聚氨酯界面特異性親和多肽及其篩選方法
【專利摘要】聚氨酯界面特異性親和多肽及其篩選方法，它涉及生物材料【技術(shù)領(lǐng)域】，它包含VHWDFRQWWQPS特異性氨基酸序列的親和肽；它的篩選方法為：分別以水基聚氨酯和溶劑基聚氨酯涂層材料為靶界面，利用噬菌體展示技術(shù)篩選與靶界面特異親和的肽，包括噬菌體12肽庫的親和篩選，噬菌體克隆的ELISA鑒定，最后噬菌體陽性克隆DNA的制備及序列測定。它不僅能通過直接浸潤接觸使短肽分子快速穩(wěn)定高效地結(jié)合在聚氨酯涂層材料表面，而且也能穩(wěn)定地結(jié)合在溶劑基聚氨酯材料表面，為進(jìn)一步融合活性酶蛋白分子以及開發(fā)酶蛋白在聚氨酯表面的快速固定化工藝奠定基礎(chǔ)，也為開發(fā)具有生物活性的聚氨酯材料提供了良好的方法。
【專利說明】聚氨酯界面特異性親和多肽及其篩選方法
[0001]【技術(shù)領(lǐng)域】:
本發(fā)明涉及生物材料【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種聚氨酯材料界面特異結(jié)合的短肽及其篩選方法。
[0002]【背景技術(shù)】:
噬菌體隨機(jī)肽庫展示技術(shù)是將編碼外源肽的DNA序列插入噬菌體表面編碼外殼蛋白的基因中，使大量的隨機(jī)肽段以融合形式表達(dá)在噬菌體表面。在該技術(shù)基礎(chǔ)上通過反復(fù)的結(jié)合-洗脫-單克隆擴(kuò)增可定向篩選與目標(biāo)蛋白質(zhì)、細(xì)胞、組織、材料等具有特異性親和作用的多肽。
[0003]聚氨酯全稱為聚氨基甲酸酯，是主鏈上含有重復(fù)氨基甲酸酯基團(tuán)的大分子化合物的統(tǒng)稱，它是由有機(jī)二異氰酸酯或多異氰酸酯與二羥基或多羥基化合物加聚而成。聚氨酯涂層一般具有高強(qiáng)度、高耐磨和耐溶劑等特點(diǎn)，可以直接牢固地附著在各種有機(jī)物或金屬材料表面。因此，目前已經(jīng)廣泛用于家具涂料、建材涂料、汽車涂料和紡織品等領(lǐng)域。
[0004]上世紀(jì)90年代以來，以聚氨酯材料為載體的固定化酶報道逐漸增多，根據(jù)形狀差異可以將其分為聚氨酯膜、微球、纖維和泡沫狀固定化酶，主要應(yīng)用在生物合成催化劑和生物降解有毒化合物等領(lǐng)域。聚氨酯前體材料中由于其自身包含能與酶分子直接反應(yīng)的活性異氰酸根基團(tuán)，在其聚合過程中也能以共價結(jié)合和包埋的形式固定酶分子，因而具有熱穩(wěn)定性高、不易泄漏的優(yōu)點(diǎn)。然而，由于酶蛋白分子主要分布在聚氨酯涂層骨架的內(nèi)部，僅靠涂層表面的酶分子與底物接觸催化其反應(yīng)，無法最大程度發(fā)揮其催化效率；且隨著使用時間的延長，表面活性酶分子一般會逐漸變性失活，聚氨酯涂層固定化酶就會失去其生物催化活性。因此，開發(fā)一種能將活性酶蛋白分子快速、高效、穩(wěn)定結(jié)合在聚氨酯材料表面的技術(shù)，對開發(fā)聚氨酯基生物活性材料具有重要意義。目前常見的聚氨酯材料表面固定化酶分子主要通過對聚氨酯涂層表面進(jìn)行等離子體處理，或利用二異氰酸酯在涂層表面嫁接，使聚氨酯涂層表面帶有氨基、羧基和異氰基等活性反應(yīng)基團(tuán)，再通過共價鍵連接酶蛋白分子。聚氨酯涂層表面共價固定化酶蛋白的問題在于，制備工藝復(fù)雜對環(huán)境和設(shè)備要求很高，不適合大規(guī)模工業(yè)化應(yīng)用。
[0005]
【發(fā)明內(nèi)容】
:
