專利名稱：具有2′位醚基的核苷和低聚核苷酸的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及2′位羥基被多羥基衍生物醚化的核糖核苷類似物及其制備方法，還涉及含這些核苷的低聚核苷酸及核苷在制備分子內(nèi)帶有相同或不同核苷單元的低聚核苷酸時的應(yīng)用。
核苷和低聚核苷酸均為抗病毒活性成分，并且由于其與核酸能相互作用(“反義”低聚核苷酸)和相應(yīng)的生物活性而受到廣泛的關(guān)注。例如見Uhlmann，E.Peyman，A，chemical Reviews 90543-584(1990)。為制備具有新特點的核苷或改進天然核酸與反義低聚核苷酸的相互作用并提高它們對核酸酶的穩(wěn)定性，已有許多方法來修飾核苷的糖基(或低聚核苷酸的核苷酸單位)或低聚核苷酸中的核苷酸間磷酸鍵;例如見Marquez，V.Z.，Lim，M.I.，Medicinal Research Reviews 61-40(1986)，Nelene，C，Tonlme，J.J.，Biochimica et Biophysica Acta 104999-125(1990)，English，U.，Gams，D.H..Angewartte Chamie 103629-646(1991)，Natteutti，M.D.，Birchofberger，N.，Annual Reports in Medicinal Chemistry 2687-296(1991).Cook，P.D.，Anti-Cancer Drug Design 6585-60(1991)和WO91/06556描述了在糖的2′位羥基上已被修飾的核苷。所述修飾目的是提高對核酸酶的抵抗力;烷基越長，對核酸酶抵抗力就越強。人們發(fā)現(xiàn)，對于用短鏈的烷基如甲基、乙基、丙基的短烷基，鍵條和力略有提高，而對于較長鏈的烷基，鍵親和力急劇下降。具有作為2′位羥基側(cè)鏈的多羥基衍生物的核苷尚未見報道并從未與低聚核苷酸歸如一類。令人驚奇的是，按本發(fā)明進行的修飾不僅對較短的鏈的情況下面且在較長鏈的情況下都提高了互補RNA的鍵親和力。該結(jié)果無法用已知數(shù)據(jù)來預(yù)測。同樣，對于2′位羥基修飾的低聚核苷酸，本發(fā)明的化合物由于其對核酸酶優(yōu)越的抵抗力而與眾不同。除此之外，包含本發(fā)明所述核苷的低聚核苷酸有增多的細胞吸收而且因此具有體內(nèi)較好的生物利用度和活性。
本發(fā)明涉及式Ⅰ化合物 式中，R1和R2互相獨立地為氫原子或保護基團或R1為哪些定義，R2為形成一含磷核苷酸橋鍵的基團B為嘌呤或嘧啶基團或其類似物;
R3為式Ⅰa、Ⅰb、Ⅰc基團
式中，R4為氫，C1-C21烷基，C2-C21鏈烯基，C2-C21炔基或-C(＝O)-烷基;
R5為氫，C1-C10烷基，-CH2-O-R6或式Ⅰb基;
R6為氫，C1-C22烷基，C3-C21鏈烯基或部分或全部氟取代的C1-C10烷基或[(CH2)2-O]m-R7;
R7為氫或C1-C21烷基;
Z為-(CH2)p-或-(CH2-CH2-O)q-CH2-CH2-，其中-CH2-不被取代或被一個或多個，相同或不同的C1-C10烷基;C5-C6環(huán)烷基，未取代或為C1-C4烷基取代的苯基取代。
n為1-12;
m為1-4;
p為1-10;
q為1-4;
當n＝1，R5為氫時，R4不能是氫R4優(yōu)選為氫，C1-C21烷基，C2-C21鏈烯基或C2-C21炔基。R4更為優(yōu)選為氫，C1-C8烷基，C2-C8鏈烯基或C2-C8炔基。R4特別優(yōu)選為氫或C1-C4烷基，例如R4為甲基、乙基，正或異丙基，正、異和叔丁基，和戊基的異構(gòu)體，己基，庚基，辛基，壬基，癸基，十一烷基，十二烷基，十三烷基，十四烷基、十五烷基，十六烷基，十七烷基，十八烷基，十九烷基，二十烷基，乙烯基，烯丙基，3-烯-1-丁基，2-烯-1-丁基，戊烯基，辛烯基，十二烯基，十八烯基，乙炔基，1-炔基-1-丙基，1-炔基-3-丙基，1-炔基-1-丁基或1-炔基-4-丁基。R4基特別優(yōu)選為氫、甲基、乙基、正或異丙基、正丁基。n值優(yōu)選1-8，更為優(yōu)選1-6，特別優(yōu)選1-3。
R5優(yōu)選氫、C1-C5烷基或-CH2-O-R6，特別優(yōu)選氫，甲基或-CH2-OH，-CH2-O-C1-C22烷基或-CH2-O-[(CH2)2-O]m-C1-C10烷基，其中m為1-4。
R1和R2優(yōu)選為氫。
保護基團及衍生含有這些保護基團的羥基的方法已經(jīng)在糖化學(xué)和核苷酸化學(xué)中公開并有所描述，例如Greene，B.T.，“在有機合成中的保護基團”，Wiley Interscience，New York(1991)，Sonveawx，E，Bioorganic Chemistry 14274-325(1986)或Beaacage，S.L.，Iyer，R.，Tetrahedron 482223-2311(1992)，這些保護基團舉例如下苯甲基、甲基苯甲基、二甲基苯甲基、甲氧基苯甲基，二甲氧基苯甲基、溴代苯甲基、2，4-二氯苯甲基;二苯基甲基，二(甲基苯基)甲基，二(二甲基苯基)甲基，二(甲氧基苯基)甲基，二(二甲氧基苯基)甲基，三苯基甲基，三-4，4′，4″-叔-丁基苯基甲基，二-對-甲氧苯基苯基甲基，三(甲基苯基)甲基，三(二甲基苯基)甲基，甲氧基苯基(二苯基)甲基，二(甲氧基苯基)苯基甲基，三(甲氧基苯基)甲基，三(二甲氧基苯基)甲基;三苯基甲硅烷基，烷基二苯基甲硅烷基，二烷基苯基甲硅烷基和三烷基甲硅烷基，在其烷基基團中烷基為C1-C20，優(yōu)選C1-C12特別優(yōu)選C1-C8烷基，如三甲基甲硅烷基，三乙基甲硅烷基，三-正丙基甲硅烷基，異丙基-二甲基甲硅烷基，叔丁基-二甲基甲硅烷基，叔丁基-二苯基甲硅烷基，正-辛基-二甲基甲硅烷基，(1，1，2，2-四甲基乙基)-二甲基甲硅烷基;-(C1-C8烷基)2Si-O-Si(C1-C8烷基)2-，例如，式中烷基為甲基，乙基，正和異丙基或正、異或叔丁基;C2-C12酰基，特別是C2-C8酰基，如乙酰基，丙?；?，丁酰基，戊酰基，己?；?，苯甲酰基，甲基苯甲?；?，甲氧基苯甲?；?，氯苯甲酰基和溴苯甲?；?Rs1-SO2-，式中Rs1為C1-C12烷基，特別為C1-C6烷基，C5或C6環(huán)烷基，苯基，苯甲基，C1-C12烷基苯基，特別為C1-C4烷基苯基，或C1-C12烷基苯甲基，特別為C1-C4烷基苯甲基，或鹵代苯基或鹵代苯甲基，例如甲基-，乙基-，丙基-，丁基-，苯基-，苯甲基-，對-溴代-，對甲氧基-和對甲基苯基-磺?；?C1-C12烷氧基羰基，優(yōu)選為C1-C8烷氧基羰基，其中，其可未取代或被F，Cl，Br，C1-C4烷氧基，三(C1-C4烷基)-甲硅烷基或C1-C5烷基磺?；〈?，如甲氧基-，乙氧基-，正或異丙氧基-，正、異或叔丁氧羰基，2-三甲基甲硅烷基乙氧羰基，2-甲基磺?；已豸驶┍趸驶?，或苯氧基羰基或苯甲氧基羰基，其中，烷氧羰基可未取代或被取代，如，甲基-，甲氧基-，氯苯氧基羰基或甲基-，甲氧基-，氯苯甲氧基羰基和9-芴基甲氧基羰基。如果R1和/或R2為烷基，它們可被氟，氯，溴，C1-C4烷氧基，苯氧基，氯苯氧基，甲氧苯氧基，苯甲氧基，甲氧苯甲氧基或氯苯氧基取代。式Ⅰ中R1和R2可為相同的或不同的保護基團。
R1和R2作為保護基團，優(yōu)選苯甲基，甲基苯甲基，二甲基苯甲基，甲氧基苯甲基，二甲氧基苯甲基，鹵代苯甲基，特別是溴苯甲基;二苯基甲基，二(甲基苯基)甲基，二(二甲基苯基)甲基，二(甲氧基苯基)甲基，二(甲氧基苯基)(苯基)甲基，三苯基甲基，三-4，4′，4″-叔-丁基苯基甲基，二-對-甲氧苯基苯基甲基，三(甲基苯基)甲基，三-(二甲基苯基)甲基，三(甲氧基苯基)甲基，三(三甲氧基苯基)甲基;三甲基甲硅烷基，三乙基甲硅烷基，三-正-丙基甲硅烷基，異丙基-二甲基甲硅烷基，叔丁基二甲基甲硅烷基，叔丁基二苯基甲硅烷基，正-辛基二甲基甲硅烷基，(1，1，2，2-四甲基乙基)-二甲基甲硅烷基，-(CH3)2Si-O-Si(CH3)2-，-(iso-C3H7)2Si-O-Si(iso-C3H7)2-;乙酰基，丙?；□；?，戊?；?，己?；?，苯甲?；?，甲基苯甲?；籽趸郊柞；?，氯苯甲酰基和溴苯甲?；?甲基，乙基，丙基，丁基、苯基、苯甲基、對-溴代-，對-甲氧基-和對-甲基-苯基磺?；?甲氧基-，乙氧基-，正或異丙氧基-，正、異或叔丁氧基羰基，或苯氧基羰基，苯甲氧基羰基，甲基或甲氧基或氯苯氧基羰基或甲基或甲氧基或氯苯甲氧基羰基或9-芴基甲氧基羰基，在這種條件下，R1和R2為相同的保護基團較好。
R2作為含磷的，構(gòu)成核苷酸橋基的殘基與式P1或P2相對應(yīng)， 式中，Ya為氫，C1-C12烷基，C6-C12芳基，C7-C20芳烷基，C7-C20烷芳基，-ORb，-SRb，-NH2、伯氨基、仲氨基，O M 或S M ;
Xa為氧或硫;
Ra為氫，M ，C1-C12烷基，C2-C12鏈烯基、C6-C12芳基，或RaO-基團為有5個環(huán)和1-3個氮原子的N-雜芳基-N-基。
Rb為氫，C1-C12烷基或C6-C12芳基;
M 為Na ，K ，Li 、NH4 或-伯、仲、叔或季銨;
在Ya、Ra和Rb中的烷基，芳基，芳烷基和烷芳基或未被取代，或被烷氧基，烷硫基，鹵素，-CN，-NO2、苯基，硝基苯基或鹵代苯基取代。
Ya包含的伯氨基，優(yōu)選含1-12，特別優(yōu)選含1-6個碳原子，其所包含的仲氨基，優(yōu)選含2-12，特別優(yōu)選含2-6個碳原子。
