展示、在質(zhì)粒上展示或共價展示。在特定的實施方案中，展示系統(tǒng)與核酸的編碼功能和由 核酸編碼的肽或多肽的功能性特征相關(guān)。在特定的實施方案中，展示系統(tǒng)含有可復(fù)制的遺 傳包。
[0098] 在一些實施方案中，展示系統(tǒng)包括噬菌體展示。例如，噬菌體可以是fd、M13、λ、 MS2或Τ7。在特定的實施方案中，噬菌體展示系統(tǒng)是多價的。在一些實施方案中，作為pill 融合蛋白來展示肽或多肽。
[0099] 在其他實施方案中，該方法進(jìn)一步包括擴增編碼多個具有所需生物活性的肽或多 肽的核酸。在特定的實施方案中，通過噬菌體擴增、細(xì)胞生長或聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)來擴增核 酸。
[0100] 在一些實施方案中，組是一組免疫球蛋白單可變域。在特定的實施方案中，免疫球 蛋白單可變域是重鏈可變域。在更特別的實施方案中，重鏈可變域是人重鏈可變域。在其 他實施方案中，免疫球蛋白單可變域是輕鏈可變域。在特定的實施方案中，輕鏈可變域是人 輕鏈可變域。
[0101] 在另一個方面中，本文描述了從組中選擇蛋白酶抗性多肽的方法，該多肽包括結(jié) 合目標(biāo)配體例如TNFRl的免疫球蛋白單可變域（dAb)。在一個實施方案中，該方法包括提供 含有一組多肽的噬菌體展示系統(tǒng)，該多肽含有免疫球蛋白單可變域，在適于蛋白酶活性的 條件下，將噬菌體展示系統(tǒng)和選自彈性蛋白酶、Ieucozyme和胰蛋白酶的蛋白酶混合，并回 收展示了含有結(jié)合目標(biāo)配體的免疫球蛋白單可變域的多肽的噬菌體。
[0102] 在一些實施方案中，以100 μ g/ml來使用蛋白酶，并將混合的噬菌體展示系統(tǒng)和 蛋白酶在約37 °C下溫育過夜。
[0103] 在一些實施方案中，通過結(jié)合所述目標(biāo)來回收展示了含有結(jié)合目標(biāo)配體的免疫球 蛋白單可變域的多肽的噬菌體。在其他實施方案中，通過淘洗來回收展示了含有結(jié)合目標(biāo) 配體的免疫球蛋白單可變域的多肽的噬菌體。
[0104] 本文還描述了通過本文所述的方法可選擇的或已選擇的分離的蛋白酶抗性肽或 多肽。在特定的實施方案中，本文提供了通過本文所述的方法可選擇的或已選擇的分離的 蛋白酶（例如，胰蛋白酶、彈性蛋白酶、Ieucozyme)抗性免疫球蛋白單可變域（例如，人抗 體重鏈可變域，人抗體輕鏈可變域）。
[0105] 本文還描述了編碼通過本文所述的方法可選擇的或已選擇的蛋白酶抗性肽或多 肽（例如，胰蛋白酶_、彈性蛋白酶-或Ieucozyme-抗性免疫球蛋白單可變域）的分離的或 重組的核酸，以及含有該核酸的載體（例如，表達(dá)載體）和宿主細(xì)胞。
[0106] 本文還描述了制備通過本文所述的方法可選擇的或已選擇的蛋白酶抗性肽或多 肽（例如，胰蛋白酶_、彈性蛋白酶-或Ieucozyme-抗性免疫球蛋白單可變域）的方法，包 括在適于表達(dá)的條件下維持含有編碼蛋白酶抗性肽或多肽的重組核酸的宿主細(xì)胞，由此產(chǎn) 生蛋白酶抗性肽或多肽。
[0107] 本文還描述了通過本文所述的方法可選擇的或已選擇的蛋白酶抗性肽或多肽 (例如，胰蛋白酶_、彈性蛋白酶-或Ieucozyme-抗性免疫球蛋白單可變域）用于藥物中 (例如，用于治療或診斷）。本文還描述了通過本文所述的方法可選擇的或已選擇的蛋白 酶抗性肽或多肽（例如，胰蛋白酶_、彈性蛋白酶-或Ieucozyme-抗性免疫球蛋白單可變 域）用于制造治療疾病的藥物的用途。本文還描述了治療疾病的方法，包括將有效量的通 過本文所述的方法可選擇的或已選擇的蛋白酶抗性肽或多肽（例如，胰蛋白酶_、彈性蛋白 酶-或Ieucozyme-抗性免疫球蛋白單可變域）給藥于需要的患者。
[0108] 本文還描述了用于測定樣品中是否存在TNFRl或樣品中存在多少TNFRl的診斷試 劑盒，其含有本發(fā)明的多肽、免疫球蛋白可變域（dAb)或拮抗劑和使用說明書（例如，用于 測定樣品中TNFRl的存在和/或含量）。在一些實施方案中，試劑盒進(jìn)一步包括一種或更多 種助劑，如合適的緩沖劑或合適的檢測劑（例如，結(jié)合本發(fā)明的多肽或dAb的可檢測標(biāo)記的 抗體或其抗原結(jié)合片段或與其連接或綴合的部分）。
[0109] 本發(fā)明還涉及包括固體表面的裝置，在該表面上固定了本發(fā)明的多肽拮抗劑或 dAb，使得固定的多肽或dAb結(jié)合TNFR1?？梢允褂迷谄渖峡梢怨潭贵w或其抗原結(jié)合片段 的任何合適的固體表面，例如，玻璃、塑料、碳水化合物（例如，瓊脂糖珠子）。如果需要，支 持物可以含有或?qū)⑵湫揎梺砗兴璧墓δ芑鶊F(tuán)，以促進(jìn)固定。裝置和或支持物可以具有 任何合適的形狀，例如，片狀、棒狀、條狀、平板、載玻片、珠子、丸狀、圓板、凝膠、管狀、球狀、 芯片、平板或圓盤等。在一些實施方案中，裝置是量桿。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0110] 圖1是PDOM 13(aka PD0M33)的多克隆位點的說明，其用來制備噬菌體展示組。
[0111] 圖2顯示了用來自用40ug/ml胰蛋白酶在30°C下溫育不同時間點的dAb的樣品 進(jìn)行的幾個Novex 10-20% Tricene凝膠電泳。就在加入胰蛋白酶之前，然后在加入胰蛋 白酶之后一小時、三小時和24小時時立即取樣。用IxSureBlue將蛋白質(zhì)染色。凝膠說明 DOM 15-10和D0M15-26-501在用胰蛋白酶溫育的頭三個小時的過程中都得到了明顯消化。 DOM 15-26、DOM 4-130-54和DOM lh-131-511的消化只在用胰蛋白酶溫育24小時后才變 得明顯。
[0112] 圖3是DOM lh-131-511和24個選擇的變體的氨基酸序列的說明。選定克隆中不 同于親本序列的氨基酸是高亮顯示的（相同的那些用圓點標(biāo)記）。用框顯示對應(yīng)于CDR1、 CDR2和CDR3的環(huán)。
[0113] 圖4是DOM 4-130-54和27個選擇的變體的氨基酸序列的說明。選定克隆中不同 于親本序列的氨基酸是高亮顯示的（相同的那些用圓點標(biāo)記）。用框顯示對應(yīng)于CDRl、CDR2 和CDR3的環(huán)。
[0114] 圖5是DOM 15-26-555和21個選擇的變體的氨基酸序列的說明。選定克隆中不 同于親本序列的氨基酸是高亮顯示的（相同的那些用圓點標(biāo)記）。用框顯示對應(yīng)于CDR1、 CDR2和CDR3的環(huán)。
[0115] 圖6是DOM 15-10和16個選擇的變體的氨基酸序列的說明。選定克隆中不同于 親本序列的氨基酸是高亮顯示的（相同的那些用圓點標(biāo)記）。用框顯示對應(yīng)于CDR1、CDR2 和CDR3的環(huán)。
[0116] 圖7A-7D是顯示了用不同濃度的胰蛋白酶（從0至lOOyg/ml)在37°C溫育過 夜后親本 dAb，DOM lh-131-511(圖 7A)和三個變體 dAb，DOM lh-131-203(圖 7B)、DOM lh-131-204(圖 7C)和 DOM lh-131-206(圖 7D)與固定的 TNFRl 結(jié)合的 BIAcore 痕跡。結(jié) 果表明所有三個變體對高濃度胰蛋白酶（lOOug/ml)的蛋白水解的抗性比親本高。
[0117] 圖8A-8C是顯示了用彈性蛋白酶和Ieucozyme溫育過夜后dAbDOM lh-131-511 (圖 8A)、DOM lh-131-202 (圖 8B)和 DOM lh-131-206 (圖 8C)與固定的 TNFRl 結(jié)合的 BIAcore 痕跡。與親本相比，dAb顯示出對抗彈性蛋白酶和Ieucozyme的蛋白水解提高的抗性。
[0118] 圖 9 顯示 了用胰蛋白酶溫育前 dAb DOM lh-131-511、D0Mlh-131-203、DOM lh-131-204、DOM lh-131-206、DOM lh-131-54、D0Mlh-131-201 和 DOM lh-131-202 的樣品 和用100 μ g/ml胰蛋白酶溫育I小時、3小時和24小時后的樣品進(jìn)行的兩個4-12% Novex Bis-Tris凝膠電泳。
[0119] 圖10A-10C是顯示了用不同濃度的胰蛋白酶（從0至100yg/ml)在37°C溫育過 夜后 DOM 4-130-54(圖 10A)、DOM 4-130-201(圖 10B)和 DOM 4-130-202(圖 10C)與固定 的IL-IRl融合蛋白結(jié)合的BIAcore痕跡。結(jié)果顯示兩種變體對高濃度胰蛋白酶（100 μ g/ ml)的蛋白水解的抗性都比它們的親本高。
[0120] 圖11A-11C是顯示了用彈性蛋白酶和Ieucozyme溫育過夜后D0M4-130_54(圖 11A)、D0M 4-130-201(圖 11B)和 DOM 4-130-202(圖 11C)與固定的 IL-IRl 融合蛋白結(jié)合 的BIAcore痕跡。與親本相比，dAb顯示出對抗所測試的兩種蛋白酶的蛋白水解提高的抗 性。
[0121] 圖12是DOM 15-26-555和6個變體的氨基酸序列的說明。選定克隆中不同于親 本序列的氨基酸是高亮顯示的（相同的那些用圓點標(biāo)記）。
[0122] 圖13A和13B是顯示了親本dAb，DOM 15-26-555(圖13A)和蛋白酶抗性最大的變 體，DOM lh-131-206(圖13B)與固定的VEGF結(jié)合的BIAcore痕跡。在用濃度為200yg/ml 的胰蛋白酶溫育后，在IOOnM的dAb濃度下，比較BIAcore上親本和變體的hVEGF結(jié)合。將 反應(yīng)在37°C下進(jìn)行三小時或24小時。結(jié)果表明在胰蛋白酶處理24小時后，變體對蛋白水 解的抗性比親本高。
[0123] 圖14是顯示了胰蛋白酶處理對DOM 15-26-555變體的hVEGF結(jié)合的影響的圖。 結(jié)果清楚地顯示出在胰蛋白酶處理2 4小時后，所有變體對蛋白水解的抗性比親本（D OM 15-26-555)高。
[0124] 圖15顯示了裝載了 15 μ g處理過的和未處理過的DOM 15-26-555或DOM lh-131-206樣品的兩個Novex 10-20% Tricine凝膠。就在加入胰蛋白酶之前，然后在加 入胰蛋白酶之后一小時、三小時和24小時時立即取樣。用IxSureBlue將蛋白質(zhì)染色。凝 膠說明DOM lh-131-206的胰蛋白酶抗性特征不同于BIAcore實驗顯示的特征。
[0125] 圖16是DOM 15-10和變體，DOM 15-10-11的氨基酸序列的說明。變體中不同于 親本序列的氨基酸是高亮顯示的（相同的那些用圓點標(biāo)記）。
[0126] 圖 17A 和 17B 是顯示了親本，DOM 15-10(圖 17A)和變體，D0M15-10-11(圖 17B) 與固定的VEGF結(jié)合的BIAcore痕跡。在用濃度為200 μ g/ml的胰蛋白酶溫育后，在IOOnM 的dAb濃度下，比較BIAcore上親本和變體的hVEGF結(jié)合。將反應(yīng)在37°C下進(jìn)行一小時、三 小時或24小時。結(jié)果表明在胰蛋白酶處理24小時后，變體對蛋白水解的抗性比親本高。
[0127] 圖 18 顯示了 裝載了 15 μ g DOM 15-10 或 DOM 15-10-11 樣品的兩個 Novex 10-20% Tricine凝膠。就在加入胰蛋白酶之前，然后在加入胰蛋白酶之后一小時、三小時 和24小時時立即取樣。用SureBlue (Ix)將蛋白質(zhì)染色。結(jié)果表明BIAcore研究中看到的 結(jié)合活性直接反映出蛋白質(zhì)的完整性。
[0128] 圖19A-19L說明了編碼是DOM lh-131-511或DOM 4-130-54變體的dAb的幾個核 酸的核苷酸序列。核苷酸序列各自編碼圖3和圖4中所示的氨基酸序列。
[0129] 圖20A-20E說明了編碼是DOM 15-26-555或DOM 15-10變體的dAb的幾個核酸的 核苷酸序列。核苷酸序列各自編碼圖5和圖6中所示的氨基酸序列。
[0130] 圖21顯示了 pDOM 38的載體圖譜。
[0131] 圖22 :顯示了 Labchip上在30°C下在25 : IdAb :胰蛋白酶比例下用胰蛋白酶處 理DOM 10-53-474和DOM lh-131-206蛋白質(zhì)不同時間點的凝膠電泳。箭頭顯示全長蛋白
[0132] 圖23 :顯示了通過MMC色譜接著陰離子交換的純化后從每個樣品獲得的高水平純 度的大小排阻色譜痕跡。在225nm下監(jiān)控UV，并將柱子在含有10%乙醇（v/v)的IxPBS中 運行。通過整合使用基線校準(zhǔn)的峰面積來計算單體百分比。
[0133] 圖 24 :顯示了 DOM lh-131-511、D0M lh-131-202 和 D0Mlh-131-206 的蛋白酶穩(wěn)定 性數(shù)據(jù)。
[0134] 圖 25 :是 SEC，其說明了 DOM lh-131-202、D0M lh-131-206 和 DOM lh-131-511 在 37和50°C下在Britton-Robinson中的14天穩(wěn)定性數(shù)據(jù)。對于所有dAb，蛋白質(zhì)濃度為 lmg/ml。SEC用來測定蛋白質(zhì)在熱應(yīng)力過程中是否發(fā)生了任何變化和相對于時間=O(TO) 樣品溶液中殘余的單體含量。
[0135] 圖26A至I :顯示了 SEC痕跡，其顯示了熱應(yīng)力（37和50°C )對DOM lh-131-511 (A 至C)，-202 (D至F)和-206 (G至I)的影響。還顯示了在給定時間點時相對于T = 0溶液 中殘余的單體含量。
[0136] 圖 27 :顯示了 DOM lh-131-202、DOM lh-131-206 和 DOMlh-131-511 在 24hr、48hr 以及7和14天熱應(yīng)力的IEF分析。樣品已經(jīng)在Britton-Robinson緩沖液中在37或50°C 下進(jìn)行了溫育。
[0137] 圖 28 :TNFR-1BRA，顯示了 DOM lh-131-202、DOM lh-131-206 和 DOM lh-131-511 在50°C下溫育14天的影響。假定蛋白質(zhì)濃度為lmg/ml。還顯示了沒有結(jié)合抗原的陰性對 照 dAb (VH 模型（dummy))。
[0138] 圖 29 :說明 了將?100mg/ml 的 A :D0M lh-131-202、B :D0M lh-131-206 和 C :D0M lh-131-511在Britton-Robinson緩沖液中在+4°C下存儲7天的影響。在280nm下監(jiān)控 UV0
[0139] 圖 30 :顯示了來自 DOM lh-131-202、DOM lh-131-206 和 DOMlh-131-511 在 Pari E-fiow和LC+中的噴霧器測試的數(shù)據(jù)。在任一 Britton-Robinson緩沖液中，蛋白質(zhì)濃度為 5mg/ml〇
[0140] 圖 31 :說明了 Britton-Robinson 緩沖液中 5mg/ml 的 DOMlh-131-202、DOM lh-131-206和DOM lh-131-511在噴霧過程中單體濃度的相對百分比變化。
[0141] 圖 32 :顯示了 fcittor-Robinson 緩沖液中 DOM lh-131-206 和 DOMlh-131-511 從 Pari LC+噴霧后的SEC痕跡。
[0142] 圖33 :顯示了 PBS中40mg/ml的DOM lh-131-206在1小時的噴霧過程中的SEC痕 跡。噴霧器杯和氣霧劑中的蛋白質(zhì)對于噴霧過程中dAb經(jīng)受到的剪切力和熱應(yīng)力的影響都 是高度抗性的。
[0143] 圖 34 :顯示了三種主要蛋白質(zhì)（DOM lh-131-206 和 DOM lh-131-511 和 DOM lh-131-202)中每一種的沉淀速度曲線。對于DOM lh-131-206較低濃度的樣品觀察到的雙 峰是由于該情況中樣品從室中泄漏出來造成的假象。
[0144] 圖35 :顯示了緩沖液和裝置對GSK 1995056A(D0M lh-131-511)噴霧液滴大小的 影響。
[0145] 圖36 :顯示了 GSK 1995056A(D0M lh-131-511)在各種裝置中噴霧后的穩(wěn)定性， 通過二聚體形成來測定，如通過SEC來測量。
[0146] 圖 37 :顯示了 GSK 1922567A(202)、GSK 1995057A(206)和 GSK 1995056A(511)在 Pari E-flow和LC+中的噴霧器測試。A)在Britton-Robinson緩沖液中測試，B)在PEG 1000/蔗糖緩沖液中測試。
[0147] 圖38:描繪了人TNFRl受體結(jié)合測試中的TNF-α劑量曲線。每個樣品重復(fù)四次 進(jìn)行測試。
[0148] 圖 39 :顯示了 GSK 1922567A(D0M lh-131-202)、GSK 1995057A(D0M lh-131-206) 和GSK 1995056A(D0M lh-131-511)在人TNFRl受體結(jié)合測試中的抑制作用。每個樣品重 復(fù)四次進(jìn)行測試。
[0149] 圖 40 :說明了 DOM 15-26 和 DOM 15-26-593dAb 在 VEGF RBA 中的功效。
[0150] 圖 41 :顯示了將 5mg/mg DMS 1529 (D0M 15-26-593)和 DMS 1545 (D0M 15-26-501) 以單次濃注（bolus)劑量i.v.給藥于大鼠后的藥物動力學(xué)。
[0151] 圖 42a :顯示了 DMS 1529Fc 融合體（DOM 15-26-593FC 融合體）的 SEC-MALL (大 小排阻色譜-多角度激光散射）分析，證實了單體的特征。顯示了兩個不同的批次，對于折 射率（即，濃度；虛線）和光散射（實線），證明了相似的特征。用箭頭標(biāo)記的線條表示分 子量計算。
[0152] 圖42b :顯示了 DMS 1529Fc融合體（DOM 15-26-593FC融合體）的AUC (分析超速 離心）分析，證實了單體的特征。在三個不同的濃度下（PBS緩沖液中接近0. 2、0. 5&1. Omg/ ml)測試一批材料。沉淀速率的分析證實了大約SOkDa的分子量。
[0153] 圖 43 :顯示了 DMS 1529 (D0M 15-26-593)和 DOM 15-26-501 的 DSC 痕跡。
[0154] 圖44 :是對兩個不同批次的材料進(jìn)行10次凍-融循環(huán)之前和之后，DMS 1529 (D0M lh-131-206)的 VEGF 結(jié)合 ELISA。
[0155] 圖45 :顯示了 10次凍-融循環(huán)之前和之后，DOM 15-26-593SEC特征的一致性。
[0156] 圖46 :說明了 DMS 1529融合體（DOM 15-26-593FC融合體）的加速穩(wěn)定性研究的 結(jié)果；結(jié)合ELISA證明了在所示溫度下溫育7天后的活性。
[0157] 圖 47A :顯示了在 37°C溫育 14&15 天后，人獼猴中的 DMS 1529 (D0M 15-26-593) 的穩(wěn)定性。
[0158] 圖47B :顯示了在37°C溫育14&15天后，人血清中的DMS 1529Φ0Μ 15-26-593)的 穩(wěn)定性。
[0159] 圖 48 :顯示了 DOM 15-26&D0M 15-26-593dAb 作為 Fc 融合體（各自為 DOM 1564&D0M 1529)在 VEGF RBA 中的功效。
[0160] 圖49 :說明了 DMS 1529融合體（DOM 15-26-593FC融合體）對HUVEC細(xì)胞增殖的 抑制作用。
[0161] 圖 50 :pDom33 載體圖譜。
[0162] 圖51 :描繪了結(jié)合血清白蛋白的dAb的序列（氨基酸和核苷酸序列）。

【具體實施方式】
[0163] 在本說明書中，已經(jīng)參照實施方案，以使得說明書既清楚又簡明的撰寫方式來描 述了本發(fā)明。但是打算并且應(yīng)當(dāng)理解，可以對這些實施方案進(jìn)行各種組合和分開，而沒有脫 離本發(fā)明。
[0164] 除非另外限定，在此所用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語都具有本領(lǐng)域（例如，細(xì)胞培養(yǎng)、 分子遺傳學(xué)、核酸化學(xué)、雜交技術(shù)和生物化學(xué)）普通技術(shù)人員公知的相同含義。將標(biāo)準(zhǔn)技術(shù) 用于分子、遺傳和生化方法（通常參見，Sambrook等，Molecular Cloning :A Laboratory Manual (分子克隆，實驗室手冊），第 2版（1989) ,Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y.和 Ausubel 等，Short Protocols in Molecular Biology (簡 明分子生物學(xué)實驗方法）（1999)第4版，John Wiley&Sons，Inc.，在此將其引入作為參考） 和化學(xué)方法。