本發(fā)明的目的是提供一種聚氨酯界面特異性親和多肽及其篩選方法，它不僅能通過直接浸潤接觸使短肽分子快速穩(wěn)定高效地結(jié)合在聚氨酯涂層材料表面，而且也能穩(wěn)定地結(jié)合在溶劑基聚氨酯材料表面，為進(jìn)一步融合活性酶蛋白分子以及開發(fā)酶蛋白在聚氨酯表面的快速固定化工藝奠定基礎(chǔ)，也為開發(fā)具有生物活性的聚氨酯材料提供了良好的方法。
[0006]為了解決【背景技術(shù)】所存在的問題，本發(fā)明是采用以下技術(shù)方案:它包含VHWDFRQffffQPS特異性氨基酸序列的親和肽；它的篩選方法為:分別以水基聚氨酯和溶劑基聚氨酯涂層材料為靶界面，利用噬菌體展示技術(shù)篩選與靶界面特異親和的肽，包括噬菌體12肽庫的親和篩選，噬菌體克隆的ELISA鑒定，最后噬菌體陽性克隆DNA的制備及序列測定。
[0007]本發(fā)明的具體篩選方法為: 一、噬菌體12肽庫的親和篩選
(1)水基聚氨酯涂層的制備:將3mL脂肪族水基聚氨酯TO-116加入細(xì)胞培養(yǎng)皿，水平靜置室溫24小時固化，之后置于70 °C烘箱內(nèi)進(jìn)一步固化4小時取出待用。溶劑基聚氨酯涂層的制備:聚丙烯酸樹脂Desmophen A870和聚異氰酸樹脂Desmodur N3600,稱取2.1 g聚丙烯酸樹脂Desmophen A870于20 mL玻璃瓶中，再加入0.5 mL乙酸正丁酯,強(qiáng)力攪拌1500 rpm、I分鐘，加入0.8 g聚異氰酸樹脂Desmodur N3600,繼續(xù)攪拌I分鐘，將混合物轉(zhuǎn)移加入至水平放置的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，將涂層靜置于通風(fēng)處內(nèi)10分鐘后放入70 0C烘箱，在該溫度下放置4小時使涂層聚合完全取出待用；
(2)親和篩選:加入含體積比0.1% Tween-20的TBST I mL洗滌6次，于潔凈面巾紙上扣干；以I mL TBST稀釋10 uL原始文庫液至4X10 10 pfu/mL，加入到清洗晾干后的含聚氨酯涂層的細(xì)胞培養(yǎng)皿內(nèi)，室溫溫和搖動60 min，傾倒出培養(yǎng)皿內(nèi)液體，扣干殘余溶液，并用4 mL TBST清洗10次，每次清洗后傾倒去緩沖溶液并在潔凈的面巾紙上扣干；向培養(yǎng)皿中加入I mL濃度為0.2 M的pH 2.2的甘氨酸.鹽酸Glycine-HCl緩沖液，于室溫溫和搖動10 min，洗脫液吸入另一干凈微量離心管中，然后再用150 uL pH 9.1的Tris-HCl中和上述洗脫液，測定少量洗脫液的滴度，剩余洗脫物根據(jù)常規(guī)M13方法進(jìn)行第一輪噬菌體洗脫物的擴(kuò)增，加入到20 ml處于對數(shù)前期的ER2738菌體培養(yǎng)物中，37 °C劇烈搖動培養(yǎng)4.5小時，對擴(kuò)增后的噬菌體進(jìn)行分離純化并測定滴度；將第一輪篩選后的噬菌體擴(kuò)增液以I mL TBST稀釋至10 11 pfu/mL，并加入到預(yù)先制備聚氨酯的細(xì)胞培養(yǎng)皿中進(jìn)行第二輪到第五輪篩選，操作同上述第一輪篩選，用含體積比0.5% Tween-20的TBST溶液清洗10次，同上進(jìn)行篩選后噬菌體的擴(kuò)增和滴度的測定；第三輪，第四輪和第五輪洗脫物滴度測定過程中對含有少于100個藍(lán)色噬菌斑的平板中單克隆的噬菌體進(jìn)行DNA測序；
二、噬菌體克隆的ELISA鑒定
ELISA檢測噬菌體展示短肽對靶分子的的結(jié)合活性:用20 uL水基聚氨酯包被ELISA板的每個孔，經(jīng)固化和0.1% Tween-20的TBST溶液清洗后，將經(jīng)過3輪和5輪篩選后的單克隆噬菌體進(jìn)行再次擴(kuò)增，取100 ul稀釋至10 11 pfu/mL的噬菌體在密封的濕盒中室溫溫和搖動吸附I h，TBST洗滌后，加入稀釋至工作濃度的抗M13-HRP結(jié)合物，室溫反應(yīng)I h，TBST充分洗滌，加入TMB底物顯色溶液，室溫30 min，后加50 uL濃度為12 M的H2SO4終止反應(yīng)，測定0D450 ；