例如，伯氨基和仲氨基為式RcRdN殘基，其中Rc為氫，或獨立地具有Rd的定義，而Rd為C1-C20，優(yōu)選C1-C12，特別優(yōu)選C1-C6烷基，C1-C20，優(yōu)選C1-C12-，特別優(yōu)選C1-C6-氨基烷基或C1-C20-，優(yōu)選C1-C12，特別優(yōu)選C1-C6-羥基烷基;羧基烷基或烷氧羰基烷基，烷氧羰基基團含2-8個碳原子和烷基含1-6，優(yōu)選1-4個碳原子;C2-C20，優(yōu)選C2-C12-，特別優(yōu)選C2-C6鏈烯基;苯基，單一或二-(C1-C4-烷基或C1-C4烷氧基)苯基、苯甲基，單或二-(C1-C4烷基或C1-C4烷氧基)苯甲基;或1，2-，1，3-或1，4-咪唑基-C1-C6烷基，或Rc和Rb同為四或五一亞甲基，3-惡-1，5-戊二烯亞戊基，-CH2-NRe-CH2CH2-或-CH2CH2-NR19-CH2CH2-，其中Re為氫或C1-C4烷基。氨基烷基中的氨基可被一或二個C1-C4烷基或C1-C4羥基烷基取代。羥基烷基中的羥基可被C1-C4烷基醚化。
Ya的伯、仲、叔和季銨，按M+的定義，可理解為它是式RfRgRhRiN 的離子，其中Rf為C1-C20、優(yōu)選C1-C12、特別優(yōu)選C1-C6-烷基，C1-C20，優(yōu)選C1-C12，特別優(yōu)選C1-C6-氨基烷基，C1-C20-、優(yōu)選C1-C12-;特別優(yōu)選C1-C6-羥基烷基;羧基烷基或烷氧羰基烷基，含2-8碳原子的烷氧羰基，和含1-6，優(yōu)選1-4碳原子的烷基;C2-C20-、優(yōu)選C2-C12-、特別優(yōu)選C2-C6-鏈烯基;苯基;一或二(C1-C4烷基或C1-C4烷氧基)苯基，苯甲基、一或二-(C1-C4烷基或C1-C4烷氧基)苯甲基;或1，2-，1，3-或1，4-咪唑基-C1-C6-烷基，和Rg，Rh和Ri為相互獨立的氫或有Rf的定義，或Rf和Rg均為四-或五-亞甲基，3-惡-1，5-戊二烯亞戊基，-CH2-NRe-CH2CH2-或-CH2CH2-NRe-CH2CH2-，其中Re為氫或C1-C4烷基;Rh和Ri相互獨立，其中一個有Rf的定義。氨基烷基中的氨基可被一或二個C1-C4烷基或C1-C4羥基烷基取代。羥基烷基中的羥基可被C1-C4烷基醚化。
羧基烷基的實例為羰基甲基，羧基乙基，羧基丙基和羧基丁基，烷氧基羰基烷基的實例為被甲基或乙基酯化的羧基烷基基團。鏈烯基的實例為烯丙基，1-烯基-3-或4-丁基、3-或4-烯基-1或2-戊基，3-或4-或5-烯基-1-或2-己基，烷基-、烷氧-苯基、烷基-和烷氧-苯甲基的實例如甲基苯基，二甲基苯基，乙基苯基，二乙基苯基;甲基苯甲基，二甲基苯甲基，乙基苯甲基，二乙基苯甲基，甲氧基苯基，二甲氧基苯基，乙氧基苯基，二乙氧基苯基、甲氧苯甲基，二甲氧基苯甲基，乙氧基苯甲基和二乙氧苯甲基。烷基優(yōu)選含2-4個碳原子的咪唑烷基的實例如1，2-，1，3-或1，4-咪唑-乙基或正-丙基或正-丁基，R19優(yōu)選氫、甲基或乙基。
伯和仲氨基優(yōu)選的實例為甲基-、乙基-、二甲基-、二乙基-、二異丙基-，一或二-(1-羥基-2-乙基)-，苯基-和苯甲基氨基，乙酰基氨基，苯酰基氨基，哌啶基，哌嗪基和嗎啉基。
伯和仲銨的優(yōu)選實例為甲基-，乙基-、二甲基、二乙基-，二異丙基-、一或二(1-羥基-2-乙基)-，苯基和苯甲基銨。
Ya、Ra和Rb為烷基的實例如甲基、乙基和丙基、丁基、戊基、己基、庚基、丁基的異構(gòu)體;Ya、Ra和Rb為芳基的實例為苯基和萘基;Ra為鏈烯基的實例為烯丙基和(C1-C4烷基)CH＝CH-CH2-.Ya為芳烷基的實例為苯基-CnH2n-，其中n為1-6，特別為苯甲基;Ya為烷芳基的實例為一、二和三(C1-C4烷基)苯基。取代基優(yōu)選氯、溴，甲氧基，-NO2，-CN，2，4-二氯苯基和4-硝基苯基，Rb的實例為2，2，2-三氯乙基，4-氯苯基，2-氯苯基和2，4-二氯苯基;RbO為N-雜芳基的實例為吡咯N-基，三唑-N-基和苯并三唑-N-基。
Ra特別優(yōu)選β-氰乙基和Ya特別優(yōu)選二(異丙基氨基)。
如果B為嘌呤基團或其類似物，其可為式Ⅱ、Ⅱa、Ⅱb、Ⅱc、Ⅱd、Ⅱe或Ⅱf殘基。

其中Rb1為H、Cl、Br、OH或-O-C1-C12烷基，Rb2，Rb3和Rb5為相互獨立的H、OH、SH、NH2、NHNH2，NHOH，NHO-C1-C12烷基，-N＝CH-N(C1-C12烷基)2，-N＝CH-N-環(huán)烷基，F(xiàn)，Cl，Br，C1-C12烷基，羥基-C1-C12烷基，氨基-C1-C12烷基，C1-C12烷氧基，苯甲氧基或C1-C12烷硫基-，未被取代或被保護基團取代的羥基和氨基，或苯基、苯甲基、C1-C20的伯基或C2-C30的仲氨基。
Rb4為氫、CN或-C＝C-Rb7，Rb6和Rb7為氫或C1-C4烷基，理想的保護基團如前所述，優(yōu)選的保護基團為C1-C8?；?，如乙?；；⒍□；捅郊柞；b6優(yōu)選氫或甲基。
伯氨基優(yōu)選含1-12個，特別優(yōu)選1-6個碳原子，仲氨基優(yōu)選含2-12個，特別優(yōu)選2-6個碳原子。
一些優(yōu)選含C1-C6的烷基，烷氧基、烷硫基，羥基烷基和氨基烷基的實例為甲基，乙基和丙基，丁基，戊基，己基，庚基，丁基，壬基，癸基，十一烷基，和十二烷基的異構(gòu)體，還有其相應(yīng)的烷氧基，烷硫基，羥基烷基和氨基烷基。烷基、烷氧基，烷硫基，羥基羰基和氨基烷基，其中烷基特別優(yōu)選含1-4個碳原子。烷基、烷氧基、烷硫基、羥基烷基和氨基烷基優(yōu)選為甲基、乙基、正和異丙基、正、異和叔丁基，甲氧基，乙氧基，甲硫基和乙硫基，氨基甲基，氨基乙基，羥甲基和羥乙基。
例如，伯氨基和仲氨基為式Ra1，Ra2N的殘基，式中Ra1為氫，或獨立地有Ra2的定義，Ra2為C1-C20-，優(yōu)選C1-C12-;特別優(yōu)選C1-C6烷基，C1-C20-，優(yōu)選C1-C12-，特別優(yōu)選C1-C6氨基烷基，C1-C20-，優(yōu)選C1-C12-，特別優(yōu)選C1-C6-羥烷基;羧烷基或烷氧基羰基烷基，含2-8個碳原子的烷氧基羰基和含1-6個碳原子，優(yōu)選1-4個碳原子的烷基;C2-C20-，優(yōu)選C2-C12-、特別優(yōu)選C2-C6-鏈烯基;苯基，一或二(C1-C4-烷基或C1-C4烷氧基)苯基，苯甲基，一或二(C1-C4烷基或C1-C4烷氧基)苯甲基;或1，2-，1，3-，1，4-咪唑基-C1-C6烷基，或Ra1和Ra2一起為四或五亞甲基，3-惡-1，5-戊二烯亞戊基，-CH2-NRa3-CH2CH2-或-CH2CH2-NRa3-CH2CH2-，式中Ra3為氫或C1-C4烷基，氨基烷基中氨基可被一或二個C1-C4烷基或C1-C4羥烷基取代。羥烷基中的羥基可被C1-C4烷基醚化。
烷基的實例如前所述。氨基烷基的實例為氨甲基、氨乙基、1-氨-2-丙基或3-丙基，1-氨基-2-丁基、-3-丁基或-4-丁基，N-甲基或N，N-二甲基或N-乙基或N，N-二乙基或N-2-羥乙基或N，N-二-2-羥基-乙基-氨甲基、氨乙基、氨丙基或氨丁基。羥烷基的實例為羥甲基，1-羥基-2-乙基，1-羥基-2-丙基或-3-丙基和1-羥基-2-丁基-3-丁基、或-4-丁基。羧烷基的實例為羧甲基、羧乙基、羧丙基和羧丁基，烷氧基羰基烷基的實例為那些被甲基或乙基酯化的烷氧羰基。鏈烯基的實例為烯丙基、1-烯基-3-或-4-丁基，-3-或-4-烯基-1-或-2-戊基，-3-或-4-或-5-烯基-1-或-2-己基。烷基和烷氧基苯基與烷基和烷氧基苯甲基的實例為甲苯基、二甲苯基、乙苯基、二乙苯基、甲基苯甲基、二甲基苯甲基、乙基苯甲基、二乙基苯甲基、甲氧基苯基、二甲氧基苯基、乙氧基苯基、二乙氧基苯基，甲氧基苯甲基、二甲氧基苯甲基、乙氧基苯甲基和二乙氧基苯甲基。烷基優(yōu)選含C2-C4的咪唑烷基的實例為1，2-，1，3-，1，4-咪唑基-乙基或正丙基或正丁基。Ra3優(yōu)選為氫、甲基或乙基。
伯和仲氨基優(yōu)選實例為甲基、乙基，二甲基、二乙基、烯丙基、一或二(1-羥基-2-乙基);苯基和苯甲基氨基，乙酰氨基，異丁?；捅郊柞０被?br> Rb1優(yōu)選為氫，Rb5有時優(yōu)選為氫，更為優(yōu)選的是Rb2和Rb3為相互獨立的H、F、Cl、Br、OH、SH、MH2、NHOH、NHNH2，甲氨基，二甲氨基、苯甲酰氨基、異丁酰氨基、甲氧基、乙氧基和甲硫基。
嘌呤類似物系列的一些實例，除嘌呤外，有黃嘌呤，次黃嘌呤，腺嘌呤，N-甲基-腺嘌呤，N-苯甲?；?腺嘌呤，2-甲硫基腺嘌呤，2-氨基腺嘌呤，6-羥基嘌呤，2-氨基-6-氯嘌呤，2-氨基-6-甲硫基嘌呤，鳥嘌呤，N-異丁酰鳥嘌呤。特別優(yōu)選腺嘌呤，2-氨基腺嘌呤，鳥嘌呤和其堿基保護的衍生物。
如果式Ⅰ中B為嘧啶基，則其優(yōu)選為式Ⅲ、Ⅲa或Ⅲc的尿嘧啶，胸腺嘧啶或胞嘧啶或它們的二氫衍生物，
其中Rb6為氫或C1-C4烷基，Rb8為H，OH，SH，NH2，NHNH2，NHOH，NH-C1-C12烷基，-N＝CH-N(C1-C12烷基)2，N＝CH-N-環(huán)烷基，F(xiàn)，Cl，Br，C1-C12烷基，羥基-C1-C12烷基，氨基-C1-C12烷基，C1-C12烷氧基，苯甲氧基或C1-C12烷硫基，羥基和氨基可不被取代或被保護基團所取代，Rb8還可為苯基、苯甲基、含1-20個碳原子的伯氨基，含2-30個碳原子的仲氨基，C1-C12鏈烯基或C1-C12炔基，式Ⅲb中的NH2基可未被取代或被C1-C6烷基，苯甲酰基或保護基團所取代。式Ⅲ的Rb8優(yōu)選為氫，C1-C6烷基或C1-C6羥烷基，C1-C6鏈烯基或C2-C6炔基，F(xiàn)，Cl，Br2，NH2，苯甲酰氨基，或一或二-C1-C6烷基氨基。式Ⅲb和Ⅲc的Rb8為優(yōu)選為氫、C1-C6烷基或C1-C6烷氧基或C1-C6羥烷基，C1-C6鏈烯基或C1-C6炔基，F(xiàn)，Cl，Br，NH2，苯甲酰氨基或一或二-C1-C6烷基氨基。