[0165] 如在此所用的，術(shù)語"腫瘤壞死因子受體I (TNFRl)的拮抗劑"或"抗-TNFRl拮抗 齊U"等指的是結(jié)合TNFRl并可以抑制（S卩，一種或更多種）TNFRl功能的物質(zhì)（例如，分子， 化合物）。例如TNFRl的拮抗劑能夠抑制TNF α結(jié)合TNFRl和/或抑制通過TNFRl介導(dǎo)的 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。因此，利用TNFRl的拮抗劑能夠抑制TNFRl介導(dǎo)的過程和細(xì)胞應(yīng)答（例如在標(biāo) 準(zhǔn)的L929細(xì)胞毒性測試中的TNF α誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡）。
[0166] 如在此所用的，"肽"指的是通過肽鍵連接在一起的兩個至約50個氨基酸。
[0167] 如在此所用的，"多肽"指的是通過肽鍵連接在一起的至少約50個氨基酸。多肽 通常包括三級結(jié)構(gòu)并折疊成功能域。
[0168] 如在此所用的，"對蛋白酶降解抗性的"肽或多肽（例如，域抗體（dAb))是在適 于蛋白酶活性的條件下用蛋白酶溫育時，基本上不受蛋白酶的降解。在適于蛋白酶活性的 溫度下用蛋白酶溫育一小時后，不超過約25%、不超過約20%、不超過約15%、不超過約 14%、不超過約13%、不超過約12%、不超過約11 %、不超過約10%、不超過約9%、不超過 約8%、不超過約7%、不超過約6%、不超過約5%、不超過約4%、不超過約3%、不超過約 2%、不超過約1%或基本上沒有蛋白質(zhì)受蛋白酶降解時，多肽（例如，dAb)基本上是沒有降 解的。例如37或50°C。可以使用任何合適的方法來測定蛋白質(zhì)降解，例如，如本文所述的。 通過SDS-PAGE或通過功能測試（例如，配體結(jié)合）。
[0169] 如在此所用的，"展示系統(tǒng)"指的是其中基于所需特征（如，物理、化學(xué)或功能特 征）易于選擇的多肽或肽的集合的系統(tǒng)。展示系統(tǒng)可以是合適的多肽或肽的組（例如，在 溶液中，固定在合適的支持物上）。展示系統(tǒng)還可以是使用細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)（例如，在轉(zhuǎn)化的、 感染的、轉(zhuǎn)染的或轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞中核酸文庫的表達(dá)和細(xì)胞表面上所編碼多肽的展示）或非細(xì) 胞表達(dá)系統(tǒng)（例如，乳液區(qū)室化和展示）的系統(tǒng)。示例性展示系統(tǒng)與核酸的編碼功能以及 由核酸編碼的多肽或肽的物理、化學(xué)和/或功能特征相關(guān)。使用這樣的展示系統(tǒng)時，可以選 擇具有所需物理、化學(xué)和/或功能特征的多肽或肽，并可以容易地分離或回收編碼選定多 肽或肽的核酸。與核酸的編碼功能以及多肽或肽的物理、化學(xué)和/或功能特征相關(guān)的各種 展示系統(tǒng)是本領(lǐng)域已知的，例如，細(xì)菌噬菌體（bacteriophage)展示（噬菌體展示，例如噬 粒展示）、核糖體展示、乳液區(qū)室化和展示、酵母展示、嘌呤霉素展示、細(xì)菌展示、在質(zhì)粒上展 示、共價展示等。（參見，例如，EP 0436597 (Dyax)、U. S.專利 No. 6, 172, 197 (McCafferty 等）、U. S.專利 No. 6, 489, 103 (Griffiths 等））。
[0170] 如在此所用的，"組（repertoire) "指的是特征在于氨基酸序列多樣性的多肽或肽 的集合。組的單個成員可以具有共同的特征，如共同的結(jié)構(gòu)特征（例如，共同的核心結(jié)構(gòu)） 和/或共同的功能特征（例如，結(jié)合共同配體（例如，通用配體或目標(biāo)配體，TNFR1)的能 力）。
[0171] 如在此所用的，"功能性"描述了具有生物活性的多肽或肽，如特定的結(jié)合活性。例 如，術(shù)語"功能性多肽"包括通過其抗原-結(jié)合位點結(jié)合目標(biāo)抗原的抗體或其抗原-結(jié)合 片段。
[0172] 如在此所用的，"通用配體〃指的是結(jié)合給定組的絕大部分（例如，基本上全部） 功能性成員的配體。通用配體（例如，共同的通用配體）可以結(jié)合給定組的許多成員，即使 成員對于共同的目標(biāo)配體不具有結(jié)合特異性。通常，多肽上功能性通用配體結(jié)合位點的存 在（如通過結(jié)合通用配體的能力來表明）表明多肽是正確折疊的和功能性的。通用配體的 合適實例包括超抗原、結(jié)合在組的絕大部分功能性成員上表達(dá)的表位的抗體等。
[0173] "超抗原"是指在與這些蛋白的目標(biāo)配體結(jié)合位點不同的位點與免疫球蛋白超 家族的成員相互作用的通用配體的術(shù)語。葡萄球菌腸毒素是與T-細(xì)胞受體相互作用的 超抗原的實例。結(jié)合抗體的超抗原包括蛋白G，其結(jié)合IgG恒定域（Bjorck和Kronvall, J. Immunol.，133 :969 (1984));蛋白 A，其結(jié)合 IgG 恒定域和 Vh 結(jié)構(gòu)域（Forsgren 和 Sjoquist, J. Immunol.，97 :822 (1966));和蛋白 L，其結(jié)合 Vl 結(jié)構(gòu)域（Bjorck，J. Immunol.， 140 :1194(1988))。
[0174] 如在此所用的，"目標(biāo)配體"指的是由多肽或肽特異性或選擇性結(jié)合的配體。例如， 多肽是抗體或其抗原-結(jié)合片段時，目標(biāo)配體可以是任何所需的抗原或表位。與目標(biāo)抗原 的結(jié)合取決于功能性的多肽或肽。
[0175] 如在此所用的，抗體指的是IgG、IgM、IgA、IgD或IgE或片段（如Fab、F(ab'） 2、 Fv、二硫化物連接的scFv、閉合構(gòu)象多特異性抗體、二硫化物連接的scFv、diabody)，不管 是源自天然產(chǎn)生抗體的物種，或是通過重組DNA技術(shù)形成的；不管是分離自血清、B-細(xì)胞、 雜交瘤、轉(zhuǎn)染瘤、酵母或細(xì)菌。
[0176] 如在此所用的，"抗體形式"指的是其中可以引入一個或更多個抗體可變域使得給 予結(jié)構(gòu)上抗原結(jié)合特異性的任何合適的多肽結(jié)構(gòu)。各種合適的抗體形式是本領(lǐng)域已知的， 如，嵌合抗體、人源化抗體、人抗體、單鏈抗體、雙特異性抗體、抗體重鏈、抗體輕鏈、抗體重 鏈和/或輕鏈的同型二聚體和雜二聚體、之前任一項的抗原結(jié)合片段（例如，F(xiàn)v片段（例 如，單鏈Fv(scFv)、二硫化物鍵合的Fv)、Fab片段、Fab'片段、F (ab'）2片段）、單抗體可變 域（例如，dAb、VH、VHH、')和之前任一項的修飾形式（例如，通過聚乙二醇或其他合適聚合 物或人源化V hh的共價連接修飾的）。
[0177] 短語"免疫球蛋白單可變域"指的是與其他V區(qū)或域無關(guān)的特異性結(jié)合抗原或表 位的抗體可變域（V H、Vffin VJ。免疫球蛋白單可變域可以以帶有其他可變區(qū)或可變域的形 式（例如，同型-或雜-多聚體）存在，其中其他區(qū)或域?qū)τ趩蚊庖咔虻鞍卓勺冇虻目乖Y(jié) 合不是所需的（即，其中免疫球蛋白單可變域結(jié)合抗原與其他可變域無關(guān)）。"域抗體"或 "dAb"與在此所用的術(shù)語"免疫球蛋白單可變域"相同。"單抗體可變域"或"抗體單可變域" 與在此所用的術(shù)語"免疫球蛋白單可變域"相同。在一個實施方案中，免疫球蛋白單可變域 是人抗體可變域，但還包括來自其他物種的單抗體可變域，如嚙齒動物（例如，W000/29004 中公開的，在此將其內(nèi)容作為整體引入作為參考）、護(hù)士鯊和Camelid Vhh dAb。Camelid Vhh 是源自包括駱駝、美洲駝、羊駝、單峰駱駝和原駝的物種的免疫球蛋白單可變域多肽，其產(chǎn) 生天然缺少輕鏈的重鏈抗體?？梢詫 hh人源化。
[0178] "結(jié)構(gòu)域〃是經(jīng)過折疊的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，其具有與蛋白質(zhì)其余部分無關(guān)的蛋白質(zhì)三級 結(jié)構(gòu)。通常，結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)蛋白質(zhì)的分離的功能特征，并且在許多情況下可以添加、去除或轉(zhuǎn) 移給其他蛋白質(zhì)，而不喪失該蛋白質(zhì)和/或該結(jié)構(gòu)域的其余部分的功能。"單抗體可變域" 是指經(jīng)過折疊的多肽域，包含抗體可變域的特征性序列。因此，其包括完整的抗體可變區(qū)和 修飾的可變域，例如，其中一個或更多個環(huán)已經(jīng)由不是抗體可變區(qū)特征性的序列替代，或已 被截斷或包含N-端或C-端延伸的抗體可變域，以及保留全長結(jié)構(gòu)域的至少結(jié)合活性和特 異性的可變域的折疊片段。
[0179] 術(shù)語"文庫〃指的是異源多肽或核酸的混合物。文庫由成員組成，每個成員具有 單個多肽或核酸序列。就這點而言，"文庫"和"組〃同義。文庫成員之間的序列差異造成 文庫中存在的多樣性。文庫可以采用多肽或核酸的簡單混合物的形式，或者用核酸文庫轉(zhuǎn) 化的生物體或細(xì)胞的形式，例如細(xì)菌、病毒、動物或植物細(xì)胞等。在一個實施方案中，各個生 物體或細(xì)胞僅含有一個或數(shù)目有限的文庫成員。在一個實施方案中，將核酸摻入到表達(dá)載 體中，以表達(dá)該核酸所編碼的多肽。因此，在一個方面中，文庫可以采用宿主生物體群的形 式，每個生物體含有一個或更多個拷貝的表達(dá)載體，所述載體含有核酸形式的文庫的單個 成員，所述核酸可以表達(dá)而產(chǎn)生其相應(yīng)的多肽成員。因此，宿主生物體群具有編碼一大組不 同多肽的潛力。
[0180] "通用框架"是單抗體框架序列，對應(yīng)于序列中的保守抗體區(qū)，如Kabat限定的 ("Sequences of Proteins of Immunological Interest"（免疫學(xué)重要性蛋白的序列）， US Department of Health and Human Services(美國衛(wèi)生和人類服務(wù)部）），或?qū)?yīng)于人 種系免疫球蛋白組或結(jié)構(gòu)，如Chothia和Lesk限定的，（1987) J. Mol. Biol. 196 :910-917。 文庫和組可以使用單個框架，或一組這樣的框架，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)其允許實質(zhì)上任何結(jié)合特異性 的產(chǎn)生，盡管變化僅在超變區(qū)內(nèi)。
[0181] 如在此所用的，術(shù)語"劑量"指的是在一次給藥（單位劑量），或在限定時間間隔 內(nèi)兩次或更多次給藥時給藥于患者的全部配體量。例如，劑量可以指的是在一天（24小時） (日劑量）、兩天、一周、兩周、三周或一個或更多個月（例如，通過單次給藥，或通過兩次或 更多次給藥）的過程中給藥于患者的配體量（例如，含有結(jié)合目標(biāo)抗原的免疫球蛋白單可 變域的配體）。給藥之間的間隔可以是任何所需的時間量。
[0182] 短語"半衰期"是指配體的血清濃度在體內(nèi)降至50%所需的時間，例如因為通過 天然機制所致的配體降解和/或清除或螯合。本發(fā)明的配體在體內(nèi)可以是穩(wěn)定的，其半衰 期因結(jié)合抗降解和/或清除或螯合的分子而延長。通常，這類分子是天然存在的蛋白質(zhì)， 它們本身在體內(nèi)具有較長的半衰期。如果配體的功能活性在體內(nèi)的持續(xù)時間比對延長半 衰期的分子不具有特異性的類似配體更長的話，則配體半衰期延長。例如，將對人血清白蛋 白（HAS)和靶分子具有特異性的配體，與對HSA無特異性且不結(jié)合HSA，而結(jié)合別的分子的 相同配體進(jìn)行比較。例如，它能結(jié)合細(xì)胞上的第三目標(biāo)物。通常，半衰期延長lO^JO%、 30 (%、40(%、50(%或更多。半衰期延長范圍在21、31、41、51、1(^、2(^、3(^、4(^、5(^或以上是 可能的?；蛘?，或另外，半衰期延長范圍高達(dá)30χ、40χ、50χ、60χ、70χ、80χ、90χ、ΙΟΟχ、150x也 是可能的。
[0183] 如在此所用的，"流體動力學(xué)大小"指的是基于分子通過水溶液擴散的分子（例如， 蛋白質(zhì)分子，配體）的表觀大小。將蛋白質(zhì)通過溶液的擴散或移動進(jìn)行處理，以得到蛋白質(zhì) 的表觀大小，其中通過蛋白質(zhì)顆粒的"Stokes半徑"或"流體動力學(xué)半徑"來給出大小。蛋 白質(zhì)的"流體動力學(xué)大小"取決于質(zhì)量和形狀（構(gòu)象），使得具有相同分子量的兩個蛋白質(zhì) 基于蛋白質(zhì)的整體構(gòu)象可以具有不同的流體動力學(xué)大小。
[0184] 如在此所用的，術(shù)語"競爭"意思是第一目標(biāo)與其同源目標(biāo)結(jié)合域的結(jié)合在所述 同源目標(biāo)特異性的第二結(jié)合域的存在下受到抑制。例如，結(jié)合可以受到空間抑制，例如，通 過結(jié)合域的物理阻斷或通過改變結(jié)合域的結(jié)構(gòu)或環(huán)境，使其對目標(biāo)的親和性或親和力降 低。對于怎樣進(jìn)行競爭ELISA和競爭BiaCore實驗來測定第一和第二結(jié)合域之間的競爭的 詳細(xì)內(nèi)容參見W02006038027。
[0185] 如下進(jìn)行兩個序列之間的"同源性"或"同一性〃或"相似性"（在此可將這些術(shù)語 互換使用）的計算。為了優(yōu)化比較目的，將序列比對（例如，為了比較目的，對于最佳比對， 可以在第一個和第二個氨基酸或核酸序列中引入缺口，并且非同源序列可以忽略不計）。在 一個實施方案中，為了比較目的，所比對的參考序列的長度占參考序列長度的至少30%，或 至少40 %，或至少50 %，或至少60 %，或至少70 %，80 %，90 %，100 %。然后，將相應(yīng)氨基酸 位置或核苷酸位置的氨基酸殘基或核苷酸進(jìn)行比較。當(dāng)?shù)谝恍蛄兄械哪硞€位置由與第二序 列相應(yīng)位置的相同氨基酸殘基或核苷酸占據(jù)時，那么分子在該位置上是相同的（在此所用 的氨基酸或核酸"同源性"等同于氨基酸或核酸"同一性"）。兩個序列之間的同一性百分比 是考慮了缺口數(shù)和每個缺口的長度后序列共有的相同位置數(shù)的函數(shù)，需要引入這些缺口以 進(jìn)行兩個序列的最佳比對?？梢允褂肂LAST2S eqUenCes算法，使用缺省參數(shù)，來準(zhǔn)備和測定 如在此所限定的氨基酸和核苷酸序列比對和同源性、相似性或同一性（Tatusova，T.A.等， FEMS Microbiol Lett,174 ： 187-188 (1999))〇
[0186] 選擇方法
[0187] 在一個實施方案中，本發(fā)明涉及通過選擇蛋白酶抗性肽和多肽的方法選擇的具有 所需生物活性的多肽和dAb。在方法中使用了兩種選擇程序來產(chǎn)生有效的方法，用于選擇對 蛋白酶降解高度穩(wěn)定和抗性的并具有所需生物活性的多肽。如本文所述的，蛋白酶抗性肽 和多肽通常保持生物活性。相反，在本文所述的方法中，蛋白酶敏感性肽和多肽受到蛋白酶 的分裂或降解，并因此，失去其生物活性。因此，通?；谄渖锘钚匀缃Y(jié)合活性來選擇蛋 白酶抗性肽或多肽。
[0188] 本文所述的方法提供了幾個優(yōu)點。例如，如在此公開的和例舉的，對能抵抗一種蛋 白酶（例如，胰蛋白酶）的蛋白水解降解而選擇的可變域、拮抗劑、肽或多肽也能抵抗其他 蛋白酶（例如，彈性蛋白酶、Ieucozyme)的降解。在一個實施方案中，蛋白酶抗性與肽或 多肽的較高解鏈溫度（Tm)相關(guān)。較高的解鏈溫度表示更穩(wěn)定的可變域、拮抗劑、肽和多肽。 在一個實施方案中，對蛋白酶降解的抗性還與對目標(biāo)配體的高親和性結(jié)合相關(guān)。因此，本文 所述的方法提供了選擇、分離和/或回收具有所需生物活性并且非常適于體內(nèi)治療和/或 診斷用途（因為這些是蛋白酶抗性和穩(wěn)定的）的可變域、拮抗劑、肽、多肽的有效途徑。在 一個實施方案中，蛋白酶抗性與提高的PK相關(guān)，例如，提高的超過非蛋白酶抗性的可變域、 詰抗劑、膚或多膚。提商的PK可以是提商的AUC(曲線下面積）和/或提商的半哀期。在 一個實施方案中，蛋白酶抗性與可變域、拮抗劑、肽或多肽對剪切力和/或熱應(yīng)力的提高的 穩(wěn)定性和/或噴霧過程中降低的聚集傾向相關(guān)，例如，提高的超過非蛋白酶抗性的可變域、 拮抗劑、肽或多肽。在一個實施方案中，蛋白酶抗性與提高的存儲穩(wěn)定性相關(guān)，例如，提高的 超過非蛋白酶抗性的可變域、拮抗劑、肽或多肽。在一個方面中，提供了一個、兩個、三個、四 個或全部優(yōu)點，優(yōu)點是對蛋白酶降解的抗性、較高的Tm和對目標(biāo)配體的高親和性結(jié)合。
[0189] 在一個方面中，提供了從肽和多肽的文庫或組（例如，展示系統(tǒng)）中選擇、分離和 /或回收對蛋白酶（例如，一種或更多種蛋白酶）降解抗性的肽或多肽的方法。在一個實 施方案中，該方法是從肽和多肽的文庫或組（例如，展示系統(tǒng)）中選擇、分離和/或回收對 蛋白酶（例如，一種或更多種蛋白酶）降解抗性的多肽的方法。通常，該方法包括提供肽或 多肽的文庫或組，在適于蛋白酶活性的條件下將文庫或組與蛋白酶（例如，胰蛋白酶、彈性 蛋白酶、leucozyme、胰酶、痰液）混合，并選擇、分離和/或回收對蛋白酶降解抗性的并具 有所需生物活性的肽或多肽。由于蛋白酶的活性，蛋白酶降解的肽或多肽通常具有降低的 生物活性或失去其生物活性。因此，可以使用基于生物活性的方法來選擇、分離和/或回收 對蛋白酶降解抗性的肽或多肽，生物活性如結(jié)合活性（例如，結(jié)合通用配體，結(jié)合特異性配 體，結(jié)合底物）、催化活性或其他生物活性。
[0190] 在適于蛋白酶的蛋白水解活性的條件下，將肽或多肽的文庫或組與蛋白酶（例 如，一種或更多種蛋白酶）混合。適于蛋白酶的蛋白水解活性的條件以及含有蛋白水解活 性的生物制劑或混合物是本領(lǐng)域公知的，并可以通過本領(lǐng)域普通技術(shù)人員容易地測定。如 果需要，例如，可以通過測定一定范圍的PH條件、蛋白酶濃度、溫度下的蛋白酶活性和/或 通過改變文庫或組與蛋白酶反應(yīng)的時間量來鑒定或優(yōu)化合適的條件。例如，在一些實施方 案中，蛋白酶例如胰蛋白酶與肽或多肽（例如，可變域）的比例（以摩爾/摩爾為基礎(chǔ)）為 800至80,00(例如，8, 000至80, 000)蛋白酶：肽或多肽，例如，使用10微克/ml蛋白酶時， 比例為800至80, 000蛋白酶：肽或多肽；或使用100微克/ml蛋白酶時，比例為8, 000至 80, 000蛋白酶：肽或多肽。在一個實施方案中，蛋白酶（例如，胰蛋白酶）與肽或多肽（例 如，可變域）的比例（以重量/重量為基礎(chǔ)，例如微克/微克）為1，600至160, 000 (例如， 16, 000至160,000)蛋白酶：肽或多肽，例如，使用10微克/ml蛋白酶時，比例為1，600至 160, 000蛋白酶：肽或多肽；或使用100微克/ml蛋白酶時，比例為16, 000至160, 000蛋 白酶：肽或多肽。在一個實施方案中，使用至少100或1000微克/ml濃度的蛋白酶，并且 蛋白酶例如胰蛋白酶與肽或多肽（例如，可變域）的蛋白酶：肽比例（以摩爾/摩爾為基 礎(chǔ)）為8, 000至80, 000蛋白酶：肽或多肽。在一個實施方案中，使用至少10微克/ml濃 度的蛋白酶，并且蛋白酶例如胰蛋白酶與肽或多肽（例如，可變域）的蛋白酶：肽比例（以 摩爾/摩爾為基礎(chǔ)）為800至80, 000蛋白酶：肽或多肽。在一個實施方案中，例如，C為 10微克/ml時，蛋白酶（例如，胰蛋白酶）與肽或多肽（例如，可變域）的比例（以重量/ 重量為基礎(chǔ)，例如微克/微克）為1600至160, 000蛋白酶：肽或多肽；或C或C'為100微 克/ml時，比例為16, 000至160, 000蛋白酶：肽或多肽。在一個實施方案中，濃度（c或 c'）為至少100或1000微克/ml蛋白酶。對于測試單個或分離的肽或多肽（例如，免疫球 蛋白可變域），例如，已經(jīng)從組或文庫中分離出來的，可以將蛋白酶加入合適緩沖液（例如， PBS)中的肽或多肽溶液中，以產(chǎn)生肽或多肽/蛋白酶溶液，如至少約0.01% (w/w)蛋白酶/ 肽或多肽的溶液，約〇. 01 %至約5% (w/w)蛋白酶/肽或多肽，約0. 05%至約5% (w/w)蛋 白酶/肽或多肽，約〇.1%至約5%(￥/\￥)蛋白酶/肽或多肽，約0.5%至約5%(￥/\￥)蛋白 酶/肽或多肽，約1%至約5% (w/w)蛋白酶/肽或多肽，至少約0.01% (w/w)蛋白酶/肽 或多肽，至少約0.02% (w/w)蛋白酶/肽或多肽，至少約0.03% (w/w)蛋白酶/肽或多肽， 至少約0.04% (w/w)蛋白酶/肽或多肽，至少約0.05% (w/w)蛋白酶/肽或多肽，至少約 0. 06% (w/w)蛋白酶/肽或多肽，至少約0. 07% (w/w)蛋白酶/肽或多肽，至少約0. 08% (w/w)蛋白酶/肽或多肽，至少約0. 09% (w/w)蛋白酶/肽或多肽，至少約0. 1% (w/w)蛋 白酶/肽或多肽，至少約0.2% (w/w)蛋白酶/肽或多肽，至少約0.3% (w/w)蛋白酶/肽 或多肽，至少約0.4% (w/w)蛋白酶/肽或多肽，至少約0.5% (w/w)蛋白酶/肽或多肽，至 少約0. 6% (w/w)蛋白酶/肽或多肽，至少約0. 7% (w/w)蛋白酶/肽或多肽，至少約0. 8% (w/w)蛋白酶/肽或多肽，至少約0.9% (w/w)蛋白酶/肽或多肽，至少約1% (w/w)蛋白酶 /肽或多肽，至少約2% (w/w)蛋白酶/肽或多肽，至少約3% (w/w)蛋白酶/肽或多肽，至 少約4% (w/w)蛋白酶/肽或多肽，或約5% (w/w)蛋白酶/肽或多肽?？梢栽诘鞍酌富钚?合適的溫度下（例如，室溫，約37°C)溫育混合物，并以（例如，1小時，2小時，3小時等） 時間間隔取樣。使用任何合適的方法，如SDS-PAGE分析或配體結(jié)合，分析樣品的蛋白質(zhì)降 解，并且結(jié)果可以用來建立降解的時間過程。