三、噬菌體陽性克隆DNA的制備及序列測定
將噬菌體陽性克隆提取其單鏈DNA后，用-96 gill測序引物交由上海生物工程有限公司測序，以推測其相應(yīng)的水基聚氨酯特異性吸附肽序列為VHWDFRQWWQPS，溶劑基聚氨酯特異性吸附肽序列為VHWDFRQWWQPS。
[0008]四、聚氨酯特異性親和肽的吸附效率和穩(wěn)定性測定
按照測序結(jié)果固相合成親和肽VHWDFRQWWQPS后，用FITC-NCO修飾親和肽末端氨基，透析除去未反應(yīng)的FITC分子，多肽溶液10uL加入聚氨酯包被的96孔板濕盒中4 0C吸附Ih，剩余溶液，加入100 uL PBST洗滌后合并，測定熒光強(qiáng)度；穩(wěn)定性測定為反復(fù)洗滌測定洗滌液熒光強(qiáng)度，作圖洗滌次數(shù)-吸附多肽百分率，或通過AFM跟蹤吸附多肽的分布形態(tài)。
[0009]本發(fā)明提供的聚氨酯特異性親和肽，能與水基和溶劑基聚氨酯材料快速高效穩(wěn)定結(jié)合，因此本短肽序列與氨基甲酸酯基團(tuán)具有顯著的結(jié)合力，同時理論上而言可以與各種酶分子進(jìn)行化學(xué)交聯(lián)或融合表達(dá)，為進(jìn)一步開發(fā)在聚氨酯涂層表面固定化生物活性分子(酶，抗菌肽，抗體等)技術(shù)奠定堅實(shí)基礎(chǔ)。同時本發(fā)明的聚氨酯特異性結(jié)合肽篩選方法，也為其他在各種材料界面特異性結(jié)合的小肽分子篩選結(jié)合提供切實(shí)可行的技術(shù)方案。
[0010]【具體實(shí)施方式】:
為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合【具體實(shí)施方式】及實(shí)施例，對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的【具體實(shí)施方式】及實(shí)施例僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
[0011]本【具體實(shí)施方式】采用以下技術(shù)方案:它包含VHWDFRQWWQPS特異性氨基酸序列的親和肽；它的篩選方法如下:
一、噬菌體12肽庫的親和篩選
(I)水基聚氨酯涂層的制備:將3 mL脂肪族水基聚氨酯PU-116 (購自安徽安科精細(xì)化工)加入細(xì)胞培養(yǎng)皿(35 mm X 12 mm購自Fisher Scientif ic)，水平靜置室溫24小時固化，之后置于70 °C烘箱內(nèi)進(jìn)一步固化4小時取出待用。溶劑基聚氨酯涂層的制備:聚丙烯酸樹脂(Hydroxyl-bearing polyacrylate, Desmophen A870)和聚異氰酸樹脂(Hexamethylene diisocyanate, Desmodur N3600)購自 Bayer。稱取 2.1 g 聚丙烯酸樹脂Desmophen A870于20 mL玻璃瓶中，再加入0.5 mL乙酸正丁酯，強(qiáng)力攪拌(1500 rpm)I分鐘，加入0.8 g聚異氰酸樹脂Desmodur N3600，繼續(xù)攪拌I分鐘。將混合物轉(zhuǎn)移加入至水平放置的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，將涂層靜置于通風(fēng)處內(nèi)10分鐘后放入70 0C烘箱，在該溫度下放置4小時使涂層聚合完全取出待用。