Rb6優(yōu)選為氫或甲基，式Ⅲ的Rb8優(yōu)選H、F、Cl，Br，MH2，NHCH3，N(CH3)2，C1-C4烷基，C2-C4鏈烯基或C2-C4炔-1-基，式Ⅲb和Ⅲc的Rb8優(yōu)選氫，C1-C4烷基，特別優(yōu)選甲基，C2-C4鏈烯基，特別是乙烯基或C2-C4炔-1-基，特別是1-丙塊-1-基，式NH2，NHCH3或(CH3)2N。
嘧啶類似物的實例為尿嘧啶，胸腺嘧啶、胞嘧啶，5-氟尿嘧啶，5-氯尿嘧啶，5-溴尿嘧啶，二氫尿嘧啶，5-甲基胞嘧啶，5-丙炔胸腺嘧啶和5-丙炔胞嘧啶。
本發(fā)明也涉及式Ⅰ化合物制備方法 其中，R1和R2為相互獨立的氫或保護基團或R1有這些定義而R2為構(gòu)成含磷核苷酸橋鍵的殘基;B為嘌呤或嘧啶基或其類似物，和(a)R3為式Ⅰa基團
其中，R4為氫、C1-C21烷基，C2-C21鏈烯基，C2-C21炔基，或-C(＝O)烷基;
R5為氫、C1-C10烷基、-CH2-O-R6或式Ⅰb殘基;
R6為氫，C1-C22烷基，C3-C21鏈烯基，部分或全部被氟取代的C1-C10烷基或-[(CH2)2-O]m-R7;
R7為氫或C1-C21烷基;
n為1-12;
m為1-4;
當n＝1和R5為氫時，R4不能是氫;
該方法包括將式Ⅳa化合物
其中，R14和R15為相同或不同的保護基團，B為嘌呤或嘧啶或其類似物，堿基B中功能基團被保護基團保護起來，在惰性溶劑中，與式A化合物反應(yīng)， 其中，R4、R5和n均如上所述定義，X為Cl，Br，I，甲苯磺?；?O，甲磺酰基-O;
(b)R3為式Ⅰc基團 其制備方法為在惰性溶劑中將式Ⅳa化合物與式B化合物反應(yīng) 其中X為Cl，Br，I，甲苯磺?；?O或甲磺?；?O;
(c)R3為式Ⅰb基團
其中，R5為氫，C1-C10烷基，-CH2-O-R6或式Ⅰb基團，R6為氫，C1-C22烷基，C3-C21鏈烯基，部分或全部被氟取代的C1-C10烷基或-[(CH2)2-O]m-R7;
R7為氫或C1-C21烷基;
Z為-(CH2)p-或-(CH2-CH-O)q-CH2CH2，Z中的-CH2-可不被取代或被一個或多個、相同或不同的取代基C1-C10烷基或C5-C6環(huán)烷基，和不被取代或被C1-C4烷基取代的苯基所取代。
m為1-4;
p為1-10;
q為1-4;
該方法為在H2O和BF3存在下，使從(b)獲得的環(huán)氧化物開環(huán)并用式X′-(CH2)q-X′或X′-(CH2-CHO)rX′的化合物(X′為Cl，Br，I，甲苯磺?；?O-或甲磺?；?O)使之關(guān)環(huán)，形成一個新環(huán);
(d)R3為式Ⅰa基團，方法為在R6OH和BF3存在下，將(b)得到環(huán)氧化物反應(yīng)，如需要使游離羥基轉(zhuǎn)變?yōu)槊鸦蝓セ?e)R3為式Ⅰa基團，方法為在BF3和例如NaBH4的存在下，將(b)得到的環(huán)氧化物氫化，如需要使游離羥基轉(zhuǎn)變?yōu)槊鸦蝓セ?
(f)R3為式Ⅰa基團，方法為將適當?shù)腉rignard試劑與(b)獲得的環(huán)氧化物反應(yīng)，如需要將游離羥基轉(zhuǎn)變?yōu)槊鸦蝓セ?或(g)R3為式Ⅰa、Ⅰb、Ⅰc基團方法如用(a)-(f)所述方法之一，在式Ⅳb化合物的2′-羥基上進行取代， 其中R14和R15如所述定義而A為離去基團，優(yōu)選烷氧基、酰氧基、甲磺酰基-O，甲苯磺?；?O，特別優(yōu)選OCH3，OCOCH3和苯甲酰氧基，然后按照已知方法。通過取代引入堿基B[(Lukevics，E.，Zablorka，A.“核苷合成”，Ellis Howood，New York(1991)]，如需要去掉保護基團R14和R15，引入構(gòu)成合磷核苷酸橋鍵的基團。
式Ⅰ化合物(R5為氫，n＝1)也可通過將式Ⅳa化合物與式X-CH2-CO-OR化合物反應(yīng)，然后還原CO基團為CH2OH基團并對其進行烷基化而獲得。
式Ⅳa和Ⅳb，A和B的化合物是已知的，其中有些是可市購的或可用已知或類似方法制備。
惰性溶劑舉例如烴，鹵代烴，烷基化羧酰胺和內(nèi)酰胺，醚，腈，如乙腈，二烷基砜或二烷基亞砜或環(huán)狀砜和亞砜。
在方法(a)-(g)中的反應(yīng)溫度為-50°-200℃，優(yōu)選0-90℃。
本反應(yīng)最好在堿存在下進行，例如堿金屬氫化物，醇化物，氫氧化物，碳酸鹽，三烷基胺或二氮雜二環(huán)十一碳烯。
例如，本反應(yīng)可在催化下進行或在氫硼化合物存下進行。
式Ⅰ化合物可用已知方法分離和純化，如沉淀或結(jié)晶，過濾和色譜法。
式Ⅰ化合物可用于合成由于核酸的相互作用而具有很好的生物活性的低聚核苷酸，還可用作藥物活性成分或診斷試劑。
本發(fā)明還涉及式化合物在制備含式Ⅰ化合物的相同或不同的單體單元的低聚核苷酸中的應(yīng)用，但是，至少一個式Ⅰ化合物的單體單元與其他天然或合成的核苷的單體單元結(jié)合，該低聚核苷酸含有2-200個單體單元，優(yōu)選2-100個，特別優(yōu)選2-50個，最特別優(yōu)選4-30個單體單元。優(yōu)選含式Ⅰ化合物的相同或不同單體單元的低聚核苷酸，優(yōu)選也適于同時還含有從D-核糖成D-脫氧核糖衍生出的合成或天然核苷的單體單元的低聚核苷酸。
本發(fā)明還涉及式Ⅴ的低聚核苷酸其中，X為0-200，Y為核苷酸橋鍵，U，V和W為相互獨立的天然或合成的核苷的相同或不同殘基，至少U.V和/或W殘基之一為式Ⅵ的基團 ;B和R3的優(yōu)選和實例的定義如式Ⅰ化合物所設(shè)。
優(yōu)選的橋基Y為存在天然低聚核苷酸之中的-P(O)O 基團。進一步講，橋基的實例為-P(O)S -，-P(S)S -，-P(O)R16，P(O)N-R17R18，和-CH2-，其中R16為氫式C1-C6烷基，R17和R18相互獨立的具有R16的定義，在式Ⅴ中，X優(yōu)選0-100，特別優(yōu)選1-50，更為優(yōu)選3-29。式Ⅵ的基團可在未端或按核苷酸序列成鏈，全部或某些如，2-5個式Ⅵ基團可以相互連接，或Ⅵ基團可在天然或合成核苷的基團間成鍵，或在核苷酸序列中存在這些分布的混合形式。
一個特別優(yōu)選的形式為式Ⅴ低聚核苷酸，其中X＝2-50，優(yōu)選2-30，Y為-P(O)O--基團，U，V和W為相互獨立的相同或不同的天然核苷殘基，和對應(yīng)于式Ⅵ的至少U.V或W殘基之一。適用的天然核苷如腺嘌呤核苷、胞嘧啶核苷、鳥嘌呤核苷，尿嘧啶核苷，2-氨基腺嘌呤，5-甲基胞嘧啶，2′-脫氧腺嘌呤核苷，2-′脫氧胞嘧啶核苷，2′-脫氧鳥嘌呤核苷和胸腺嘧啶核苷。還可能提及天然核苷堿基，特別優(yōu)選腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤，胸腺嘧啶和尿嘧啶。式Ⅵ殘基可按未端或核苷酸序列成鍵，全部或某些，如2-5個相同或不同的式Ⅵ殘基可相互連接，或式Ⅵ的相同或不同的殘基在天然核苷殘基之間成鍵，或在核苷酸序列中存在這些分布的混合形成。在式Ⅴ的低聚核苷酸的另一優(yōu)選形式中，所有U.V和W殘基為相同或不同的式Ⅵ殘基。X優(yōu)選3-29，式Ⅵ的殘基總數(shù)優(yōu)選為1-12。
本發(fā)明所述的低聚核苷酸可以使用市售的全自動DNA合成器和加工指令，用不同方法，按已知方式制備。對于橋基-P(O)O -，例如，可用本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員所熟知的磷三酯法、亞磷酸三酯法，或H-磷酸鹽法。例如，亞磷酸三酯法可按如下進行R1和R2均為氫的式Ⅰ核苷與保護基團試劑反應(yīng)，如，4，4′-2甲氧基三苯基甲基氯化物，得到式D的核苷 式D化合物在“連接劑”(如琥珀酸酐)作用下，附著在一個固體載體(如可控微孔玻璃(CPG))，并含有長鏈烷基氨基基團。在另一方法中，將式D化合物的羥基用R′OP[N(異丙基)2)]2派生，得到式E化合物，例如磷酰胺化物(phosphorus amidite) 例如其中R′為β-氰乙基當保護基團;如附著在載體的物質(zhì)的DMT基團，被除去后，隨著-N(iso-C3H7)2的離去，式D化合物會發(fā)生偶聯(lián)，任何游離的羥基會被阻斷，生成的亞磷酸酯被氧化為磷酸酯。二聚物被去保護并反復(fù)進行與式E化合物循環(huán)反應(yīng)，直至合成出含有所需數(shù)量的單體單元的低聚物，產(chǎn)物從載體上取出。低聚核苷酸可通過這個方法得到，其中與式V一致的所有U.V和W殘基組成式Ⅵ殘基。該方法也同樣適于制備具有所需序列的所需單體單元的低聚核苷酸，其單元和序列決定于本發(fā)明合成和天然核苷結(jié)構(gòu)單元，這些單元和它們序列用于個別反應(yīng)循環(huán)中。
按本發(fā)明所述，R1和R2均為氫的式Ⅰ化合物具有抗病毒和抗生殖特性，因而可用作藥物。除此之外，本發(fā)明所述的低聚核苷酸對核酸酶的降解有很高的穩(wěn)定性。特別是它們可與互補核酸鏈，特別是RNA型，可極好地配對。除此之外，它們還具有相當高的細胞吸收。因此，本發(fā)明所述的低聚核苷酸特別適用于反義技術(shù)，即通過約束適當?shù)膍RNA的互補核苷序列而抑制不必要的蛋白質(zhì)產(chǎn)物的表達(EP266099，WO87/07300和WO89/08146)。它們可用于感染和疾病的治療，如通過在核酸(如致癌基因)水平上阻斷生物活性蛋白質(zhì)的表達。本發(fā)明所述的低聚核苷酸也適于用作診斷試劑并在控測病毒感染或遺傳疾病上用作基因探針，通過在單或雙鏈核酸水平上選擇性地作用，特別是由于對核酸酶有較大的穩(wěn)定性，它們不僅能用于體外診斷，還可用于體內(nèi)診斷(如組織樣品，血小板和血清)。例如在WO91/06556中對這些可能的應(yīng)用有所描述。
