專利名稱：得到經(jīng)過修飾降低了鼠抗體可變區(qū)之免疫原性的免疫球蛋白的方法及含有免疫球蛋白的 ...的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及免疫學領(lǐng)域，特別是涉及得到經(jīng)過修飾降低了鼠抗體可變區(qū)之免疫原性的免疫球蛋白的方法及含有這些免疫球蛋白的組合物。
免疫系統(tǒng)產(chǎn)生以高親和力和特異性與很大范圍的抗原結(jié)合并激發(fā)效應細胞機制的抗體。醫(yī)學中已將抗體用作診斷和治療劑，并且隨著新技術(shù)的出現(xiàn)而成功地提高了它們的應用潛力。
雜交瘤技術(shù)的應用得以分離產(chǎn)生單一特異性抗體的細胞系(Koehler G.，Milstein C.(1975)，Natare(London)256，495—497)，并且基因技術(shù)允許自雜交瘤構(gòu)建一系列工程化抗體。
抗體的區(qū)域結(jié)構(gòu)有利于對抗體進行工程化改造，并且通過得到或丟失其某些性質(zhì)而進一步改善許多抗體的實用性?？贵w的抗原結(jié)構(gòu)特性提供了識別功能，并可將其連接到一種或多種效應劑上。然后則必須基于效力、特異性和免疫原性標準來檢驗抗體是否同時具有這兩種性質(zhì)。
已很容易從被免疫的嚙齒動物得到產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤。目前已將幾種鼠單克隆抗體廣泛用于惡性腫瘤的影像診斷和治療、抗中毒性休克預防給藥、修飾移植物排斥部分，以及緩解急性炎癥反應。在使用嚙齒動物抗體進行治療的大多數(shù)病例中，接受者體內(nèi)都引發(fā)了針對抗體的免疫反應。這些反應已限制了治療期限和效果。
雖然存在幾種選擇，例如使用SCID—hu小鼠、體外免疫、重組的文庫，或這些方法的某些有用結(jié)合，但因為有許多已明確鑒定的嚙齒動物單克隆抗體已可以得到(如果能夠排除免疫反應，即可將其用于臨床)，所以開發(fā)人來源的相似制劑的努力已受到挫拆，而生產(chǎn)工程化改造的抗體則引起了很大關(guān)注。
已設(shè)計了工程化抗體，以盡可能地用等同的人序列取代外源序列。在基團工程化抗體中，大都是將來自不同種的免疫球蛋白的片段連接在一起的嵌合抗體。
首先，構(gòu)建了包含與人恒定區(qū)融合之嚙齒動物可變區(qū)的嵌合抗體。特別是小鼠/人嵌合抗體因表現(xiàn)出同樣的特異性，但與其小鼠對應物相比又降低了免疫原性，故可用于免疫治療。下列參考文獻描述了嵌合抗體技術(shù)Lobuglio et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 864220—4224(1989)；美國專利4,816,567；PCT國際公開WO 87/02671(1987年5月7日)；歐洲專利公開255,694(1988，2，10)；歐洲專利公開274,394(1988年7月13日)；歐洲專利公開323,806(1989年7月12日)；PCT國際專利公開WO89/00999(1989年2月9日)；歐洲專利公開327,000(1989年8月9日)；歐洲專利公開328,404(1989年8月16日)和歐洲專利公開332,424(1989年9月12日)。
值得注意的是，用人等同物取代恒定區(qū)也可能不降低它們的免疫原性，而仍有大約一半的接受者產(chǎn)生了對嚙齒動物可變區(qū)的免疫反應。因此，已廣泛地操作嚙齒動物抗體，以使之更加相似于人抗體。
已實現(xiàn)的進一步降低嵌合抗體之免疫原性的方法是，首先只將嚙齒動物單克隆抗體的CDR(互補決定區(qū))移植到人框架區(qū)上，然后再與適當?shù)暮愣▍^(qū)融合(Jones et al.，Nature 321522—525(1986))。這樣完成CDR移植的方法常常產(chǎn)生不完善的人抗體，即是說所得到的抗體失去了親和性，或者在保留其原有親和性的嘗試中，許多鼠框架殘基已取代了相應的被選擇之人框架的殘基(Winter，歐洲專利申請，239,400；Riechmann，et al.，Nature332323—327(1988))。
就鑒定用于轉(zhuǎn)移的最小數(shù)目的殘基，以達到對免疫原性有最小潛在影響的有用結(jié)合親和性這一目的來說，已經(jīng)發(fā)展了許多戰(zhàn)略，但從所顯示的結(jié)果看，每個戰(zhàn)略都只在重建親本親和性中取得一定程度上的成功。
雖然也已發(fā)現(xiàn)某些鄰近框架殘基參予抗原結(jié)合，但主要還是根據(jù)CDR的結(jié)構(gòu)和相對變位來確定抗體結(jié)合位點的配基結(jié)合特性(Davies et al.，Ann.Rev.Biochem.59439—473(1990))。因此，如果能夠嚴格地保留其CDR結(jié)構(gòu)及某些鄰近殘基、它們彼此間的相互作用，以及它們與可變區(qū)的相互反應，便可以維持抗體的精確特異性。
Padlan(Padlan，歐洲專利申請0519596A1；Padlan，Molecular Immunology 28489—498(1991))提出了抗體人源化的進一步方法，該方法是基于蛋白質(zhì)的抗原性取決于其表面的性質(zhì)，并且其中在嚙齒動物可變區(qū)中許多可接近溶劑的殘基被人抗體的殘基所取代這一事實。通過觀察人抗體KOL和鼠抗體J539的高分辨率X射線結(jié)構(gòu)來鑒定這些殘基的定位。通過鑒定最大同源性抗體群實現(xiàn)對人表面殘基的選擇。
蛋白質(zhì)表面的性質(zhì)對于其被抗原加工細胞，特別是抗原特異性B細胞識別和在這些細胞中內(nèi)在化都是很重要的，由T細胞識別特定線性結(jié)構(gòu)對于蛋白質(zhì)的免疫原性也是很重要的。
已建立了幾組鑒定在輔助T細胞抗原肽的MHC限制中起作用的序列特征和結(jié)構(gòu)性決定基的計算機自動分析方法(Berssofskyetal.，The Journal of Immunology 1382213—2229(1987)；Elliott et al，J.Immunol.1382949—2952(1987)；Reyeset al，The Journal of Biological Chemistry 26412854—12858(1989))。使用這些計算方法有可能鑒定推測的T細胞提呈肽。
分析已知原子結(jié)構(gòu)的抗體已闡明了抗體結(jié)合位點的序列與三維結(jié)構(gòu)的關(guān)系(Chothia et al.，J.Biol.Chem.196901—917(1987))。這種關(guān)系揭示，在VH區(qū)中除第三區(qū)域外，結(jié)合位點環(huán)還具有小數(shù)目的主鏈構(gòu)象之一，即“典型結(jié)構(gòu)”(“CanonicalStructures”)。在特定環(huán)中形成的典型結(jié)構(gòu)是根據(jù)其大小和在環(huán)與骨架區(qū)中的關(guān)鍵位點上存在某些殘基而確定的。
已將一個附加的骨架殘基亞組定義為“游標”帶，其可能調(diào)整CDR結(jié)構(gòu)并精調(diào)與抗原的配合性(Foot et al.，J.Mol.Biol.224487—499(1992))。取代這些殘基已顯示對于恢復CDR移動抗體的親和性是很重要的。因此游標帶對于設(shè)計人源化抗體有著明顯的意義。
因此，本發(fā)明的目的是提供將一種哺乳動物的單克隆抗體轉(zhuǎn)化為另一個種的單克隆抗體的方法。另一個目的是推測可變區(qū)序列上的潛在的T抗原決定基。另一個目的是鑒定負責T免疫原性的單克隆抗體序列上，負責種特異性或免疫原性的氨基酸殘基。再一個目的是用第二個種的T抗原決定基序列上的氨基酸殘基取代第一個種的T抗原決定基序列上的氨基酸殘基，從而使第一個種的抗體在第二個種中不再有免疫原性。再一個目的只在重和輕鏈的框架區(qū)中而不在互補決定區(qū)中造成取代，屬于游標帶的氨基酸和參予典型結(jié)構(gòu)的氨基酸可不被取代。本發(fā)明的再一個目的是提供摻入取代氨基酸殘基的新的DNA序列。再一個目的是提供含有改變了抗體之DNA序列的載體。再一個目的是用含有被修飾的抗體之DNA序列的載體轉(zhuǎn)化的真核或原核宿主細胞。