[0191] 在本文所述的方法中，可以使用任何所需的一種或更多種蛋白酶。例如，可以使用 單種蛋白酶，不同蛋白酶的任何所需組合或含有蛋白水解活性的任何生物制劑、生物提取 物或生物勻漿。所用一種或更多種蛋白酶的特性不必定是已知的?？梢詥为毣蛞匀魏嗡?組合來使用的蛋白酶的合適實例包括絲氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、巰 基蛋白酶、基質(zhì)金屬蛋白酶、羧肽酶（例如，羧肽酶A、羧肽酶B)、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、 胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、彈性蛋白酶、leukozyme、胰酶、凝血酶、血纖維蛋白溶酶、組織蛋白 酶（例如，組織蛋白酶G)、蛋白酶（例如，蛋白酶1、蛋白酶2、蛋白酶3)、嗜熱菌蛋白酶、凝乳 酶、腸肽酶、胱天蛋白酶（例如，胱天蛋白酶1、胱天蛋白酶2、胱天蛋白酶4、胱天蛋白酶5、 胱天蛋白酶9、胱天蛋白酶12、胱天蛋白酶13)、|丐激活中性蛋白酶、無花果蛋白酶（ficain)、 梭菌蛋白酶、奇異果蛋白酶（actinidain)、菠蘿蛋白酶和分離酶。合適的含有蛋白水解活 性的生物提取物、勻漿和制劑包括痰液、粘液（例如，胃粘液、鼻粘液、支氣管粘液）、支氣管 肺泡灌洗、肺勻漿、肺提取物、胰腺提取物、胃液、唾液、眼淚等。以適于發(fā)生蛋白水解降解 的含量使用蛋白酶。例如，如本文所述的，可以使用約〇.〇1 %至約5% (w/w，蛋白酶/肽或 多肽）的蛋白酶。將蛋白酶與包括肽或多肽組的展示系統(tǒng)（例如，噬菌體展示系統(tǒng)）混合 時，例如，可以使用約10 μ g/ml至約3mg/ml濃度的蛋白酶，約10 μ g/ml，約20 μ g/ml，約 30 μ g/ml，約 40 μ g/ml，約 50 μ g/ml，約 60 μ g/ml，約 70 μ g/ml，約 80 μ g/ml，約 90 μ g/ml， 約 100 μ g/ml，約 200 μ g/ml，約 300 μ g/ml，約 400 μ g/ml，約 500 μ g/ml，約 600 μ g/ml，約 700 μ g/ml，約 800 μ g/ml，約 900 μ g/ml，約 1000 μ g/ml，約 I. 5mg/ml，約 2mg/ml，約 2. 5mg/ ml 或約 3mg/ml。
[0192] 在適于蛋白酶活性的溫度下將蛋白酶與肽或多肽的集合（文庫或組）一起溫 育。例如，可以在約20°C至約40°C的溫度下溫育蛋白酶和肽或多肽的集合（例如，在室溫， 約 20°C，約 21°C，約 22°C，約 23°C，約 24°C，約 25°C，約 26°C，約 27°C，約 28°C，約 29°C， 約 30°C，約 31°C，約 32°C，約 33°C，約 34°C，約 35°C，約 36°C，約 37°C，約 38°C，約 39°C，約 40°C)。將蛋白酶和肽或多肽的集合一起溫育一段足以發(fā)生蛋白水解降解的時間。例如， 可以將肽或多肽的集合與蛋白酶溫育約30分鐘至約24或約48小時。在一些實施例中，將 肽或多肽的集合與蛋白酶一起溫育過夜，或至少約30分鐘，約1小時，約1. 5小時，約2小 時，約3小時，約4小時，約5小時，約6小時，約7小時，約8小時，約9小時，約10小時，約 11小時，約12小時，約13小時，約14小時，約15小時，約16小時，約17小時，約18小時， 約19小時，約20小時，約21小時，約22小時，約23小時，約24小時，約48小時，或更長時 間。
[0193] 通常理想的是，至少在較早的選擇輪次中（例如，使用展示系統(tǒng)時），與沒有包括 蛋白酶溫育的選擇相比，蛋白酶導(dǎo)致選擇的具有所需生物活性的克隆數(shù)量減少至少一個數(shù) 量級。在特定的實施例中，方法中所用的蛋白酶含量和條件足以將回收的克隆數(shù)量減少至 少一個對數(shù)（10倍），至少約2個對數(shù)（100倍），至少約3個對數(shù)（1000倍）或至少約4個 對數(shù)（10, 000倍）。使用常規(guī)方法和/或在此提供的指導(dǎo)，可以容易地測定導(dǎo)致所需回收克 隆減少的合適的蛋白酶含量和溫育條件。
[0194] 可以使用任何合適的方法（例如，體外、體內(nèi)或離體（ex vivo))來混合并溫育蛋 白酶和肽或多肽的集合。例如，可以在合適的容器中將蛋白酶和肽或多肽的集合混合并在 適于蛋白酶活性的溫度下保持靜止、搖晃、振蕩、渦旋等。如果需要，可以在體內(nèi)或離體（ex vivo)系統(tǒng)中混合蛋白酶和肽或多肽的集合，如通過將多肽的集合（例如，噬菌體展示文庫 或組）引入合適的動物中（例如，小鼠），經(jīng)過對于蛋白酶活性而言足夠的時間后，回收肽或 多肽的集合。在另一個實施例中，用多肽的集合（例如，噬菌體展示文庫或組）灌注器官 或組織，經(jīng)過對于蛋白酶活性而言足夠的時間后，回收多肽的集合。
[0195] 溫育后，可以基于所需生物活性如結(jié)合活性來選擇蛋白酶抗性肽或多肽。如果需 要，可以在選擇前加入蛋白酶抑制劑?？梢允褂没旧喜桓蓴_選擇方法的任何合適的蛋白 酶抑制劑（或兩種或更多種蛋白酶抑制劑的組合物）。合適的蛋白酶抑制劑的實例包括， α 1-抗-胰蛋白酶、α 2-巨球蛋白、阿嗎他定、抗凝血酶III、抑肽酶、4-(2-氨乙基）苯磺 ?；餁渎然铮ˋEBSF)、（4-脒基-苯基）-甲烷-磺酰氟化物（APMSF)、貝他定、芐 脒、抑凝乳蛋白酶素、3,4_二氯異香豆素、二異丙基氟磷酸鹽（DIFP)、E-64、乙二胺四乙酸 (EDTA)、彈性蛋白酶抑制劑（elastatinal)、亮肽素、N-乙基馬來酰亞胺、苯甲基磺酰氟化 物（PMSF)、抑胃肽、1，10-鄰二氮雜菲、膦酰二肽（phosphoramidon)、絲氨酸蛋白酶抑制劑、 N-甲苯磺?；?L-賴氨酸-氯甲基酮（TLCK)、Na-甲苯磺酰基-Phe-氯甲基酮（TPCK)等。 此外，許多含有幾類蛋白酶抑制劑的制劑是可購得的（例如，Roche Complete Protease Inhibitor Cocktail Tablets?(RocheDiagnostics Corporation ；Indianapolis, IN, USA)，其抑制胰凝乳蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶、木瓜蛋白酶、鏈霉蛋白酶、胰腺提取物和胰蛋白 酶）。
[0196] 可以使用所需的生物活性選擇方法來選擇蛋白酶抗性肽或多肽，這種選擇方法可 以使具有所需生物活性的肽和多肽與不具有所需生物活性的肽和多肽區(qū)分開來并進(jìn)行選 擇。通常，已經(jīng)受到蛋白酶消化或分裂的肽或多肽失去了它們的生物活性，而蛋白酶抗性肽 或多肽仍然保留功能。因此，對于生物活性合適的測試可以用來選擇蛋白酶抗性肽或多肽。 例如，可以使用合適的結(jié)合測試（例如，ELISA、淘選）來測定共同的結(jié)合功能（例如，結(jié)合 通用配體，結(jié)合特異性配體或結(jié)合底物）。例如，可以通過淘選或使用合適的親和性基質(zhì)來 選擇、分離和/或回收結(jié)合目標(biāo)配體或通用配體（如蛋白A、蛋白L或抗體）的多肽?？梢?通過將配體（例如,通用配體、目標(biāo)配體）溶液加入合適的容器（例如,試管、培養(yǎng)皿）中并 使配體沉積或覆蓋在容器壁上來完成淘選。將過量的配體洗掉并將多肽（例如，噬菌體展 示文庫）加入容器中，并將容器維持在適于多肽結(jié)合固定化配體的條件下。將未結(jié)合的多 肽洗掉，使用任何合適的方法（如刮下（scraping)或降低pH)來回收結(jié)合的多肽。
[0197] 使用噬菌體展示系統(tǒng)時，可以在噬菌體ELISA中測試結(jié)合?？梢愿鶕?jù)任何合適的 程序來進(jìn)行噬菌體ELISA。在一個實施例中，通過ELISA篩選每一輪選擇產(chǎn)生的噬菌體群 與選定的目標(biāo)配體或通用配體的結(jié)合，以鑒定呈現(xiàn)出蛋白酶抗性肽或多肽的噬菌體。如果 需要，可以測試可溶性肽和多肽與目標(biāo)配體或通用配體的結(jié)合，例如，通過ELISA，例如，使 用對抗C-或N-端標(biāo)記物的試劑（參見，例如Winter等（1994)，Ann. Rev. Immunology 12， 433-55以及其中引用的參考文獻(xiàn)）。還可以通過PCR產(chǎn)物的凝膠電泳（Marks等，1991，上 文；Nission 等，1994,上文）、探針檢測（Tomlinson 等，1992, J. Mol. Biol. 227, 776)或通過 載體DNA的測序來測定選定噬菌體的多樣性。
[0198] 除了對TNFRl的特異性，含有抗-TNFRl蛋白酶抗性多肽（例如，單抗體可變域） 的拮抗劑或多肽（例如，雙特異性配體）可以具有通用配體或任何所需目標(biāo)配體的結(jié)合特 異性，目標(biāo)配體如人或動物蛋白，包括細(xì)胞因子、生長因子、細(xì)胞因子受體、生長因子受體、 酶（例如，蛋白酶）、酶的輔因子、DNA結(jié)合蛋白、脂質(zhì)和碳水化合物。
[0199] 在一些實施方案中，蛋白酶抗性肽或多肽（例如，dAb)或拮抗劑結(jié)合肺組織中的 TNFRl。在一個實施方案中，拮抗劑或多肽還結(jié)合肺組織中的其他目標(biāo)物。
[0200] 在本文所述的方法中使用展示系統(tǒng)時（例如，與核酸的編碼功能和該核酸編碼的 肽或多肽的功能性特征相關(guān)的展示系統(tǒng)），常常能有利地擴增或提高編碼選定肽或多肽的 核酸的拷貝數(shù)。這提供了一條獲得足量核酸和/或肽或多肽的有效途徑，以用于更多輪次 的選擇，使用本文所述的方法或其他合適的方法，或用于制備其他的組（例如，親和性突變 組）。因此，在一些實施方案中，該方法包括使用展示系統(tǒng)（例如，與核酸的編碼功能和該核 酸編碼的肽或多肽的功能性特征相關(guān)的展示系統(tǒng)，如噬菌體展示）并進(jìn)一步包括擴增或提 高編碼選定肽或多肽的核酸的拷貝數(shù)?？梢允褂萌魏魏线m的方法來擴增核酸，如通過噬菌 體擴增、細(xì)胞生長或聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。
[0201] 本文所述的方法可以用作計劃的一部分來分離蛋白酶抗性肽或多肽，例如，dAb， 如果需要，可以包括其他合適的選擇方法。在這些情況中，可以在計劃的任何所需點使用本 文所述的方法，如在使用其他選擇方法之前或之后。本文所述的方法還可以用來提供兩輪 或更多輪的選擇，如本文所述和舉例說明的。
[0202] 在一個實施例中，方法用于選擇能抵抗彈性蛋白酶降解的肽或多肽，例如dAb，包 括提供肽或多肽的文庫或組，在適于彈性蛋白酶的蛋白水解消化的條件下將文庫或組與彈 性蛋白酶（或含有彈性蛋白酶的生物制劑、提取物或勻漿）混合，并選擇、分離和/或回收 能抵抗彈性蛋白酶降解并具有TNFRl結(jié)合活性的肽或多肽。
[0203] 在特定的實施方案中，提供了選擇能抵抗彈性蛋白酶降解并結(jié)合TNFRl的免疫球 蛋白單可變域（dAb)的方法。在這些實施方案中，提供了含有dAb的文庫或組，并在適于彈 性蛋白酶的蛋白水解消化的條件下與彈性蛋白酶（或含有彈性蛋白酶的生物制劑、提取物 或勻漿）混合。選擇特異性結(jié)合TNFRl的彈性蛋白酶抗性dAb。例如，彈性蛋白酶抗性dAb 在0.04% (w/w)彈性蛋白酶溶液中在37°C下持續(xù)至少約2小時時基本上沒有降解。在一 個實施方案中，彈性蛋白酶抗性dAb在0.04% (w/w)彈性蛋白酶溶液中在37°C下持續(xù)至少 約12小時時基本上沒有降解。在一個實施方案中，彈性蛋白酶抗性dAb在0.04% (w/w)彈 性蛋白酶溶液中在37°C下持續(xù)至少約24小時、至少約36小時或至少約48小時時基本上沒 有降解。
[0204] 在一個實施方案中，提供了選擇能抵抗彈性蛋白酶降解并結(jié)合TNFRl的免疫球蛋 白單可變域（dAb)的方法，該方法包括提供含有一組多肽的噬菌體展示系統(tǒng)，該多肽含有 免疫球蛋白單可變域，將噬菌體展示系統(tǒng)與彈性蛋白酶（約1〇〇μ g/ml)混合并將混合物在 約37°C下溫育，例如過夜（例如，約12-16小時），然后選擇呈現(xiàn)出特異性結(jié)合TNFRl的dAb 的噬菌體。
[0205] 在一個實施例中，提供了選擇能抵抗Ieucozyme降解的肽或多肽（例如，dAb)的 方法，包括提供肽或多肽的文庫或組，在適于Ieucozyme的蛋白水解消化的條件下將文庫 或組與Ieucozyme (或含有Ieucozyme的生物制劑、提取物或勻楽）混合，并選擇、分離和/ 或回收能抵抗leucozyme降解并具有特異性TNFRl結(jié)合活性的肽或多肽。
[0206] 在特定的實施方案中，提供了選擇能抵抗leucozyme降解并結(jié)合TNFRl的免疫球 蛋白單可變域（dAb)的方法。在這些實施方案中，提供了含有dAb的文庫或組，并在適于 leucozyme的蛋白水解消化的條件下與leucozyme (或含有l(wèi)eucozyme的生物制劑、提取物 或勻楽）混合。選擇特異性結(jié)合TNFRl的leucozyme抗性dAb。例如，leucozyme抗性dAb 在0. 04% (w/w) leucozyme溶液中在37°C下持續(xù)至少約2小時時基本上沒有降解。在一個 實施方案中，leucozyme抗性dAb在0· 04% (w/w) leucozyme溶液中在37°C下持續(xù)至少約12 小時時基本上沒有降解。在一個實施方案中，leucozyme抗性dAb在0. 04% (w/w) leucozyme 溶液中在37°C下持續(xù)至少約24小時、至少約36小時或至少約48小時時基本上沒有降解。
[0207] 在一個實施方案中，提供了選擇能抵抗leucozyme降解并特異性結(jié)合TNFRl的免 疫球蛋白單可變域（dAb)的方法，該方法包括提供含有一組多肽的噬菌體展示系統(tǒng)，該多 肽含有免疫球蛋白單可變域，將噬菌體展示系統(tǒng)與leucozyme(約100μ g/ml)混合并將混 合物在約37°C下溫育，例如過夜（例如，約12-16小時），然后選擇呈現(xiàn)出特異性結(jié)合TNFRl 的dAb的噬菌體。
[0208] 在另一個實施例中，提供了用于選擇對胰蛋白酶降解有抗性的肽或多肽（例如 dAb)的方法，其包括提供肽或多肽的文庫或組，在適于胰蛋白酶蛋白水解消化的條件下將 所述文庫或組與胰蛋白酶組合，以及選擇、分離和/或回收對胰蛋白酶降解有抗性且特異 性結(jié)合TNFRl的肽或多肽。
[0209] 在特定的實施方案中，提供了選擇對胰蛋白酶降解有抗性且特異性結(jié)合TNFRl的 免疫球蛋白單可變域（dAb)的方法。在這些實施方案中，提供了包含dAb的文庫或組，并將 其與胰蛋白酶（或包含胰蛋白酶的生物制劑、提取物或勻漿液）在適于胰蛋白酶蛋白水解 消化的條件下組合。選擇結(jié)合TNFRl的胰蛋白酶抗性dAb。例如，在37°C下在0.04% (w/ w)胰蛋白酶溶液中溫育至少大約2小時的時間段時，胰蛋白酶抗性dAb基本上不被降解。 在一個實施方案中，在37°C下在0.04% (w/w)胰蛋白酶溶液中溫育至少大約3小時的時間 段時，胰蛋白酶抗性dAb基本上不被降解。在37°C下在0.04% (w/w)胰蛋白酶溶液中溫育 至少大約4小時、至少大約5小時、至少大約6小時、至少大約7小時、至少大約8小時、至 少大約9小時、至少大約10小時、至少大約11小時、或至少大約12小時的時間段時，胰蛋 白酶抗性dAb基本上不被降解。
[0210] 在示范性的實施方案中，提供了用于選擇對胰蛋白酶降解有抗性且特異性結(jié)合 TNFRl的免疫球蛋白單可變域（dAb)的方法。該方法包括提供噬菌體展示系統(tǒng)（其包含一 組含有免疫球蛋白單可變域的多肽），將所述噬菌體展示系統(tǒng)與胰蛋白酶（100 μ g/ml)組 合，并在大約37°C下溫育混合物例如過夜（例如大約12-16小時），接著選擇展示特異性結(jié) 合TNFRl的dAb的噬菌體。
[0211] 在另一個方面中，提供了一組產(chǎn)生蛋白酶抗性肽或多肽（例如，dAb)的方法。該 方法包括提供一組肽或多肽；在適于蛋白酶活性的條件下將肽或多肽組與蛋白酶混合；并 回收多個特異性結(jié)合TNFRl的肽或多肽，由此產(chǎn)生一組蛋白酶抗性肽或多肽。在此對于其 他方法描述了適用于該方法中的蛋白酶、展示系統(tǒng)、用于蛋白酶活性的條件和選擇肽或多 肽的方法。
[0212] 在一些實施方案中，使用了含有一組肽或多肽的展示系統(tǒng)（例如，與核酸的編碼 功能和該核酸編碼的肽或多肽的功能性特征相關(guān)的展示系統(tǒng)），并且該方法進(jìn)一步包括擴 增或提高編碼多個選定肽或多肽的核酸的拷貝數(shù)?？梢允褂萌魏魏线m的方法來擴增核酸， 如通過噬菌體擴增、細(xì)胞生長或聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。
[0213] 在特定的實施方案中，提供了產(chǎn)生一組包含抗-TNFR IdAb的蛋白酶抗性多肽的 方法。該方法包括提供一組包含dAb的多肽；在適于蛋白酶活性的條件下將肽或多肽組與 蛋白酶（例如，胰蛋白酶、彈性蛋白酶、leucozyme)混合；并回收多個包含具有TNFRl結(jié)合 特異性的dAb的多肽。該方法可以用于產(chǎn)生天然組，或偏向所需結(jié)合活性的組，如基于具有 TNFRl結(jié)合特異性的親本dAb的親和性突變組。
[0214] 多肽展示系統(tǒng)
[0215] 在一個實施方案中，提供用于本文所述方法中的肽或多肽的組或文庫包含合適的 展示系統(tǒng)。該展示系統(tǒng)可以抵抗蛋白酶的降解（例如，單種蛋白酶或蛋白酶的組合，以及含 有蛋白水解活性的任何生物提取物、勻漿或制劑（例如，痰液、粘液（例如，胃粘液、鼻粘液、 支氣管粘液）、支氣管灌洗、肺勻漿、肺提取物、胰腺提取物、胃液、唾液、眼淚等））。在一個 實施方案中，展示系統(tǒng)以及展示系統(tǒng)與所展示肽之間的聯(lián)系至少抵抗蛋白酶能與組中最穩(wěn) 定的肽或多肽那樣。這使得可以容易地分離和/或擴增編碼選定的展示多肽的核酸。
[0216] 在一個實施例中，可以從溶液中或共價或非共價連接合適表面（如塑料或玻璃 (例如，微滴定平板、多肽陣列，如微陣列））的一組肽或多肽中選擇、分離和/或回收蛋白 酶抗性肽或多肽，例如dAb。例如，可以使用在表面上的肽陣列，其排列方式使每個不同的 文庫成員（例如，獨特的肽序列）處于陣列中分開的、預(yù)定的位置?？梢酝ㄟ^陣列中的空間 位置來決定該陣列中每個文庫成員的身份?？梢詼y定在目標(biāo)配體與例如反應(yīng)性文庫成員之 間發(fā)生結(jié)合作用的陣列中的位置，因此基于空間位置來鑒定反應(yīng)性成員的序列。（參見，例 如，U. S.專利 No. 5, 143, 854, W090/15070 和 W092/10092)。