[0012](2)親和篩選:加入含體積比0.1% Tween-20的TBST I mL洗滌6次，于潔凈面巾紙上扣干。以I mL TBST稀釋10 uL原始文庫液至4X10 10 pfu/mL,加入到清洗晾干后的含聚氨酯涂層的細(xì)胞培養(yǎng)皿內(nèi)，室溫溫和搖動60 min，傾倒出培養(yǎng)皿內(nèi)液體，扣干殘余溶液，并用4 mL TBST清洗10次，每次清洗后傾倒去緩沖溶液并在潔凈的面巾紙上扣干。向培養(yǎng)皿中加入I mL濃度為0.2 M的pH 2.2的甘氨酸?鹽酸Glycine-HCl緩沖液，于室溫溫和搖動10 min，洗脫液吸入另一干凈微量離心管中，然后再用150 uL pH 9.1的Tris-HCl中和上述洗脫液，測定少量洗脫液的滴度。剩余洗脫物根據(jù)常規(guī)M13方法進(jìn)行第一輪噬菌體洗脫物的擴(kuò)增，加入到20 ml處于對數(shù)前期的ER2738菌體培養(yǎng)物中，37 °C劇烈搖動培養(yǎng)4.5小時，對擴(kuò)增后的噬菌體進(jìn)行分離純化并測定滴度。將第一輪篩選后的噬菌體擴(kuò)增液以I mL TBST稀釋至10 11 pfu/mL，并加入到預(yù)先制備聚氨酯的細(xì)胞培養(yǎng)皿中進(jìn)行第二輪到第五輪篩選(操作同上述第一輪篩選)，用含體積比0.5% Tween-20的TBST溶液清洗10次，同上進(jìn)行篩選后噬菌體的擴(kuò)增和滴度的測定。第三輪，第四輪和第五輪洗脫物滴度測定過程中對含有少于100個藍(lán)色噬菌斑的平板中單克隆的噬菌體進(jìn)行DNA測序。
[0013]二、噬菌體克隆的ELISA鑒定
ELISA檢測噬菌體展示短肽對靶分子的的結(jié)合活性:用20 uL水基聚氨酯包被ELISA板的每個孔，經(jīng)固化和0.1% Tween-20的TBST溶液清洗后，將經(jīng)過3輪和5輪篩選后的單克隆噬菌體進(jìn)行再次擴(kuò)增，取100 ul稀釋至10 11 pfu/mL的噬菌體在密封的濕盒中室溫溫和搖動吸附I h，TBST洗滌后，加入稀釋至工作濃度的抗M13-HRP結(jié)合物，室溫反應(yīng)I h，TBST充分洗滌，加入TMB底物顯色溶液，室溫30 min，后加50 uL濃度為12 M的H2SO4終止反應(yīng)，測定0D450 ； 三、噬菌體陽性克隆DNA的制備及序列測定
將噬菌體陽性克隆提取其單鏈DNA后，用-96 gill測序引物交由上海生物工程有限公司測序，以推測其相應(yīng)的水基聚氨酯特異性吸附肽序列為VHWDFRQWWQPS，溶劑基聚氨酯特異性吸附肽序列為VHWDFRQWWQPS。
[0014]四、聚氨酯特異性親和肽的吸附效率和穩(wěn)定性測定
按照測序結(jié)果固相合成親和肽VHWDFRQWWQPS后，用FITC-NCO修飾親和肽末端氨基，透析除去未反應(yīng)的FITC分子，多肽溶液10uL加入聚氨酯包被的96孔板濕盒中4 0C吸附Ih，剩余溶液，加入100 uL PBST洗滌后合并，測定熒光強(qiáng)度；穩(wěn)定性測定為反復(fù)洗滌測定洗滌液熒光強(qiáng)度，作圖洗滌次數(shù)-吸附多肽百分率，或通過AFM跟蹤吸附多肽的分布形態(tài)。
[0015]實(shí)施例:
一、實(shí)驗(yàn)材料
O隨機(jī)十二肽噬菌體展示文庫100 μ?，1.5X1013 pfu/ml。貯存于含50 %甘油的TBS溶液中。復(fù)雜度~2.7 X 19個轉(zhuǎn)化子。
2)-28gill測序引物 5’-HOGTA TGG GAT TTT GCT AM CAA C-3’，100 pmol, I pmol/
μ?