公開了一種鑒定和取代T細胞抗原序列的獨特方法，該方法將第一種哺乳動物的免疫球蛋白抗原性轉(zhuǎn)變?yōu)榈诙N哺乳動物的免疫球蛋白抗原性。該方法將同時改變免疫原性并嚴格保留配基結(jié)合性質(zhì)。審慎地取代可變區(qū)的T細胞抗原序列上的那些與三維結(jié)構(gòu)未牽連的氨基酸殘基，沒有影響配基結(jié)合性質(zhì)但大大改變了免疫原性。


圖1推測的IOR egf—IOR EGF—R3單克隆抗體之可變區(qū)的氨基酸序列。
(a)可變區(qū)κ輕鏈。
(b)可變區(qū)重輕鏈。
互補決定區(qū)已被劃下線并用粗體鉛字表示。
圖2和3對抗體IOR egf—R3重鏈和輕鏈可變區(qū)所作修飾的分析。
A鼠IOR egf—R3單克隆抗體可變區(qū)的序列。
B最同源的人免疫球蛋白之可變區(qū)的序列。
C經(jīng)修飾的IOR egf—R3可變區(qū)的序列。
陰影部分推測的T細胞抗原序列。
加下線的氨基酸殘基參予三級結(jié)構(gòu)的氨基酸。
粗體鉛字互補決定區(qū)。
方框中的氨基酸殘基提議的取代。
對于重鏈和輕鏈的描述同上。
圖4mAB IOR egf—R3可變區(qū)的分子模型。
以直方圖展示分子模型，其中VH在右邊并且比VL暗。該模型顯示了鼠殘基的側(cè)鏈，這些殘基經(jīng)過突變以使預測的兩親和性片段人源化。
圖5通過RRA檢測嵌合和突變IOR egf—R3與EGF—R的結(jié)合。
以不同濃度的純化的鼠IOR egf—R3(—■—)、嵌合IOR egf—R3(+)和突變VHR3/muR3VK(—*—)進行抗原結(jié)合活性檢測，并將結(jié)合的125I—EGF的CPM數(shù)對各抗體濃度的對數(shù)作圖(以ELISA法定量IgG的濃度)。
圖6用鼠IOR egf—R3、嵌合IOR egf—R3和突變體IOREGF—R3免疫猴。
縱座標405nm吸光率。
橫座標采血的天數(shù)。
ELISA按實施例9所述步驟進行。
箭頭指示每種MAb各注射2mg的間隔時間。
使用的血清稀釋度為1/10,000。
圖7和8對抗體IOR—T1的重鏈和輕鏈可變區(qū)所作修飾的分析。
A鼠IOR—T1單克隆抗體可變區(qū)的序列。
B最同源的人免疫球蛋白可變區(qū)的序列。
C經(jīng)修飾的IOR—T1抗體可變區(qū)的序列。
各標號的意義同圖2。
對重鏈和輕鏈的描述同上。
圖9和10對抗體IOR—CEA1重鏈和輕鏈可變區(qū)所作修飾的分析。
A鼠IOR—CEA1單克隆抗體可變區(qū)的序列。
B最同源的人免疫球蛋白可變區(qū)的序列。
C經(jīng)修飾的IOR—CEA1抗體可變區(qū)的序列。
各標號的意義同圖2。
對重鏈和輕鏈的描述同上。
本發(fā)明涉及降低嚙齒動物單克隆抗體的免疫原性，同時又在整體上保留其配基結(jié)合特性的方法。因為免疫球蛋白的抗原性取決于其序列上T細胞抗原肽的存在，故可經(jīng)取代包括不同于通常見于另一種哺乳動物抗體中的T細胞抗原序列上的殘基，來降低異種或同種異體抗體的免疫原性。
殘基的取代并不包括參予到典型結(jié)構(gòu)或游標帶(VernierZone)中的殘基。這種殘基的適宜取代沒有影響結(jié)構(gòu)決定基或區(qū)域內(nèi)接觸，因此，配基結(jié)合性質(zhì)沒有因只限于可變區(qū)框架殘基的改變而受到影響。
(1)可變區(qū)同源性的分析本方法中使用了由Kabat等人(“Sequence of ProteinsofImmunological Interest”Fifth edition Bethesda，Maryland；National Inst.of Health，1994)收集的人抗體可變區(qū)的序列資料。
第一步驟中，將第一種動物即小鼠的重或輕鏈可變區(qū)與第二種動物即人的相應可變區(qū)進行比較。預定本發(fā)明將允許對任何種動物的抗體進行抗原改變。
借助自動化計算機分析方法(PC—DOS HIBIO PROSIS 06—00，Hitachi)進行比較。然后將最同源的人可變區(qū)殘基與相應的小鼠可變區(qū)殘基相比較。如此也將確定與各小鼠序列更加相類似的人可變區(qū)亞組。
(2)T—抗原決定基的預測第二步驟中，分析小鼠和人的兩同源可變區(qū)序列，以便預測T抗原序列。
AMPHI計算程序(Bersofsky el al.，The JournalofImmunology 1382213—2229，(1987))用于預測a螺旋序列。SOHHA計算程序則推測螺旋疏水性的條帶(Elliott et al，J.Immunol.1382949—2952，(1987))。這些計算程序可預測抗原蛋白質(zhì)的T細胞提呈片段。
(3)對免疫原性降低的分析用人對應物中存在的殘基取代小鼠框架中不同于其人對應物的那些殘基。發(fā)生這種變換只是涉及那些存在于T抗原序列上的殘基。
最后，取代負責典型結(jié)構(gòu)的那些殘基或卷入游標帶中的那些殘基可能對三級結(jié)構(gòu)有重要影響。因此，它們不能被包括在該取代中。有關(guān)所提議的取代對三級結(jié)構(gòu)或結(jié)合位點的影響的附加信息，可從可變區(qū)的分子模型中獲得。
在運行UNIX和利用分子模型包“QUANTA”(Polygen corp)的Silicon Graphics Iris 4D工作站構(gòu)建所說的分子模型。
(4)構(gòu)建和表達被改變之抗體的方法使用下述方法制備將第一種哺乳動物，小鼠mAb輕和重鏈的CDR摻入第二種哺乳動物人中的重組DNA序列，呈現(xiàn)可用于轉(zhuǎn)染哺乳動物細胞的框架，以表達有較小免疫原性并有該動物單克隆抗體之抗原特異性的重組抗體。
本發(fā)明進一步包括構(gòu)建和表達經(jīng)修飾的抗體的方法，該方法包括a)誘變并組裝包括CDR和FR區(qū)域的可變區(qū)。較好地使用PGR誘變方法(Kamman et al.，Nucleic Acids Res，175404—5409，(1989))以在不同的位置引入改變。
b)制備包括一個可變區(qū)和相應的人恒定區(qū)的表達載體，在將其轉(zhuǎn)染到細胞中后即導致分泌足可供親和性和特異性檢測的蛋白質(zhì)。
c)將重和輕鏈表達載體共轉(zhuǎn)染到適當?shù)募毎抵?。約兩周后，用ELISA方法分析細胞上清液中有無人IgG產(chǎn)生。然后用任何已知方法分析樣品中能夠與特異性抗原結(jié)合的人IgG。
本發(fā)明提供了將動物單克隆抗體的CDR摻入似乎為天然人免疫球蛋白的框架中，從而使所得重組抗體在用于人時只有微弱免疫原性或無免疫原性的方法。當用于治療目的時，重組體免疫球蛋白被較好識別為自身蛋白質(zhì)。因為重組體抗體在給人使用時將是有微弱免疫原性的或無免疫原性的，所以該方法可使重組抗體作為治療劑使用。
本發(fā)明還期望包括任何動物單克隆抗體向提供適當框架區(qū)之顯現(xiàn)重組人的單克隆抗體的重組轉(zhuǎn)化。
本發(fā)明意欲包括任何動物免疫球蛋白向顯現(xiàn)人的免疫球蛋白的轉(zhuǎn)化。另外還試圖使顯現(xiàn)人的免疫球蛋白不合有κ或λ輕鏈，或者下列任何重鏈異型(α、σ、ε、γ和μ)之一。
下列實施例旨在舉例說明本發(fā)明，而不是限制本發(fā)明的范圍。
實施例1測得的IOR egf—R3單克隆抗體DNA序列的鼠可變區(qū)按Faloro等人(Faloro，J.et al.，Methods in Enzymology65718—749(1989))所述方法從大約106個R3(抗表皮生長因子受體)雜交瘤細胞中提取胞漿RNA。