本發(fā)明還涉及本發(fā)明所述的低聚核苷酸作為診斷試劑，在檢測病毒感染或遺傳疾病中的應(yīng)用。
本發(fā)明還涉及本發(fā)明所述式Ⅰ核苷和式Ⅴ低聚核苷酸在通過純化體內(nèi)核苷酸序列從而治療包括人類在內(nèi)的熱血動物疾病的治療方法上的應(yīng)用。例如體重約為70kg的熱血動物的每月施藥劑量為0.01-1000mg。給藥優(yōu)選以藥物組合物的形式，非腸道給藥，如靜脈注射，腹腔注射給藥。
本發(fā)明還涉及藥物組合物，其中只含有效劑量的式Ⅰ核苷或式Ⅴ的低聚核苷酸或共同含這兩種，另外還有其他活性成分、藥物載體，優(yōu)選以足夠劑量，和適量賦形劑。
本發(fā)明所述的藥理活性核苷和低聚核苷酸可以非腸道給藥的組合物或滴注溶液的形式應(yīng)用。該溶液優(yōu)選等滲水溶液或懸浮液，例如含活性成分本身或加入載體(如甘露糖醇)的冷凍干燥組合物，這些溶液或懸浮液在使用之前制備。該藥物組合物可以是滅菌的，和/或賦形劑，如防腐劑、穩(wěn)定劑、濕潤劑和/或乳化劑、助溶劑、調(diào)節(jié)滲透壓的鹽和/或緩沖劑。如有必要，可按已知方法制備含更多藥理活性物質(zhì)(如抗生素)的藥物組合物，例如，按常規(guī)溶解或冷凍干燥方法，可含有約0.1%-90%，優(yōu)選的0.5%-30%，如1%-5%的活性成分。
下面的實施例用來闡述本發(fā)明。該′H-NMR-波譜是基于下列環(huán)碳結(jié)構(gòu)的碳原子的位次偏排初始化合物
核苷(實例) 用于說明書和分子式中的縮寫符號DMF N′N-二甲基甲酰胺ClBnCl22，4-二氯苯甲基氯Bn 苯甲基Ac 乙?；?br> φ 苯基BSA N，N-雙三甲基硅烷基乙酰氨DBU 二氮雜雙環(huán)[5，4，0]十一烷-7-烯BOM-Cl 苯甲氧基甲基氯DMTCl 4，4′二甲氧三苯甲基氯THF 四氫呋喃(A)核苷類似物的制備實例A1在60℃，將28.0g的1-甲基核糖逐滴加到含13.5gNaH的130mlDMF中。當H2放完后，逐滴加入110.0g的ClBnCl2。將反應(yīng)混合物在25℃攪拌16小時。為徹底除掉殘留的NaH，逐滴小心加入甲醇，將反應(yīng)混合物倒入冰水混合物中。濾去塊狀沉淀，用乙腈徹底洗滌而得到化合物(A1) 1H-NMR(250MHz，CDCl3)H-C(1)-質(zhì)子出現(xiàn)在5.0ppm，呈單峰，MS638(M+)實例A2
將65.9g由實例A1制備的產(chǎn)物溶于600ml二氯甲烷并冷卻至0℃。逐滴加入800ml含121mlSnCl4的二氯甲烷，反應(yīng)混合物在3℃放置。過26小時后再加2mlSnCl4?？偣?5小時后，將反應(yīng)溶液小心倒入700ml的飽合NaHCO3溶液，用400ml二氯甲烷稀釋后，濾掉含Sn沉淀，用MgSO4干燥濾液的有機相并蒸發(fā)濃縮而得到化合物(A2)。
1H-NMR(250MHz，CDCl3)H-C(1)質(zhì)子出現(xiàn)在4.90ppm，呈雙峰，J＝5Hz。
實例A3
將125.9g由實例A2獲得的產(chǎn)物溶于1升吡啶。在20℃，加入25.5g乙酐和1g4-二甲基氨基吡啶。反應(yīng)混和物攪拌17hr，在1升水中吸收，用濃鹽酸酸化后，用乙酸乙酯萃取。用MgSO4干燥萃取液并蒸發(fā)濃縮。最后用己烷使殘余物結(jié)晶而得到化合物(A3) 1H-NMR(250MHz，CDCl3)5.15[d，J＝4.5Hz，H-C(1)];3.50(s，OCH3);2.17(s，OCOCH3);
MS522(M+)[α]Na(D)＝87.4±1.0°，CHCl3(0.998%)實例A4在100ml1，2-二氯乙烷中，將24g胸腺嘧啶制漿。加入116.4gBSA后，加熱回流反應(yīng)混合物直至溶液澄清。然后將反應(yīng)混合物冷卻至50℃，加入50g由實例A3制備產(chǎn)物和27.5g三氟甲基磺酸三甲基硅酯。在70℃攪拌反應(yīng)混合物20小時，然后加入300mlNaHCO3溶液并攪拌，用二氯甲烷萃取后，用MgSO4干燥反應(yīng)混合物并蒸發(fā)干燥。最后用甲醇使殘余物結(jié)晶而得到化合物(A4) 1H-NMR(250MHz，CDCl3)8.25(s，NH);6.10[d，J＝4.5Hz，H-C(1’)];2.13(s，OCOCH3);1.66(s，CH3);
MS616(M+)實例A5將85g由實例A4制備的產(chǎn)物懸浮于850ml乙腈中。在室溫下，逐滴加入24.2gDBU和24.9g的BOM-Cl，攪拌反應(yīng)混合物20小時，倒入水中并用乙酸乙酯萃取。用MgSO4干燥萃取液，蒸發(fā)濃縮后得到化合物(A5)
1H-NMR(250MHz，CDCl3)6.05[d，J＝4.5Hz，H-C(1’)];5.5(AB，CH2);5.37[dd，H-C(2’)];2.13(s，OCOCH3);1.55(s，CH3);
MS736(M+)實例A6將106g由實例A5制備的產(chǎn)物懸浮于1升THF中，逐滴加入26g的30%NaOCH3/CH3OH溶液。攪拌2.5小時后，將反應(yīng)溶液倒入水中，加入飽合氯化鈉水溶液，用乙酸乙酯萃取反應(yīng)溶液。用MgSO4干燥后，蒸發(fā)濃縮后得到化合物(A6)。
1H-NMR(250MHz，CDCl3)5.93[d，J＝5Hz，H-C(1’)];5.5(AB，CH2);3.03(d，J＝6.5Hz，OH);1.72(s，CH3)MS694(M+)
實例A7將20.3g由實例A6得到的產(chǎn)物溶于200mlTHF中。加入0.73gNaH，將反應(yīng)混合物煮沸30分鐘然后加入2.89g2-氯乙基甲基醚，將反應(yīng)混合物再煮沸24小時。再加0.5gNaH和1.7g2-氯乙基甲基醚，繼續(xù)沸騰。總共32小時后，反應(yīng)混合物倒入水中并用乙酸乙酯萃取。用MgSO4干燥萃取液，蒸發(fā)濃縮。將殘余用硅膠層析用甲苯/乙酸乙酯(4∶1)洗脫，得到化合物(A7) 1H-NMR(250MHz，CDCl3)7.65[s，H-C(6)];5.93[s，H-C(1’)];5.5(s，CH2);3.33(s，OCH3);1.6(s，CH3).
MS752(M+).
實例A8將79.4g由實例A6獲得的產(chǎn)物溶解于800mlTHF。加入3.3gNaH，使反應(yīng)混合物沸騰一會兒，然后在40℃，滴加21g溴乙酸甲酯。反應(yīng)混合物在60℃攪拌共27小時，在16小時后和20小時后分別加1gNaH和2ml溴乙酸甲酯。最后，將反應(yīng)混合物倒入水中并用乙酸乙酯萃取。用MgSO4干燥萃取液，蒸發(fā)濃縮得到化合物(A8) 1H-NMR(250MHz，CDCl3)7.70[s，H-C(6)];5.92[s，H-C(1’)];5.48(AB，CH2);3.75(s，OCH3);1.58(s，CH3).
MS766(M+).
實例A9a)將37g由實例A8得到的產(chǎn)物溶于400mlTHF。在20℃分批加入1.5g LiBH4，將反應(yīng)混和物攪拌1小時。然后將反應(yīng)混合物小心加入500ml水中，用32ml2N鹽酸水溶液中和。用乙酸乙酯萃取并蒸發(fā)濃縮得到化合物(A9)。
1H-NMR(250MHz，CDCl3)7.65[s，H-C(6)];5.96[s，H-C(1’)];5.50(AB，CH2);2.57(broad s，OH);1.60(s，CH3).
MS738(M+).
(b)在70℃，在含NaH的THF溶液中，用CH3I將化合物(A9)甲基化。8小時后，如實例A7所述進行反應(yīng)而得到化合物(A7)。
實例A10將20.0g由實例A7所得產(chǎn)物溶于200ml THF。在常壓(吸收H2102%)和25℃，在2g Pd/C(5%)上氫化4.5小時。過濾后通過蒸發(fā)濃縮濾液，殘余液溶于170ml甲醇。用30%NaOCH3/CH3OH調(diào)PH于11。24小時后，反應(yīng)混合物倒入250ml水，用2N鹽酸水溶液酸化并用乙酸乙酯萃取。用MgSO4干燥萃取液并蒸發(fā)濃縮而得化合物(A10)。
1H-NMR(250MHz，CDCl3)8.75(s，NH);7.65[s，H-C(6)];5.97[s，H-C(1’)];3.33(s，OCH3);1.60(s，CH3).
MS632(M+).
實例A11在常壓50℃，在5g Pd/C(5%)上，在0.25g無水乙酸鈉存在下，將15g由實例A10制備的產(chǎn)物在250ml甲醇中氫化。46小時后，過濾該氫化混合物并蒸發(fā)濃縮。為去掉鹽，殘余液在一小硅膠玻璃板上層析(乙酸乙酯/甲醇9∶1)，從而獲得化合物(A11)。
1H-NMR(250MHz，CDCl3)11.5(s，NH);7.95[s，H-C(6)];6.00[d，J＝6Hz，H-C(1’)];5.33(broad s，OH);5.20(d，OH);3.32(s，OCH3);1.92(s，CH3).
MS316(M+).
實例A12將0.45g由實例A11制備的產(chǎn)物分兩次放入吡啶中并蒸發(fā)濃縮。再往18ml吡啶中依次加入0.2g三乙胺，0.55g DMTCl和25mg 4-二甲基氨基吡啶。在室溫攪拌該反應(yīng)混合物16小時，然后用50ml乙酸乙酯稀釋并倒入50ml水中。用MgSO4干燥有機相并濃縮。殘余物在硅膠(己烷/乙酸乙酯/三乙胺86∶10∶4)上層析而得到化合物A12。

1H-NMR(250MHz，CDCl3)7.62[s，H-C(6)];6.02[d，J＝4Hz，H-C(1’)];3.38(s，OCH3);1.36(s，CH3).