3)-96 gill 測序引物 5，-HOCCC TCA TAG TTA GCG TAA CG-3，，100 pmol/μ?, Ipmol/M-1
4)E.coli ER2738宿主菌 F，IacIq Δ (lacZ)M15 proA+B+ zzf::Tn 10 (TetR)/fhuA2supE thi Δ (lac-proAB) Δ (hsdMS-mcrB) 5 (rk - m k - McrBC -)。該菌株以含 50% 甘油的菌體培養(yǎng)物形式提供，非感受態(tài)細(xì)胞。貯存于-70 °C。
5)鏈霉親和素Streptavidin,凍干粉1.5mg。
[0016]6)生物素，10 mM 100 M-1 Ph.D.TM 是 New England B1labs, Inc.的注冊商標(biāo)。
[0017]7)抗體。
[0018]8)水基脂肪族聚氨酯I3U-116購自安徽安科精細(xì)化工
9)溶劑基雙組分聚氨酯分別為聚丙烯酸樹脂(Hydroxyl-bearing polyacrylate,Desmophen A870)和聚異氰酸樹脂(Hexamethylene diisocyanate, Desmodur N3600)購自 Bayer。
[0019]10)人工合成多肽由上海強(qiáng)耀生物科技有限公司合成，純度90%以上。
[0020]二、實(shí)驗(yàn)步驟:
I)水基聚氨酯涂層的制備
將3 mL脂肪族水基聚氨酯PU-116 (購自安徽安科精細(xì)化工)加入細(xì)胞培養(yǎng)皿(35 mmX 12 mm購自Fisher Scientific)，水平靜置室溫24小時固化，之后置于70 °(:烘箱內(nèi)進(jìn)一步固化4小時取出待用。溶劑基聚氨酯涂層的制備:聚丙烯酸樹脂(Hydroxyl-bearingpolyacrylate, Desmophen A870)和聚異氰酸樹脂(Hexamethylene diisocyanate,Desmodur N3600)購自 Bayer。稱取 2.1 g 聚丙烯酸樹脂 Desmophen A870 于 20 mL 玻璃瓶中，再加入0.5 mL乙酸正丁酯,強(qiáng)力攪拌(1500 rpm) I分鐘,加入0.8 g聚異氰酸樹脂Desmodur N3600，繼續(xù)攪拌I分鐘。將混合物轉(zhuǎn)移加入至水平放置的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，將涂層靜置于通風(fēng)處內(nèi)10分鐘后放入70 0C烘箱，在該溫度下放置4小時使涂層聚合完全取出待用。
[0021]2)噬菌體12肽庫的親和篩選
加入含體積比0.1% Tween-20的TBST I mL洗滌6次，于潔凈面巾紙上扣干。以I mLTBST稀釋10 uL原始文庫液至4X10 10 pfu/mL，加入到清洗晾干后的含聚氨酯涂層的細(xì)胞培養(yǎng)皿內(nèi)，室溫溫和搖動60 min，傾倒出培養(yǎng)皿內(nèi)液體，扣干殘余溶液，并用4 mL TBST清洗10次，每次清洗后傾倒去緩沖溶液并在潔凈的面巾紙上扣干。向培養(yǎng)皿中加入I mL濃度為0.2 M的pH 2.2的甘氨酸?鹽酸Glycine-HCl緩沖液，于室溫溫和搖動10 min，洗脫液吸入另一干凈微量離心管中，然后再用150 uL pH 9.1的Tris-HCl中和上述洗脫液，測定少量洗脫液的滴度。剩余洗脫物根據(jù)常規(guī)M13方法進(jìn)行第一輪噬菌體洗脫物的擴(kuò)增，力口入到20 ml處于對數(shù)前期的ER2738菌體培養(yǎng)物中，37 °C劇烈搖動培養(yǎng)4.5小時，對擴(kuò)增后的噬菌體進(jìn)行分離純化并測定滴度。將第一輪篩選后的噬菌體擴(kuò)增液以I mL TBST稀釋至10 11 pfu/mL，并加入到預(yù)先制備聚氨酯的細(xì)胞培養(yǎng)皿中進(jìn)行第二輪到第五輪篩選(操作同上述第一輪篩選)，用含體積比0.5% Tween-20的TBST溶液清洗10次，同上進(jìn)行篩選后噬菌體的擴(kuò)增和滴度的測定。第三輪，第四輪和第五輪洗脫物滴度測定過程中對含有少于100個藍(lán)色噬菌斑的平板中單克隆的噬菌體進(jìn)行DNA測序。
