專(zhuān)利名稱(chēng)：Mt生產(chǎn)的新工藝的制作方法
金屬硫蛋白(Metallothionein，簡(jiǎn)稱(chēng)MT)是一類(lèi)低分子量(約6500D)、富含半胱氨酸的金屬結(jié)合蛋白。1957年Margoshes& Vallee在研究Cd++對(duì)生物體的效應(yīng)時(shí)，從蓄積鎘的馬腎中首先分離出來(lái)了MT(Margoshes M.& Vallee，B.L.A cadmiumprotein from equine kidney cortex.J.Am.Chem.Soc.，1957，79，4813-4814.)，如今已發(fā)現(xiàn)MT幾乎存在于哺乳動(dòng)物所有的組織中(連接組織除外)，而且近年來(lái)從植物和微生物中也分離出來(lái)了這種類(lèi)似的金屬蛋白結(jié)合體。研究證明MT可高效地清除導(dǎo)致人衰老的超氧游離基(·O2-)和羥游離基(·OH)(Mayo，K.E.& Palmiter，R.D.Glucocorticoid regulation of themouse metallothionein in rats.Am.J.Physiol.1986，251E688-E694.)，而人們已較熟悉的SOD卻對(duì)后者無(wú)作用。故MT有”人體衰老因子清道夫”的美稱(chēng)。許多國(guó)家的科技工作者也為此做了廣泛深入的研究與應(yīng)用探討，到如今已召開(kāi)了四次國(guó)際性的專(zhuān)題討論會(huì)，我國(guó)已將MT的研究列入國(guó)家863計(jì)劃，其應(yīng)用已列入了國(guó)家火炬計(jì)劃。
本發(fā)明涉及生產(chǎn)MT生物工程技術(shù)的革新，到目前為止，已有的生產(chǎn)工藝系采用對(duì)人體有毒的CdCl2誘導(dǎo)，所制備出的MT雖經(jīng)純化處理，但仍有結(jié)合態(tài)的Cd原子存在，一般在1個(gè)MT分子中含有4～5個(gè)Cd，不宜直接用于保健品或藥品。
本發(fā)明的新工藝主要特征包括1.是采用了無(wú)毒的二價(jià)鹽(其通式為MX，式中M＝Zn2+、Cu2+、Fe2+、Cr2+；X＝Cl-、SO42-)代替了有毒的Cd2+作為誘導(dǎo)劑；2.以磷酸鹽緩沖液代替了Tris-HCl緩沖液；3.精減了柱層析純化過(guò)程。新工藝的總收率達(dá)到1.3％，縮短了生產(chǎn)周期并大大降低了成本；4.為了減少血紅蛋白對(duì)產(chǎn)品色質(zhì)的污染，在誘導(dǎo)結(jié)束處死動(dòng)物時(shí)采用斷頭法放血，并用擠壓法盡量使殘留血流出；5.在產(chǎn)品的后期處理中，采用無(wú)水乙醇和無(wú)水乙醚沉淀的辦法，精減了冰凍干燥步驟和所需設(shè)備；6.在提取過(guò)程中采用煮沸法使MT與其它雜蛋白分離，而絲毫不降低產(chǎn)品的活性，這不但簡(jiǎn)化了生產(chǎn)工藝，而且保證了安全操作；7.用于提取的材料除取用肝臟外，還取用了小腸和腎臟組織，從而再一次降低了生產(chǎn)成本。
實(shí)施例1取家兔(體重為3～4公斤)2只，耳朵皮下注射ZnSO4(生理鹽水配制)四次，即第一天注射15mg Zn/kg，第二天和第四天注射22.5mg Zn/kg，第七天注射30mg/kg，第八天斷頭處死，盡量把血放干凈，取出肝臟、小腸和腎臟，稱(chēng)重并剪成小塊后，加入等體積的0.01M磷酸鹽緩沖液，用組織搗碎機(jī)制成勻漿，調(diào)pH至8.6，低溫離心(8000rpm)，棄渣，取上清液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上使總體積濃縮至300～400ml，再加入足夠量的衛(wèi)生酒精，最終使醇濃度達(dá)到70％，靜置使MT充分沉淀。用虹吸法移出上清液，沉淀用無(wú)水乙醇洗滌，抽濾，再用少量無(wú)水乙醚洗滌，即可得到近乎白色的MT干粉。產(chǎn)率～1.3％(按組織濕重計(jì)算)。