實例A13將300mg由實例A12制備的產(chǎn)物加入110mg二異丙基四唑銨，178mg2-氰乙基-N，N，N′，N′四異丙基磷酰胺和6ml二氯甲烷。在室溫攪拌此反應(yīng)混合物17小時，然后倒入飽合NaHCO3水溶液，用MgSO4干燥有機相并蒸發(fā)濃縮、殘余物在硅膠(乙醇/乙酸乙酯4∶1)，另外加入1%的三乙胺)上層析。將得到的泡沫溶于1ml甲基叔丁基醚并在0℃逐滴加入戊烷中而得到化合物(A13)(非對映異構(gòu)體，1∶1)
1H-NMR(250MHz，CDCl3)7.70[s，H-C(6)] and 7.63[s，H-C(6)];6.08[d，J＝4Hz，H-C(1’)];6.02[d，J＝4Hz，H-C(1’)].
實例14將24.2g由實例A2得到的產(chǎn)物溶于250ml THF中。加入8.76g溴乙酸甲酯和1.38g NaH，然后在60℃攪拌此反應(yīng)混合物3.5小時。在另加0.14g NaH和0.53ml溴乙酸甲酯后，在60℃再攪拌此反應(yīng)混合物3小時，將懸浮液倒入300ml水中，用2N的鹽酸水溶液中和并用乙酸乙酯萃取。用MgSO4干燥萃取液并蒸發(fā)濃縮而得到化合物(A14) 1H-NMR(250MHz，CDCl3)5.05[d，J＝4Hz，H-C(1’)];3.50[s，OCH3] and 3.75[s，OCH3].
MS552(M+).
實例A15將5.0g由實例14得到的產(chǎn)物溶于60ml乙腈中。加入4.88g二甲硅烷基化胸腺嘧啶，在60℃攪拌，滴加2.6g三氟甲基磺酸三甲基甲硅烷基酯。攪拌3.5小時后，冷卻反應(yīng)液，將其倒入飽合NaHCO3水溶液中攪拌。然后用乙酸乙酯萃取此反應(yīng)液，用MgSO4干燥有機相并蒸發(fā)濃縮。殘余物用硅膠(甲苯/乙酸乙酯1∶1)層析而得到化合物A15。
1H-NMR(250MHz，CDCl3)8.36(s，NH);7.70[s，H-C(6)];5.94[d，J＝1.5Hz，H-C(1’)];3.73(s，OCH3);1.58[s，CH3].
MS646(M+).
b)與苯甲氧基甲基氯反應(yīng)，得到化合物(A8)。
實例16按照類似前述方法，可進行2′-OH修飾，見表1表1 2′-OH修飾的實例表1 2′-OH進一步修飾的實施例






實例A17將5.0g由實例A6制備的產(chǎn)物溶于50ml THF中。加入0.21g NaH后，在60℃加熱反應(yīng)混合物45分鐘，然后加入1.57g二甘醇氯乙基甲基醚，最后在60℃總共持續(xù)攪拌54小時。在8小時和42小時，分別再加0.05g NaH和0.4g二甘醇氯乙基甲基醚。冷卻混合物，倒入水中并用乙酸乙酯萃取，用MgSO4干燥并蒸發(fā)濃縮萃取液而得到化合物(A17)，通過用己烷/乙酸乙酯1∶1進行硅膠層析而得。
1H-NMR(250MHz，CDCl3)1.60(s，CH3);3.33(s，OCH3);5.47(AB，CH2);5.93[d，H-C(1’)];7.65[s，H-C(6)].
MS840(M-).
實例A18將3.2g由實例A17得到的產(chǎn)物，在常壓和22℃，用0.6g Pd/C(5%)在THF中氫化。1小時后(吸收H2-96%)，過濾氫化混合物至澄清并蒸發(fā)濃縮。殘余物溶于30ml甲醇并加入3.5ml 30%的NaHCO3甲醇溶液。在20℃攪拌24小時后，將反應(yīng)液倒入水中并用乙酸乙酯萃取。用MgSO4干燥并蒸發(fā)濃縮萃取液而得到化合物(A18)。
1H-NMR(250MHz，CDCl3)1.60(s，CH3);3.55(s，OCH3);5.96[d，J＝2Hz，H-C(1’)];7.62[s，H-C(6)];8.96(s，NH).
MS720/722/724(M+).
實例A19將2.3g由實例A18制備的產(chǎn)物溶于75ml甲醇并加入1.15g乙酸鈉和1.0g Pd/C(5%)進行氫化反應(yīng)。43小時后，濾掉催化劑，濃縮濾液。為分離出鹽，用乙酸乙酯/甲醇(4∶1)在硅膠上過濾殘余物而得到化合物(A19)。
1H-NMR[250MHz，methanol(D4)]1.72(s，CH3);3.22(s，OCH3);5.80[d，J＝5Hz，H-C(1-’)];7.78[s，H-C(6)].
MS404(M).
實例A20將400mg由實例A19制備的產(chǎn)物溶于8ml無水吡啶中。在20℃加入0.34g DMTCl，攪拌反應(yīng)混合物20小時，用30ml二氯甲烷稀釋并倒入水中。用水再洗滌一次有機相，然后干燥(MgSO4)并蒸發(fā)濃縮。殘余物用乙酸乙酯/三乙胺(97∶3)進行硅膠層析而得到化合物(A20)。
1H-NMR(250MHz，CDCl3;all signals are broad)1.40(s，CH3);3.35(s，OCH3);3.70(s，2x OCH3);6.02(s，H-C(1’);7.66[s，H-C(6)].
MS705(M-H).
實例A21將0.39g由實例A20制備的產(chǎn)物的2.5ml二氯乙烷溶液滴加至含0.12g二異丙基四唑銨和0.2g氰乙基四異丙基磷酰胺(phosphous amidite)的2.5ml無水乙氯甲烷中。在20℃攪拌28小時，將反應(yīng)液倒入飽合NaHCO3水溶液并用二氯乙烷萃取，蒸發(fā)濃縮并用乙酸乙酯/三乙胺(97∶3)進行硅膠層析而得到化合物(A21)。
1H-NMR(250MHz，CDCl3)The protons of H-C(1’)appear as doublets at 6.02 and 6.07 ppm.
31P-NMR(CDCl3)149.95 and 149.88 ppm實例A22將21.4g尿嘧啶懸浮于250ml二氯乙烷中。加入116g BSA并將反應(yīng)混合物加熱到80℃。30分鐘后形成溶液。將溶液冷卻至40℃;加入50.0g溶于350ml二氯乙烷的由實例A3制備的產(chǎn)物和27.4g SnCl4。在80℃，放置溶液5小時，冷卻后倒入飽合NaHCO3溶液。將得到的雙相懸浮液過濾并將有機相分離出。用CH2Cl2萃取水相。用MgSO4干燥收集的萃取液并蒸發(fā)濃縮。在乙腈中浸煮殘余物而得到化合物(A22)
NMR(250MHz，CDCl3)2.22(s，OAc)，5.35(t，H-C(2’))，6.07(d，J＝4Hz，H-C(1’))，5.53 and 7.23(each d，J＝8Hz，H-C(5)and H-C(6))，8.57(s，NH).
MS602實例A23在60℃，將溶于300ml THF的35.6g由實例A4制備的產(chǎn)物加到含1.47g NaH(100%)的60ml THF中，持續(xù)加熱1小時。分批加入14.0g R-(-)縮水甘油甲苯磺酸酯。2.5小時后，再加0.1g NaH。加熱此反應(yīng)混合物4小時后冷卻，倒在水中并用乙酸乙酯萃取。蒸發(fā)濃縮萃取液并進行層析(硅膠，甲苯/乙酸乙酯9∶1)而得到化合物(A23)。
NMR(250MHz，CDCl3)1.59(s，CH3)，5.48(AB，CH2)，5.92(s，1.5Hz，H-C(1’))，7.62(s，H-C(6)).
FAB-MS751(M+H)
實例A24將5.1g由實例A23制備的產(chǎn)物和4.93g十六烷醇溶于50ml CH2Cl2。加入0.96g三氟化硼二乙基醚化物(d＝1.13g/ml)。在室溫攪拌該液19小時，然后倒入水中并用CH2Cl2萃取。蒸發(fā)濃縮萃取液并用硅膠(乙酸乙酯/己烷1∶1)層析而得到化合物(A24)。
NMR(250MHz，CDCl3)1.60(s，CH3)，5.47(AB，CH2)，5.93(d，J＝1.5Hz，H-C(1’))，7.63(s，H-C(6)).
FAB-MS1027(M+Cl)-
實例A25將3.45g由實例A24制備的產(chǎn)物加入含0.15g MaH(100%)的35ml THF中，在60℃加熱45分鐘。再加入0.63g MeI，再加熱反應(yīng)混合物1.5小時。冷卻反應(yīng)混合物，倒入水中并用乙酸乙酯萃取。蒸發(fā)濃縮殘余物，然后在甲苯中通過短硅膠柱過濾而得到化合物(A25)。
NMR(250MHz，CDCl3)1.59(s，CH3)，5.45(AB，CH2)，5.93(d，J＝1.5Hz，H-C(1′))，7.63(s，H-C(6)).
MS(DCl)1024(M+NH4)+實例A26將3.3g由實例A25制備的產(chǎn)物在70ml THF中，在0.7g Pd/C(33小時，H2吸收104%)上氫化。將反應(yīng)混和物過濾并蒸發(fā)濃縮。將殘余物溶于10ml THF和10ml甲醇，加入NaCH3/HOCH3溶液(30%)。在室溫攪拌反應(yīng)混合物24小時，然后濃縮其體積至約一半，倒入水中并用乙酸乙酯萃取。蒸發(fā)濃縮該萃取液并用硅膠(乙酸乙酯/甲苯1∶2)層析而得到化合物(A26)。
NMR(250MHz，CDCl3)1.62(s，CH3)，3.40(s，OCH3)，5.98(d，J＝2Hz，H-C(1′))，7.62(s，H-C(6))，8.57(s，NH).
MS(DCl)886實例A27將1.21g由實例A26制備的產(chǎn)物在50ml甲醇和5ml甲苯中，用0.2g Pd/C(10%)和0.258g MgO(2小時，H2-吸收220ml)氫化。過濾該反應(yīng)混和物，蒸發(fā)濃縮并用硅膠(去Mg鹽)過濾而得到化合物(A27)。
NMR(250MHz，DMSO-D6)1.72(s，CH3)，5.05(d，OH)，5.18(t，OH)，5.84(d，J＝6Hz，H-C(1′))，7.77(s，H-C(6)).
FAB-MS569(M-H).
實例A28將0.83g由實例A27制備的產(chǎn)物溶于50ml吡啶，蒸發(fā)濃縮溶液。向殘余物加入8ml吡啶和0.6g DMT氯化物，在室溫攪拌反應(yīng)混合物44小時。將溶液倒入水中并用乙酸乙酯萃取。蒸發(fā)濃縮殘余物并用硅膠(甲苯/乙酸乙酯1∶1)+1% NEt3)層析而得到化合物(A28)。
NMR(250MHz，CDCl3)1.35(s，CH3)，3.47(s，OCH3)，3.80(s，OCH3)，6.03(d，J＝4Hz，H-C(1′))，7.64(s，H-C(6))，8.20(s，NH).
FAB-MS873(M+H).
實例A29將10ml CH2Cl2、0.245g二異丙基四唑銨和0.39g氰乙基四異丙基磷三酸胺加入0.95g由實例A28制備的產(chǎn)物。在室溫下攪拌三天后，將反應(yīng)混合物倒入飽和NaHCO3溶液并用CH2Cl2萃取。蒸發(fā)濃縮殘余物并用硅膠(甲苯/乙酸乙酯2∶1+1%NEt3)層析而得到化合物(A29) 1H-NMR(250MHz，CDCl35.97 and 6.05(each d，J＝4Hz，each H-C(1))，7.62 and 7.70(each s，each H-C(6)).