[0022]3)噬菌體克隆的ELISA鑒定
ELISA檢測噬菌體展示短肽對靶分子的的結(jié)合活性:用20 uL水基聚氨酯包被ELISA板的每個孔，經(jīng)固化和0.1% Tween-20的TBST溶液清洗后，將經(jīng)過3輪和5輪篩選后的單克隆噬菌體進(jìn)行再次擴(kuò)增，取100 ul稀釋至10 11 pfu/mL的噬菌體在密封的濕盒中室溫溫和搖動吸附I h，TBST洗滌后，加入稀釋至工作濃度的抗M13-HRP結(jié)合物，室溫反應(yīng)I h，TBST充分洗滌，加入TMB底物顯色溶液，室溫30 min，后加50 uL濃度為12 M的H2SO4終止反應(yīng)，測定0D450 ；
4)噬菌體陽性克隆DNA的制備及序列測定
將噬菌體陽性克隆提取其單鏈DNA后，用-96 gill測序引物交由上海生物工程有限公司測序，以推測其相應(yīng)的水基聚氨酯特異性吸附肽序列為VHWDFRQWWQPS，溶劑基聚氨酯特異性吸附肽序列為VHWDFRQWWQPS。
[0023]5)化學(xué)合成多肽
采用固相合成法合成上述多肽有上海強(qiáng)耀生物科技有限公司合成，純度90%以上。
[0024]6)聚氨酯特異性親和肽的吸附效率和穩(wěn)定性測定
按照測序結(jié)果固相合成親和肽VHWDFRQWWQPS后，用FITC-NCO修飾親和肽末端氨基，透析除去未反應(yīng)的FITC分子，多肽溶液10uL加入聚氨酯包被的96孔板濕盒中4 0C吸附Ih，剩余溶液，加入100 uL PBST洗滌后合并，測定熒光強(qiáng)度；穩(wěn)定性測定為反復(fù)洗滌測定洗滌液熒光強(qiáng)度，作圖洗滌次數(shù)-吸附多肽百分率，或通過AFM跟蹤吸附多肽的分布形態(tài)。
[0025]以上所述僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員對本發(fā)明的技術(shù)方案所做的其它修改或者等同替換，只要不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的精神和范圍，均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍當(dāng)中。
【權(quán)利要求】
1.聚氨酯界面特異性親和多肽，其特征在于它包含VHWDFRQffffQPS特異性氨基酸序列的親和肽。
2.聚氨酯界面特異性親和多肽的篩選方法，其特征在于它的篩選方法為:分別以水基聚氨酯和溶劑基聚氨酯涂層材料為靶界面，利用噬菌體展示技術(shù)篩選與靶界面特異親和的肽，包括噬菌體12肽庫的親和篩選，噬菌體克隆的ELISA鑒定，最后噬菌體陽性克隆DNA的制備及序列測定。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的聚氨酯界面特異性親和多肽的篩選方法，其特征在于它的具體篩選方法為: (一)、噬菌體12肽庫的親和篩選 (1)水基聚氨酯涂層的制備:將3mL脂肪族水基聚氨酯TO-116加入細(xì)胞培養(yǎng)皿，水平靜置室溫24小時固化，之后置于70 0C烘箱內(nèi)進(jìn)一步固化4小時取出待用。