cDNA合成反應混合物由5μgRNA、50mM TrisHCl pH7.5、75mMKCl、10mMDTT、3mMMCl2、25pmol重鏈可變區(qū)的CG2AFOR引物(5′GGAAGCTTAGACCGATGGGGCCTGTTGTTTTG3′)或輕鏈可變區(qū)的CK2FOR引物(5′GGAAGCTTGAAGATGGATACAGTTGGTGCAGC 3′)、各250μM dATP、dTTP、dCTP、dGTP、15U核糖核酸酶抑制劑(RNA保護劑，Pharmacia)組成，總體積50μl。樣品于70℃加熱10分鐘并經(jīng)30分鐘緩慢冷卻至37℃。然后加入100單位MMLV反轉(zhuǎn)錄酶(BRL)并于37℃持續(xù)保溫1小時。
使用Orlandi等人(Orlandi，R.et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 863833—3837(1989))所述PCR擴增VH和VKcDNA。用于VH的PCR擴增，DNA/引物混合物由5μl cDNA、25pmoles CG2A FOR (5′GGAAGCTTAGACCGATGGGGCCTGTTGTTTTG 3′)和VH1BACK引物(5′AGGT(G/C)(A/C)A(A/G)CTGCAG(G/C)AGTC(A/T)GG3′組成。用VK的PCR擴增，DNA/引物混合物由5μl cDNA、25pmoles CK2 FOR (5’GGAAGCTTGAAGATGGATA C AGTTGGTGCAGC3’)和KIOBACK(5’TTGAATTCCAGTGATGTTTTGATGACCCA3’)引物組成。向這些混合物中加入各2.5mM dATP、dCTP、dTTP和dGTP、5μl 10X嗜熱酶(thermolase)緩沖液成分和1單位嗜熱酶(IBI)，終體積為50μl。樣品在94℃，30秒；50℃，30秒；72℃，1分鐘進行25次熱循環(huán)，并于72℃持續(xù)保溫5分鐘。在Prep.A Gene純化藥盒(BioRad)上純化擴增的VH和VK DNA。
將純化的VH和VK cDNA克隆到M13載體中。使用T7DNA Pol(Pharmacia)經(jīng)二脫氧方法測定克隆的序列。結(jié)果見圖1。
實施例2嵌合基因的構(gòu)建我們使用擴增VH的VH1 BACK(5′AGGT(G/C)(A/C)A(A/G)CTGCAG(G/C)AGTC(A/T)GG3′)和VH1FOR(5′TGAGGAGACGGTGACCGTGGTCCCTTGGCCCCAG 3′)引物，和用于擴增VK的VK3 BACK(5′GACATTCAGCTGACCCA3′)與VK3FOR(5′GTTAGATCTCCAGTTTGGTGCT3′)引物，經(jīng)PCR再次擴增cDNA。用Pst I和BstEII消化VH基因的擴增的cDNA，或用PvuII和Bg1II消化VK基因的擴增的cDNA。將消化的片段克隆到M13—VHPCR1(用PstI和BstEII消化過的)中或M13—VKPCR1(用PvuII和Bc1I消化過的)中。有關(guān)這些載體詳見Orlandi等人的報導(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 863833—3837(1989))。經(jīng)序列分析直接鑒定含有可變區(qū)基因的M13VHPCR—R3和M13VKPCR—R3。
經(jīng)用HindIII和BamHI消化，從M13載體上切掉VH基因連同Ig重鏈啟動子、適用的切接位點及信號肽序列，并克隆到表達載體(pSVgpt)中。然后加進作為BamH I片段的人IgG1恒定區(qū)(Takahashi，N.et al.，Cell 29718—749(1982)。所得到的構(gòu)建體是R3VH—pSVgpt。R3VK—pSVhyg的構(gòu)建方法基本相同，不同的是用潮霉素抗性基因取代gpt基因，并加入人κ鏈恒定區(qū)(Hieter，P.A.et al.，Cell 22197—207(1980))。
實施例3修飾IOR egf—R3鼠單克隆抗體的可變區(qū)序列以使預測的T細胞抗原序列人源化。
根據(jù)T細胞抗原序列分析IOR egf—R3之重和輕鏈的可變區(qū)序列。使用計算機AMPHI計算程序進行分析，推測帶有兩親性螺旋結(jié)構(gòu)的長度中序列11氨基酸的片段，該片段有一個疏水側(cè)和一個與MHCII分子結(jié)合的親水側(cè)。
推測重鏈可變區(qū)序列上有5個片段，它們是(使用Kabat的序列編號)1.氨基酸3—13間的FR1，
2.氨基酸8—20間的FR1，3.氨基酸39—55之間的FR2和CDR2，4.氨基酸74—84間的FR3，5.氨基酸100c—110之間的FR4和CDR3。
圖2顯示相當于重鏈的序列。
將該鼠序列與包括在GeneBank和EMBL數(shù)據(jù)庫中的免疫球蛋白序列相比較。確定最同源的人可變區(qū)序列并限定與小鼠序列最密切相似的人亞類序列。在這種情況下所發(fā)現(xiàn)的人序列是稱為HUMIGHVA的胎兒免疫球蛋白，其可變區(qū)與鼠免疫球蛋白IORegf—R3的FR區(qū)有75％的同源性。
然后比較人和鼠可變區(qū)序列的殘基，并選擇出那些在FR區(qū)不參予游標帶或與典型結(jié)構(gòu)相關(guān)的殘基。因此，它們可以被在人序列上同一位置的那些殘基所改變。
最后，該分析用結(jié)合位點的計算機模型設(shè)計而得以充實?；谠摲肿幽Ｐ陀锌赡芟薅切_亂結(jié)合位點之三級結(jié)構(gòu)的取代。
對于鼠IOR egf—R3的重鏈，我們提出6處取代1.11位上的LEU被VAL取代，2.12位上的VAL被LYS取代，只有這兩處取代有可能破壞兩親性螺旋，因此推測的T抗原決定基在FR1處。
3.75位上的SER被THR取代，4.76位上的THR被SER取代，5.78位上的ALA被VAL取代，6.83位上的THR被ARG取代。
在這種情況下，取代提示在FR3中，其為人源化的。
FR2中的T細胞抗原序列包含兩個PRO，而它們在大多數(shù)螺旋抗原位點中是很罕見的氨基酸殘基，所以我們認為它不是真正的T細胞抗原決定基。
在FR4的108位中出現(xiàn)存在于某些人免疫球蛋白同一位置上的THR，在人免疫球蛋白中只有109位(LEU)是很罕見的，除了這一個點差異處，大多數(shù)推測的T細胞抗原決定基是人的，基于此不需要對其進行修飾。
圖3中顯示對鼠IOR egf—R3之輕鏈的分析結(jié)果。此序列中，推測相應于CDR2和FR3的殘基52—63之間只有一個兩親性螺旋，并在這個區(qū)域中，鼠和人序列間在63位只有一個點差異。因為該鼠輕鏈對人應是非免疫原性的，故沒有提出取代(見分子模型設(shè)計)。
實施例4mAb IORegf—R3 VK和VH的分子模型設(shè)計使用在150MHz Silicon Graphics Indigo Extreme工作站上運行的分子模型設(shè)計程序QUANTA/CHARm4.0(MolecularSimulations Inc.，(1994))，組構(gòu)小鼠mAb IOR egf—R3可變區(qū)的模型。分別從Fab 26—10(Jeffrey，P.D.et al.，Proc Natl，Acad，Sci.USA，9010310(1993))和Fab36—71(Strong，R.K. et al.，Biochemistry 303739(1993))組構(gòu)VK和VH框架。Fab 26—1O和mAb IOR egf—R3在VK框架中有92％同源性，在完整VK區(qū)中有88％同源性。Fab 36—71和R3 mAb的VH框架有85％同源性。從Brookhaven Protein Data Bank(入口II G1和6FAB)取得等同物(Coordinates)。將Fab 36—70的框架對接于Fab 26—10的架上，結(jié)果只有那些已發(fā)現(xiàn)常常卷入重和輕鏈可變區(qū)間界面中的殘基相匹配(Chotia，C et al.，J.Mol.Biol.186651(1985))。然后，刪除Fab 26—10的VH區(qū)和Fab 36—71的VK區(qū)以留下必須的雜合體。按最大交迭方法(Snow，M.E.et al.，Proteins 1；267(1986))進行側(cè)鏈取代，并且在可能時與其他結(jié)晶結(jié)構(gòu)相比較。
