抑制腫瘤細胞增殖的多肽類似物和對應(yīng)的編碼cDNA及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及多肽類似物，特別涉及一種抑制腫瘤細胞增殖的多肽類似物和對應(yīng)的 編碼cDNA及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] NS蛋白又稱為鳥苷酸結(jié)合蛋白樣3(guanine nucleotide binding protein-like 3，GNL3)，其在胚胎發(fā)生、組織再生和腫瘤的發(fā)生等過程中均扮演重要的角色，NS蛋白的這 些功能與其促進細胞周期進程的功能密不可分。NS蛋白的表達和腫瘤的惡性程度有密切的 關(guān)系，干擾NS蛋白的表達可引起這些腫瘤增殖能力的普遍下降。因此，NS蛋白已成為防治腫 瘤藥物研制的重要靶點之一。
[0003] 近年來有研究表明，NS蛋白可通過與抑癌基因相互作用，抑制抑癌基因的功能，促 進腫瘤的發(fā)展。例如，NS蛋白與P53相互作用，使P53表達下調(diào)，可通過抑制P21基因的轉(zhuǎn)錄促 進細胞的過度增殖，也可通過影響B(tài)cl-2蛋白家族的功能而抑制凋亡，誘導(dǎo)腫瘤的產(chǎn)生。
[0004] p27是重要的細胞周期G1周期蛋白抑制因子，其可以結(jié)合⑶K4-Cyclin D復(fù)合物， 抑制后者的活性和細胞周期G1-S期轉(zhuǎn)換，從而抑制腫瘤細胞的增殖。本專利公布的數(shù)據(jù)表 明，腫瘤中，NS蛋白可與p27發(fā)生相互作用，促進腫瘤細胞中p27的降解。導(dǎo)致腫瘤細胞的過 度增殖和發(fā)展。因此，阻斷NS蛋白與抑癌基因 p27的相互作用成為我們尋找抗腫瘤藥物的新 策略。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種抑制腫瘤細胞增殖的多肽類似物及應(yīng)用，至少能夠解決 上述問題之一。
[0006] 為實現(xiàn)上述目的，根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供了一種抑制腫瘤細胞增殖的多肽 類似物，其氨基酸序列如序列表SEQ NO. 1所示：。抑制腫瘤細胞增殖的多肽類似物用于干擾 NS蛋白與p27相互作用。
[0007] 相應(yīng)地，本發(fā)明還提供了上述抑制腫瘤細胞增殖的多肽類似物的應(yīng)用，在制備抗 腫瘤藥物的應(yīng)用。
[0008] 相應(yīng)地，本發(fā)明還提供了上述抑制腫瘤細胞增殖的多肽類似物的編碼cDNA序列， 其序列如序列表SEQ NO. 1所示。
[0009] 相應(yīng)地，本發(fā)明還提供了上述抑制腫瘤細胞增殖的多肽類似物的編碼cDNA序列的 應(yīng)用，在制備抗腫瘤藥物的應(yīng)用。
[0010]本發(fā)明的有益效果為:本發(fā)明基于腫瘤中核仁蛋白燦(31608七6111；[11(吧)與細胞周期 蛋白依賴性激酶抑制蛋白（CKI)成員p27kipl(簡稱P27)相互作用結(jié)構(gòu)域的確立，利用基因 工程方法構(gòu)建出了多肽類似物NS 118_288aa。本發(fā)明多肽類似物能夠阻斷NS蛋白和p27的相互 作用，抑制NS蛋白對p27降解，從而發(fā)揮抑制腫瘤細胞的過度增殖的功能?？蔀槟[瘤治療靶 點的探尋提供理論依據(jù)，對于應(yīng)用于腫瘤的臨床治療具有十分重要的開發(fā)前景。
【附圖說明】
[0011] 圖1、圖1A為p27和NS蛋白進行免疫沉淀的免疫沉淀復(fù)合物檢測實驗結(jié)果圖，圖1B 為免疫熒光分析NS蛋白和p27在肝癌細胞中的共定位情況；
[0012] 圖2、圖2上部為NS蛋白的不同截斷片段，圖2下部為免疫沉淀結(jié)果檢測圖；
[0013] 圖3、步驟S102中重組真核表達載體圖譜；
[0014]圖4、步驟S102中HepG2細胞系中免疫印跡證明多肽的蛋白表達實驗結(jié)果圖；
[0015]圖5、步驟S103中免疫印跡表明HepG2細胞系中多肽類似物阻斷NS和p27的相互作 用實驗結(jié)果圖；
[0016]圖6、步驟S104中免疫印跡表明HepG2細胞系中多肽類似物抑制NS對p27的降解實 驗結(jié)果圖；
[0017] 圖7、步驟S201中流式細胞儀測定HEP3B細胞系中多肽類似物阻滯細胞周期進程實 驗結(jié)果圖；