[0217] 在一個實施方案中，該方法使用連接核酸的編碼功能和該核酸編碼的多肽的物 理、化學(xué)和/或功能性特征的展示系統(tǒng)。這樣的展示系統(tǒng)可以包括多個可復(fù)制的遺傳包，如 噬菌體或細(xì)胞（細(xì)菌）。在一個實施方案中，展示系統(tǒng)包括文庫，如細(xì)菌噬菌體展示文庫。
[0218] 已經(jīng)描述了各種合適的細(xì)菌噬菌體展示系統(tǒng)（例如，多價展示和多價展示系統(tǒng)）。 (參見，例如，Griffiths等，U.S.專利No. 6, 555, 313B1 (在此引入作為參考）Johnson等， 。5.專利此.5,733,743(在此引入作為參考）以(^3€€6竹7等，。5.專利此.5,969，108(在 此引入作為參考）以1111丨 8&11-1^11〇6，。5.專利此.5,702,892(在此引入作為參考）； Winter, G.等，Annu. Rev. Immunol. 12 :433-455(1994) ； Soumi 11 ion P.等，Appl. Biochem. Biotechnol. 47(2-3) :175-189(1994) ;Castagonoli，L.等，Comb. Chem. High Throughput Screen，4 (2) :121-133(2001))。細(xì)菌噬菌體展示系統(tǒng)中展示的肽或多肽可以在任何合適的 細(xì)菌噬菌體上展示，如絲狀噬菌體（例如，fd，M 13, F 1)、溶菌噬菌體（例如，T4、T7、λ ) 或RNA噬菌體（例如，MS2)。
[0219] 通常，產(chǎn)生或提供展示一組肽或噬菌體多肽的噬菌體文庫，作為與合適的噬菌體 外殼蛋白（例如，fd pill蛋白）的融合蛋白。融合蛋白可以展不在喔囷體外殼蛋白尖端的 肽或多肽，或如果需要，在內(nèi)部位置。例如，展示的肽或多肽可以存在于pin結(jié)構(gòu)域1的氨 基端的位置。（pin的結(jié)構(gòu)域1也稱為NI)。展示的肽可以直接與pin融合（例如，pin 結(jié)構(gòu)域1的N-端）或使用連接物與pill融合。如果需要，融合體可以進(jìn)一步包括標(biāo)記物 (例如，myc表位、His標(biāo)記物）?？梢允褂萌魏魏线m的方法來產(chǎn)生包括作為與噬菌體外殼蛋 白的融合蛋白展示的一組肽或多肽的文庫，如通過將編碼展示的肽或多肽的噬菌體載體或 噬粒載體的文庫引入合適的宿主細(xì)胞中，并培養(yǎng)所得到的細(xì)菌來產(chǎn)生噬菌體（例如，如果 需要，使用合適的輔助噬菌體或補充質(zhì)粒）。可以使用任何合適的方法從培養(yǎng)物中回收噬菌 體文庫，如沉淀和離心。
[0220] 展示系統(tǒng)可以包含一組含有任何所需量多樣性的肽或多肽。例如，組可以含有具 有對應(yīng)于由生物體、一組生物體（例如，一組分離自Camelid的V hh dAb的序列）、所需組織 或所需細(xì)胞類型表達(dá)的天然產(chǎn)生多肽的氨基酸序列的肽或多肽，或可以含有具有隨機或隨 機化氨基酸序列的肽或多肽。如果需要，多肽可以共有共同的核心或支架。該組或文庫中 的多肽可以包含隨機或隨機化氨基酸序列的限定片段或共同的氨基酸序列的片段。在特定 的實施方案中，組中所有或基本上所有的多肽是所需類型的，如所需的酶（例如，聚合酶） 或所需的抗體的抗原結(jié)合片段（例如，人V h或人')。在實施方案中，多肽展示系統(tǒng)包含一 組多肽，其中每個多肽包含抗體可變域。例如，組中的每個多肽可以含有V H、'或Fv (例如， 單鏈Fv)。
[0221] 可以使用任何合適的方法將氨基酸序列多樣性引入任何所需的肽或多肽或支架 的片段中。例如，可以通過使用任何合適的誘變方法（例如，低保真度PCR、寡核苷酸-介導(dǎo) 的或定向突變、使用NNK密碼子的多樣化）或任何其他合適的方法制備編碼多樣化多肽的 核酸，將氨基酸序列多樣性引入目標(biāo)片段中，如抗體可變域的互補性決定區(qū)或疏水性結(jié)構(gòu) 域。如果需要，可以將待多樣化的多肽片段隨機化。
[0222] 構(gòu)成組的多肽的大小很大程度上是選擇的問題，并且不需要統(tǒng)一的多肽大小。在 一個實施方案中，組中的多肽至少具有三級結(jié)構(gòu)（形成至少一個結(jié)構(gòu)域）。
[0223] 選擇/分離/回收
[0224] 可以使用任何合適的方法從組或文庫（例如，在展示系統(tǒng)中）中選擇、分離和/或 回收蛋白酶抗性肽或多肽（例如，一群蛋白酶抗性多肽）。在一個實施方案中，基于可選擇 的特征（例如，物理特征、化學(xué)特征、功能性特征）來選擇或分離蛋白酶抗性多肽。合適的可 選擇的功能性特征包括組中肽或多肽的生物活性，例如，結(jié)合通用配體（例如，超抗原）、結(jié) 合目標(biāo)配體（例如，抗原、表位、底物）、結(jié)合抗體（例如，通過肽或多肽上表達(dá)的表位）或催 化活性。（參見，例如，Tomlinson 等，W099/20749 ;W001/57065 ;W099/58655)。在一個實施 方案中，選擇是基于與TNFRl的特異性選擇。在另一個實施方案中，選擇是基于能產(chǎn)生其 中成員是蛋白酶抗性的第二組的選定功能性特征，接著從第二組中選擇特異性結(jié)合TNFRl 的成員。
[0225] 在一些實施方案中，從其中基本上所有蛋白酶抗性肽或多肽共有共同的可選擇特 征的文庫或組中選擇和/或分離蛋白酶抗性肽或多肽。例如，可以從其中基本上所有蛋白 酶抗性肽或多肽結(jié)合共同的通用配體、結(jié)合共同的目標(biāo)配體、結(jié)合共同的抗體（或由其結(jié) 合）或具有共同的催化活性的文庫或組中選擇蛋白酶抗性肽或多肽。這種類型的選擇對于 基于具有所需生物活性的親本肽或多肽來制備一組蛋白酶抗性肽或多肽特別有用，例如， 進(jìn)行免疫球蛋白單可變域的親和性突變時。
[0226] 基于結(jié)合共同的通用配體的選擇可以產(chǎn)生含有為原始庫或組成分的全部或基本 上全部蛋白酶抗性肽或多肽的肽或多肽的集合或群體。例如，可以通過淘選或使用合適的 親和性基質(zhì)來選擇、分離和/或回收結(jié)合目標(biāo)配體或通用配體（如，蛋白A、蛋白L或抗體） 的肽或多肽?？梢酝ㄟ^將配體（例如，通用配體、目標(biāo)配體）溶液加入合適的容器中（例如， 試管、培養(yǎng)皿）并使配體沉積或覆蓋在容器壁上來完成淘選。將過量的配體洗掉并將肽或 多肽（例如，已經(jīng)用蛋白酶溫育過的組）加入容器中，并將容器維持在適于肽或多肽結(jié)合固 定化配體的條件下。將未結(jié)合的肽或多肽洗掉，使用任何合適的方法（如刮下（scraping) 或降低pH)來回收結(jié)合的肽或多肽。
[0227] 合適的配體親和性基質(zhì)通常含有固體支持物或珠子（例如，瓊脂糖），配體與其共 價或非共價連接?？梢允褂梅峙椒ā⒅椒ɑ蛉魏纹渌线m的方法，在適于肽或多肽與基 質(zhì)上的配體結(jié)合的條件下，將親和性基質(zhì)與肽或多肽（例如，已經(jīng)用蛋白酶溫育過的組）混 合。可以將沒有結(jié)合親和性基質(zhì)的肽或多肽洗掉，并使用任何合適的方法將結(jié)合的肽或多 肽洗脫并回收，例如用較低PH的緩沖液、用溫和的去污劑（例如，脲）或競爭與配體結(jié)合的 肽來洗脫。在一個實施例中，在適于組中的肽或多肽結(jié)合目標(biāo)配體（TNFRl)的條件下，將生 物素化的目標(biāo)配體與組混合。使用固定化的抗生物素蛋白或抗生物素蛋白鏈菌素（例如， 在珠子上）來回收結(jié)合的肽或多肽，
[0228] 在一些實施方案中，通用配體是抗體或其表位。結(jié)合文庫或組的肽或多肽中基本 上保守的肽或多肽的結(jié)構(gòu)特征的抗體或抗原結(jié)合片段作為通用配體是特別有用的。對于 分離、選擇和/或回收蛋白酶抗性肽或多肽而適宜用作配體的抗體和抗原結(jié)合片段可以是 單克隆或多克隆的，并可以使用任何合適的方法來制備。
[0229] 文庫/組
[0230] 在其他方面中，提供了蛋白酶抗性肽和多肽的組、編碼蛋白酶抗性肽和多肽的文 庫以及產(chǎn)生該文庫和組的方法。
[0231] 可以使用任何合適的方法制備或獲得編碼和/或含有蛋白酶抗性肽和多肽的文 庫?？梢曰谀繕?biāo)肽或多肽（例如，選自文庫的抗-TNFRl肽或多肽）將文庫設(shè)計來編碼蛋 白酶抗性肽或多肽，或可以使用本文所述的方法選自另一個文庫。例如，可以使用合適的多 肽展示系統(tǒng)來制備富含蛋白酶抗性多肽的文庫。
[0232] 在一個實施例中，如本文所述的，在適于蛋白酶活性的條件下，將含有一組展示多 肽的噬菌體展示文庫與蛋白酶混合，該展示多肽含有免疫球蛋白單可變域（例如，VH、Vk、 νλ)。基于所需的生物活性，如結(jié)合活性（例如，結(jié)合通用配體，結(jié)合目標(biāo)配體），來回收蛋 白酶抗性多肽，由此產(chǎn)生富含蛋白酶抗性多肽的噬菌體展示文庫。在一個實施方案中，回 收是基于結(jié)合通用配體，以產(chǎn)生富集文庫，接著基于與TNFRl的特異性結(jié)合來選擇文庫的 抗-TNFRl成員。
[0233] 在另一個實施例中，首先篩選包含一組展示肽的噬菌體文庫來鑒定對所需目標(biāo)抗 原（例如，TNFR1)具有結(jié)合特異性的組成員，該展示多肽含有免疫球蛋白單可變域（例如， VH、Vk、V λ)?；厥站哂兴杞Y(jié)合特異性的多肽集合，并如本文所述的，在適于蛋白水解活性 的條件下，將集合與蛋白酶混合?；厥站哂兴枘繕?biāo)結(jié)合特異性的蛋白酶抗性多肽的集合， 產(chǎn)生富含蛋白酶抗性和高親和性多肽的文庫。如本文所述的，在一個實施方案中，該選擇方 法中的蛋白酶抗性與高親和性結(jié)合相關(guān)。
[0234] 可以使用任何合適的方法容易地產(chǎn)生編碼所需類型多肽組的文庫。例如，可以獲 得編碼所需類型多肽（例如，聚合酶、免疫球蛋白可變域）的核酸序列，并可以制備每個含 有一個或更多個突變的核酸的集合，例如通過使用易出錯聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR)系統(tǒng)來擴 增核酸，通過化學(xué)誘變（Deng等，J. Biol. Chem. 269:9533(1994))或使用細(xì)菌突變體菌株 (Low 等，J. Mol. Biol.，260 :359 (1996))。
[0235] 在其他實施方案中，為了多樣化，可以靶向核酸的特定片段。突變選定位置的方 法也是本領(lǐng)域公知的，并包括，例如，使用錯配的寡核苷酸或簡并的寡核苷酸，使用或不使 用PCR。例如，已經(jīng)通過將突變靶向抗原結(jié)合環(huán)形成了合成的抗體文庫。已經(jīng)將隨機或半 隨機抗體H3和L3片段添加至種系免疫球蛋白V基因片段，以產(chǎn)生具有未突變框架片段的 大文庫（Hoogenboom 和 Winter (1992)上文；Nissim 等（1994)上文；Griffiths 等（1994) 上文；DeKruif等（1995)上文）。將這樣的多樣化延伸來包括一些或全部其他抗原結(jié)合環(huán) (Crameri 等（1996)Nature Med. 2 : 100 ;Riechmann 等（1995)Bio/Technology，13:475; Morphosys，W097/08320,上文）。在其他實施方案中，對于多樣化，可以靶向核酸的特定片 段，例如，通過兩步PCR策略，使用第一 PCR的產(chǎn)物作為"mega-引物"。（參見，例如，Landt， 0.等，Gene 96:125-128(1990))。例如，還可以通過SOE PCR來完成靶向多樣化。（參見， 例如，Horton，R.M.等，Gene 77:61-68(1989))。
[0236] 可以通過改變編碼序列來獲得選定位置的序列多樣性，編碼序列限定了多肽的序 列，使得可以在該位置引入各種可能的氨基酸（例如，全部的20個或其子集）。使用IUPAC 命名，最通用的密碼子是NNK，其編碼所有氨基酸以及TAG終止密碼子。可以使用NNK密碼 子，以引入所需的多樣性。實現(xiàn)相同目的的其他密碼子也是有用的，包括NNN密碼子，其導(dǎo) 致其他終止密碼子TGA和TAA的產(chǎn)生。這樣的靶向方法使得可以在目標(biāo)區(qū)域中開發(fā)所有的 序列空間。
[0237] 文庫可以包含具有已知主鏈構(gòu)象的蛋白酶抗性抗體多肽。（參見，例如，Tomlinson 等，TO99/20749)。
[0238] 可以在合適的質(zhì)?；蜉d體中制備文庫。如在此所用的，載體指的是用于將異源DNA 引入用于表達(dá)和/或其復(fù)制的細(xì)胞中的離散序列?？梢允褂萌魏魏线m的載體，包括質(zhì)粒（例 如，細(xì)菌質(zhì)粒）、病毒或細(xì)菌噬菌體載體、人造染色體和游離基因載體。這樣的載體可以用于 簡單克隆和誘變，或表達(dá)載體可以用于驅(qū)動文庫的表達(dá)。載體和質(zhì)粒通常含有一個或更多 個克隆位點（例如，多連接物）、復(fù)制起點和至少一個可選擇的標(biāo)記基因。表達(dá)載體可以進(jìn) 一步含有用于驅(qū)動多肽轉(zhuǎn)錄和翻譯的元件，如增強子元件、啟動子、轉(zhuǎn)錄終止細(xì)胞、信號序 列等。可以以可操作地連接克隆的編碼多肽的插入片段的方式來安置這些元件，使得在適 于表達(dá)的條件下（例如，在合適的宿主細(xì)胞中）維持該表達(dá)載體時，表達(dá)和產(chǎn)生多肽。
[0239] 克隆和表達(dá)載體通常含有能夠使載體在一個或更多個選定的宿主細(xì)胞中復(fù)制的 核酸序列。通常，在克隆載體中，該序列能夠使載體獨立于宿主染色體DNA而復(fù)制，并包括 復(fù)制起點或自主復(fù)制序列。對于各種細(xì)菌、酵母和病毒，這樣的序列是公知的。來自質(zhì)粒 PBR322的復(fù)制起點適用于大部分革蘭氏陰性細(xì)菌，2微米質(zhì)粒來源適用于酵母，而各種病 毒來源（例如，SV40,腺病毒）適用于在哺乳動物細(xì)胞中克隆載體。通常，對于哺乳動物表達(dá) 載體是不需要復(fù)制起點的，除非將這些用于能夠復(fù)制高水平DNA的哺乳動物細(xì)胞中，如COS 細(xì)胞。
[0240] 克隆或表達(dá)載體可以含有也稱為選擇標(biāo)記的選擇基因。這樣的標(biāo)記基因編碼在選 擇性培養(yǎng)基中生長的轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞的存活或生長需要的蛋白質(zhì)。因此，沒有用含有選擇基 因的載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞在培養(yǎng)基中將不會存活。通常的選擇基因編碼給予抗生素和其他 毒素（例如，氨芐青霉素、新霉素、氨甲喋呤或四環(huán)素）抗性、補充營養(yǎng)缺陷不足或提供生長 培養(yǎng)基中不可獲得的關(guān)鍵營養(yǎng)素的蛋白質(zhì)。
[0241] 合適的表達(dá)載體可以含有各種成分，例如，復(fù)制起點、可選擇標(biāo)記基因、一種或更 多種表達(dá)控制元件，如轉(zhuǎn)錄控制元件（例如，啟動子、增強子、終止子）和/或一種或更多種 翻譯信號、信號序列或前導(dǎo)序列等。表達(dá)控制元件和信號或前導(dǎo)序列如果存在，可以通過載 體或其他來源來提供。例如，克隆的編碼抗體鏈的核酸的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯控制序列可以用 來指導(dǎo)表達(dá)。
[0242] 可以提供啟動子用于所需宿主細(xì)胞中的表達(dá)。啟動子可以是組成型或誘導(dǎo)型的。 例如，啟動子可以可操作地連接編碼抗體、抗體鏈或其一部分的核酸，使得其指導(dǎo)核酸的轉(zhuǎn) 錄。用于原核宿主（例如，用于大腸桿菌的內(nèi)酰胺酶和乳糖啟動子系統(tǒng)、堿性磷酸酶、色 氨酸（trp)啟動子系統(tǒng)、lac、tac、T3、T7啟動子）和真核宿主（例如，猿病毒40早期或晚 期啟動子、勞斯肉瘤病毒長終止重復(fù)啟動子、巨細(xì)胞病毒啟動子、腺病毒晚期啟動子、EG-Ia 啟動子）的各種合適的啟動子是可獲得的。
[0243] 此外，表達(dá)載體通常含有用于選擇攜帶載體的宿主細(xì)胞的選擇標(biāo)記，并且在可復(fù) 制表達(dá)載體的情況中，還含有復(fù)制起點。編碼給予抗生素或藥物抗性的產(chǎn)物的基因是常用 的選擇標(biāo)記，并可以用于原核細(xì)胞（例如，β_內(nèi)酰胺酶基因（氨芐青霉素抗性）、用于四 環(huán)素抗性的Tet基因）和真核細(xì)胞（例如，新霉素（G418或geneticin)、gpt (霉酚酸）、氨 芐青霉素或潮霉素抗性基因）。二氫葉酸還原酶標(biāo)記基因使得可以用氨甲喋呤在各種細(xì)胞 中選擇。編碼宿主營養(yǎng)缺陷標(biāo)記的基因產(chǎn)物的基因（例如，LEU2、URA3、HIS3)通常用作酵 母中的選擇標(biāo)記。還考慮了使用病毒（例如，桿狀病毒）或噬菌體載體和能夠整合至宿主 細(xì)胞基因組的載體，如逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。
[0244] 用于在原核細(xì)胞（例如，細(xì)菌細(xì)胞，如大腸桿菌）或哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)的合適表 達(dá)載體包括，例如，PET 載體（例如，pET-12a、pET-36、pET-37、pET-39、pET-40，Novagen 等）、 噬菌體載體（例如，pCANTAB5E，Pharmacia)、pRIT2T(蛋白 A 融合載體，Pharmacia)、pCDM8、 pCDNAl. 1/amp、pcDNA3. 1、pRc/RSV、pEF-1 (Invitrogen，Carlsbad，CA)、pCMV-SCRIPT、 pFB、pSG5、pXTl (Stratagene, La Jolla, CA)、pCDEF3 (Goldman, L. A.等，Biotechniques, 21 :1013-1015 (1996))、pSVSP0RT(GibcoBRL，Rockville，MD)、pEF-Bos (Mizushima，S.等， Nucleic Acids Res.，18 :5322(1990))等。適用于各種表達(dá)宿主如原核細(xì)胞（大腸桿菌）、 昆蟲細(xì)胞（果蠅Schnideer S2細(xì)胞，Sf9)、酵母（P. methanolica、巴斯德畢赤酵母、釀酒酵 母（S. cerevisiae))和哺乳動物細(xì)胞（例如，COS細(xì)胞）中的表達(dá)載體是可獲得的。
[0245] 載體的實例是能夠表達(dá)對應(yīng)于多肽文庫成員的核苷酸序列的表達(dá)載體。因此，可 以通過分開的繁殖和表達(dá)多肽文庫成員的單克隆的表達(dá)來進(jìn)行使用通用配體和/或目標(biāo) 配體的選擇。如以上所述的，選擇展示系統(tǒng)可以是細(xì)菌噬菌體展示。因此，可以使用噬菌體 或噬粒載體。實例載體是具有大腸桿菌復(fù)制起點（用于雙鏈復(fù)制）以及噬菌體復(fù)制起點 (用于生產(chǎn)單鏈DNA)的噬粒載體。這些載體的操縱和表達(dá)是本領(lǐng)域公知的（Hoogenboom 和Winter (1992)上文；Nissim等（1994)上文）。簡而言之，載體可以含有給予噬粒上選擇 性的β-內(nèi)酰胺酶基因和表達(dá)盒的Iac啟動子上游，該表達(dá)盒含有合適前導(dǎo)序列、多克隆位 點、一個或更多個肽標(biāo)記物、一個或更多個TAG終止密碼子和噬菌體蛋白pill。因此，使用 各種抑制劑和大腸桿菌的非抑制劑菌株并添加葡萄糖、異丙基硫-β -D-半乳糖苷（IPTG) 或輔助噬菌體如VCS Μ13,載體能夠作為沒有表達(dá)的質(zhì)粒復(fù)制，只產(chǎn)生大量多肽文庫成員或 產(chǎn)物噬菌體，其中一些在其表面上含有多肽-PlII融合體的至少一個拷貝。
[0246] 本文所述的文庫和組可以含有抗體形式。例如，文庫和組內(nèi)包含的多肽可以是完 整的分開的V h或 '結(jié)構(gòu)域，其中任一個是修飾的或未修飾的?？梢允褂萌魏魏线m的方法， 容易地產(chǎn)生scFv片段，以及其他抗體多肽。各種合適的抗體工程化方法是本領(lǐng)域公知的。 例如，可以通過將編碼兩個可變域的核酸連接合適的編碼合適的連接肽的寡核苷酸來形 成scFv,連接肽如（Gly-Gly-Gly-Gly-Ser) 3或其他合適的連接肽。連接物橋接第一 V區(qū) 的C-端和第二V區(qū)的N-端。可以使用相似的技術(shù)，用于構(gòu)建其他抗體形式，如Fv、Fab和 F (ab) 2片段。為了使Fab和F (ab) 2格式化，可以將Vh和\多肽與恒定域片段混合，恒定域 片段分離自重排基因、種系C基因或從抗體序列庫合成的。本文所述的文庫或組可以使V h 或'，文庫或組。