P-NMR(250MHz，CDCl3)150.012 and 150.102.
FAB-MS1071(M-H).
實例A30將15.6g次黃嘌呤和46.6g BSA在300ml二氯乙烷加熱回流。30分鐘后形成溶液。將30.0g由實例A3制備的產(chǎn)物和16.5g的TMS三氟甲磺酸加入溶液中并再煮沸16小時。冷卻反應(yīng)混合物;倒入飽合NaHCO3溶液并過濾得到的懸浮液。濾液用CH2Cl2萃取。用MgSO4干燥有機相并蒸發(fā)濃縮。殘余物經(jīng)層析(甲醇/乙酸乙酯1∶1)而得到化合物(A30)。
1H-NMR(250MHz，CDCl3)6.22(d，3Hz，H-C(1′))，8.14 and 8.37(each s，H-C(2)and H-C(8)).
FAB-MS625M-H
實例A31將3.8g由實例A30的產(chǎn)物加到150ml CH2Cl2中。煮沸時逐滴加入4.8ml SOCl2和2.4ml DMF混合物。再使反應(yīng)混合物沸騰3小時，然后再加入1.2ml SOCl2和0.6ml DMF。共煮沸反應(yīng)混合物5小時然后加到飽和NaHCO3溶液中，攪拌20分鐘并用CH2Cl2萃取。用MgSO4干燥萃取液并蒸發(fā)濃縮而得到化合物(A31)。
NMR(250MHz，CDCl3)5.83(dd，H-C(2′))，6.33(d，J＝3Hz，H-C(1′))，8.47 and 8.73(each s，H-C(2)and H-C(8)).
MS664
實例A32將30.4g由實例A31制備的產(chǎn)物溶于200ml甲醇和100ml THF中，滴加16.9g 30% NaOMe/甲醇。攪拌反應(yīng)混合物3小時;倒入水中并用乙酸乙酯萃取。用MgSO4干燥萃取液并蒸發(fā)濃縮而得到化合物(A32)。
NMR(250MHz，CDCl3)4.20(s，OCH3)，6.10(d，J＝6Hz，H-C(1′))，8.17 and 8.48(each s，H-C(2)and H-C(8)).
MS598實例A33將1.17g NaH(100%)加入到含25.4g由實例A32制備產(chǎn)物的250ml THF中。煮沸時，滴加6.76g 2-溴乙基甲基醚。再煮沸反應(yīng)混合物6小時，再加入0.5g NaH和1.9ml溴化物。23小時后冷卻反應(yīng)混合物并倒入水中，用乙酸乙酯萃取并蒸發(fā)濃縮，殘余物經(jīng)層析(硅膠，己烷/丙酮2∶1)而得到化合物(A33)。
1H-NMR(250MHz，CDCl3)3.27(OCH3)，4.20(OCH3)，6.27(d，J＝5Hz，H-C(1′))，8.24 and 8.52(each s，H-C(2)and H-C(8)).
MS(DCI)656實例A34將2.2g由實例A33制備的產(chǎn)物在45ml含有0.66g Pd/C(10%)甲醇中，并加入402ml MgO的條件下氫化。13小時(H2-吸收485.5ml)后，過濾混合物至澄清并蒸發(fā)濃縮。為除去鎂鹽，殘余物用硅膠(乙酸乙酯/甲醇9∶1)層析而得化合物(A34)。
NMR(250MHz，DMSO(-d6)4.4(t，OH)，5.23(OH)，5.94(d，J＝6.5Hz，H-C(1′))，8.40 and 8.55(each s，H-C(2)and H-C(8)).
FAB MS339(M-H)-.
實例A35將2.46g由實例A34制備的產(chǎn)物溶于80ml甲醇中并放入高壓釜。加入20gNH3并在120℃保持12小時(內(nèi)壓17bar)。蒸發(fā)濃縮反應(yīng)混合物并用硅膠(乙酸乙酯/甲醇)層析而得到化合物(A35)。
NMR(250MHz，DMSO-D6)5.32(d，OH)，5.60(t，OH)，6.15(d，J＝6Hz，H-C(1′))，8.33 and 8.57(each s，H-C(2)and H-C(8)).
MS(DCI)326(M+H).
實例A36將0.48g由實例A35得到的產(chǎn)物溶于5ml甲醇中并加入0.28gN-甲基-2，2-二甲氧基吡咯烷。攪拌反應(yīng)混合物18小時后蒸發(fā)濃縮。加入兩倍于殘余物的吡啶，蒸發(fā)濃縮殘余物。得到的殘余物溶于10ml吡啶，加入0.5g DMT氯化物并在室溫攪拌40小時。將得到的混合物倒入水中并用CH2Cl2萃取。蒸發(fā)濃縮萃取液并用硅膠(乙酸乙酯/甲醇9∶1)層析而得到化合物(A36)。
NMR(250MHz，CDCl3)3.09(s，NMe)，3.72(s，OCH3)，6.08(d，J＝6Hz，H-C(1′))，7.98 and 8.43(each s，H-C(2)and H-C(8)).
FAB MS709(M+H)實例A37將6ml含0.63g由實例A36制備得到的三苯甲基衍生物的CH2Cl2溶液加入到6ml含0.38g氰乙基四異丙基磷二酸胺和0.24g二異丙基四唑銨的CH2Cl2溶液中。攪拌反應(yīng)混合物40小時，倒入飽合的NaHCl3溶液中并用CH2Cl2萃取。蒸發(fā)濃縮萃取液并進行層析(乙酸乙酯+1% NEt3)而得到化合物(A37)。
31P＝NMR(250MHz，CDCl3)149.8 and 150.4.
FAB-MS909(M+H)實例A38將7.1g由實例A23制備的環(huán)氧化物溶于70ml THF，加入0.43g NaBH4，在室溫下攪拌反應(yīng)混合物，加入0.5g BF3·OEt2?？偣?6小時后;將反應(yīng)混合物倒入水中并用乙酸乙酯萃取。蒸發(fā)濃縮后得到化合物(A38)。
NMR(250MHz，CDCl3)1.16(d，J＝7.5Hz，CH3)，1.61(s，CH3)，5.48(AB，CH2)，5.92(d，J＝1Hz，H-C(1′))，7.69(s，H-C(6)).
FAB-MS787(M+Cl)-.
實例A39在70ml THF中，用1.56g NaH(100%)和156g MeI將6.9g由實例A38制備的醇甲基化(60℃，5小時)。通過常規(guī)反應(yīng)得到化合物(A39)。
NMR(250MHz，CDCl3)1.13(d，J＝7.5Hz，CH3)，1.60(s，CH3)，3.33(s，OCH3)，5.49(AB，CH2)，5.95(A，J＝2Hz，H-C(1′))，7.64(s，H-C(6)).
MS(DCI)766(M-).
實例A40將14.4g由實例A4制備的衍生物，在60℃在加有0.65g NaH(100%)的150ml THF中加熱30分鐘。將反應(yīng)混合物冷卻至25℃并加入5.92g D-α，β-異亞丙基甘油-γ-甲苯磺酸酯。1.5小時后，在60℃再攪拌反應(yīng)混合物3小時，冷卻反應(yīng)混合物并倒入水中，用乙酸乙酯萃取并蒸發(fā)濃縮。殘余物用硅膠(甲苯/乙酸乙酯4∶1)層析而得到化合物(A40)。
NMR(250MHz，CDCl3)1.34 and 1.41(each s，each CH3)，1.58(s，CH3)，5.48(AB，CH2)，5.92(d，J＝1.5Hz，H-C(1′))，7.68(s，H-C(6)).
MS(DCI)843(M+Cl)-.
實例A41將3.31g由實例A13制備的磷酰胺化物溶于50ml乙腈中。加入9.4ml NEt3和6.17g1，2，4-三唑。在攪拌下，在溫度控制在30℃以下的條件下滴加1.53gPOCl3。在室溫再攪拌反應(yīng)混合物4小時，倒入1N NaHCO3(150ml)并用乙酸乙酯萃取。蒸發(fā)濃縮萃取液，溶于少量CH2Cl2，攪拌加入100ml正戊烷中。沉淀出化合物(A41)。
1H-NMR(250MHz，CDCl3)6.02 and 6.06(each d，J＝1.5Hz，H-C(1′))，8.44 and 8.47(each s，H-C(6))，8.07 and 9.35(each s，triazole H).
31P-NMR(250MHz，CDCl3)149.433 and 150.253MS(DCI)869(M-)
實例A42將8.88g N2-異丁酰基-O6-苯甲基嘧啶(按Jenny，TF，Schneider，K.C.，Benner，S.A，Nucleosides and Nucleotide 111257-1261(1992)所述類似方法制備)和34.8gN，O-雙(三甲基甲硅烷基)乙酰胺懸浮于130ml甲苯中，在100℃加熱至溶液形成。在50℃，加入13.0g由實例A3制備的核糖衍生物和6.33g三氟甲基磺酸三甲基甲硅烷基酯。在100℃，攪拌該無色溶液4小時，冷卻并倒入200ml飽合NaHCO3溶液。用乙酸乙酯萃取反應(yīng)混合物，用MgSO4干燥并蒸發(fā)濃縮。殘余物用1.2kg硅膠(甲苯/乙酸乙酯4∶1)層析而得到化合物(A42)。

1H-NMR(250MHz，CDCl3)1.26(d，J＝7.5Hz，CH3)，2.23(s，OAc)，5.61(AB，OCH2)，5.78(dd，H-C(2′))，6.19(d，J＝3Hz，H-C(1′))，7.83(s，NH)，8.00(s，H-C(8)).
MS(DCI)801(M-).
實例A43將0.83g 30%NaOMe/甲醇溶液加到80ml含7.4g由實例A42制備的衍生物的甲醇中，在室溫攪拌反應(yīng)溶液30分鐘。將溶液倒入水中并用乙酸乙酯萃取。用MgSO4干燥萃取液，蒸發(fā)濃縮而得到化合物(A43)。
NMR(250MHz，CDCl3)1.29(d，J＝7.5Hz，CH3)，5.61(AB，OCH2)，5.99(d，J＝6Hz，H-C(1′))，7.97(s，NH)，8.04(s，H-C(8)).
MS(DCI)760(M+H)+
實例44將630g NaH(100%)加到100ml含9.0g由實例A43制備的化合物的THF中，攪拌反應(yīng)混合物15分鐘。將1.97g α-溴乙基甲基醚噴撒在反應(yīng)混合物中。25小時后，再加2.0g溴化物。共攪拌反應(yīng)混合物48小時，然后倒入水中并用乙酸乙酯萃取。蒸發(fā)濃縮萃取液并用硅膠(甲苯/乙酸乙酯4∶1)層析向得到化合物(A44)。
NMR(250MHz，CDCl3)3.28(s，OCH3)，5.56(AB，OCH2)，6.10(d，J＝5Hz，H-C(1′))，7.90(s，H-C(8)).
FAB-MS748(M+H)+.