構(gòu)成IOR egf—R3—可變輕(VL)區(qū)(L1，L2和L3)的高可變區(qū)而保留如Fab 26—10中一樣的主鏈構(gòu)象，因兩種抗體中相應的CDR是高度同源的，并且都屬于同一典型結(jié)構(gòu)組群(Chotia，C.etal，Nature.342877(1989))。在mAb IOR egf—R3的VH區(qū)中，CDRH1同在Fab 36—71中一樣屬于典型結(jié)構(gòu)組群1，所以保持了親代分子的主鏈扭轉(zhuǎn)角。CDR H2相當于典型結(jié)構(gòu)組群2并且該環(huán)的主鏈構(gòu)象是從Fv片段4D5(入口IFVC)取得的，因為其H2環(huán)基礎(chǔ)與Fab 36—71的框架能良好匹配，所以它是從其他高分辨的結(jié)構(gòu)中選擇的。將所有上文提到的環(huán)與Data Bank中的其他CDR比較，以確定側(cè)鏈的方向。
為了構(gòu)建在mAb R3中有14氨基酸長的CDR H3模型，使用高溫度分子動力學進行構(gòu)象選擇(Bruccoler，R.E.et al.，Biopolymers，291847(1990))。首先，對沒有CDR H3的整個結(jié)構(gòu)進行能量最小化處理以保持被固定的殘基H—94和H—103，并對主鏈原子使用10Kcal/(mole原子A2)的諧振抑制。然后，從兩個原先固定的氨基酸開始構(gòu)成一個有隨機構(gòu)象的環(huán)。放置這些靠近框架的殘基時考慮到其他晶體結(jié)構(gòu)，并且構(gòu)成有伸展構(gòu)象的環(huán)的頂部，以避免與分子其他部分的強的空間作用。對于下一個模型設(shè)計步驟，只允許CDR H3和鄰近側(cè)鏈在5A°的距離內(nèi)運動。首先完成能量最小化，然后在800K進行分子動力學運行150微微秒。運行的時間間隔定為0.001微微秒，并且每100次間隔存貯協(xié)調(diào)數(shù)據(jù)。提取從動力學運行中得到的120個最低能量構(gòu)象，并使之受到使結(jié)構(gòu)中所有原子均可運動的能量最小化限制。得到幾個低能量構(gòu)象并將其中一個有最低能量者用于繼后的分析。就IOR egf—R3抗體的鼠和人變異體間的差異個別設(shè)計模型，以研究它們對CDR構(gòu)象可能產(chǎn)生的影響。
重鏈可變區(qū)中11，12(FR1)和83(FR3)位的氨基酸取代距CDR—FR邊緣足夠遠，并且對結(jié)合親和性不應有任何影響。SER75殘基指向外側(cè)，因些被THR取代對結(jié)合能力似乎并不重要。相反THR76則易受分子頂部的影響，并且可能參予與抗原的相互作用。但是由SER取代THR 76是一個保守的改變，在結(jié)合親和性上可能不會導致大的變化。
由VAL取代ALA 78將不需要空間重排。但VAL 78可能向前“推動”ILE 34(HI)。一般說來，根據(jù)計算機輔助的分子模型設(shè)計研究(圖4)，所提出的點突變不應影響結(jié)合親和性。
對IOR EGF—R3的輕鏈可變區(qū)作同樣分析，分子模型設(shè)計表明于該區(qū)域的任何改變都是不必要的。
實施例5用PCR誘變法構(gòu)建IOR egf—R3的突變體重鏈可變區(qū)使用PCR誘變技術(shù)(Kammann，M.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci，USA，864220—4224(1989))構(gòu)成突變重鏈可變區(qū)氨基酸的改變。
簡單地說，經(jīng)PCR進行兩次擴增反應混合物是0.5μl在M13中克隆的單股DNA的VH上清液、25pmole誘變的Oligo 1或2、25pmole誘變的Oligo 3或4引物(見下示引物序列)。向這些混合物中加入各2.5mM dATP、dCTP、dTTP和dGTP、5μl 10XVent聚合酶緩沖液(NEB)的成分及1單位Vent DNA聚合酶(NEB)，終體積為50μl。樣品于94℃，30秒；50℃，30秒；75℃，1分鐘進行12—15次熱循環(huán)；并于75℃持續(xù)保溫5分鐘。將兩次PCR的產(chǎn)物連接到第二個只使用外部引物(3和4)的PCR產(chǎn)物中。用Prep.A Gene純化試劑盒(BioRad)純化擴增的VH DNA。
為造成FR1中由VAL和LYS分別取代LEU11和VAL12的改變，所用引物是引物15′GAAGCCCCAGGCTTCTTCACTTCAGCCCCAGGCTG 3′引物35′GTAAAACGACGGCCAGT 3′這些引物合用于一個PCR中。引物25′CAGCCTGGGGCTGAAGTGAAGAAGCCTGGGGCTTCA 3′引物45′ACTGGCCGTCGTTTTAC 3′。這些引物合用在一個PCR中。
然后，兩PCR的產(chǎn)物合用在一個使用引物3和4的PCR中。
為造成FR3中分別由THR、SER、VAL和ARG取代SER75，THR76、VAL78和THR86的改變，所設(shè)計的引物是引物15′GCAGAGTCCTCAGATCTCAGGCTGCTGAGTTGCATGTAGACTGTGCTGGTGGATTCGTCTACCGT 3′，引物35′GTAAAACGACGGCCAGT 3′。這些引物合用在一個PCR中。引物25′ACGGTAGACGAATCCACCAGCACAGTCTACATGCAACTCAGCAGCCTGAGATCTGAGGACTCTGC3′引物45′ACTGGCCGTCGTTTTAC 3′。這些引物合用在一個PCR中。
然后，將兩PCR的產(chǎn)物合并在一個使用引物3和4的PCR中。
誘變后，將VH基因克隆到表達載體(pSVgpt)中產(chǎn)生質(zhì)粒IORegf—R3 mut VH—pSVgpt。
實施例6將DNA轉(zhuǎn)染到NSO細胞中用Pvu I消化后，將4μg R3VH—pSVgpt和8μg R3VK—pSVhyg(嵌合體)或R3突變體VH—pSVgpt和鼠R3Vk—pSVhyg切成線性。將DNA混合在一起，用乙醇沉淀，溶解于25μl水中。使約107個NSO細胞(大鼠骨髓瘤NSO是不分泌Ig的細胞系)生長至半會合，離心收獲細胞并連同經(jīng)消化的DNA一起重新懸浮在電穿孔容器內(nèi)的0.5ml DMEN中。在冰上放置5分鐘后，在960μF下給細胞170V的單一脈沖(Gene—Pulser，Bio—Kad)，并繼續(xù)在冰上放置30分鐘。然后將細胞倒入20ml DMEN加10％胎牛血清中并使之復原24小時。此時將細胞分配到96小井平板中并加入選擇培養(yǎng)基，14天后裸眼可見有轉(zhuǎn)染的克隆。
實施例7人IgG產(chǎn)生的定量分析用ELISA方法檢測含被轉(zhuǎn)染克隆之小井的培養(yǎng)基中存在的人抗體。用羊抗人IgG(重鏈特異性的)抗體(Sera—Lab)包被微量滴定板的小井。用PBST(含有0.02％吐溫20的磷酸鹽緩沖鹽水，pH7.5)洗滌后，向各小井中加入20μl在100μlPBST稀釋的從含轉(zhuǎn)化體小井中得到的培養(yǎng)基，于37℃保溫1小時。然后排空各小井，用PBST洗并加入過氧化物酶結(jié)合的羊抗人к(輕鏈特異性的)區(qū)域抗體(Sera—Lab)，37℃保溫1小時，然后排空各小井，用PBST洗并加入含鄰苯二胺的底物緩沖液。幾分鐘后加入硫酸終止反應，并檢測492nm吸光率。
實施例8EGF受體放射配基競爭試驗用人胎盤微粒體部分，經(jīng)同源性放射受體分析方法(RRA)(Macias，A.et al.，Interferony Biotechnologia 2115—127(1985))檢測鼠IOR egf—R，嵌合抗體和經(jīng)破壞抗原決定基T突變的抗體對與其受體結(jié)合的125I—EGF的親和常數(shù)和影響。