[0247] 包含蛋白酶抗性可變域的多肽可以含有目標(biāo)配體（例如，TNFR1)結(jié)合位點和通用 配體結(jié)合位點。在特定的實施方案中，通用配體結(jié)合位點是用于超抗原（如蛋白A、蛋白L 或蛋白G)的結(jié)合位點?？勺冇蚩梢曰谌魏嗡璧目勺冇?，例如，人VH(例如，VHla、VHlb、 ￥ 112、￥113、￥114、￥115、￥116)、人￥入（例如，￥入1、￥入11、￥入111、￥入1￥、￥入￥、￥入￥1或￥1〇)或 人 Vk (例如，Vk 2, Vk 3, Vk 4, Vk 5, Vk 6, Vk 7, Vk 8, Vk 9 或 Vk 10)或 Camelid VHH，任 選已經(jīng)人源化。
[0248] 核酸、宿主細(xì)胞和生產(chǎn)蛋白酶抗性多肽的方法
[0249] 本發(fā)明涉及分離的和/或重組的編碼蛋白酶抗性肽或多肽的核酸，例如，通過本 文所述的方法可選擇或已選擇的肽或多肽。
[0250] 在此稱為"分離的"核酸是已經(jīng)與原始環(huán)境（例如，在細(xì)胞或在核酸混合物如文庫 中）中的其他物質(zhì)（例如，其他核酸，如基因組DNA、cDNA和/或RNA)分開的核酸。分離的 核酸可以作為載體（例如，質(zhì)粒）的一部分來分離。
[0251] 在此稱為"重組的"核酸是通過重組DNA方法產(chǎn)生的核酸，重組DNA方法包括依賴 于人工重組的方法，如克隆至載體或染色體中，例如，使用限制酶、同源重組、病毒等，以及 使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR)制備的核酸。
[0252] 本發(fā)明還涉及重組宿主細(xì)胞，其包括（一個或更多個）重組核酸或含有編碼蛋白 酶抗性肽或多肽的核酸的表達(dá)構(gòu)建體，例如，通過本文所述的方法可選擇的或已選擇的肽 或多肽。還提供了制備蛋白酶抗性肽或多肽的方法，其包括在適于蛋白酶抗性肽或多肽表 達(dá)的條件下，維持本發(fā)明的宿主細(xì)胞。如果需要，該方法可以進(jìn)一步包括分離或回收蛋白酶 抗性肽或多肽的步驟。
[0253] 例如，可以使用任何適于選定宿主細(xì)胞的方法（例如，轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、電穿孔、感染）， 將編碼蛋白酶抗性肽或多肽的核酸分子（例如，一個或更多個核酸分子），或含有該核酸分 子的表達(dá)構(gòu)建體（一個或更多個構(gòu)建體）引入合適的宿主細(xì)胞中，以形成重組宿主細(xì)胞，使 得核酸分子可操作地連接一個或更多個表達(dá)控制元件（例如，在載體中、在通過細(xì)胞中的 加工形成的構(gòu)建體中、整合至宿主細(xì)胞基因組）。在適于表達(dá)的條件下（例如，在誘導(dǎo)劑的 存在下、在合適的動物中、在補充了適當(dāng)鹽、生長因子、抗生素、營養(yǎng)補充劑的合適培養(yǎng)基中 等），維持所得到的重組宿主細(xì)胞，由此產(chǎn)生編碼的肽或多肽。如果需要，可以分離或回收編 碼的肽或多肽（例如，從動物、宿主細(xì)胞、培養(yǎng)基、乳）。該方法包括在轉(zhuǎn)基因動物的宿主細(xì) 胞中的表達(dá)（參見，例如，W092/03918, GenPharm International)。
[0254] 還可以在合適的體外表達(dá)系統(tǒng)中，通過化學(xué)合成或通過任何其他合適的方法，來 產(chǎn)生通過本文所述的方法選擇的蛋白酶抗性肽或多肽。因此，本發(fā)明提供了蛋白酶抗性肽 和多肽。
[0255] 多肽、dAb&拮抗劑
[0256] 如本文所述和舉例說明的，本發(fā)明的蛋白酶抗性dAb通常以高親和性結(jié)合它們的 目標(biāo)配體。因此，在另一個方面中，提供了選擇、分離和/或回收本發(fā)明的以高親和性結(jié)合 TNFRl的多肽或dAb。通常，該方法包括提供肽或多肽（例如，dAb)的文庫或組，在適于蛋 白酶活性的條件下，將文庫或組與蛋白酶（例如，胰蛋白酶、彈性蛋白酶、leucozyme、胰酶、 痰液）混合，并選擇、分離和/或回收結(jié)合配體（例如，目標(biāo)配體）的肽或多肽。因為已經(jīng) 在蛋白酶敏感性肽或多肽將得到消化的條件下將文庫或組暴露于蛋白酶，因此蛋白酶的活 性可以消除具有低結(jié)合親和性的不太穩(wěn)定的多肽，并因此產(chǎn)生高親和性結(jié)合肽或多肽的集 合。
[0257] 例如，本發(fā)明的多肽或dAb可以以1 μ m或更強，或大約500nM?0. 5pM的親和性 (KD ;KD = Ukd)/Km(ka)，如通過表面等離子共振所測定的）來結(jié)合TNFR1。例如，本發(fā)明 的多肽或dAb能夠以大約500nM、大約ΙΟΟηΜ、大約10nM、大約InM、大約500pM、大約ΙΟΟρΜ、 大約10pM、大約IpM或大約0· 5pM的親和力結(jié)合TNFR1。
[0258] 盡管我們沒有受到任何特定理論的束縛，認(rèn)為能抵抗蛋白酶的肽或多肽具有較低 的熵和/或較高的穩(wěn)定能量。因此，蛋白酶抗性與高親和性結(jié)合之間的關(guān)聯(lián)可能與通過本 文所述的方法選擇的肽和多肽和dAb表面的緊密性和穩(wěn)定性相關(guān)。
[0259] 在一個實施方案中，本發(fā)明的多肽、dAb或拮抗劑抑制TNFa與TNFa受體I (P55 受體）的結(jié)合，其具有為大約500nM?50pM，或IOOnM?50pM，或IOnM?100pM，或InM? IOOpM ;例如50nM或更小，或5nM或更小，或500pM或更小，或200pM或更小，或IOOpM或更 小的抑制濃度50(IC50)。
[0260] 在特定的實施方案中，多肽、dAb或拮抗劑特異性地結(jié)合TNFR1，例如人TNFR1，并 與人TNFRl分離，具有300nM至IpM的解離常數(shù)（K d)，或300nM至5pM，或50nM至ΙρΜ，或 50nM至5pM，或50nM至20pM，或約IOpM,或約15pM，或約20pM，如通過表面等離子共振所 測定的。在特定的實施方案中，多肽、dAb或拮抗劑特異性地結(jié)合TNFR1，例如人TNFR1，并 與人 TNFRl 分離，具有 5χ1〇? ?IxKT7S-1 或 lxKT3s+lxl(T7s-1 或 IxKT4S-1 ?ΙχΚΓΥ1 或 ΙχΙΟ--IxKT7S4或ΙχΙΟΛΓ1或ΙχΚΓΥ1的1(。"速度常數(shù)，如通過表面等離子共振所測定 的。
[0261] 在特定的實施方案中，多肽、dAb或拮抗劑特異性地結(jié)合TNFR1，例如人TNFR1， 具有 1χ1(Γ3Μ? 至 1χ1(Γ7Μ? 的 Km，或 1χ1(Γ3Μ? 至 1χ1(Γ6Μ?，或約 1χ1(Γ4Μ? 或約 IxKr5M4s'在一個實施方案中，多肽、dAb或拮抗劑特異性地結(jié)合TNFRl，例如人TNFRl，并 與人TNFRl分離，具有在該段落中限定的解離常數(shù)（K d)和Ktjff。在一個實施方案中，多肽、 dAb或拮抗劑特異性地結(jié)合TNFRl，例如人TNFRl，并與人TNFRl分離，具有該段落中限定的 解離常數(shù)（Kd)和K m。在一些實施方案中，多肽或dAb特異性地結(jié)合TNFRl (例如人TNFR1)， 具有該段落中引用的Kd和/或1(。"和/或Km，并包括與DOM lh-131-206的氨基酸序列（顯 示于圖 3 中）為至少或至少約 80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、 98 %或99 %同一性的氨基酸序列。
[0262] 可以在大腸桿菌或畢赤酵母屬種（例如，巴斯德畢赤酵母）中表達(dá)多肽、dAb或拮 抗劑。在一個實施方案中，在大腸桿菌或畢赤酵母屬種（例如，巴斯德畢赤酵母）中表達(dá)時， 以至少約0. 5mg/L的量來分泌配體或dAb單體。盡管，在大腸桿菌或畢赤酵母屬種（例如， 巴斯德畢赤酵母）中表達(dá)時，本文所述的配體和dAb單體是可分泌的，可以使用任何合適的 方法來生產(chǎn)，如合成的化學(xué)方法或沒有使用大腸桿菌或畢赤酵母屬種的生物生產(chǎn)方法。
[0263] 在一些實施方案中，多肽、dAb或拮抗劑不含有Camelid免疫球蛋白可變域，或一 個或更多個框架氨基酸，這些氨基酸對于由Camelid種系抗體基因片段編碼的免疫球蛋白 可變域是獨特的，例如，在位置108、37、44、45和/或47。
[0264] 根據(jù)本發(fā)明的TNFRl的拮抗劑可以是單價的或多價的。在一些實施方案中，拮抗 劑是單價的并含有一個與TNFRl相互作用的結(jié)合位點，該結(jié)合位點是由本發(fā)明的多肽或 dAb提供的。單價拮抗劑結(jié)合一個TNFRl并可以不誘導(dǎo)導(dǎo)致受體和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)激活的細(xì)胞表 面上的TNFRl的交聯(lián)或聚集。
[0265] 在其他實施方案中，TNFRl的拮抗劑是多價的。TNFRl的多價拮抗劑可以含有兩個 或更多個用于TNFRl的特定結(jié)合位點的拷貝或含有兩個或更多個結(jié)合TNFRl的不同結(jié)合位 點，至少一個結(jié)合位點是由本發(fā)明的多肽或dAb提供的。例如，如本文所述的，TNFRl的拮 抗劑可以是二聚體、三聚體或多聚體，其含有兩個或更多個本發(fā)明的結(jié)合TNFRl的特定多 肽或dAb的拷貝，或兩個或更多個本發(fā)明的結(jié)合TNFRl的不同多肽或dAb。在一個實施方案 中，TNFRl的多價拮抗劑在標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞測試中基本上不激動TNFRl (作為TNFRl的激動劑） (艮P，當(dāng)以 ΙηΜ，ΙΟηΜ，ΙΟΟηΜ，1 μ M，10 μ M，100 μ M，1000 μ M 或 5, 000 μ M 的濃度存在時，在測 試中達(dá)到了不超過大約5%的TNFa (l〇〇Pg/ml)誘導(dǎo)的TNFRl-介導(dǎo)的活性）。
[0266] 在特定的實施方案中，TNFRl的多價拮抗劑含有兩個或更多個用于TNFRl所需的 表位或結(jié)構(gòu)域的結(jié)合位點。例如，TNFRl的多價拮抗劑能夠包含兩個或者更多個結(jié)合位點， 其結(jié)合TNFRl的結(jié)構(gòu)域1中的相同的表位。
[0267] 在其他一些實施方案中，TNFRl的多價拮抗劑含有由本發(fā)明的多肽或dAb提供的 兩個或更多個結(jié)合位點，其結(jié)合TNFRl的不同表位或結(jié)構(gòu)域。在一個實施方案中，這些多價 拮抗劑在如W02006038027所描述的標(biāo)準(zhǔn)L929細(xì)胞毒性測試或標(biāo)準(zhǔn)HeLa IL-8測試中以大 約Inm或大約IOnM或大約IOOnM或大約1 μ M或大約10 μ M的濃度存在時不會激動TNFRl。
[0268] TNFRl的其他拮抗劑不會抑制TNF α與TNFRl的結(jié)合。這些配體（和拮抗劑）可以 具有作為診斷劑的實用性，因為它們可以用于結(jié)合并檢測、定量或測量樣品中的TNFR1，并 且不會與樣品中的TNF競爭與TNFRl的結(jié)合。因此，可以準(zhǔn)確地測定樣品中是否存在TNFRl 或存在多少TNFRl。
[0269] 在其他實施方案中，多肽、dAb或拮抗劑特異性地結(jié)合TNFRl，具有本文所述的KD， 并抑制了標(biāo)準(zhǔn)小鼠 LPS/D-半乳糖胺誘導(dǎo)的敗血病性休克模型中的致死率（例如，與合適對 照相比，防止致死性或降低了至少約10 %的致死率）。在一個實施方案中，以約5mg/kg或 更多，例如，約lmg/kg給藥時，與標(biāo)準(zhǔn)小鼠 LPS/D-半乳糖胺誘導(dǎo)的敗血病性休克模型中的 合適對照相比，多肽、dAb或拮抗劑抑制至少約10%或至少約25%或至少約50%的致死率。
[0270] 在其他實施方案中，多肽、dAb或拮抗劑結(jié)合TNFRl并在標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞測試中拮抗 TNFRl介導(dǎo)的活性，具有彡IOOnM的ND5tl，并且以< 10 μ M的濃度，dAb在測試中激動< 5% 的TNFRl的活性。
[0271] 在特定的實施方案中，多肽、dAb或拮抗劑在標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞測試中基本上不激動 TNFRl (作為 TNFRl 的激動劑）（（SP，當(dāng)以 1ηΜ，10ηΜ，100ηΜ，1μΜ，10μΜ，100μΜ，1000μΜ 或5,000μΜ的濃度存在時，在測試中達(dá)到了不超過大約5%的TNFa (l〇〇Pg/ml)誘導(dǎo)的 TNFRl-介導(dǎo)的活性）。
[0272] 在特定的實施方案中，給予有效量時，本發(fā)明的多肽、dAb或拮抗劑在慢性炎癥疾 病模型中是有效的。通常，有效量為約lmg/kg至約10mg/kg(例如，約lmg/kg,約2mg/kg，約 3mg/kg，約 4mg/kg，約 5mg/kg，約 6mg/kg，約 7mg/kg，約 8mg/kg，約 9mg/kg 或約 10mg/kg)。 本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)為慢性炎癥的模型（參見W02006038027中所描述的）預(yù)示著在人體中 的治療功效。
[0273] 在特定的實施方案中，多肽、dAb或拮抗劑在標(biāo)準(zhǔn)小鼠膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎模型中是 有效的（關(guān)于該模型的細(xì)節(jié)參見W02006038027)。例如，給藥有效量的多肽、dAb或拮抗劑 能夠降低在標(biāo)準(zhǔn)小鼠膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎模型中四肢總和的平均關(guān)節(jié)炎評分，例如與適當(dāng)?shù)膶?照相比，降低大約1?大約16,大約3?大約16,大約6?大約16,大約9?大約16,或大 約12?大約16。在另一個例子中，給藥有效量的多肽、dAb或拮抗劑能夠在標(biāo)準(zhǔn)小鼠膠原 誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎模型中延遲關(guān)節(jié)炎癥狀的開始，例如與適當(dāng)?shù)膶φ障啾龋舆t大約1天，大約 2天，大約3天，大約4天，大約5天，大約6天，大約7天，大約10天，大約14天，大約21天 或大約28天。在另一個例子中，給藥有效量的多肽、dAb或拮抗劑能夠在標(biāo)準(zhǔn)小鼠膠原誘 導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎模型中得到〇?大約3,大約3?大約5,大約5?大約7,大約7?大約15,大 約9?大約15,大約10?大約15,大約12?大約15,或大約14?大約15的四肢總和的關(guān) 節(jié)炎評分。
[0274] 在其他實施方案中，多肽，dAb或拮抗劑在小鼠關(guān)節(jié)炎Λ ARE模型中是有效的（關(guān) 于該模型的細(xì)節(jié)參見W02006038027)。例如，給藥有效量的多肽、dAb或拮抗劑能夠在小 鼠關(guān)節(jié)炎AARE模型中降低平均關(guān)節(jié)炎評分，例如與適當(dāng)?shù)膶φ障啾冉档痛蠹s0. 1?大約 2. 5,大約0. 5?大約2. 5,大約1?大約2. 5,大約1. 5?大約2. 5,或大約2?大約2. 5。在 另一個例子中，給藥有效量的多肽、dAb或拮抗劑能夠在小鼠關(guān)節(jié)炎△ ARE模型中延遲關(guān)節(jié) 炎癥狀的開始，例如與與適當(dāng)?shù)膶φ障啾妊舆t大約1天，大約2天，大約3天，大約4天，大 約5天，大約6天，大約7天，大約10天，大約14天，大約21天或大約28天。在另一個例 子中，給藥有效量的多肽、dAb或拮抗劑能夠在小鼠關(guān)節(jié)炎AARE模型中得到0?大約0. 5， 大約0. 5?大約1，大約1?大約1. 5,大約1. 5?大約2,或大約2?大約2. 5的平均關(guān)節(jié) 炎評分。
[0275] 在其他實施方案中，多肽，dAb或拮抗劑在小鼠炎性腸病（IBD) AARE模型中是有 效的（關(guān)于該模型的細(xì)節(jié)參見W02006038027)。例如，給藥有效量的多肽、dAb或拮抗劑能 夠在小鼠 IBD Λ ARE模型中降低急性和/或慢性炎癥評分，例如與適當(dāng)?shù)膶φ障啾冉档痛蠹s 0. 1?大約2. 5,大約0. 5?大約2. 5,大約1?大約2. 5,大約1. 5?大約2. 5,或大約2? 大約2. 5。在另一個例子中，給藥有效量的多肽、dAb或拮抗劑能夠在小鼠 IBD AARE模型中 延遲IBD癥狀的開始，例如，與適當(dāng)?shù)膶φ障啾妊舆t大約1天，大約2天，大約3天，大約4 天，大約5天，大約6天，大約7天，大約10天，大約14天，大約21天或大約28天。在另一 個例子中，給藥有效量的多肽、dAb或拮抗劑在小鼠 IBD AARE模型中得到0?大約0. 5,大 約0. 5?大約1，大約1?大約1. 5,大約1. 5?大約2,或大約2?大約2. 5的平均急性和 /或慢性炎癥評分。
[0276] 在其他實施方案中，多肽，dAb或拮抗劑在小鼠葡聚糖硫酸鈉（DSS)誘導(dǎo)的炎性腸 病模型中是有效的（關(guān)于該模型的細(xì)節(jié)參見W02006038027)。例如，給藥有效量的多肽、dAb 或拮抗劑能夠在小鼠 IBD的DSS模型中降低平均嚴(yán)重程度評分，例如與適當(dāng)?shù)膶φ障啾冉?低大約0. 1?大約2. 5,大約0. 5?大約2. 5,大約1?大約2. 5,大約1. 5?大約2. 5,或大 約2?大約2. 5。在另一個例子中，給藥有效量的多肽、dAb或拮抗劑能夠在小鼠 IBD的DSS 模型中延遲IBD癥狀的開始，例如與適當(dāng)?shù)膶φ障啾妊舆t大約1天，大約2天，大約3天，大 約4天，大約5天，大約6天，大約7天，大約10天，大約14天，大約21天或大約28天。在 另一個例子中，給藥有效量的多肽、dAb或拮抗劑能夠在小鼠 IBD的DSS模型中得到0?大 約0. 5,大約0. 5?大約1，大約1?大約1. 5,大約1. 5?大約2,或大約2?大約2. 5的平 均嚴(yán)重程度評分。
[0277] 在特定的實施方案中，多肽，dAb或拮抗劑在小鼠煙草煙霧慢性梗阻性肺病模型 (COPD)中是有效的（關(guān)于該模型的細(xì)節(jié)，參見W02006038027和W02007049017)。例如，與 適當(dāng)?shù)膶φ障啾?，給藥有效量的配體能夠降低COPD癥狀或延遲COPD癥狀的開始。
[0278] 可以獲得一些動物模型系統(tǒng)，其能夠用于篩選TNFRl的拮抗劑（例如其配體、抗體 或結(jié)合蛋白）在保護(hù)抵抗或治療疾病中的效率。用于在易感性小鼠中測試系統(tǒng)性紅斑狼瘡 (SLE)的方法是本領(lǐng)域中已知的（Knight et al. (1978) J. Exp. Med.，147 :1653 ;Reinersten et al.(1978)New Eng.J.Med.，299:515)。在 SJL/J 雌性小鼠中測試重癥肌無力（MG), 其通過利用來自另一物種的可溶性AchR蛋白誘導(dǎo)該疾病（Lindstrom et al.(1988)Adv. Immunol.，42 :233)。關(guān)節(jié)炎是在小鼠的易感株中通過注射II型膠原而誘導(dǎo)的（Stuart et al. (1984)Ann. Rev. Immunol.，42 :233)。在易感大鼠中通過注射分枝桿菌熱休克蛋白而誘 導(dǎo)佐劑關(guān)節(jié)炎的模型已經(jīng)被描述（Van Eden et al.(1988)Nature，331:171)。甲狀腺炎 是在小鼠中根據(jù)所描述的通過給藥甲狀腺球蛋白而誘導(dǎo)的（Maron et al. (1980)J.Exp. Med. ,152:1115)。胰島素依賴性糖尿病（IDDM)是自然出現(xiàn)的，或者可以在某些小鼠株中 根據(jù)Kanasawa et al. (1984)Diabetologia，27 :113.所描述的那些進(jìn)行誘導(dǎo)。在小鼠和大 鼠中EAE作為人中MS的模型。在該模型中，去髓鞘疾病是通過給藥髓鞘堿性蛋白而誘導(dǎo)的 (參見Paterson (1986) Textbook of Immunopathology,Mischer et al. , eds. , Grune and Stratton, New York, ρρ· 179-213 ;McFarlin et al. (1973) Science, 179 :478 :and Satoh et al. (1987)J. Tmmunol.，138 :179)。