實例A45
從化合物(A3)開始加入各種堿，產(chǎn)物列于表2。
表2引入其它堿基的實施例


實例B低聚核苷酸的制備低聚核苷酸與固體載體(可控微孔玻璃，CPG)結(jié)合，用本發(fā)明所述的二甲氧基三苯甲基化和3′-活化的[3′-(β-氰乙氧基-二(異丙基氨基-磷酰胺化物)]核苷或類似活化的天然核苷結(jié)合，按照生產(chǎn)商品標準草案[參閱“低聚核苷酸合成，一種可行的方法“M.J.Gait;IRL Press 1984(Oxford-Washington DC)]在DNA合成器(應(yīng)用生物系統(tǒng)，380B型，標準磷酰胺化物化學(xué)和iodoxidation)中合成，當最終核苷結(jié)構(gòu)單元偶聯(lián)后，通過用濃氨水處理過夜將5′位保護的低聚核苷酸從載體脫下，同時脫去所有保護基團，用50mM乙酸銨緩沖液(PH＝7)/乙腈在反相HPLC上純化。用80%乙酸處理20分鐘除去5′-二甲氧基三苯甲基保護基團。用乙醇將低聚核苷酸沉淀出來并離心分離。低聚核苷酸的純度用膠體電泳(聚乙酰胺)測試，其同一性用MALDI-TOFMS法測試。
實例C11親和力;低聚核苷酸(反義)和互補低聚核苷酸序列(有義)的相互作用。
低聚核苷酸與相應(yīng)堿基互補的天然核糖核苷酸低聚物的相互作用可通過記錄UV熔化曲線和確定的Tm值表征，例如Marky，L.A.Breslauer，K.J.，Biopolymers 261601-1620(1987)描述了該標準方法。
制備低聚核苷酸和相應(yīng)堿基互補天然低聚核糖核苷酸的10mM磷酸鹽緩沖液，100mM NaCl0.1mMEZDTA，PH＝7.0(C＝4×10-6M/低聚核苷酸)，在260nm的消光變化記錄為溫度(15-95℃)的函數(shù)，從得到的熔化曲線確定其Tm值(表3)。
表3親合力表3親合力(a)TTTTtCTCTCTCTCT(vs.RNA)
(b)CTCGTACCtTTCCGTCC(vs.RNA)
(c)CTCGTACttttCCGGTCC(vs.RNA)


實例D2專一性，低聚核苷酸和己與異常核苷(Y)結(jié)合的堿基互補的低聚核糖核苷酸的相互作用。
制備低聚核苷酸和具有序列γ(GGA CCGGAA YGG TAC GAG)的相應(yīng)堿基互補低聚核苷酸溶液的10mM磷酸鹽緩沖液，100mM NaCl，0.1mMEDTA，PH＝7，(C＝4×10-6M/低聚核苷酸)，測量在260nm的消光變化作為溫度(15-95℃)的函數(shù)，Tm值從曲線確定。結(jié)果列于表4。
表4，專一性有義GAG CAU GGY AAG GCC AGG(RNA)反義CTC GTA CCt TTC CGG TCC(DNA)Tm(℃)和△Tm Y=A 63.3 65.0 64.1Y=C 54.5 55.8 55.1(-8.9) (-9.2) (-9.0)Y=G 61.6 61.4 59.5(-1.7 (-3.6) (-4.5)Y=U 55.8 57.5 55.9(-7.5) (-7.5) (-8.2)Y=無 59.4 57.8 56.4(-3.9) (-7.2) (-7.7)
實例C3核酸酶穩(wěn)定性;具有序列d(TCC AGG TGT CCG tttC)的不同低聚核苷酸的酶水解。
在37℃，在200ml 10%熱滅活的小牛胚胎血清(C＝70μg/ml)中培養(yǎng)14μg合成低聚核苷酸和14μg相應(yīng)天然低聚物。在0.5，1，2，4，6，24和48小時后，加入25μl 9M尿素和三硼酸鹽緩沖液(PH7)使15ml反應(yīng)液驟冷，測量之前-20℃保存;通過聚乙酰胺凝膠電泳使驟冷的反應(yīng)液分離出來并用含磷量(磷成像方法)測量斷裂產(chǎn)物。完整低聚核苷酸濃度(Cnt)，和由于從3′未端除去天然C結(jié)構(gòu)單元而形成的片段濃度(Cn-1t)之和與t＝0時完整低聚核苷酸的初始濃度(Ch0)的比值R＝(Cn(t)+Cn-1t)/Cn°對時間作圖，設(shè)立半衰期τ1/2，即R＝0.5時的時間。

對于t＝ τ1/2＞96h.
權(quán)利要求
1.式Ⅰ化合物 其中R1和R2互相獨立為氫或保護基團，或R1為上述定義而R2為形成含磷核苷酸橋基的殘基；B為嘌呤或嘧啶殘基或其類似物，R3為式Ⅰa、Ⅰb或Ⅰc殘基 其中，R4為氫，C1-C21烷基，C2-C21鏈烯基，C2-C21炔基或-C(=O)-烷基；R5為氫，C1-C10烷基，-CH2-O-R6或式Ⅰb殘基，R6為氫，C1-C22烷基，C3-C21鏈烯基，部分或全部氟取代的C1-C10烷基或-[(OH2)-O]m-R7；R7為氫或C1-C21烷基；Z為-(CH2)p-或-(CH2-CH-O)q-CH2CH2-，其中-CH2-不取代或被一個或多個相同或不同的C1-C10烷基或C5-C6環(huán)烷基，和不取代或C1-C4烷基取代苯基所取代，n為1-12；m為1-4；p為1-10；q為1-4；當n=1、R5為氫時，R4不能是氫。
2.權(quán)利要求1所述化合物的R1和R2均為氫。
3.權(quán)利要求1所述化合物的R1和R2為同一保護基團。
4.權(quán)利要求1所述化合物中作為嘌呤基或類似物的B為式Ⅱ、Ⅱa、Ⅱb、Ⅱc、Ⅱd、Ⅱe或Ⅱf殘基， 其中，Rb1為H，Cl，Br，OH或-O-C1-C12烷基，Rb2，Rb3和Rb5為互為獨立的H、OH、SH，NH2，NHNH2，NHSH，NHO-C1-C12烷基，-N＝CH-N(C1-C12烷基)2，-N＝CH-N-環(huán)烷基，F(xiàn)，Cl，Br，C1-C12烷基，羥基-C1-C12烷基，氨基-C1-C12烷基，C1-C12烷氧基，苯甲氧基或C1-C12-烷硫基，未取代或被保護基團取代的羥基或氨基;或苯基，苯甲基，C1-C20伯氨基或C2-C30的仲氨基。Rb4為氫;CH或-C＝C-Rb7Rb6和Rb7為氫或C1-C4烷基。
5.權(quán)利要求4所述化合物中，其中羥基和氨基的保護基團為C1-C8?；?br> 6.權(quán)利要求4所述化合物中，伯氨基含1-12個碳原子和仲氨基含2-12個碳原子。
7.權(quán)利要求4所述化合物中，伯和仲氨基為式Ra1Ra2N殘基，其中Ra1為氫或獨立地有Ra2的定義，Ra2為C1-C20烷基，C1-C20氨基烷基或C1-C20羥基烷基;羧基烷基或烷氧基羰基烷基，其中羧基包含2-8個碳原子，烷基包含1-6，優(yōu)選1-4個碳原子;C2-C20鏈烯基;苯基，一或二(C1-C4烷基或C1-C4烷氧基)苯基，苯甲基，一或二(C1-C4烷基或C1-C4烷氧基)苯甲基;或1，2-，1，3-，1，4-咪唑基-C1-C6烷基，或Ra1和Ra2均為四或五一亞甲基，3-惡-1，5-亞戊二烯亞戊基，-CH2-NRa3-CH2CH2-或-CH2CH2-NRa3-CH2CH2-，其中Ra3為氫或C1－4烷基，在氨基烷基中氨基未被取代或被一或二個C1-C4烷基或C1-C4羥烷基取代，羥基烷基中的羥基未取代或被C1-C4烷基醚化。
8.權(quán)利要求6所述化合物中的伯和仲氨基為甲基-，乙基-，二甲基-，二乙基-，烯丙基-，一或二(羥基-2-乙基)-，苯基-和苯甲基-，乙?；?，異丁?；?和苯甲?；被?。
9.權(quán)利要求4所述化合物中式Ⅱ、Ⅱb、Ⅱc、Ⅱd、Ⅱe中的Rb1為氫。
10.權(quán)利要求4所述化合物中式Ⅱd中的Rb5為氫。
11.權(quán)利要求4所述化合物中式Ⅱ，Ⅱa。Ⅱb、Ⅱc、Ⅱd、Ⅱf中的Rb2和Rb3為相互獨立的H，F(xiàn)，Cl，Br，OH，SH，NH2，NHOH，NHNH2，甲氨基，二甲氨基，苯甲?；被籽趸?，乙氧基和甲硫基。
12.權(quán)利要求4所述化合物中，B為嘌呤或下列一組腺嘌呤類似物殘基，N-甲基腺嘌呤，N-甲?；汆堰?，2-甲硫基腺嘌呤，2-氨基腺嘌呤，6-羥基嘌呤，2-氨基-6-氯嘌呤，2-氨基-6-甲硫基嘌呤，鳥嘌呤和N-異丁酰鳥嘌呤。
13.權(quán)利要求1所述化合物中，式Ⅰ中的作為嘧啶的B為式Ⅲ、Ⅲa、Ⅲb、Ⅲc的尿嘧啶，胸腺嘧啶，胞嘧啶殘基， 其中Rb6為氫或C1-C4烷基，Rb8為H，OH，SH，NH2，NHNH2，NHOH，NHO-C1-C12烷基，-N＝CH-N(C1-C12烷基)2，-N＝CH-N-環(huán)烷基，F(xiàn)，Cl，Br，C1-C12烷基，羥基-C1-C12烷基，氨基C1-C12烷基，C1-C12烷氧基，苯甲氧基或C1-C12烷硫基，未被取代或被保護基團取代的羥基和氨基，或為苯基，苯甲基，C1-C20的伯氨基，C2-C30的仲氨基，C1-C12鏈烯基或C1-C12炔基，式Ⅲb中的NH2未被取代或被C1-C6烷基，苯甲?；?，保護基團，式Ⅲ、Ⅲa、Ⅲb、和Ⅲc殘基的二氫衍生物所取代。
14.權(quán)利要求13所述化合物中Rb8為氫，C1-C6烷基，或C1-C6羥烷基，C2-C6鏈烯基或C2-C6炔基，F(xiàn)，Cl，Br，NH2，苯甲?；被蛞换蚨﨏1-C6烷基氨基。
15.權(quán)利要求13所述化合物中Rb8為氫，C1-C6烷基或C1-C6烷氧基或C1-C6羥烷基，C2-C6鏈烯基或C2-C6炔基，F(xiàn)，Cl，Br，NH，苯甲酰基氨基或一或二-C1-C6烷基氨基。
16.權(quán)利要求14所述的化合物中Rb8為H，F(xiàn)，Cl，Br，NH2，NHCH3，N(CH3)2，C2-C4烷基，C2-C4鏈烯基-(1)或C2-C4炔基-(1)。
17.權(quán)利要求15所述化合物中Rb8為氫、C1-C4烷基，C2-C4鏈烯基-(1)，C2-C4炔基-(1)，NH2，NHCH3或(CH3)2N。
18.權(quán)利要求1所述化合物中作為嘧啶類似物殘基的B可以下列化合物派生尿嘧啶，胸腺嘧啶，胞嘧啶，5-氟尿嘧啶，5-氯尿嘧啶，5-溴尿嘧啶，二氫尿嘧啶，5-甲基胞嘧啶，5-丙炔胸腺嘧啶和5-丙炔胞嘧啶。
19.權(quán)利要求1所述化合物中R2為與式P1或P2相對應(yīng)的含磷的構(gòu)成核苷酸橋基的殘基 其中，Ya為氫，C1-C12烷基，C6-C12芳基，C7-C20芳烷基，C7-C20烷基芳基，-ORb，-SRb，-NH2，伯氨基，仲氨基，O-M+或S-M+;Xa為氧或硫;Ra為氫，M+，C1-C12烷基，C2-C12鏈烯基或C6-C12芳基，或RaO-基團如有5元環(huán)和1-3個氮原子的N-氮雜芳基-N-基;R6為氫，C1-C12烷基或C6-C12芳基;M+為Na+，K+，Li+，NH4+或伯、仲、叔、季銨;Ya中的烷基，芳基，芳烷基和烷芳基及Ra和Rb未被取代或被烷氧基，烷硫基，鹵素，-CN，-NO2，苯基，硝基苯基或鹵代苯基取代。
