專利名稱：A環(huán)被修飾的積雪草酸衍生物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及A環(huán)被修飾的積雪草酸衍生物，該衍生物由式1表示

其中R1表示含1-4個(gè)碳原子的低級(jí)烷基、含1-4個(gè)碳原子的烷氧基、羥甲基、鹵代甲基或可被乙二硫醇保護(hù)的醛基；R2表示含1-4個(gè)碳原子的低級(jí)烷基、叔丁基二甲基甲硅烷氧基甲基、鹵代甲基、-CH2OCO(CH2)nCO2H(n=0-3)、-CH2OCOCHCHC6H5或可以被乙?；虮郊柞；Ｗo(hù)的羥甲基；R3表示氫原子或甲基；而2位的雙鍵可被還原為單鍵。
本發(fā)明還涉及含上述衍生物作為活性組份的抗癌劑和肝功能保護(hù)劑。
背景技術(shù)：
這些積雪草酸衍生物已通過(guò)修飾積雪草酸或積雪草酸甲酯的A環(huán)制備。此修飾已用來(lái)判定積雪草酸的結(jié)構(gòu)式，并已報(bào)道[B.Singh和R.P.Rastogi,Phytochemistry,8,917-921,1969]。
積雪草酸和積雪草皂苷(積雪草酸的三糖)和羥基積雪草酸(madecassic acid)，它們提取自積雪草，由Bontems在1941年首次分離[J.E.Bontems,Bull.Sci.Pharmacol.,49,186-96(1941)]，而它們的結(jié)構(gòu)由Polonsky及其同事確定[J.Polonsky,Compt.Rend.,232,1878-80(1951)；J.Polonsky,Bull.Soc.Chim.,173-80(1953)]。
由積雪草中得到的該提取物包括積雪草酸和積雪草皂苷，它們很早就已用于治療損傷的皮膚或慢性潰瘍，還用于治療肺結(jié)核或麻風(fēng)病造成的皮膚變形[P.Boiteau,A.Buzas,E.Lederer和J.Polonsky,Bull.Soc.Chim.,31,46-51(1949)]。
最近，報(bào)道了與從植物中提取的積雪草酸結(jié)構(gòu)相似的多種三萜類，特別是烏索酸，對(duì)細(xì)胞毒性有作用[K.Yasukawa,Oncology,48,72-76(1991)；Dominic,Y.Alex,Med.Sci.Res.,21(5),213-215(1993)；Ryu,Shi young,Arch.Pharmacal.Res.,17(5),375-7(1994)]。據(jù)報(bào)道樺木酸表現(xiàn)出對(duì)黑素瘤細(xì)胞具有細(xì)胞毒作用而且基本上無(wú)副作用，該樺木酸可容易地由分離自白樺樹(shù)皮的前體合成[Nat.Med.1,1046(1995)]。
發(fā)明公開(kāi)本發(fā)明為開(kāi)發(fā)具有多種醫(yī)療用途的新的藥物組合物進(jìn)行了廣泛的研究，結(jié)果由得自積雪草的積雪草酸開(kāi)始合成了帶有被修飾的A環(huán)的多種衍生物。還發(fā)現(xiàn)這些衍生物具有細(xì)胞毒作用和肝臟保護(hù)功能，于是完成了本發(fā)明。
本發(fā)明的目的是提供積雪草酸衍生物。
本發(fā)明涉及A環(huán)被修飾的積雪草酸衍生物，該衍生物由式1表示