[0018] 圖8、步驟S202中轉(zhuǎn)染以及未轉(zhuǎn)染細胞細胞培養(yǎng)表明細胞系中多肽類似物抑制腫 瘤細胞增殖實驗結(jié)果圖。
[0019] 圖9、步驟S203中未轉(zhuǎn)染及穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Flag-NS118~288aa表達質(zhì)粒的HepG2細胞體內(nèi)形 成腫瘤實驗結(jié)果圖。
【具體實施方式】
[0020] 下面結(jié)合附圖對本發(fā)明作進一步詳細的說明。
[0021] 本發(fā)明提供了一種抑制腫瘤細胞增殖的多肽類似物，其氨基酸序列如序列表SEQ NO. 1所示。抑制腫瘤細胞增殖的多肽類似物用于干擾NS蛋白與p27相互作用。上述抑制腫瘤 細胞增殖的多肽類似物可應(yīng)用于制備抗腫瘤藥物。
[0022] 相應(yīng)地，本發(fā)明還提供了上述抑制腫瘤細胞增殖的多肽類似物的編碼cDNA序列， 其序列如序列表SEQ N0.2所示。本發(fā)明還提供了上述抑制腫瘤細胞增殖的多肽類似物的編 碼cDNA序列在制備抗腫瘤藥物的應(yīng)用。
[0023] 一、以下為NS蛋白與p27相互作用的驗證。
[0024] (1) p27和NS蛋白在肝癌細胞中存在直接的相互作用及細胞內(nèi)共定位。
[0025] 將肝癌組織進行組織以IP裂解液（50mM Tris-HCl pH8.0、150mM NaCl、l%NP-40、 5mM EDTA、20mM MgC12、lXRoche phosphatase&Protease inhibitor cocktail)裂解后， 分別以p27和NS蛋白進行免疫沉淀，檢測免疫沉淀復(fù)合物中是否有NS及p27。如圖1A所示，結(jié) 果表明，兩者在肝癌組織中存在相互作用。
[0026]免疫熒光分析NS蛋白和ρ27在肝癌細胞中的共定位情況。在Huh7和Hep3B肝癌細胞 系中，以Lipof ectamine 2000轉(zhuǎn)染NS-Flag載體，轉(zhuǎn)染36h后進行免疫熒光分析NS蛋白和p27 在肝癌細胞中的共定位情況。結(jié)果表明，如圖1B所示，NS蛋白和p27在肝癌細胞內(nèi)存在明顯 的共定位，且兩者均存在明顯的細胞核仁分布。
[0027] (2)NS蛋白通過其118-228片段和p27進行相互作用。
[0028]分別構(gòu)建NS蛋白的不同截斷片段，如圖2上部所示，將NS蛋白按照其結(jié)構(gòu)域分為1_ 123aa，118-228aa和289-550aa三個截斷片段。將這三個截斷片段均構(gòu)建至pCMV-N-Flag載 體中，將構(gòu)建好的NS蛋白截斷載體和p27-myc全長載體進行共轉(zhuǎn)染至293T細胞中。轉(zhuǎn)染36h 后，收集細胞進行免疫沉淀實驗，以Flag抗體進行免疫沉淀，分析NS的哪個片段可以和p27 存在相互作用。免疫沉淀結(jié)果表明，如圖2下部所示，NS 118_228aa截斷片段和p27存在直接相互 作用。
[0029 ]二、下述內(nèi)容為本發(fā)明的抑制腫瘤細胞增殖的多肽類似物的真核表達載體的重組 步驟。
[0030] S101、多肽類似物的克隆載體構(gòu)建。
[0031 ]以DMEM培養(yǎng)基添加10%胎牛血清體外培養(yǎng)人的Huh7肝癌細胞系，在細胞處于指數(shù) 生長期，添加 lml的Trizol裂解液提取Huh7細胞中的總RNA。將總RNA進行反轉(zhuǎn)錄成人的肝癌 細胞cDNA文庫，應(yīng)用PCR技術(shù)成功擴增出對應(yīng)的cDNA序列。擴增得到的片段與質(zhì)粒載體連 接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入感受態(tài)大腸桿菌中，在含Amp+瓊脂平板上挑選克隆質(zhì)粒，以堿裂解法小 提重組質(zhì)粒后，以EC0R1酶切鑒定。
[0032] S102、多肽類似物真核表達載體構(gòu)建及其表達檢測。
[0033]將S101的克隆質(zhì)粒和質(zhì)粒pCMV-N-Flag雙酶切后，利用回收試劑盒獲得目的片段 和載體連接。經(jīng)轉(zhuǎn)化、提取等步驟獲得重組真核表達載體Flag-NSm，譜如圖3所示。酶 切鑒定重組體，并且測序進一步確定，測序結(jié)果。將正確連接的多肽真核表達載體轉(zhuǎn)染腫瘤 細胞HepG2細胞系，48小時后搜集樣品