4.溶劑基聚氨酯涂層的制備:聚丙烯酸樹脂DesmophenA870和聚異氰酸樹脂Desmodur N3600,稱取2.1 g聚丙烯酸樹脂Desmophen A870于20 mL玻璃瓶中，再加入0.5mL乙酸正丁酯,強(qiáng)力攪拌1500 rpm、l分鐘,加入0.8 g聚異氰酸樹脂Desmodur N3600,繼續(xù)攪拌I分鐘，將混合物轉(zhuǎn)移加入至水平放置的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，將涂層靜置于通風(fēng)處內(nèi)10分鐘后放入70 0C烘箱，在該溫度下放置4小時使涂層聚合完全取出待用； (2)親和篩選:加入含體積比0.1% Tween-20的TBST I mL洗滌6次，于潔凈面巾紙上扣干；以I mL TBST稀釋10 uL原始文庫液至4X10 10 pfu/mL，加入到清洗晾干后的含聚氨酯涂層的細(xì)胞培養(yǎng)皿內(nèi)，室溫溫和搖動60 min，傾倒出培養(yǎng)皿內(nèi)液體，扣干殘余溶液，并用4 mL TBST清洗10次，每次清洗后傾倒去緩沖溶液并在潔凈的面巾紙上扣干；向培養(yǎng)皿中加入I mL濃度為0.2 M的pH 2.2的甘氨酸.鹽酸Glycine-HCl緩沖液，于室溫溫和搖動10 min，洗脫液吸入另一干凈微量離心管中，然后再用150 uL pH 9.1的Tris-HCl中和上述洗脫液，測定少量洗脫液的滴度，剩余洗脫物根據(jù)常規(guī)M13方法進(jìn)行第一輪噬菌體洗脫物的擴(kuò)增，加入到20 ml處于對數(shù)前期的ER2738菌體培養(yǎng)物中，37 °C劇烈搖動培養(yǎng)4.5小時，對擴(kuò)增后的噬菌體進(jìn)行分離純化并測定滴度；將第一輪篩選后的噬菌體擴(kuò)增液以I mL TBST稀釋至10 11 pfu/mL，并加入到預(yù)先制備聚氨酯的細(xì)胞培養(yǎng)皿中進(jìn)行第二輪到第五輪篩選，操作同上述第一輪篩選，用含體積比0.5% Tween-20的TBST溶液清洗10次，同上進(jìn)行篩選后噬菌體的擴(kuò)增和滴度的測定；第三輪，第四輪和第五輪洗脫物滴度測定過程中對含有少于100個藍(lán)色噬菌斑的平板中單克隆的噬菌體進(jìn)行DNA測序； (二 )、噬菌體克隆的ELISA鑒定 ELISA檢測噬菌體展示短肽對靶分子的的結(jié)合活性:用20 uL水基聚氨酯包被ELISA板的每個孔，經(jīng)固化和0.1% Tween-20的TBST溶液清洗后，將經(jīng)過3輪和5輪篩選后的單克隆噬菌體進(jìn)行再次擴(kuò)增，取100 ul稀釋至10 11 pfu/mL的噬菌體在密封的濕盒中室溫溫和搖動吸附I h，TBST洗滌后，加入稀釋至工作濃度的抗M13-HRP結(jié)合物，室溫反應(yīng)I h，TBST充分洗滌，加入TMB底物顯色溶液，室溫30 min，后加50 uL濃度為12 M的H2SO4終止反應(yīng)，測定0D450 ； (三)、噬菌體陽性克隆DNA的制備及序列測定 將噬菌體陽性克隆提取其單鏈DNA后，用-96 gill測序引物交由上海生物工程有限公司測序，以推測其相應(yīng)的水基聚氨酯特異性吸附肽序列為VHWDFRQWWQPS，溶劑基聚氨酯特異性吸附肽序列為VHWDFRQWWQPS ； (四)、聚氨酯特異性親和肽的吸附效率和穩(wěn)定性測定 按照測序結(jié)果固相合成親和肽VHWDFRQWWQPS后，用FITC-NCO修飾親和肽末端氨基，透析除去未反應(yīng)的FITC分子，多肽溶液10uL加入聚氨酯包被的96孔板濕盒中4 0C吸附Ih，剩余溶液，加入100 uL PBST洗滌后合并，測定熒光強(qiáng)度；穩(wěn)定性測定為反復(fù)洗滌測定洗滌液熒光強(qiáng)度，作圖洗滌次數(shù)-吸附多肽百分率，或通過AFM跟蹤吸附多肽的分布形態(tài)。
【文檔編號】C07K7/08GK104447956SQ201410644033
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年11月14日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月14日
【發(fā)明者】楊柳, 張立挺 申請人:陜西天瑞生物科技有限公司