使用該技術(shù)檢測嵌合抗體和破壞抗原決定基T抗體的突變體結(jié)合EGF—R的能力(圖5)。兩種抗體均以如原始鼠抗體的同樣親和力(1O—9M)與EGF—R結(jié)合，進一步證實已克隆了正確的小鼠可變區(qū)，并且新的抗體異型沒有影響結(jié)合。進一步說，突變抗體中的改變并沒有影響與抗原的結(jié)合。
實施例9用鼠抗體、嵌合抗體和VH突變抗體免疫CercopithecusAethiops猴三個處理組各有2只Cercopithecus aethiops猴，各組分別用鼠IOR egf—R3 mAb、嵌合IOR egf—R3抗體和突變VH IOR egf—R3抗體免疫。在0、14、28和42天，用2mg吸附到5mg氫氧化鋁上的抗體經(jīng)皮內(nèi)注射免疫各組動物。第—次免疫前和每次免疫后1周從所有各組動物體內(nèi)采血，從每份樣品分離血清并于-20℃保存。以ELISA技術(shù)檢測抗鼠IOR egf—R3 mAb之抗體的滴度。
用50μl鼠IOR egf—R3單克隆抗體(在碳酸氫鹽緩沖液(pH9.6)中濃度為10μg/ml)包被Costar平板(Inc.highbinding)，并保溫過夜。然后用PBST洗平板，用含有1％BSA的同樣緩沖液于室溫下封閉1小時。
重復洗滌步驟并加入50μl/小井不同的血清稀釋液。37℃保溫2小時后，再次洗平板并加堿性磷酸酶結(jié)合的抗人IgG Fc區(qū)域特異性抗血清(Sigma，Inc.)37C保溫1小時。用PBST洗滌后各小并加50μl底物緩沖液(在二乙醇胺緩沖液(pH9.8)中稀釋的1mg/ml對硝基苯磷酸)保溫。在ELISA記錄儀(Organon Teknika，Inc.)中讀出405nm吸光率。
當使用該抗體作為免疫原時得到對鼠IOR egf—R3抗體的高IgG反應。當用嵌合抗體免疫猴時，與用突變體VH譯本免疫相反，得到較低的但仍可檢測到的抗鼠IOR egf—R3抗體的IgG反應(1/10,000)(圖6)。用突變的VH IOR egf—R3抗體免疫二次后沒有檢測到抗體反應，且在經(jīng)4次免疫后只測得很小的反應(1/10,000)。
實施例10修飾IOR—T1鼠單克隆抗體的可變區(qū)序列以使推測的T細胞抗原序列人源化分析IOR—T1重和輕鏈可變區(qū)序列的T細胞抗原序列。
預測了重鏈可變區(qū)上的3個片段，它們是1.氨基酸2—21間的FR—1，2.氨基酸29—43間的FR1，CDR1，F(xiàn)R2，3.氨基酸97—111間的FR4、CDR3。
圖7中顯示與最同源的人序列的比較和所提出的取代，在FR1上5處，F(xiàn)R2上2處，F(xiàn)R4上2處。
對于輕鏈(圖8)以同樣方法提出下列T細胞抗原片段1.氨基酸60—65間的FR3，2.氨基酸79—90間的FR3、CDR3，3.氨基酸93—95A間的CDR3。
分析后，我們提出在FR3中的60，63，83，85和87位上的5處取代。
實施例11修飾I0R—CEA1鼠單克隆抗體的可變區(qū)序列，以使推測的T細胞抗原序列人源化分析IOR—CEA1重和輕鏈可變區(qū)序列中的T細胞抗原序列。
推測重鏈可變區(qū)上的2個片段，它們是1.氨基酸1—16間的FR1，2.殘基96—110間的FR4和CDR3。
圖9中，顯示與最同源的人序列的比較，和所提出的取代，其FR1上7處(在2，3，5，6，9，10和15位)且在FR4上2處(在108和109位)。
對輕鏈作同樣分析(圖10)，提出下列T細胞抗原片段
1.氨基酸1—14間的FR1，2.氨基酸55—70間的FR3—CDR2，3.殘基74—100間的FR—3—CDR 3—FR4。
分析后，我們提出FR1中9，10，11和13位上的4處取代，F(xiàn)R3中58，60，63，70，75，76，78，81，83，85和87位上的11處取代，以及FR4中100位上的1處取代。
實施例12分析免疫球蛋白家族的可變區(qū)中的兩親性片段AMPHI程序以子程序的形式被包括在一個為閱讀和加工來自Kabat數(shù)據(jù)庫的免疫球蛋白序列而編制的程序中。在加工序列中制得下列重排—將未限定的GLX型氨基酸(可能是GLN或GLU)限定為GLN(GLN和GLU有相似的親水性(hydrofilicity)指數(shù)分別為—0.22和—0.64)。
—將未限定的ASX型氨基酸(可能是ASN或ASP，分別具有—0.60和—0.77的親水指數(shù))限定為ASN。
—其他未限定的氨基酸(序列中的空位或“奇形”符號)被限定為XXX(未知)。對該氨基酸，程序AMPHI指定親水值為0.0。
該分析中不包括有5個以上未知氨基酸(XXX)的序列。
該初步分析后，用程序AMPHI處理各序列，并且對每個免疫球蛋白家族以表格形式示出所得結(jié)果。
表I至VI中顯示對6個小鼠重鏈家族的分析結(jié)果。基于那些數(shù)據(jù)，可以限定“優(yōu)勢兩親性區(qū)域”(PAR)在90％以上的可變區(qū)序列屬于每個家族。例如，比較框架結(jié)構(gòu)1(FR1)，家族I和II的PAR可限定在11和16個氨基酸殘基之間，相反，家族III和IV一般從第1個氨基酸到第30個氨基酸沒有兩親性區(qū)域。在家族V和VI中，較小的PAR可分別限定在12—14和12—15個殘基。
PAR的人源化將降低在病人體內(nèi)的免疫原性。兩親性區(qū)域群集在免疫球蛋白可變區(qū)框架中，支持所提出的方法的普遍適用性，即通過幾個點突變使這些預測的T細胞抗原決定基人源化。
小鼠重鏈族I名稱 5 10 1520 25 30 35 40 45 5055 60 65 70 75 80 85 90 95 100 1011-TF5-139′CL ** ****** *** **--************* ***2-E7′CL** ****** *** **--************* *---------*******3-DFB-6l11′** ****** *** **--************* *----------******4-BALB/C121 ** ****** *** **--*************5-MOPC 450′C ** ****** *** **--************* ********** *** ***6-TF2-36′CL** **--************* ***** ********7-D35′CL ** ****** *** **--************* ** ***8-A/J GERMLI** **********--*************9-H37-92′CL** ****** *** **--*************---*****10-H37-85′CL********** *** **--*************11-36-60 CRI-** **********--******* ******12-JD31′CL ** ****** *** **--************13-H37-78′CL** ****** *** **--*************---*********14-H37-68′CL** ****** *** **--*************---*** *---------*******15-D7′CL** ****** *--*************16-42.7C.11.2*************--************ *****----------------*****17-42.BE.9.2′ *************--************ *****----------------*****18-H37-96′CL** ****** **--************* ****19-HF5.49′CL** **********--******************20-H37-24′CL** ****** *** **--*****************21-H37-42′CL***** *** *******---* *******22-42.7B3.2a′ *************--*****************---------------*****23-A10′CL ** **********--******* *******24-H37-88′CL** ****** *** **--***********25-JD21′CL *** **********--******* ******26-L69′CL ****** *** ************ **----------** ***27-VMS9′CL ********* **--****** ***********--* ***28-264″CL ********* **--****** ***********--***********29-VFM11′CL ********* **--****** ***********--* ***30-VMS2′CL ********* **--****** ********* ******31-VFM1′CL ********* ********* ******32-VMS1′CL *********** **** **** ***33-N-T151′CL****** ** *********--------*****
表2小鼠中鏈族II名稱 5 10 15 20 25 30 3540 45 50 5560 65 70 75 80 85 90 95 100 1011-LB8′CL ****** *-***************------------******2-DF4-29.4′ ** **** *-************ *** ***3-mAb D′CL ****** *-***************** ****4-BAT123′CL ****** *-************ *****--------------****5-35-20 ****** *-******************6-AN02*********-************7-AN02′CL*********-************8-40-120 ****** *-*************---***** ***------------*******9-40-40 ****** *-*************---***** ***------------*******10-H146-24E9** ****** *-*** ***********11-AN07′CL ** ****** *-****** *****12-40-160 ****** *********-********* ***---******------------*******13-S1.2′CL****** *-*************---***** **--------------*****14-40-140 ****** *-*** *******---***** ***------------*******15-37.1.1′CL ****** ****-************------------*****16-GAM3-2′CL ******* *-*** ****** ********------------***17-8-1-12-58′ ****** *-************ ******-------------------------*******18-S27′CL ****** *-************ **--------------*****19-AN03′CL****** ****-************ **----------******20-L11-1A1′CL ****** *-**************--******21-AN01′CL****** ****-************ *---------******22-VHIF′CL****** *-*** ****** *** **----------*****23-MOPC 315′C ****** *****-***************** *******24-MOPC315 ****** *****-************ *** *****
表3小鼠重鏈族III名稱 5 10 15 20 25 30 35 40 45505560 65 70 75 80 85 90 95 100 1011-H220-22′CL **--*** *** ********* ***2-DB1-453.2 **--*** *** ***3-H61-15′CL**--*** *** ******* ***4-1G7′CL **--*** *** ***5-NQ2 20.5.3**--*** *** ***6-E′CL **--*** *** ***7-NQ5 4.3.1′ **--*** *** ***8-NQ2 17.4.1**--*** *** ***9-H26′CL **--*** *** ***10-18G8′CL **--*** *** ****** **--------------**11-NQ5 61.1.2*** *** ****12-NQ2 48.2.2**--*** *** ***13-9G6′CL **--*** *** *** **--------------*14-3B6′CL **--*** *** ***15-2B2′CL **--*** *** ***16-F5-1419′CL **--*** *** ***17-E3′CL*** *** ***-------* ***18-20G9′CL **--*** *** ******19-3E3′CL **--*** *** ***20-12G10′CL **--*** ***21-5.4K 1y p′ **--*** ****--------**** ***22-17s.145′CL **--*** *** *** ******23-NC19FB′CL**--****** *** *** ***24-NPYI-125.3 *** **--*** *** *** *** **** ***25-NPYII-14.1 *** **--*** *** ***** ***-----------*****26-Lym-1′CL **--*** ****27-18-2-3′CL**--*** *** *********-------* *** ***28-PJ14′CL **--****** *** **** ****29-185.6′CL ******* **** *******30-185.6′CL ******* **** *******31-48.2.1′CL *** *** *** ***32-D1.3 **--****** *** *** ****33-PCG1-1′CL ***** *** **** **** *--------** ****34-F5-1336′CL **--****** *********---------**35-F5-444′CL ****--****** ****** *******--------*****36-F5-1126′CL ****--****** **********--------*****37-VD2H9′CL*** *** *** ***38-MOPC141J′CL **--****** *********---*******33-NPYII-269*** **--****** *** *****40-H220-22′CL **--*** *** *** ****** ***