實(shí)施例2家兔2只(體重3～4公斤)，耳朵皮下注射ZnSO4(生理鹽水配制)四次，即第一天注射15mg Zn/kg，第二天和第四天注射22.5mg Zn/kg，第七天注射30mg/kg，第八天斷頭處死，盡量把血放干凈，取出肝臟、小腸和腎臟，稱(chēng)重并剪成小塊后，加入等體積的0.01M Tris-HCl緩沖液，用組織搗碎機(jī)制成勻漿，調(diào)pH至8.6，沸水浴上加熱處理10分鐘，使雜蛋白變性沉淀，離心(8000rpm)棄渣，取上清液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上使總體積濃縮至300～400ml，再加入足夠量的衛(wèi)生酒精，最終使醇濃度達(dá)到70％，靜置使MT充分沉淀。用虹吸法移出上清液，沉淀用無(wú)水乙醇洗滌，抽濾，再用少量無(wú)水乙醚洗滌，即可得到近乎白色的MT干粉。產(chǎn)率1.0％(按組織濕重計(jì)算)。MT含量測(cè)定—單掃示波極譜法(SSP)取20～50μl，收集管中溶液，加0.5ml，1mol/L HNO3，混勻后加入0.5ml 3mol/L NaAc，加水至5ml，再加入50μl 4×10-3mol/Lα，α-聯(lián)吡啶，搖勻后轉(zhuǎn)入10ml小燒杯中，起始電位-0.8伏，陰極化掃描，記錄-1.13伏處導(dǎo)數(shù)峰高，其中MT-I和MT-II的混合含量為1.3～1.5％。
權(quán)利要求
1.MT系Metallothionein的簡(jiǎn)稱(chēng)，是一種金屬蛋白結(jié)合體，或稱(chēng)金屬硫蛋白，研究證明它具有很好的消除黃褐斑、老年斑等抗衰老功能。本發(fā)明的主要內(nèi)容是采用了無(wú)毒的二價(jià)鹽，如Zn++、Cu++、Fe++、Cr++等作為誘導(dǎo)劑代替有毒的Cd++誘導(dǎo)劑，以磷酸鹽緩沖液代替了Tris-HCl緩沖液，精簡(jiǎn)了柱層析純化過(guò)程，提高了收率并大大降低了成本；
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述，當(dāng)誘導(dǎo)結(jié)束處死動(dòng)物時(shí)，用斷頭法放血，盡量減少血紅蛋白對(duì)產(chǎn)品的污染；
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述，以無(wú)水乙醇和無(wú)水乙醚多次洗滌沉淀并使產(chǎn)品快速干燥，從而省卻了冰凍干燥等設(shè)備要求，且保持了產(chǎn)品應(yīng)有的活性；
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述，本發(fā)明所使用的原材料除原用的肝臟外，還增加了小腸與腎臟，進(jìn)一步降低了成本。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述，本發(fā)明在提取MT時(shí)，采用煮沸的方法將MT與其它雜蛋白分離，而絲毫不降低MT的生物活性，并由此大大簡(jiǎn)化了工藝流程，并保證了安全操作。
全文摘要
本發(fā)明涉及用對(duì)生物體無(wú)毒有益的二價(jià)鹽誘導(dǎo)的生物工程技術(shù)生產(chǎn)金屬蛋白結(jié)合體(Metallothionein，以下簡(jiǎn)稱(chēng)MT)的新方法。到目前為止，已有的生產(chǎn)工藝系采用對(duì)人體有毒的CdCl
文檔編號(hào)C07K14/435GK1155547SQ9511782
公開(kāi)日1997年7月30日 申請(qǐng)日期1995年12月7日 優(yōu)先權(quán)日1995年12月7日
發(fā)明者丁鑒, 張祖豐, 阮慎康 申請(qǐng)人:丁鑒, 張祖豐, 阮慎康