[0279] 通常，本發(fā)明的配體（例如，拮抗劑）將以純化的形式與藥物學(xué)上合適的載體一起 使用。通常，這些載體包括水或醇/水溶液、乳液或懸浮液、任何包括鹽和/或緩沖的基質(zhì)。 非腸道載體包括氯化鈉溶液、Ringer's葡萄糖、葡萄糖和氯化鈉和乳酸化Ringer's。如果 需要在懸浮液中保持多肽復(fù)合物，合適的生理學(xué)上可接受的佐劑可以選自增稠劑，如羧甲 基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、明膠和海藻酸鹽。
[0280] 靜脈內(nèi)載體包括流體和營養(yǎng)補充劑和電解質(zhì)補充劑，如基于Ringer' s葡萄糖 的那些。防腐劑和其他添加劑，如抗微生物劑、抗氧化劑、螯合劑和惰性氣體，也可以存在 (Mack(1982)Remington's Pharmaceutical Sciences，第 16版）?？梢允褂酶鞣N合適的制 齊U，包括緩釋制劑。
[0281] 本發(fā)明的配體（例如，拮抗劑）可以用作分開給藥的組合物或結(jié)合其他藥劑。這些 包括各種免疫治療藥物，如環(huán)孢霉素、氨甲喋呤、阿霉素或順鉬和免疫毒素。藥物組合物可 以包括各種細(xì)胞毒性或其他藥劑與本發(fā)明配體結(jié)合的"組合藥劑（cocktails) "，或甚至是 根據(jù)本發(fā)明的具有不同特異性的配體的組合物，如使用不同目標(biāo)抗原或表位選擇的配體， 不管是否是在給藥之前混合。
[0282] 根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物的給藥途徑可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的那些。對于治 療，包括但不限于免疫治療，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)將本發(fā)明選定的配體給藥于任何患者。
[0283] 給藥可以是任何合適的模式，包括非腸道、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、經(jīng)皮、通過肺的 途徑，或者其他，合適地，通過用導(dǎo)管直接灌輸。給藥的劑量和頻率將取決于患者的年齡、性 別和狀況、其他藥物的同時給藥、禁忌和醫(yī)師將要考慮的其他參數(shù)。如所示的，給藥可以是 局部（例如，通過肺部給藥局部遞送至肺，例如，鼻內(nèi)給藥）或全身的。
[0284] 可以將本發(fā)明的配體凍干，用于存儲以及在使用前在合適的載體中重建。已經(jīng)表 明該技術(shù)對常規(guī)的免疫球蛋白是有效的，并可以使用本領(lǐng)域已知的凍干和重建技術(shù)。本領(lǐng) 域技術(shù)人員將認(rèn)識到凍干和重建可能導(dǎo)致抗體活性不同程度的損耗（例如，使用常規(guī)的免 疫球蛋白，IgM抗體的活性損耗易于比IgG抗體高），可以調(diào)節(jié)使用水平來補償。
[0285] 可以將含有本發(fā)明配體（例如，拮抗劑）或其混合物的組合物給藥來用于預(yù)防和/ 或治療處理。在特定的治療應(yīng)用中，將實現(xiàn)選定細(xì)胞群的至少部分抑制、遏制、調(diào)節(jié)、殺滅或 一些其他可測量參數(shù)的適當(dāng)含量定義為"治療有效量"。實現(xiàn)該劑量需要的含量將取決于疾 病的嚴(yán)重程度和患者自身免疫系統(tǒng)的一般狀況，但通常為0. 005至5. Omg配體/kg體重,配 體例如為dAb或拮抗劑，更常使用0. 05至2. Omg/kg/劑的劑量。對于預(yù)防性應(yīng)用，可以給 藥相似或略低劑量的含有本發(fā)明配體或其混合物的組合物，以預(yù)防、抑制或延遲疾病的發(fā) 作（例如，維持緩解或靜止，或防止急性期）。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠測定治療、抑制或預(yù)防疾 病的合適給藥間隔。將TNFRl的配體（例如，拮抗劑）給藥來治療、抑制或預(yù)防慢性炎癥疾 病時，可以給藥高達(dá)四次/天，每周兩次，每周一次，每兩周一次，一月一次或每兩月一次， 例如，劑量為約 10 μ g/kg 至約 80mg/kg，約 100 μ g/kg 至約 80mg/kg，約 lmg/kg 至約 80mg/ kg,約 lmg/kg 至約 70mg/kg，約 lmg/kg 至約 60mg/kg，約 lmg/kg 至約 50mg/kg，約 lmg/kg 至約 40mg/kg，約 lmg/kg 至約 30mg/kg，約 lmg/kg 至約 20mg/kg，約 lmg/kg 至約 10mg/kg， 約 10 μ g/kg 至約 10mg/kg，約 10 μ g/kg 至約 5mg/kg，約 10 μ g/kg 至約 2. 5mg/kg，約 lmg/ kg,約 2mg/kg，約 3mg/kg，約 4mg/kg，約 5mg/kg，約 6mg/kg，約 7mg/kg，約 8mg/kg，約 9mg/kg 或約10mg/kg。在特定的實施方案中，將TNFRl的配體（例如，拮抗劑）給藥來治療、抑制 或防止慢性炎癥疾病，每兩周一次或一月一次，劑量為約1〇μ g/kg至約10mg/kg(例如，約 10 μ g/kg，約 100 μ g/kg，約 lmg/kg,約 2mg/kg，約 3mg/kg，約 4mg/kg，約 5mg/kg，約 6mg/kg, 約 7mg/kg，約 8mg/kg，約 9mg/kg 或約 lOmg/kg)。
[0286] 如果相對于治療前存在的癥狀，或相對于沒有用該組合物治療的個體（人或模型 動物）或其他合適對照中的癥狀，一種或更多種癥狀得到減輕（例如，至少10 %或臨床評價 等級的至少一個點），認(rèn)為使用本文所述的組合物進(jìn)行的處理或治療是"有效的"。癥狀將根 據(jù)靶向的疾病或病癥而明顯不同，但可以通過普通醫(yī)師或技術(shù)人員來測量。例如，可以通 過監(jiān)控疾病或病癥的一個或更多個生化指示劑的水平（例如，酶或與疾病相關(guān)的代謝產(chǎn)物 的水平、受影響細(xì)胞的數(shù)目等）、通過監(jiān)控身體呈現(xiàn)（例如，炎癥、腫瘤大小等），或通過公認(rèn) 臨床評價等級來測量該癥狀-例如擴展運動障礙狀態(tài)量度（對于多發(fā)性硬化）、歐文炎癥性 腸病調(diào)查表（32點評定評價關(guān)于腸功能、系統(tǒng)性癥狀、社會功能和情緒狀態(tài)的生活質(zhì)量-評 分在32到224的范圍內(nèi)，評分越高說明生活質(zhì)量越好）、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎生活質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、或 本領(lǐng)域中已知的其他認(rèn)可的臨床評估標(biāo)準(zhǔn)。在給定的臨床標(biāo)準(zhǔn)上疾病或紊亂癥狀持續(xù)（例 如一天或更多，或更長）降低至少10%或一個或更多個點是有效治療的指標(biāo)。
[0287] 相似地，如果相對于未用組合物治療的相似個體（人或動物模型）中的癥狀，一種 或更多種癥狀的發(fā)作或嚴(yán)重程度得到了延遲、減輕或消除，使用本文所述的組合物進(jìn)行的 預(yù)防是"有效的"。
[0288] 可以在預(yù)防或治療情況中使用含有根據(jù)本發(fā)明的配體（例如，拮抗劑）或其混合 物的組合物，以幫助改變、滅活、殺滅或除去哺乳動物中選定的目標(biāo)細(xì)胞群。此外，本文所述 的選定的多肽組可以離體地或在體外選擇性地從異源細(xì)胞集合中殺滅、耗盡或另外有效地 除去目標(biāo)細(xì)胞群?？梢愿鶕?jù)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，將來自哺乳動物的血液在體外與配體混合，由此殺滅 或另外從用于返回至哺乳動物的血液中除去不利的細(xì)胞。
[0289] 可以在預(yù)防或治療情況中使用含有根據(jù)本發(fā)明的配體（例如，拮抗劑）的組合物， 以幫助改變、滅活、殺滅或除去哺乳動物中選定的目標(biāo)細(xì)胞群。
[0290] 可以將配體（例如，抗-TNFRl拮抗劑、dAb單體）給藥，和或與一種或更多種其他 的治療劑或活性劑一起配制。配體（dAb)與其他的治療劑一起給藥時，可以在給藥其他藥 劑之前、同時或之后，給藥配體。通常，以提供重疊治療效果的方法來給藥配體和其他藥劑。
[0291] 在一個實施方案中，本發(fā)明是用于治療、抑制或預(yù)防慢性炎癥疾病的方法，該方法 包括將治療有效劑量或含量的根據(jù)本發(fā)明的多肽、dAb或TNFRl的拮抗劑給藥于需要的哺 乳動物。
[0292] 在一個實施方案中，本發(fā)明是用于治療、抑制或預(yù)防關(guān)節(jié)炎（例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié) 炎、幼年型類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、強直性脊柱炎、牛皮癬關(guān)節(jié)炎）的方法，其包括為有此需要的 哺乳動物給藥治療有效劑量或量的根據(jù)本發(fā)明的多肽、dAb或TNFRl的拮抗劑。
[0293] 在另一個實施方式中，本發(fā)明是用于治療、抑制或者預(yù)防牛皮癬的方法，其包括為 有此需要的哺乳動物給藥治療有效劑量或者量的根據(jù)本發(fā)明的多肽、dAb或TNFRl的拮抗 劑。
[0294] 在另一個實施方式中，本發(fā)明是用于治療、抑制或者預(yù)防炎性腸病（例如克羅恩 氏病、潰瘍性結(jié)腸炎）的方法，其包括為有此需要的哺乳動物給藥治療有效劑量或者量的 根據(jù)本發(fā)明的多肽、dAb或TNFRl的拮抗劑。
[0295] 在另一個實施方式中，本發(fā)明是用于治療、抑制或者預(yù)防慢性阻塞性肺?。ɡ?慢性支氣管炎、慢性梗阻性支氣管炎、肺氣腫）的方法，其包括為有此需要的哺乳動物給藥 治療有效劑量或者量的根據(jù)本發(fā)明的多肽、dAb或TNFRl的拮抗劑。
[0296] 在另一個實施方式中，本發(fā)明是用于治療、抑制或者預(yù)防肺炎（例如細(xì)菌性肺炎 例如葡萄球菌肺炎）的方法，其包括為有此需要的哺乳動物給藥治療有效劑量或者量的根 據(jù)本發(fā)明的多肽、dAb或TNFRl的拮抗劑。
[0297] 本發(fā)明提供了用于治療、抑制或預(yù)防除了慢性梗阻性肺病和肺炎之外的其他肺病 的方法。根據(jù)本發(fā)明可以治療、抑制或預(yù)防的其他肺病包括例如囊性纖維變性和哮喘（例 如類固醇抗性哮喘）因此，在另一個實施方案中，本發(fā)明是用于治療、抑制或預(yù)防肺病（例 如，囊性纖維變性和哮喘）的方法，其包括將治療有效劑量或含量的根據(jù)本發(fā)明的多肽、 dAb或TNFRl的拮抗劑給藥于需要的哺乳動物。
[0298] 在特定的實施方案中，通過肺部遞送，如通過吸入（例如，支氣管內(nèi)、鼻內(nèi)或口腔 吸入、鼻內(nèi)滴劑）或通過全身性遞送（例如，非腸道、靜脈內(nèi)、粘膜內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下）來給藥 TNFRl的拮抗劑。
[0299] 在另一個實施方案中，本發(fā)明是治療、抑制或預(yù)防敗血性休克的方法，其包括為有 此需要的哺乳動物給藥治療有效劑量或者量的根據(jù)本發(fā)明的多肽、dAb或TNFRl的拮抗劑。 [0300] 在本發(fā)明進(jìn)一步的方面中，提供了組合物，其包含根據(jù)本發(fā)明的多肽、dAb或 TNFRl的拮抗劑和藥物學(xué)上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。
[0301] 此外，本發(fā)明提供了使用根據(jù)本發(fā)明的多肽、dAb或TNFRl的拮抗劑或組合物來治 療疾病的方法。在一個實施方案中，疾病是癌癥或炎癥，例如，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、哮喘或克羅 恩氏病。
[0302] 形式
[0303] 提高的半衰期在免疫球蛋白，特別是抗體，最特別是小尺寸的抗體片段的體內(nèi)應(yīng) 用中是有用的。這樣的片段（Fv、二硫化物鍵合的Fv、Fab、scFv、dAb)能從體內(nèi)快速清除； 因此，盡管它們能夠快速地到達(dá)身體的大部分部位，并且能快速產(chǎn)生和更容易操作，但它們 在體內(nèi)的應(yīng)用受到僅在體內(nèi)短暫持續(xù)的限制。本發(fā)明的一個實施方案通過提供體內(nèi)半衰期 延長的配體并且隨后配體的功能活性在體內(nèi)持續(xù)更長時間來解決了該問題。
[0304] 藥物動力學(xué)分析的方法和配體半衰期的測定是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的?？?以在 Kenneth, A 等：Chemical Stability of Pharmaceuticals ：A Handbook for Pharmacists (藥物動力學(xué)的化學(xué)穩(wěn)定性：藥劑師手冊）和Peters等，Pharmacokinetc analysis :A Phactical Approach(藥物動力學(xué)分析：實踐方法）（1996)中找到詳細(xì)內(nèi)容。 還可以參考"Pharmacokinetics"（藥物動力學(xué)），M Gibaldi&D Perron，Marcel Dekker 出版，第2次再版（1982)，其描述了藥物動力學(xué)參數(shù)，如ta和半衰期和曲線下面積 (AUC)。
[0305] 可以從配體隨時間的血清濃度曲線確定半衰期（t1/2 α和t1/2 β )和AUC。例如，可 以使用 WinNonlin 分析包（從 Pharsight Corp. ,Mountain View，CA94040,USA 獲得）來模 擬曲線。在第一期中（α期），配體主要經(jīng)歷在患者中的分布，并有一些清除。第二期（β 期）是配體已經(jīng)得到分布的末期，血清濃度隨著配體從患者體內(nèi)清除出去而降低。ta半衰 期是第一期的半衰期，而半衰期是第二期的半衰期。因此，在一個實施方案中，本發(fā)明 提供了具有15分鐘或更長ta半衰期的配體或含有根據(jù)本發(fā)明的配體的組合物。在一個 實施方案中，范圍的下限是30分鐘、45分鐘、1小時、2小時、3小時、4小時、5小時、6小時、 7小時、10小時、11小時或12小時。此外，或可替換地，根據(jù)本發(fā)明的配體或組合物將具有 高達(dá)并包括12小時的ta半衰期。在一個實施方案中，范圍的上限是11、1〇、9、8、7、6或5 小時。合適范圍的實例是1至6小時，2至5小時或3至4小時。
[0306] 在一個實施方案中，本發(fā)明提供具有2. 5小時或更長半衰期的配體（多肽、 dAb或拮抗劑）或含有根據(jù)本發(fā)明的配體的組合物。在一個實施方案中，范圍的下限是3 小時，4小時，5小時，6小時，7小時，10小時，11小時或12小時。此外，或可替換地，根據(jù)本 發(fā)明的配體或組合物將具有高達(dá)并包括21天的半衰期。在一個實施方案中，范圍的上 限是12小時，24小時，2天，3天，5天，10天，15天或20天。在一個實施方案中，根據(jù)本發(fā) 明的配體或組合物將具有12至60小時的?β半衰期。在進(jìn)一步的實施方案中，將是12至 48小時。在仍然進(jìn)一步的實施方案中，將是12至26小時。
[0307] 對于以上標(biāo)準(zhǔn)，另外或可替換地，本發(fā)明提供了具有l(wèi)mg.min/ml或更高AUC值 (曲線下面積）的配體或含有根據(jù)本發(fā)明的配體的組合物。在一個實施方案中，范圍的下限 是5、10、15、20、30、100、200或300mg. min/ml。此外，或可替換地，根據(jù)本發(fā)明的配體或組 合物具有高達(dá)600mg.min/ml的AUC。在一個實施方案中，范圍的上限是500、400、300、200、 150、100、75或50mg. min/ml。在一個實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的配體具有選自以下范圍的 AUC :15 至 150mg. min/ml, 15 至 IOOmg. min/ml, 15 至 75mg. min/ml 和 15 至 50mg. mon/ml〇
[0308] 例如，通過連接PEG基團(tuán)、血清白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白受體或至少轉(zhuǎn)鐵蛋白 結(jié)合部分、抗體Fc區(qū)，或通過綴合抗體結(jié)構(gòu)域，將本發(fā)明的多肽和dAb以及含有這些的拮抗 劑格式化，以具有較大的流體動力學(xué)大小。例如，將多肽dAb和拮抗劑格式化成較大的抗體 的抗原結(jié)合片段或抗體（例如，格式化成Fab、Fab '、F (ab) 2、F (ab '）2、I gG、scFv)。
[0309] 可以使用本領(lǐng)域公知的方法來測定本發(fā)明配體（例如，dAb單體或多聚體）的流 體動力學(xué)大小。例如，凝膠過濾色譜可以用來測定配體的流體動力學(xué)大小。用于測定配體 的流體動力學(xué)大小的合適的凝膠過濾基質(zhì)，如交聯(lián)的瓊脂糖基質(zhì)，是公知的并容易獲得。
[0310] 配體形式的大?。ɡ?連接dAb單體的PEG部分的大?。┛梢愿鶕?jù)所需的應(yīng)用 而改變。例如，在打算將配體離開循環(huán)并進(jìn)入外周組織的情況中，希望保持低的配體流體動 力學(xué)大小，以促進(jìn)從血流中外滲?；蛘?，在期望配體在全身循環(huán)中保持更長時間的情況中， 可以提高配體的大小，例如，通過格式化成Ig樣蛋白。
[0311] 通討靶向提高體內(nèi)半衰期的抗原或表位來延長半衰期
[0312] 如本文所述的，還可以通過將本發(fā)明的TNFRl結(jié)合多肽、dAb或拮抗劑綴合或連 接結(jié)合提高體內(nèi)半衰期的抗原或表位的結(jié)合域（例如，抗體或抗體片段）來提高配體的流 體動力學(xué)大小及其血清半衰期。例如，可以將TNFRl結(jié)合劑（例如，多肽）綴合或連接抗-血 清白蛋白或抗-新生兒Fc受體抗體或抗體片段，例如，抗-SA或抗新生兒Fc受體dAb、Fab、 Fab'或scFv,或抗-SA親和體或抗-新生兒Fe受體親和體或抗-SA avimer，或抗-SA結(jié)合 域，其包含選自但優(yōu)選不限于CTLA-4、lipocallin、SpA、親和體、avimer、GroEl和纖連蛋白 的支架（對于這些結(jié)合域的公開內(nèi)容，參見，PCT/GB2008/000453,2008年2月8日申請，在 此將結(jié)合域及其序列引入作為參考，并形成本發(fā)明文本公開內(nèi)容的一部分）。綴合指的是將 含有本發(fā)明的多肽、dAb或拮抗劑的組合物結(jié)合（共價或非共價）結(jié)合血清白蛋白的結(jié)合 域。
[0313] 提高體內(nèi)血清半衰期的合適多肽包括，例如，轉(zhuǎn)鐵蛋白受體特異性配體-神經(jīng)藥 劑融合蛋白（參見，U.S.專利No. 5, 977, 307,在此將其教導(dǎo)引入作為參考）、腦毛細(xì)管內(nèi)皮 細(xì)胞受體、轉(zhuǎn)鐵蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白受體（例如，可溶性轉(zhuǎn)鐵蛋白受體）、胰島素、胰島素樣生長 因子（IGFl)受體、胰島素樣生長因子2 (IGF2)受體、胰島素受體、凝血因子X、α 1-抗胰蛋 白酶和HNFla。合適的提高血清半衰期的多肽還包括α 1-糖蛋白（血清類粘蛋白；AAG)、 a 1-抗凝乳蛋白酶（ACT)、a 1-微球蛋白（蛋白HC ;ΑΜ)、抗凝血酶III (AT III)、阿樸脂 蛋白A-UApo A-1)、阿樸脂蛋白B(Apo B)、血漿銅藍(lán)蛋白（Cp)、補體成分C3(C3)、補體成分 C4(C4)、Cl彈性蛋白酶抑制劑（ClIHN)、C-反應(yīng)性蛋白（CRP)、鐵蛋白（FER)、血液結(jié)合素 (HPX)、脂蛋白（a) (Lp(a))、甘露糖-結(jié)合蛋白（MBP)、肌紅蛋白（Myo)、前清蛋白（甲狀腺素 運載蛋白（transthyretin) ;PAL)、視黃醇-結(jié)合蛋白（RBP)和類風(fēng)濕因子（RF)。