表4小鼠重鏈族IV名稱51015 20 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 8085 90 95 100 1011-FAC1′CL *** ** ***2-D23′CL *********3-AB.1′CL *** ****-------------*******4-AB.2′CL *** *** *****---------*****5-JV10′CL*** *** ********6-MA-1505′CL **** *** *****-------------*****7-163.69′CL *** **-----------*******8-Mik-81(Fv) **** *** ***-----------**9-VH101′CL*** *** ***----------***10-MC101′CL*** *** ***----------***11-BPPI-6.4′C *** ***12-36.1.2D′CL *** **** ******13-36.5.7Bu′C *** **** ******
表5小鼠重鏈族V名稱 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 1011-HDEX31 **** ****--****** *** *** ***2-MOPC104E **** ****--****** *** *** ***3-HDEX1**** ****--****** *** ****----------******4-HDEX25 **** ****--****** *** *** ***5-HDEX4**** ****--****** *** *** *****6-HDEX7**** ****--****** *** *** ***7-HDEX5**** ****--****** *** ****----------*****8-HDEX6**** ****--****** *** *** ***9-HDEX11 **** ****--****** *** *** *****10-HDEX3**** *****--***** *** *** ***11-HDEX24 **** ****--****** *** ****----------*****12-J558 **** ****--****** *** *** ***13-HDEX37 **** ****--****** *** ****----------*****14-HDEX2**** ****--****** *** *** ***15-HDEX12 **** ****--****** *** *** ***16-414.2′CL**** ****--****** ******** ****----------*****17-262.9′CL**** ****--****** ***** *** ***18-126.33′CL **** ****--****** ***** *** ****----------*****19-9.14.7′CL *******--****** *** ***20-HDEX10 **** ****--****** *** *** ***21-HDEX14 **** ****--****** *** *** ***22-16.3′CL **** ****--****** ***** **** ***23-HDEX9**** ****--****** *** *** ***24-AC38 205.1 *******--****** *** *** ***---------******25-9.4.5′CL*******--****** *** ****--------*******26-4.1.3C4′CL *******--****** *** ******* ***27-3.2.3E5′CL *******--****** *** *** ***28-45.21.1′CL *******--****** *** ***29-4.8.1′CL*******--****** *** *** ***30-3.4.1G6′CL *******--****** *** ***31-42.5D4.2a′ *******--****** *** *** *******32-4.3F1′CL*******--****** *** ***33-37.1E5.2a′ *******--****** *** ***34-59.102.2′C *******--****** *** ***35-2.31.1′CL *******--****** *** ****---------** ***36-MRA1OH′CL **** ****--****** ******** ** *****37-165.60′CL **** ****--****** ******** ** *******38-A5.B12.1′C *******--****** *** *** **---------** ***39-A6/24′CL ****--****** *** *** **---------******40-163.72′CL******* ****--****** ******* *** ********---------******41-17s.93g′CL **** ****--****** ******** ** ***42-A20/44′CL ****--****** *** ***43-106-10E′CL ***********--****** ******** **44-I.29′CL **** **** *********--****** *** ********* ***45-L1.15′CL**** **** *********--****** ***46-HDEX8**** ****--****** *** *** ***
表6小鼠重鏈族VI名稱 5 10 15 20 25 30 3540 45 50 5560 65 70 7580 85 90 95 10010l1-202.135′CL ******* **********--****** *** ****----------*******2-202.61′CL******* **********--****** *** *** **-----------******3-202.80′CL******* **********--****** *** *** *******4-202s.38′CL ******* **********--****** *** *** *** ***5-111.34′CL******* **********--****** *** *** ** ***6-111.109′CL********** **********--****** *** ******* *----------***7-17p.101′CL********** **********--****** *** *******---------------** ***8-C′CL ******* **********--****** *** **********9-AN11′CL ******* **********--****** ******* ***10-D44′CL **** **** **** **********--****** *** *** ***11-D14A031VH ******* **********--*********** *** ***12-AM29′CL **** ** *********** *** ******--------** ***13-AM28′CL ******* ******** *--******* *** ******--------** ***14-BWR4.H′CL*********** *** **-------------******15-D444′CL ******* *********--****** ******** **---------------******16-PL2-8′CL **** **** ***** *** ***---------*****17-PL2-3′CL ********* *** *** ***---------*****18-PL2-6′CL ********* *** *** ***---------*****19-34-28′CL ******* **********--** ******
權(quán)利要求