其中R1表示含1-4個(gè)碳原子的低級(jí)烷基、含1-4個(gè)碳原子的烷氧基、羥甲基、鹵代甲基或可被乙二硫醇保護(hù)的醛基；R2表示含1-4個(gè)碳原子的低級(jí)烷基、叔丁基二甲基甲硅烷氧基甲基、鹵代甲基、-CH2OCO(CH2)nCO2H(n=0-3)、-CH2OCOCHCHC6H5或可被乙?；虮郊柞；Ｗo(hù)的羥甲基；R3表示氫原子或甲基；而2位的雙鍵可被還原為單鍵。
本發(fā)明還涉及含上述衍生物作為活性組份的抗癌劑和肝功能保護(hù)劑。
制備本發(fā)明的帶有被修飾的A環(huán)的積雪草酸衍生物的方法舉例如下方法11)用重氮甲烷處理積雪草酸(2)定量得到積雪草酸甲酯(3,R3=甲基)，然后將其氧化得到內(nèi)半縮醛結(jié)構(gòu)的化合物(4,R3=甲基)，其A環(huán)已被修飾。用催化劑量的乙酸/哌啶處理此化合物得到A(1)-降烏(norursa)-2,12-二烯-23-羥基-2-甲?；?28-甲酸甲酯(5,R3=甲基)[見(jiàn)方案1]。
2)如上用積雪草酸(2)得到具有內(nèi)半縮醛結(jié)構(gòu)的化合物(4,R3=H)，并將所得化合物用乙酸/哌啶催化劑處理制備A(1)-降烏-2,12-二烯-23-羥基-2-甲?；?28-甲酸(5,R3=H)，其中帶有被修飾的A環(huán)[見(jiàn)方案1]。方案1

方法2通過(guò)用R4COOH在催化劑的存在下將得到的上述化合物(5)酯化制備通式(6)表示的化合物[見(jiàn)方案2]。
方案2
方法3用叔丁基二甲基甲硅烷基氯和咪唑處理上述化合物(5)得到通式(7)的中間體，即23-OH被保護(hù)的中間體。將所得化合物的醛基還原得到通式(8)的化合物，然后將其鹵化得到通式(9)的中間體。
用還原劑處理通式(9)的中間體化合物并加熱回流得到通式(10)的化合物，然后用四丁基氟化銨將其甲硅烷基除去得到通式(11)的化合物，本發(fā)明的一種新的化合物(見(jiàn)方案3)。方案3

方法4將上述化合物(5)的醛基還原得到通式(12)的化合物，本發(fā)明的一種新化合物，然后用鹵化試劑處理得到通式(13)的化合物。
用還原劑處理上述通式(13)的化合物并加熱回流得到通式(14)的化合物，本發(fā)明的一種新化合物(見(jiàn)方案4)。
方案4

方法5將上述通式(5)的化合物的23-羥基(OH)?；玫奖槐Ｗo(hù)的化合物，通式(15)化合物，然后用二乙胺三氟化硫處理得到通式(16)的化合物，本發(fā)明的一種新化合物。
將上述通式(15)的化合物還原得到通式(17)的化合物，然后將其用二乙胺三氟化硫處理得到通式(18)的化合物，一種新化合物(見(jiàn)方案5)。方案5

方法6將上述通式(12)的化合物還原得到通式(19)的化合物，一種新化合物(見(jiàn)方案6)。
方案6

方法7用乙二硫醇處理上述通式(5)的化合物得到化合物(20)，該化合物被硫縮醛保護(hù)。用阮內(nèi)鎳將通式(20)的化合物還原得到通式(21)的化合物，本發(fā)明的一種新化合物(見(jiàn)方案7)。方案7