[0314] 來自胞外基質(zhì)的合適蛋白包括，例如，膠原蛋白、昆布氨酸、整聯(lián)蛋白和纖連蛋白。 膠原蛋白是胞外基質(zhì)主要的蛋白。目前已知約15種類型的膠原蛋白，在身體的不同部分 發(fā)現(xiàn)，例如，在骨、皮膚、腱、韌帶、角膜、內(nèi)臟中發(fā)現(xiàn)的I型膠原蛋白（占身體膠原蛋白的 90% )，或在軟骨、椎間盤、脊索和眼睛的玻璃體中發(fā)現(xiàn)的II型膠原蛋白。
[0315] 來自血液的合適蛋白包括，例如，血漿蛋白（例如，纖維蛋白、α-2巨球蛋白、血清 白蛋白、纖維蛋白原（例如，纖維蛋白原Α、纖維蛋白原Β)、血清淀粉狀蛋白Α、結(jié)合珠蛋白、 抑制蛋白、泛素、子宮球蛋白和β-2-微球蛋白）、酶和酶抑制劑（例如，血纖維蛋白溶酶原、 溶菌酶、半胱氨酸蛋白酶抑制劑（cystatin)C、α-1-抗胰蛋白酶和胰腺胰蛋白酶抑制劑）、 免疫系統(tǒng)的蛋白，如免疫球蛋白（例如，IgA、IgD、IgE、IgG、IgM、免疫球蛋白輕鏈（κ/λ))、 轉(zhuǎn)運蛋白（例如，視黃醇結(jié)合蛋白、α-l微球蛋白）、防御素（例如，β-防御素1、嗜中性防 御素1、嗜中性防御素2和嗜中性防御素3)等。
[0316] 在血腦屏障或神經(jīng)組織中發(fā)現(xiàn)的合適蛋白包括，例如，黑皮素受體、髓磷脂、抗壞 血酸轉(zhuǎn)運子等。
[0317] 提高體內(nèi)血清半衰期的合適多肽還包括位于腎臟中的蛋白（例如，polycystin、 IV型膠原蛋白、有機陰離子轉(zhuǎn)運子KU Heymann' s抗原）、位于肝臟中的蛋白（例如，醇脫 氫酶、G250)、位于肺中的蛋白（例如，分泌成分，其結(jié)合IgA)、位于心臟中的蛋白（例如， HSP27,其與擴張型心肌病相關(guān)）、位于皮膚中的蛋白（例如，角蛋白）、骨特異性蛋白，如 骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP)，其是證明了骨形成活性的蛋白的轉(zhuǎn)化生長因子β超家族的子集 (例如，BMP-2、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-7、ΒΜΡ-8)、腫瘤特異性蛋白（例如，滋養(yǎng)層抗原、 here印tin受體、雌激素受體、組織蛋白酶（例如，組織蛋白酶Β，其可以在肝臟和脾臟中找 到）。
[0318] 合適的疾病特異性蛋白包括，例如，只在激活的T-細(xì)胞上表達(dá)的抗原，包括 LAG-3(淋巴細(xì)胞激活基因）、骨保護(hù)素配體（0PGL ;參見Nature 402,304-309(1999))， 0X40(TNF受體家族的成員，在激活的T細(xì)胞上表達(dá)并在人I-型T細(xì)胞白血病病毒 (HTLV-I)-產(chǎn)生細(xì)胞中特異性地上調(diào)；參見Immunol. 165(1) :263-70(2000))。合適的疾病 特異性蛋白還包括，例如，金屬蛋白酶（與關(guān)節(jié)炎/癌癥相關(guān)），包括CG6512果蠅、人截癱蛋 白（paraplegin)、人FtsH、人AFG3L2、鼠 ftsH ;和血管生成生長因子，包括酸性成纖維細(xì)胞 生長因子（FGF-I)、堿性成纖維細(xì)胞生長因子（VEGF/VPF)、轉(zhuǎn)化生長因子-a (TGF α )、腫瘤 壞死因子-a (TNF- α )、血管生成素、白細(xì)胞間介素-3 (IL-3)、白細(xì)胞間介素-8 (IL-8)、血 小板衍生內(nèi)皮生長因子（PD-ECGF)、胎盤生長因子（PlGF)、中期因子（midkine)血小板-衍 生生長因子-BB(H)GF)和 fractalkine。
[0319] 提高體內(nèi)血清半衰期的合適多肽還包括應(yīng)激蛋白，如熱休克蛋白（HSP)。HSP通常 在細(xì)胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)。在胞外發(fā)現(xiàn)時，它是細(xì)胞已經(jīng)死亡并溢出其內(nèi)含物的指示劑。作為創(chuàng)傷、疾 病或損傷的結(jié)果時，發(fā)生這種非程序化細(xì)胞死亡（壞死），胞外HSP引發(fā)了來自免疫系統(tǒng)的 應(yīng)答。結(jié)合胞外HSP可以導(dǎo)致將本發(fā)明的組合物定位于患病部位。
[0320] 涉及Fc轉(zhuǎn)運的合適蛋白包括，例如，Brambell受體（也稱為FcRB)。這種Fc受 體具有兩個功能，對于遞送都是潛在有用的。功能是（1)通過胎盤將IgG從母體轉(zhuǎn)運至子 女，（2)保護(hù)IgG免受降解，由此延長其血清半衰期。認(rèn)為受體使來自核內(nèi)體的IgG再循環(huán)。 (參見，Holliger 等，Nat Biotechnol 15(7) :632-6(1997))。
[0321] 結(jié)合血清白蛋白的dAb
[0322] 在一個實施方案中，本發(fā)明提供了多肽或拮抗劑（例如，雙特異性配體），其含有 結(jié)合TNFRl的抗TNFRldAb (第一 dAb)和結(jié)合血清白蛋白（SA)的第二dAb，第二dAb結(jié)合 SA，具有通過表面等離子共振測定的InM至1、2、3、4、5、10、20、30、40、50、60、70、100、200、 300、400 或 500 μ M(即，χ10_9 至 5xl0_4)的 KD，或 IOOnM 至 ΙΟμΜ，或 1 至 5μΜ，或 3 至 70nM， 或IOnM至1、2、3、4或5μΜ。例如，30至70nM，如通過表面等離子共振所測定的。在一個 實施方案中，第一 dAb (或dAb單體）結(jié)合SA(例如，HSA)，具有通過表面等離共振測定的 大約1、50、70、100、150、200、30011]\1或1、2或34]\1的1( 1)。在一個實施方案中，對于含有第一 抗-SA dAb和第二對TNFRl的dAb的雙特異性抗體，第二dAb對其目標(biāo)的親和性（例如Kd 和/或Ktjff，如通過表面等離子共振所測量的，例如使用BiaCore)為dAb對SA的親和性的1 至 100000 倍（例如，100 至 100000,或 1000 至 100000,或 10000 至 100000 倍）。在一個實 施方案中，血清白蛋白是人血清白蛋白（HSA)。例如，第一 dAb以大約10 μ M的親和性結(jié)合 SA，而第二dAb以IOOpM的親和性結(jié)合其目標(biāo)。在一個實施方案中，血清白蛋白是人血清白 蛋白（HSA)。在一個實施方案中，第一 dAb以大約50,例如，70、100、150或200nM的Kd結(jié)合 SA(例如，HSA)。雙特異性配體的詳細(xì)內(nèi)容可以在W003002609、W004003019和W004058821 中找到。
[0323] 在一個實施方案中，本發(fā)明的配體包含結(jié)合血清白蛋白（SA)的dAb，具有通過 表面等離子共振測定的 InM 至 1、2、3、4、5、10、20、30、40、50、60、70、100、200、300、400 或 500μΜ(艮P，xl(T9 至 5xl(T4)的 KD，或 IOOnM至 ΙΟμΜ，或 1 至 5μΜ，或 3 至 70nM，或 IOnM至 1、2、3、4或5μΜ。例如，30至70nM，如通過表面等離子共振所測定的。在一個實施方案中， 第一 dAb (或dAb單體）結(jié)合SA(例如，HAS)，具有通過表面等離共振測定的大約1、50、70、 100、150、200、300nM或1、2或3 μ M的KD。在一個實施方案中，第一和第二dAb通過連接物 連接，例如，1至4個氨基酸的連接物，或1至3個氨基酸，或多于3個氨基酸，或多于4、5、 6、7、8、9、10、15或20個氨基酸。在一個實施方案中，可以使用較長的連接物（多于3個氨 基酸）來提高功效（拮抗劑中一個或兩個dAb的K d)。
[0324] 在配體和拮抗劑的特定實施方案中，dAb結(jié)合人血清白蛋白并與選自以下的dAb 競爭與白蛋白的結(jié)合：
[0325] MSA-16、MSA-26(對于這些序列的公開內(nèi)容，參見TO04003019,在此將該序列及其 核酸對應(yīng)物引入作為參考并形成本發(fā)明文本公開內(nèi)容的一部分），
[0326] D0M7m-16(SEQ ID NO ：473) , D0M7m-12 (SEQ ID NO ：474) , D0M7m-26 (SEQ ID NO :475)、D0M7r-l (SEQ ID NO :476)、D0M7r-3(SEQ ID NO :477)、D0M7r-4(SEQ ID NO : 478)、DOM7r-5(SEQ ID NO :479)、DOM7r-7(SEQ ID NO :480)、DOM7r-8(SEQ ID NO :481)、 D0M7h-2(SEQ ID N0:482)、D0M7h-3(SEQ ID N0:483)、D0M7h-4(SEQ ID N0:484)、 D0M7h-6(SEQ ID N0:485)、D0M7h-l(SEQ ID N0:486)、D0M7h-7(SEQ ID N0:487)、 D0M7h-22(SEQ ID N0:489)、D0M7h-23(SEQ ID N0:490)、D0M7h-24(SEQ ID N0:491)、 D0M7h-25(SEQ ID NO :492)、D0M7h-26(SEQ ID NO :493)、D0M7h-21 (SEQ ID NO :494)、 D0M7h-27(SEQ ID N0:495)、D0M7h-8(SEQ ID N0:496)、D0M7r-13(SEQ ID N0:497)、 D0M7r-14(SEQ ID NO ：498), D0M7r-15 (SEQ ID NO ：499), D0M7r-16 (SEQ ID NO ：500), D0M7r-17(SEQ ID NO ：501), D0M7r-18 (SEQ ID NO ：502), D0M7r-19 (SEQ ID NO ：503), D0M7r-20(SEQ ID N0:504)、D0M7r-21(SEQ ID N0:505)、D0M7r-22(SEQ ID N0:506)、 D0M7r-23(SEQ ID NO ：507), D0M7r-24 (SEQ ID NO ：508), D0M7r-25 (SEQ ID N0：509), D0M7r-26 (SEQ ID NO ：510), D0M7r-27 (SEQ ID NO ：511), D0M7r-28 (SEQ ID NO ：512), D0M7r-29(SEQ ID NO ：513), D0M7r-30 (SEQ ID NO ：514), D0M7r-31 (SEQ ID N0：515), D0M7r-32(SEQIDN0:516)、D0M7r-33(SEQIDN0:517)(對于這些序列的公開內(nèi)容，參見 W02007080392,在此將其序列及其核酸對應(yīng)物引入作為參考并形成本發(fā)明文本公開內(nèi)容的 一部分；該段落中的SEQ ID NO是W02007080392公開的那些），
[0327] dAb8 (dAblO)、dAblO、dAb36、dAb7r20 (D0M7r20)、dAb7r21 (D0M7r21)、 dAb7r22 (D0M7r22)、dAb7r23 (D0M7r23)、dAb7r24 (D0M7r24)、dAb7r25 (D0M7r25)、 dAb7r26 (D0M7r26)、dAb7r27 (D0M7r27)、dAb7r28 (D0M7r28)、dAb7r29 (D0M7r29)、 dAb7r29 (D0M7r29)、dAb7r31(D0M7r31)、dAb7r32 (D0M7r32)、dAb7r33 (D0M7r33)、 dAb7r33 (D0M7r33)、dAb7h22 (D0M7h22)、dAb7h23 (D0M7h23)、dAb7h24 (D0M7h24)、 dAb7h25 (D0M7h25)、dAb7h26(D0M7h26)、dAb7h27 (D0M7h27)、dAb7h30 (D0M7h30)、 dAb7h31 (D0M7h31)、dAb2(dAbs4、7、41)、dAb4、dAb7、dAbll、dAb 12 (dAb7ml2)、 dAbl3(dAbl5)、dAbl5、dAbl6(dAb21、dAb7ml6)、dAbl7、dAbl8、dAbl9、dAb21、dAb22、 dAb23、 dAb24、 dAb25(dAb26、 dAb7m26)、 dAb27、 dAb30(dAb35)、 dAb31、 dAb33、 dAb34、 dAb35、dAb38(dAb54)、dAb41、dAb46(dAbs47、52 和 56)、dAb47、dAb52、dAb53、dAb54、 dAb55、 dAb56、 dAb7ml2、 dAb7ml6、 dAb7m26、 dAb7rl(D0M7rl)、 dAb7r3(D0M7r3)、 dAb7r4(D0M7r4)、dAb7r5(D0M7r5)、dAb7r7(D0M7r7)、dAb7r8(D0M7r8)、dAb7rl3(D0M7rl3)、 dAb7rl4 (D0M7rl4)、dAb7rl5 (D0M7rl5)、dAb7rl6 (D0M7rl6)、dAb7rl7 (D0M7rl7)、 dAb7rl8(D0M7rl8)、 dAb7rl9(D0M7rl9)、 dAb7hl(D0M7hl)、 dAb7h2(D0M7h2)、 dAb7h6(D0M7h6)、dAb7h7(D0M7h7)、dAb7h8(D0M7h8)、dAb7h9(D0M7h9)、dAb7hlO(DOM7hlO)、 dAb7hll (D0M7hll)、dAb7hl2 (D0M7hl2)、dAb7hl3 (D0M7hl3)、dAb7hl4(D0M7hl4)、 dAb7pl (D0M7pl)和 dAb7p2(D0M7p2)(對于這些序列的公開內(nèi)容，參見PCT/GB2008/000453， 2008年2月8日申請，在此將其序列及其核酸對應(yīng)物引入作為參考并形成本發(fā)明文本的 公開內(nèi)容的一部分）。dAb后括號中顯示了可替換的名稱，例如dAb8具有可替換的名稱 dAblO,即dAb8(dAblO)。還在圖51a和b中列出了這些序列。
[0328] 在特定的實施方案中，dAb結(jié)合人血清白蛋白，并包含與選自以下的dAb的氨基酸 序列具有至少約80 %或至少約85 %，或至少約90 %，或至少約95 %，或至少約96 %，或至少 約97%，或至少約98%，或至少約99%氨基酸序列同一性的氨基酸序列：
[0329] MSA-16, MSA-26,
[0330] D0M7m-16(SEQ ID NO :473)、D0M7m-12(SEQ ID NO :474)、D0M7m-26(SEQ ID NO :475)、D0M7r-l (SEQ ID NO :476)、D0M7r-3 (SEQ ID NO :477)、D0M7r-4(SEQ ID NO : 478)、D0M7r-5(SEQ ID NO :479)、D0M7r-7(SEQ ID NO :480)、D0M7r-8(SEQ ID NO :481)、 D0M7h-2(SEQ ID N0:482)、D0M7h-3(SEQ ID N0:483)、D0M7h-4(SEQ ID N0:484)、 D0M7h-6(SEQ ID N0:485)、D0M7h-l(SEQ ID N0:486)、D0M7h-7(SEQ ID N0:487)、 D0M7h-22(SEQ ID N0:489)、D0M7h-23(SEQ ID N0:490)、D0M7h-24(SEQ ID N0:491)、 D0M7h-25(SEQ ID N0:492)、D0M7h-26(SEQ ID N0:493)、D0M7h-21(SEQ ID N0:494)、 D0M7h-27(SEQ ID N0:495)、D0M7h-8(SEQ ID N0:496)、D0M7r-13(SEQ ID N0:497)、 D0M7r-14(SEQ ID NO ：498), D0M7r-15 (SEQ ID NO ：499), D0M7r-16 (SEQ ID N0：500), D0M7r-17(SEQ ID NO ：501), D0M7r-18 (SEQ ID NO ：502), D0M7r-19 (SEQ ID NO ：503), D0M7r-20(SEQ ID N0:504)、D0M7r-21(SEQ ID N0:505)、D0M7r-22(SEQ ID N0:506)、 D0M7r-23(SEQ ID NO ：507), D0M7r-24 (SEQ ID NO ：508), D0M7r-25 (SEQ ID NO ：509), D0M7r-26(SEQ ID NO ：510), D0M7r-27 (SEQ ID NO ：511), D0M7r-28 (SEQ ID NO ：512), D0M7r-29(SEQ ID NO ：513), D0M7r-30 (SEQ ID NO ：514), D0M7r-31 (SEQ ID N0：515), D0M7r-32(SEQIDN0:516)、D0M7r-33(SEQIDN0:517)(該段落中的SEQIDN0是 W02007080392中公開的那些），
[0331] dAb8、dAb 10、dAb36、dAb7r20、dAb7r21、dAb7r22、dAb7r23、dAb7r24、dAb7r25、 dAb7r26、dAb7r27、dAb7r28、dAb7r29、dAb7r30、dAb7r31、dAb7r32、dAb7r33、dAb7h21、 dAb7h22、dAb7h23、Ab7h24、Ab7h25、Ab7h26、dAb7h27、dAb7h30、dAb7h31、dAb2、dAb4、dAb7、 dAbll、dAbl2、dAbl3、dAbl5、dAbl6、dAbl7、dAbl8、dAbl9、dAb21、dAb22、dAb23、dAb24、 dAb25、dAb26、dAb27、dAb30、dAb31、dAb33、dAb34、dAb35、dAb38、dAb41、dAb46、dAb47、 dAb52、dAb53、dAb54、dAb55、dAb56、dAb7ml2、dAb7ml6、dAb7m26、dAb7rl、dAb7r3、dAb7r4、 dAb7r5、dAb7r7、dAb7r8、dAb7rl3、dAb7rl4、dAb7rl5、dAb7rl6、dAb7rl7、dAb7rl8、dAb7rl9、 dAb7hl、dAb7h2、dAb7h6、dAb7h7、dAb7h8、dAb7h9、dAb7hlO、dAb7hll、dAb7hl2、dAb7hl3、 dAb7hl4、dAb7pl 和 dAb7p2。
[0332] 例如，結(jié)合人血清白蛋白的dAb可以含有與以下序列具有至少約90 %，或至少 約95%，或至少約96%，或至少約97%，或至少約98%，或至少約99 %氨基酸序列同一 性的氨基酸序列：D0M7h-2(SEQ ID N0:482)、D0M7h-3(SEQ ID N0:483)、D0M7h-4(SEQ ID NO :484)、D0M7h-6 (SEQ ID NO :485)、D0M7h-l (SEQ ID NO :486)、D0M7h-7 (SEQ ID NO : 487)、D0M7h-8 (SEQ ID NO :496)、D0M7r-13 (SEQ ID NO :497)、D0M7r-14 (SEQ ID NO :498)、 D0M7h-22(SEQ ID N0:489)、D0M7h-23(SEQ ID N0:490)、D0M7h-24(SEQ ID N0:491)、 D0M7h-25(SEQ ID N0:492)、D0M7h-26(SEQ ID N0:493)、D0M7h-21(SEQ ID N0:494)、 D0M7h-27(SEQIDN0:495)(該段落中的SEQIDN0是W02007080392 中公開的那些），
[0333] dAb8、dAb 10、dAb36、dAb7h21、dAb7h22、dAb7h23、Ab7h24、Ab7h25Ab7h26、dAb7h27、 dAb7h30、dAb7h31、dAb2、dAb4、dAb7、dAbll、dAbl2、dAbl3、dAbl5、dAbl6、dAbl7、dAbl8、 dAbl9、dAb21、dAb22、dAb23、dAb24、dAb25、dAb26、dAb27、dAb30、dAb31、dAb33、dAb34、 dAb35、dAb38、dAb41、dAb46、dAb47、dAb52、dAb53、dAb54、dAb55、dAb56、dAb7hl、dAb7h2、 dAb7h6、dAb7h7、dAb7h8、dAb7h9、dAb7hlO、dAb7hll、dAb7hl2、dAb7hl3 和 dAb7hl4。
[0334] 在特定的實施方案中，dAb結(jié)合人血清白蛋白并含有與以下序列具有至少約80% 或至少約85%，或至少約90%，或至少約95%，或至少約96%，或至少約97%，或至少約 98%，或至少約99%氨基酸序列同一性的氨基酸序列：