1.鑒定免疫球蛋白的T細胞抗原序列上哺乳動物種特異性氨基酸殘基的差異的方法，包括a.比較第一種哺乳動物的可變區(qū)框架氨基酸與第二種哺乳動物的可變區(qū)的框架氨基酸；b.確定與第一種哺乳動物最密切對應的第二種哺乳動物的亞群；c.確定最相似于第一種哺乳動物序列的第二種哺乳動物序列；d.鑒定不同于第二種哺乳動物之氨基酸殘基的第一種哺乳動物的氨基酸殘基，其中所說的氨基酸是在免疫球蛋白可變區(qū)中的T細胞抗原序列上；e.只鑒定不在互補區(qū)域內(nèi)或不直接與典型結(jié)構(gòu)或游標帶相關(guān)聯(lián)的那些氨基酸殘基。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中第一種哺乳動物是小鼠。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中第二種哺乳動物是人。
4.將具有第一種哺乳動物之免疫原性的免疫球蛋白轉(zhuǎn)化成具有第二種哺乳動物之免疫原性的抗體的方法，包括用按權(quán)利要求1方法鑒定的最相似的第二種哺乳動物的相應氨基酸殘基取代第一種哺乳動物框架中不同于第二種哺乳動物之氨基酸殘基的氨基酸殘基。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中第一種哺乳動物是小鼠。
6.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中第二種哺乳動物是人。
7.一種方法，包括a.制備編碼對已知抗原有特異性的經(jīng)修飾的免疫球蛋白的DNA序列，其中不同于第二種哺乳動物同一位置上的氨基酸殘基的第一種哺乳動物的T細胞抗原序列上的某些殘基被按權(quán)利要求1的方法鑒定的最相似的第二種哺乳動物的相應氨基酸殘基取代；b.將該序列插入經(jīng)操作連接到與宿主細胞相容之適當啟動子上的可復制的表達載體中；c.用b的載體轉(zhuǎn)化宿主細胞；d.培養(yǎng)該宿主細胞；e.從宿主細胞培養(yǎng)物中回收經(jīng)修飾的免疫球蛋白。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中第一種哺乳動物是小鼠。
9.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中第二種哺乳動物是人。
10.一種包含對已知抗原有特異性之修飾的免疫球蛋白的組合物。
11.編碼識別EGF—R之鼠IOR—R3抗體的DNA序列。
12.編碼按權(quán)利要求1、4和7的方法得到的經(jīng)修飾之嵌合IOR—R3抗體的DNA序列。
13.按權(quán)利要求1、4和7的方法得到的表現(xiàn)有人抗體之抗原性的經(jīng)修飾的嵌合IOR—R3抗體。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的經(jīng)修飾的嵌合IOR—R3抗體，其重鏈框架區(qū)中有下列點突變FR1.11位LEU由VAL取代，12位VAL由LYS取代，F(xiàn)R3.75位SER由THR取代，76位THR由SER取代，78位ALA由VAL取代，且83位THR由ARG取代。
15.包含根據(jù)權(quán)利要求13的經(jīng)修飾的嵌合單克隆抗體的藥物組合物。
16.編碼按權(quán)利要求1、4和7的方法得到的經(jīng)修飾的嵌合IOR—T1抗體的DNA序列。
17.按權(quán)利要求1、4和7的方法得到的表現(xiàn)有人抗體之抗原性的經(jīng)修飾的嵌合IOR—T1抗體。18.根據(jù)權(quán)利要求17的經(jīng)修飾的嵌合IOR—T1抗體，其兩鏈的框架區(qū)域中有下列點突變重鏈FR13位上LYS被GLN取代5位上VAL被LEU取代6位上GLN被GLU取代13位上LYS被GLN取代19位上LYS被ARG取代FR240位上THR被ALA取代42位上GLU被GLY取代FR4108位上THR被LEU取代109位上LEU被VAL取代輕鏈FR360位上ASP被ALA取代63位上THR被SER取代83位上LEU被PHE取代85位上GLU被VAL取代87位上PHE被TYR取代。
19.包含根據(jù)權(quán)利要求17之經(jīng)修飾的嵌合單克隆抗體的醫(yī)藥組合物。
20.編碼按權(quán)利要求1、4和7的方法制得的經(jīng)修飾之嵌合IOR—CEA1抗體的DNA序列。
21.按權(quán)利要求1、4和7的方法制得的表現(xiàn)有人抗體之抗原性的經(jīng)修飾的嵌合IOR—CEA1抗體。
22.根據(jù)權(quán)利要求21的經(jīng)修飾的嵌合IOR—CEA1抗體，其兩鏈的框架區(qū)域中有下列點突變重鏈FR12位上的PRO被VAL取代3位上的LYS被GLN取代5位上的LEU被VAL取代6位上的GLU被GLN取代9位上的GLY被ALA取代10位上的ASP被GLU取代15位上的GLU被GLY取代FR4108位上的THR被LEU取代109位上的LEU被VAL取代輕鏈FR19位上的LYS被SER取代10位上的PHE被THR取代11位上的SER被LEU取代13位上的THR被ALA取代FR358位上的VAL被ILE取代60位上的ASP被SER取代63位上的THR被SER取代70位上的ASP被GLU取代75位上的ILE被VAL取代76位上的SER被ILE取代78位上的VAL被LEU取代81位上的GLN被ASP取代83位上的LEU被PHE取代85位上的GLU被THR取代87位上的PHE被TYR取代FR4100位上的ALA被GLN取代。
23.包含根據(jù)權(quán)利要求21或22的經(jīng)修飾的單克隆抗體的藥物組合物。
24.根據(jù)權(quán)利要求13、14、17、18、21和22的經(jīng)修飾的嵌合單克隆抗體的治療應用。
25.根據(jù)權(quán)利要求13、14、17、18、21和22的經(jīng)修飾的嵌合抗體用于制造抗腫瘤藥物。
26.包括衍生于第一種哺乳動物的重和輕鏈可變區(qū)及衍生于第二種哺乳動物的重和輕鏈恒定區(qū)的經(jīng)修飾的嵌合抗體，其中在T細胞抗原序列內(nèi)重鏈可變區(qū)或輕鏈可變區(qū)，或兩者被修飾，以使此氨基酸序列與衍生于所說的第二種哺乳動物之抗體相應區(qū)域中的氨基酸序列相適應，并除外在互補決定區(qū)中的修飾，以及在框架區(qū)內(nèi)典型結(jié)構(gòu)或游標帶中的修飾。
27.包括衍生于第一種哺乳動物的重鏈可變區(qū)和衍生于第二種哺乳動物的重鏈恒定區(qū)的經(jīng)修飾的嵌合抗體重鏈，其中T細胞抗原序列內(nèi)的重鏈可變區(qū)被修飾，以使此氨基酸序列與衍生于所說的第二種哺乳動物之抗體的相應重鏈區(qū)域中的氨基酸序列相適應，但除外在互補決定區(qū)的修飾以及在框架區(qū)內(nèi)典型結(jié)構(gòu)或游標帶中的修飾。
28.包括衍生于第一種哺乳動物的輕鏈可變區(qū)和衍生于第二種哺乳動物的輕鏈恒定區(qū)的經(jīng)修飾的嵌合抗體輕鏈，其中T細胞抗原序列內(nèi)的輕鏈可變區(qū)被修飾，以使此氨基酸序列與衍生于所說的第二種哺乳動物之抗體的相應輕鏈區(qū)域中的氨基酸序列相適應，并且其中除外在互補決定區(qū)中的修飾以及在框架區(qū)內(nèi)的典型結(jié)構(gòu)或游標帶中的修飾。
全文摘要
本發(fā)明涉及鑒定免疫球蛋白的T細胞抗原序列上哺乳動物種特異性氨基酸殘基的差異的方法，它包括a.比較第一種哺乳動物和第二種哺乳動物的可變區(qū)框架氨基酸；b.確定與第一種哺乳動物最密切對應的第二種哺乳動物的亞群；c.確定最相似于第一種哺乳動物序列的第二種哺乳動物序列；d.鑒定不同于第二種哺乳動物之氨基酸殘基的第一種哺乳動物的氨基酸殘基。
文檔編號C07K19/00GK1133886SQ95109148
公開日1996年10月23日 申請日期1995年6月30日 優(yōu)先權(quán)日1994年6月30日
發(fā)明者R·P·羅德里古, C·M·德考思塔·戴里奧, J·L·瓦拉達列 申請人:分子免疫中心