方法8將上述通式(8)化合物的羥基甲基化得到通式(22)的化合物，然后用四丁基氟化銨將甲硅烷基除去得到通式(23)的化合物(見(jiàn)方案8)。

對(duì)于成人來(lái)說(shuō)，作為抗癌劑，通式(1)化合物的劑量為0.01至1000mg/天，而作為肝臟保護(hù)劑，其劑量為0.05至50mg/天。此劑量依賴于患者的年齡和體重以及癥狀。
本發(fā)明的抗癌劑和肝臟保護(hù)劑可通過(guò)常規(guī)方法配制為適于口服或非腸道給藥的制劑。對(duì)于口服給藥，可將其配制為片劑、膠囊、溶液劑、糖漿劑或混懸劑，而對(duì)于非腸道給藥，可配制為透皮或皮下注射液，或腹腔內(nèi)或肌肉內(nèi)注射液。
實(shí)施本發(fā)明的最好方式現(xiàn)在，參照實(shí)施例、實(shí)驗(yàn)實(shí)施例和制劑實(shí)施例描述本發(fā)明。然而應(yīng)注意本發(fā)明并不限于這些實(shí)施例中。實(shí)施例1積雪草酸甲酯(3)的制備將積雪草酸(500mg)溶解于甲醇(25ml)中，并將此溶液冷卻至0℃。加入過(guò)量的重氮甲烷/乙醚溶液，并將所得混合物室溫?cái)嚢?小時(shí)。減壓蒸發(fā)除去溶劑，通過(guò)柱色譜純化此殘余物(洗脫液∶二氯甲烷/甲醇=30∶1)得到490mg白色固體(收率95％)。將產(chǎn)物用乙酸乙酯重結(jié)晶得到針狀結(jié)晶。IR(neat):3400,1718cm-1Mass(EI):m/e 503(M-+1),467,443,262,203,189,1331H-NMR(CDCl3):δ0.75,0.91,1.04,1.08(each 3H,s),0.85(3H,d,J=6.4Hz),0.94(1H,d,J=6.0Hz),2.23(1H,d,J=10.8Hz),3.41,3.47(2H,ABq,J=9.2Hz),3.60(3H,s),3.69(1H,d,J=10.4Hz),3.73-3.80(1H,m),5.25(1H,brt)實(shí)施例2化合物(4,R3=甲基)的制備將積雪草酸甲酯(1000mg,1.99mmol)溶解于甲醇∶水=20∶1中，并加入NaIO4(645.6mg)，將所得混合物室溫?cái)嚢杓s3小時(shí)。減壓濃縮除去溶劑，并將此殘余物用乙酸乙酯稀釋，洗滌并干燥。過(guò)濾后，減壓濃縮濾液得到殘余物，將其通過(guò)柱色譜(二氯甲烷∶甲醇=50∶1)分離得到790mg白色固體(收率79.3％)。IR(neat):3426,1713cm-1Mass(EI):m/e 500(M+)1H-NMR(400MHz,CDCl3):δ9.95(s,1H),5.30(t,1H,J=3.2Hz),5.14-5.10(m,1H),3.93,3.75(ABq,2H,J=13.6Hz),3.61(s,3H),2.34(d,1H,J=2.9Hz),1.08,1.06,1.00,0.84(each s,3H),0.85(d,3H,J=7.8Hz)
化合物(4,R3=H)的制備除了用積雪草酸代替積雪草酸甲酯外，用與實(shí)施例2相同的方法(收率72.8％)。IR(neat):3368,2927,1694cm-1Mass(EI):m/e 486(M+)1H-NMR(300MHz,CDCl3):δ9.93(s,1H),5.28(t,1H),5.10(m,1H),3.91,3.73(ABq,2H,J=13.3Hz),2.19(d,1H,J=10.5Hz),1.07,1.04,0.98,0.82(each s,3H),0.93(d,3H,J=5.61Hz),0.85(d,3H,J=3.66Hz)實(shí)施例3:A(1)-降烏-2,12-二烯-23-羥基-2-甲?；?28-甲酸甲酯(5,R3=甲基)的制備將化合物(4,830mg,1.66ml)減壓干燥并充入氮?dú)?，再溶解于無(wú)水苯中。加入乙酸(20ml)、哌啶(20ml)。將所得溶液在60℃加熱回流約1小時(shí)。1小時(shí)后加入無(wú)水硫酸鎂并加熱回流5小時(shí)，減壓蒸發(fā)除去溶劑并用乙酸乙酯稀釋此殘余物，洗滌并干燥。