[0335] D0M7h-2(SEQ ID NO :482)、D0M7h-6(SEQ ID NO :485)、D0M7h-l (SEQ ID NO : 486)、D0M7h-7(SEQ ID NO :487)、D0M7h-8(SEQ ID NO :496)、D0M7h-22(SEQ ID NO :489)、 D0M7h-23(SEQ ID N0:490)、D0M7h-24(SEQ ID N0:491)、D0M7h-25(SEQ ID N0:492)、 D0M7h-26(SEQIDN0:493)、D0M7h-21(SEQIDN0:494)、D0M7h-27(SEQIDN0 :495)(該段 落中的SEQ ID NO是W02007080392中公開的那些），
[0336] dAb7h21、dAb7h22、dAb7h23、Ab7h24、Ab7h25、Ab7h26、dAb7h27、dAb7h30、dAb7h31、 dAb2、dAb4、dAb7、dAb38、dAb41、dAb7hl、dAb7h2、dAb7h6、dAb7h7、dAb7h8、dAb7h9、dAb7hl0、 dAb7hll、dAb7hl2、dAb7hl3 和 dAb7hl4。
[0337] 在更特別的實施方案中，dAb是結(jié)合人血清白蛋白的Vk dAb，并具有選自以下的 氨基酸序列：
[0338] D0M7h-2(SEQ ID NO :482)、D0M7h-6(SEQ ID NO :485)、D0M7h-l (SEQ ID NO : 486)、D0M7h-7(SEQ ID NO :487)、D0M7h-8(SEQ ID NO :496)(該段落中的 SEQ ID NO 是 W02007080392中公開的那些），
[0339] dAb2、dAb4、dAb7、dAb38、dAb41、dAb54、dAb7hl、dAb7h2、dAb7h6、dAb7h7、dAb7h8、 dAb7h9、dAb7hlO、dAb7hll、dAb7hl2、dAb7hl3 和 dAb7hl4。
[0340] 在更特別的實施方案中，dAb是結(jié)合人血清白蛋白的Vh dAb，并具有選自dAb7h30 和dAb7h31的氨基酸序列。
[0341] 在更特別的實施方案中，dAb是dAb7hll或dAb7hl4。
[0342] 在其他實施方案中，dAb、配體或拮抗劑結(jié)合人血清白蛋白，并含有之前任一氨基 酸序列的一個、兩個或三個⑶R，例如，dAb7hll或dAb7h 14的一個、兩個或三個⑶R。
[0343] 合適的結(jié)合血清白蛋白的Camelid Vhh包括TO2004/041862(Ablynx N. V.)和 W02007080392中公開的那些（在此將其Vhh序列及其核酸對應(yīng)物引入作為參考，并形成本 發(fā)明文本公開內(nèi)容的一部分），如序列A(SEQ ID N0:518)、序列B(SEQ ID N0:519)、序列 C(SEQIDN0:520)、序列D(SEQIDN0:521)、序列E(SEQIDN0 :522)、序列F(SEQIDN0: 523)、序列G(SEQIDN0:524)、序列H(SEQIDN0:525)、序列I(SEQIDN0 :526)、序列J(SEQ IDN0:527)、序列K(SEQIDN0:528)、序列L(SEQIDN0 :529)、序列M(SEQIDN0:530)、 序列 N(SEQ ID NO :531)、序列 0 (SEQ ID NO :532)、序列 P (SEQ ID NO :533)、序列 Q (SEQ ID NO :534)，這些序列編號對應(yīng)于 W02007080392 或 W02004/041862(Ablynx N. V.)中引用的 那些。在特定的實施方案中，Camelid Vhh結(jié)合人血清白蛋白并含有與W0200708030392中 公開的ALB 1或SEQ ID NO :518-534中任一個具有至少約80%，或至少約85%，或至少約 90%，或至少約95%，或至少約96%，或至少約97%，或至少約98%，或至少約99 %氨基酸 序列同一性的氨基酸序列，這些序列編號對應(yīng)于W02007080392或W02004/041862中引用的 那些。
[0344] 在一些實施方案中，配體或拮抗劑含有與在此公開的任一抗-血清白蛋白dAb競 爭與血清白蛋白（例如，人血清白蛋白）結(jié)合的抗-血清白蛋白dAb。
[0345] 在可替換的實施方案中，拮抗劑或配體含有TNFRl (例如，人TNFR1)特異性的結(jié) 合部分，其中該部分含有非免疫球蛋白序列，如2008年2月8日申請的共同未決申請PCT/ GB2008/000453中所述的，這些結(jié)合部分、它們的生產(chǎn)和選擇方法（例如，來自不同的文庫） 及其序列的公開內(nèi)容在此引入作為參考，作為本發(fā)明文本的公開內(nèi)容的一部分。
[0346] 與半衰期延長部分（例如，白蛋白）的綴合
[0347] 在一個實施方案中，將（一個或更多個）半衰期延長部分（half-life extending moiety)(例如，白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白及其片段和類似物）綴合或連接本發(fā)明的TNFRl-結(jié)合多 肽、dAb或拮抗劑。對用于TNFRl-結(jié)合形式中的合適白蛋白、白蛋白片段或白蛋白變體的 實例描述于W02005077042中，在此將其公開內(nèi)容引入作為參考，并形成本發(fā)明文本的公開 內(nèi)容的一部分。特別地，以下的白蛋白、白蛋白片段或白蛋白變體可以用于本發(fā)明中：
[0348] *SEQ ID NO :1(如W02005077042中公開的，在此明確地將該序列引入本發(fā)明公開 內(nèi)容中作為參考）；
[0349] ?含有 W02005077042 中的 SEQ ID NO :1 的氨基酸 1-387 或由 W02005077042 中的 SEQ ID NO :1的氨基酸1-387組成的白蛋白片段或變體；
[0350] ?白蛋白、或其片段或變體，含有選自以下的氨基酸序列：（a)W02005077042中的 SEQ ID N0:1 的氨基酸 54-61;(b)W02005077042 中的 SEQ ID N0:1 的氨基酸 76 至 89; (c)TO2005077042 中的 SEQ ID NO :1 的氨基酸 92 至 100 ; (d)W02005077042 中的 SEQ ID N0:1 的氨基酸 170 至 176;(e)W02005077042 中的 SEQ ID N0:1 的氨基酸 247 至 252; (f)TO2005077042 中的 SEQ ID NO :1 的氨基酸 266 至 277 ; (g)W02005077042 中的 SEQ ID NO :1 的氨基酸 280 至 288 ; (h)W02005077042 中的 SEQ ID NO :1 的氨基酸 362 至 368 ; (i) W02005077042 中的 SEQ ID NO :1 的氨基酸 439 至 447 ; (i)W02005077042 中的 SEQ ID NO : 1 的氨基酸 462 至 475;(k)W02005077042 中的 SEQ ID N0:1 的氨基酸 478 至 486;和（1) W02005077042 中的 SEQ ID NO :1 的氨基酸 560 至 566。
[0351] 對用于TNFRl結(jié)合形式中的合適白蛋白、片段或類似物的更多實例描述于 W003076567中，在此將其公開內(nèi)容引入作為參考，并形成本發(fā)明文本的公開內(nèi)容的一部分。 特別地，以下的白蛋白、片段或變體可以用于本發(fā)明中：
[0352] ?如W003076567中所述的人血清白蛋白，例如，圖3中（在此明確地將該序列信息 引入本發(fā)明公開內(nèi)容中作為參考）；
[0353] ?由具有66, 500通式分子量的585個氨基酸的單非糖基化多肽鏈組成的人血 清白蛋白（參見，Meloun 等，F(xiàn)EBS Letters 58 :136(1975) ;Behrens 等，F(xiàn)ed. Proc. 34 : 591 (1975) ;Lawn 等，Nucleic Acids Research 9:6102-6114(1981) ;Minghetti 等， J. Biol. Chem. 261 :6747(1986))；
[0354] ?白蛋白的多態(tài)變體或類似物或片段，如Weitkamp等，Ann. Hum. Genet. 37 : 219(1973)中所述的；
[0355] ?如EP322094中所述的白蛋白片段或變體，例如，HA(1-373)、HA(1-388)、 HA (1-389)、HA (1-369)和 HA (1-419)以及 1-369 和 1-419 之間的片段；
[0356] ?如EP399666中所述的白蛋白片段或變體，例如，HA(1-177)和ΗΑ(1-200)以及 HA(I-X)之間的片段，其中X是178至199的任何數(shù)字。
[0357] 在將（一個或更多個）半衰期延長部分（例如，白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白及其片段和類似 物）用于格式化本發(fā)明的TNFRl-結(jié)合多肽、dAb和拮抗劑的情況中，可以使用任何合適的 方法來綴合，如通過直接融合TNFRl-結(jié)合部分（例如，抗-TNFRldAb)，例如，通過使用編碼 融合蛋白的單核苷酸構(gòu)建體，其中將融合蛋白編碼為單多肽鏈，在位于TNFR 1結(jié)合部分的 N-或C-端具有半衰期延長部分。或者，可以通過在部分之間使用肽連接物來完成綴合，例 如，W003076567或W02004003019中所述的肽連接物（在此將這些連接物的公開內(nèi)容引入 作為參考，以提供用于本發(fā)明中的實例）。通常，提高體內(nèi)血清半衰期的多肽是在體內(nèi)天然 產(chǎn)生的多肽，并且能抵抗從生物體內(nèi)（例如，人）除去不利物質(zhì)的內(nèi)源機制的降解或去除。 例如，提高體內(nèi)血清半衰期的多肽可以選自胞外基質(zhì)的蛋白，血液中發(fā)現(xiàn)的蛋白，血腦屏障 或神經(jīng)組織中發(fā)現(xiàn)的蛋白，位于腎臟、肝臟、肺、心臟、皮膚或骨中的蛋白，應(yīng)激蛋白，疾病特 異性蛋白或涉及Fc轉(zhuǎn)運的蛋白。
[0358] 在整個公開內(nèi)容中所述的本發(fā)明的實施方案中，替代本發(fā)明的拮抗劑或配體中的 抗-TNFRl "dAb"的使用，考慮了本領(lǐng)域技術(shù)人員可以使用含有本發(fā)明的結(jié)合TNFRl的dAb 的一個或更多個或全部3個CDR的多肽或結(jié)構(gòu)域（例如，嫁接在合適蛋白支架或骨架上的 CDR，支架或骨架例如為，親和體、SpA支架、LDL受體A類結(jié)構(gòu)域或EGF結(jié)構(gòu)域）。因此，認(rèn)為 該公開內(nèi)容作為整體提供了使用這樣的結(jié)構(gòu)域替代dAb的拮抗劑的公開內(nèi)容。在這點上， 參見2008年2月8日申請的PCT/GB2008/000453,在此將其公開內(nèi)容引入作為參考）。
[0359] 因此，在一個實施方案中，本發(fā)明的拮抗劑包含具有TNFRl結(jié)合特異性的免疫球 蛋白單可變域或結(jié)構(gòu)域抗體（dAb)或該dAb合適形式的互補性決定區(qū)。拮抗劑可以是由該 dAb組成的多肽，或基本上是由該dAb組成的多肽。拮抗劑可以是包含合適形式的dAb (或 dAb的(DR)的多肽，如抗體形式（例如，IgG-樣形式，scFv、Fab、Fab'、F(ab'）2)，或含有結(jié) 合TNFRl的dAb和結(jié)合另一個目標(biāo)蛋白、抗原或表位（例如，血清白蛋白）的第二dAb的雙 特異性配體。
[0360] 可以將根據(jù)本發(fā)明的多肽、dAb和拮抗劑格式化成本領(lǐng)域已知的各種合適的抗體 形式，如IgG-樣形式、嵌合抗體、人源化抗體、人抗體、單鏈抗體、雙特異性抗體、抗體重鏈、 抗體輕鏈、抗體重鏈和/或輕鏈的同型二聚體和雜二聚體、之前任一項的抗原結(jié)合片段（例 如，F(xiàn)v片段（例如，單鏈Fv) (scFv)、二硫化物鍵合的Fv)、Fab片段、Fab'片段、F(ab'）2片 段）、單可變域（例如，V H、VJ、dAb和之前任一項的修飾形式（通過共價連接聚烷撐二醇 (例如，聚乙二醇、聚丙二醇、聚丁二醇）或其他合適聚合物的修飾）。
[0361] 在一些實施方案中，本發(fā)明提供了為IgG-樣形式的配體（例如，抗-TNFRl拮抗 劑）。這樣的形式具有IgG分子常規(guī)的四條鏈結(jié)構(gòu)（2條重鏈和兩條輕鏈），其中一個或更 多個可變區(qū)（V h和或')已經(jīng)由本發(fā)明的dAb替代。在一個實施方案中，每個可變區(qū)（2個 Vh區(qū)和2個 '區(qū)）由dAb或單可變域替代，其中至少一個是根據(jù)本發(fā)明的抗-TNFRldAb。 IgG-樣形式中包括的dAb或單可變域可以具有相同的特異性或不同的特異性。在一些實施 方案中，IgG-樣形式是三價的，并可以具有一種（只抗-TNFR1)、兩種（例如，抗-TNFRl和 抗-SA)、三種或四種特異性。例如，IgG樣形式可以是單價的，并含有具有相同特異性的4個 dAb ;是雙特異性的并含有3個具有相同特異性的dAb和另一個具有不同特異性的dAb ;是 雙特異性的并含有兩個具有相同特異性的dAb和兩個具有共同的但不相同特異性的dAb ; 三特異性的并含有具有相同特異性的第一和第二dAb，具有不同特異性的第三dAb和具有 不同于第一、第二和第三dAb的特異性的第四dAb ;或四特異性的，并含有四個具有各不相 同特異性的dAb?？梢灾苽銲gG樣形式的抗原結(jié)合片段（例如，F(xiàn)ab、F(ab'） 2、Fab'、Fv、 scFv)。在一個實施方案中，IgG樣形式或其抗原結(jié)合片段不與TNFRl交聯(lián)，例如，形式對于 TNFRl可以是單價的。如果需要補體激活和/或抗體依賴性細(xì)胞毒性（ADCC)功能，配體可以 是IgGl-樣形式。如果需要，IgG-樣形式可以包含突變的恒定域（變體IgG重鏈恒定域）， 以最小化與Fc受體的結(jié)合和/或固定補體的能力。（參見，例如，Winter等，GB2, 209, 757B ; Morrison 等，W089/07142 ;Morgan 等，W094/29351，1994 年 12 月 22 日）。
[0362] 本發(fā)明的配體（多肽、dAb和拮抗劑）可以格式化成融合蛋白，其含有與第二免疫 球蛋白單可變域直接融合的第一免疫球蛋白單可變域。如果需要，該形式可以進(jìn)一步包含 半衰期延長部分。例如，配體可以包含與第二免疫球蛋白單可變域直接融合的第一免疫球 蛋白單可變域，而第二免疫球蛋白單可變域與結(jié)合血清白蛋白的免疫球蛋白可變域直接融 合。
[0363] 通常，不管配體是否包含連接物，具有對目標(biāo)有結(jié)合特異性的結(jié)合位點的多肽結(jié) 構(gòu)域的方向是設(shè)計選擇的問題。然而，一些方向，使用或不使用連接物，可以提供比其他 方向更好的結(jié)合特征。本發(fā)明包括的所有方向（例如，dAbl-連接物-dAb2;dAb2-連接 物-dAbl)是含有提供所需結(jié)合特征的方向的配體，該結(jié)合特征可以通過篩選容易地識別。
[0364] 根據(jù)本發(fā)明的多肽和dAb，包括dAb單體、二聚體和三聚體，可以連接抗體Fc區(qū)， 包含C H2和CH3結(jié)構(gòu)域中的一個或兩個，和任選鉸鏈區(qū)。例如，作為單個核苷酸序列連接Fc 區(qū)的載體編碼配體可以用來制備這樣的多肽。
[0365] 此外，本發(fā)明提供了上述dAb單體的二聚體、三聚體和多聚體。
[0366] 密碼子優(yōu)化序列
[0367] 如上所述，本發(fā)明的實施方案提供了編碼本發(fā)明的多肽和可變域的密碼子優(yōu)化核 苷酸序列。如以下說明中所示的，可以產(chǎn)生編碼相同可變域的約70%同一性的密碼子優(yōu)化 序列（在該情況中，可變域氨基酸序列與DOM lh-131-206相同）。在這種情況下，對于通過 巴斯德畢赤酵母（密碼子優(yōu)化序列1-3)或大腸桿菌（密碼子優(yōu)化序列4和5)的表達(dá)，將 序列優(yōu)化。
[0368] 我們在考慮了遺傳密碼的簡并性之后進(jìn)行了計算，并將通過D0Mlh-131_206(如 顯示于圖19中）的核苷酸序列和理論核苷酸序列編碼的每個簡并密碼子內(nèi)的核苷酸變化 數(shù)量最大化，理論核苷酸序列仍然編碼與DOM lh-131-206相同的可變域。計算揭示了理論 序列與顯不于圖19中的DOM lh-131-206的核苷酸序列只具有57%的同一性。
[0369] 密碼子優(yōu)化序歹Il 1
[0370] DNA 序列
[0371] gaggttcaattgttggaatccggtggtggattggttcaacctggtggttctttgagattgtcctgtgct gcttccggttttactttcgctcacgagactatggtttgggttagacaggctccaggtaaaggattggaatgggtttc ccacattccaccagatggtcaagatccattctacgctgactccgttaagggaagattcactatctccagagacaact ccaagaacactttgtacttgcagatgaactccttgagagctgaggatactgctgtttaccactgtgctttgttgcca aagagaggaccttggtttgattactggggacagggaactttggttactgtttcttcc
[0372] 相應(yīng)的AA序列
[0373] evqlIesggglvqpggslrlscaasgftfahetmvwvrqapgkglewvshippdgqdpfyadsvkgrft isrdnskntIylqmnslraedtavyhcalIpkrgpwfdywgqgtlvtvss
[0374] ?與WT序列74. 1 %的核苷酸序列同一性
[0375]

【權(quán)利要求】
1. 抗-了即〇1型受體〇'即1?1巾55)免疫球蛋白單可變域，其含有與0011111-131-206的 氨基酸序列（顯示于圖3中）為至少93%同一性的氨基酸序列。
2. 抗1即〇1型受體〇'即1?1巾55)免疫球蛋白單可變域，其含有與0011111-131-206的 氨基酸序列（顯示于圖3中）相同的氨基酸序列。
3. 抗1冊〇1型受體〇'即1?1巾55)免疫球蛋白單可變域，其是由與0011111-131-206的 核苷酸序列（顯示于圖19中）具有至少80%同一性的核苷酸序列編碼的。
4. 抗-TNFa I型受體（TNFR1 ;p55)免疫球蛋白單可變域，其是由與與DOMlh-131-206 的核苷酸序列（顯示于圖19中）相同的序列編碼的。 5. TNFa I型受體（TNFR1 ;p55)拮抗劑，其含有根據(jù)前述任一項權(quán)利要求的抗-TNFRl 免疫球蛋白單可變域。
6. 抗-了即〇1型受體〇'即1?1巾55)免疫球蛋白單可變域，其含有與001111-131-206 的氨基酸序列（顯示于圖3中）相同的氨基酸序列，或者在不超過25個氨基酸位置與 DOMlh-131-206的氨基酸序列不同并具有與DOMlh-131-206的CDRl序列為至少50%同一 性的CDRl序列的氨基酸序列。
7. 抗-了即〇1型受體〇'即1?1巾55)免疫球蛋白單可變域，其含有與0011111-131-206 的氨基酸序列（顯示于圖3中）相同的氨基酸序列，或者在不超過25個氨基酸位置與 DOMlh-131-206的氨基酸序列不同并具有與DOMlh-131-206的CDR2序列為至少50%同一 性的CDR2序列的氨基酸序列。
8. 抗-了即〇1型受體〇'即1?1巾55)免疫球蛋白單可變域，其含有與0011111-131-206 的氨基酸序列（顯示于圖3中）相同的氨基酸序列，或者在不超過25個氨基酸位置與 DOMlh-131-206的氨基酸序列不同并具有與DOMlh-131-206的CDR3序列為至少50%同一 性的CDR3序列的氨基酸序列。
9. 抗-了即〇1型受體〇'即1?1巾55)免疫球蛋白單可變域，其含有與0011111-131-206 的氨基酸序列（顯示于圖3中）相同的氨基酸序列，或者在不超過25個氨基酸位置與 DOMlh-131-206的氨基酸序列不同并具有與DOMlh-131-206的CDRl序列為至少50%同一 性的⑶Rl序列和具有與DOMlh-131-206的⑶R2序列為至少50%同一性的⑶R2序列的氨 基酸序列。
10. 抗-TNFa I型受體（TNFR1 ;p55)免疫球蛋白單可變域，其含有與DOMlh-131-206 的氨基酸序列（顯示于圖3中）相同的氨基酸序列，或者在不超過25個氨基酸位置與 DOMlh-131-206的氨基酸序列不同并具有與DOMlh-131-206的CDRl序列為至少50%同一 性的⑶Rl序列和具有與DOMlh-131-206的⑶R3序列為至少50%同一性的⑶R3序列的氨 基酸序列。
【文檔編號】C07K16/28GK104311663SQ201410440384
【公開日】2015年1月28日 申請日期:2008年6月4日 優(yōu)先權(quán)日:2007年6月6日
【發(fā)明者】L.耶斯珀斯, M.普佩卡, I.湯林森, C.埃內(nèi)弗 申請人:杜門蒂斯有限公司