20.權(quán)利要求19所述化合物中Ra為β-氰乙基，Ya為二(異丙基)氨基。
21.權(quán)利要求1所述化合物中R3為式Ⅰa殘基。
22.權(quán)利要求21所述化合物中n為1-8。
23.權(quán)利要求22所述化合物中n為1-6。
24.權(quán)利要求21所述化合物中R4為氫，C1-C21烷基，C2-C21鏈烯基或C2-C21炔基。
25.權(quán)利要求24中所述化合物中R4為氫或C1-C4烷基。
26.權(quán)利要求21所述化合物中R5為氫，C1-C5烷基，-CH2-OH，-CH2-O-C1-C22烷基或-CH2-O-[(CH2)2-O]m-C1-C10烷基，式中m為1-4。
27.權(quán)利要求26所述化合物中R5為氫、甲基-CH2OH，-CH2-O-C1-C22烷基或-CH2-O-[(CH2)2-O]m-C1-C10烷基，式中m為1-4。
28.權(quán)利要求1所述化合物中，R3為式Ⅰb殘基。
29.權(quán)利要求28所述化合物中，Z為-CH2-或取代-CH2-。
30.權(quán)利要求1所述化合物中，R3為式Ⅰc殘基。
31.式Ⅰ化合物的制備方法 其中R1和R2為相互獨立的氫或保護基團，或R1有此定義而R2為構(gòu)成含烯核苷的殘基，B為嘌呤基或嘧啶基或其類似物。(a)R3為式Ⅰa殘基 其中，R4為氫，C1-C21烷基，C2-C21鏈烯基，C2-C21炔基或-C(＝O)烷基;R5為氫，C1-C10烷基，-CH2-O-R6或式Ⅰb殘基;R6為氫，C1-C22烷基，C2-C21鏈烯基，部分或全部氟取代的C1-C10烷基或-[(CH2)2-O]m-R7;R7為氫或C1-C21烷基;n為1-12;m為1-4;當n＝1，R5＝氫時，R4不能是氫，該方法為在惰性溶劑中，將式Ⅳa化合物 其中R14和R15為相同的或不同的保護基團，B為嘌呤基或嘧啶基或其類似物，堿基B中功能基團被保護基團保護起來，與式A化合物反應(yīng)， 其中R4，R5和n為前述定義，X為Cl，Br，I，甲苯磺?；?O或甲磺?；?O;(b)R3為式Ⅰc殘基 制備方法為在惰性溶劑中，將式Ⅳa化合物與式B化合物反應(yīng) 其中X為Cl，Br，I，甲苯磺酰基-O或甲磺?；?O;(c)R3為式Ⅰb的殘基 其中，R5為氫，C1-C10烷基，-CH2-O-R6或式Ⅰb殘基;R6為氫，C1-C22烷基，C3-C21鏈烯基，部分或全部氟代C1-C10烷基或-[(CH2)2-O]m-R7;R7為氫或C1-C21烷基;Z為-(OH2)p-或-(CH2-CH-O)q-CH2CH2-，Z中的-CH2-未被取代或被一個或多個、相同或不同的C1-C10烷基或C5-C6環(huán)烷基，未被取代或C1-C4烷基取代苯基取代;m為1-4;p為1-10;q為1-4;該方法為在H2O和BF3存在下打開由(b)得到的環(huán)氧化物并與式X′-(CH2)q-X′或X′-(CH2-CH-O)r-X′化合物關(guān)環(huán)而形成一個新環(huán)，其中X′為Cl，Br，I，甲苯磺酸基-O或甲磺?；?O，(d)R3為式Ⅰa)殘基該方法為在R6OH和BF3存在下，使由(b)獲得的環(huán)氧化物反應(yīng)，將游離羥基轉(zhuǎn)化為醚基或酯基;(e)R3為式Ⅰa殘基該方法為在BF3和NaBH4存在下，將由(b)獲得的環(huán)氧化物加氫，將游離羥基轉(zhuǎn)化為醚基或酯基，(f)R3為式Ⅰa殘基，該方法為將由(b)獲得的環(huán)氧化物與適量的Grignard試劑反應(yīng)，從而將游離羥基轉(zhuǎn)化為醚基或酯基;(g)R3為式Ⅰa、Ⅰb或Ⅰc殘基該方法包括用(a)-(f)所述方法之一取代式Ⅳb化合物的2′-OH 其中R14和R15如前述定義，A為離去基團，通過取代引入堿基B;進而去掉保護基R14和R15，引入構(gòu)成含磷核苷酸橋基的殘基。
32.權(quán)利要求1所述化合物在制備低聚核苷酸的應(yīng)用，該低聚核苷酸含有式Ⅰ化合物相同或不同單體單元或含有式Ⅰ化合物至少一個單體單元與其他天然或合成核苷的單體單元結(jié)合，該低聚核苷酸含有2-200個單體單元。
33.權(quán)利要求32，其用途在于制備含有2-200單體單元的低聚核苷酸。
34.根據(jù)權(quán)利要求33，其用途在于制備含有2-50個單體單元的低聚核苷酸。
35.根據(jù)權(quán)利要求34，其用途在于制備含有4-30個單體單元的低聚核苷酸。
36.根據(jù)權(quán)利要求32，其用途在于制備含有式Ⅰ化合物相同或不同的單體單元的低聚核苷酸。
37.根據(jù)權(quán)利要求32，其用途在于制備含有式Ⅰ化合物相同的單體單元和天然或合成核苷的單體單元的低聚核苷酸。
38.式Ⅴ低聚核苷酸其中X為0-200，Y為核苷酸橋基;U、V和W為相互獨立的相同或不同的天然或合成核苷酸殘基，至少U，V和/或W之一為式Ⅵ殘基 其中B為嘌呤基或嘧啶基或其類似物;R3為式Ⅰa，Ⅰb，Ⅰc殘基 其中，R4為氫，C1-C21烷基，C2-C21鏈烯基，C2-C21炔基，或-C(＝O)烷基;R5為氫，C1-C10烷基，-CH2-O-R6或式Ⅰb殘基;R6為氫，C1-C22烷基，C3-C21鏈烯基，部分或全部氟代的C1-C10烷基或[(CH2)2-O]m-R7;R7為氫或C1-C21烷基Z為-(CH2)p-或-(CH2-CH-O)q-CH2CH2-，Z中的-CH2-未取代或被一個或多個相同或不同的C1-C10烷基或C5-C6環(huán)烷基，未被取代或C1-C4烷基取代的苯基取代;n為1-12;m為1-4;p為1-10;q為1-4。
39.權(quán)利要求38所述低聚核苷酸中，橋基Y為-P(O)O-，-P(O)S-，-P(S)S-，-P(O)R16-，-P(O)NR17R18-或-CH2-，R16為氫或C1-C6烷基，R17和R18相互獨立地具有R16的定義。
40.權(quán)利要求38所述低聚核苷酸中，橋基Y為-P(O)O-。
41.權(quán)利要求38所述低聚核苷酸中，X為0-100。
42.權(quán)利要求41所述低聚核苷酸中，X為1-50。
43.權(quán)利要求42所述低聚核苷酸，X為3-29。
44.權(quán)利要求38所述低聚核苷酸中，式Ⅵ殘基在未端和/或在核苷酸序列中成鍵。
45.權(quán)利要求38所述低聚核苷酸中，式Ⅵ殘基在天然或合成核苷酸殘基之間成鍵。
46.權(quán)利要求44和45所述低聚核苷酸中，2-5個相同或不同式Ⅵ殘基互相連接。
47.權(quán)利要求38所述低聚化合物中含有總共4-30核苷單元和1-12個式Ⅵ殘基。
48.權(quán)利要求38所述低聚核苷酸中，作為嘌呤基或其類似物的B為式Ⅱ、Ⅱa、Ⅱb、Ⅱc、Ⅱd、Ⅱe或Ⅱf殘基 其中，Rb1為H，Cl，Br，OH或-O-C1-C12烷基;Rb2，Rb3和Rb5為相互獨立的H，OH，SH，NH2，NHNH2，NHOH，NHO-C1-C12烷基，-N＝CH-N(C1-C12烷基)2，-N＝CH-N-環(huán)烷基，F(xiàn)，Cl，Br，C1-C12烷基，羥基-C1-C12烷基，氨基-C1-C12烷基，C1-C12烷氧基，苯甲氧基或C1-C12烷硫基;未取代或被保護基團取代的羥基和氨基;苯基，苯甲基，有C1-C20的伯氨基或C2-C30的仲氨基，Rb4為氫，CN或-C＝C-Rb7;Rb6和Rb7為氫或C1-C4烷基
49.權(quán)利要求38所述的低聚核苷酸中，B為式Ⅲ、Ⅲa、II-Ib、Ⅲc的尿嘌嘧啶、胸腺嘧啶或胞嘌啶的殘基， 其中Rb6為氫或C1-C4烷基，Rb8為H，OH，SH，NH2，NHNH2，NHOH，NH-C1-C12烷基，-N＝CH-N(C1-C12烷基)2，N＝CH-N-環(huán)烷基，F(xiàn)，Cl，Br，C1-C12烷基，羥基-C1-C12烷基，氨基-C1-C12烷基，C1-C12烷氧基，苯甲氧基或C1-C12烷硫基，未取代或被保護基團取代的羥基和氨基，或為苯基，苯甲基，有C1-C20的伯氨基，C2-C30的仲氨基，C2-C12鏈烯基或C2-C12炔基，或Ⅲb中的NH2基未被取代或被C1-C6烷基，苯甲?；?，保護基團，式Ⅲ、Ⅲa、Ⅲb、Ⅲc殘基的二氫衍生物取代。
50.權(quán)利要求38所述的低聚核苷酸中，R3為式Ⅰa殘基。
51.權(quán)利要求50所述的低聚核苷酸中，n為1-8。
52.權(quán)利要求51所述的低聚核苷酸中，n為1-6。
53.權(quán)利要求50所述的低聚核苷酸中，R4為氫，C1-C21烷基，C2-C21鏈烯基或C2-C21炔基。
54.權(quán)利要求53所述的低聚核苷酸中，R4為氫或C1-C4烷基。
55.權(quán)利要求50所述的低聚核苷酸中，R5為氫，C1-C5烷基或-CH2-OH，-CH2-O-C1-C22烷基或-CH2-O-[(CH2)2-O]m-C1-C10烷基，其中m為1-4。
56.權(quán)利要求55所述的低聚核苷酸中，R5為氫、甲基或-CH2-OH，-CH2-O-C1-C22烷基或-CH2-O-[(CH2)2-O]m-C1-C10烷基，其中m為1-4。
57.權(quán)利要求38所述的低聚核苷酸中，R3為式Ⅰb殘基。
58.權(quán)利要求57所述的低聚核苷酸中，Z為-CH2或取代-CH2-。
59.權(quán)利要求38所述的低聚核苷酸中，R3為式Ⅰc殘基。
60.式Ⅴ的低聚核苷酸作為診斷試劑在檢測病毒感染或遺傳疾病中的應(yīng)用。
61.式Ⅴ低聚核苷酸在通過作用于體內(nèi)核苷酸序列而治療包括人類在內(nèi)的熱血動物疾病的治療方法中的應(yīng)用。
62.只含有有效量的式Ⅰ核苷或式Ⅴ低聚核苷酸或還含有其他活性成分，藥物載體和適量賦形劑的藥物組合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及I式化合物，式中各基團定義詳見說明書。
文檔編號C07H19/167GK1100728SQ9410571
公開日1995年3月29日 申請日期1994年5月11日 優(yōu)先權(quán)日1993年5月12日
發(fā)明者P·馬丁 申請人:希巴-蓋吉股份公司