減壓濃縮濾液并分別通過(guò)柱色譜(二氯甲烷∶甲醇=80∶1)純化得到580mg(收率72.5％)。IR(neat):3443,1718,1685cm-1Mass(EI):m/e 483(M++1)1H-NMR(300MHz,CDCl3):δ9.70(s,1H),6.64(t,1H),5.26(t,1H,J=4.0Hz),3.59(s,3H),3.54,3.50(ABq,2H,J=6.96Hz),1.23,1.07,1.01,0.83(each s,3H),0.91(d,3H,J=5.61Hz),0.82(d,3H,J=6.36Hz)實(shí)施例4:A(1)-降烏-2,12-二烯-23-烷基羰基氧基-2-甲?；?28-甲酸甲酯(6,R4=-C2H4CO2H)的制備將化合物(5,31.5mg,0.065ml)、琥珀酸(8.49ml)、1,3-二環(huán)己基碳亞胺(carboimide)(14.98mg)、4-二甲基氨基吡啶(0.80mg)減壓干燥，所得物質(zhì)充以氬氣，溶解于二氯甲烷中并室溫?cái)嚢?2小時(shí)。將所得物質(zhì)過(guò)濾，并用稀鹽酸、水和飽和氯化鈉溶液洗滌濾液，并干燥。將此濾液減壓干燥并分別通過(guò)柱色譜(二氯甲烷∶甲醇=20∶1)純化得到17.3mg(收率45.5％)。IR(neat):2927,1733cm-1Mass(EI):m/e 582(M+)1H-NMR(300MHz,CDCl3):δ9.69(s,1H),6.56(s,1H),5.28(s,1H),5.26(t,1H),4.06,3.98(A3q,2H,J=10.97Hz),3.59(s,3H),2.65(s,4H),1.23,1.06,1.03(each s,3H),0.91(d,3H,J=5.85Hz),0.83(d,3H,J=4.14Hz)化合物(6,R4=-C3H6CO2H)除了用戊二酸代替琥珀酸外，用與實(shí)施例4相同的方法(收率51.2％)。IR(neat):2928,1733cm-1Mass(EI):m/e 596(M+),597,5981H-NMR(300MHz,CDCl3):δ9.69(s,1H),6.58(s,1H),5.26(t,1H),4.05,3.94(ABq,2H,J=10.7Hz),3.59(s,3H),2.42(t,2H,J=6.71Hz),2.21(d,1H,J=11.2Hz),1.95(t,2H,J=7.19Hz),1.22,1.07,1.05,0.92,0.82(each s,3H),0.82(d,3H,J=6.33Hz)化合物(6,R4=-CHCHC6H5)除了用肉桂酸代替琥珀酸外，用與實(shí)施例4相同的方法(收率73.0％)。IR(neat):2927,1718cm-1Mass(EI):m/e 612(M+),613,6141H-NMR(300MHz,CDCl3):δ9.72(s,1H),7.68(d,1H,J=15.8Hz),7.53-7.50(m,2H),7.40-7.37(m,3H),6.66(s,1H),6.43(d,1H,J=16.1Hz),5.27(t,1H),4.17,4.08(ABq,2H,J=10.95Hz),3.59(s,3H),2.20(d,1H,J=10.5Hz),1.53,1.24,1.10,1.04,0.79(eachs,3H),0.90(d,3H,J=6.09Hz),0.82(d,3H,J=5.13Hz)化合物(6,R4=-C6H5)除了用苯甲酸代替琥珀酸外，用與實(shí)施例4相同的方法(收率60.1％)。IR(neat):2927,1723cm-1Mass(EI):m/e 586(M-),5871H-NMR(300MHz,CDCl3):δ9.96(s,1H).7.96(d,2H,J=6.42Hz),7.51(t,1H,J=7.40Hz),7.38(t,2H,J=7.19Hz),6.63(s,1H),5.21(t,1H,J=3.53Hz),4.26,4.11(ABq,2H,J=10.98Hz),3.54(s,3H),2.15(d,1H,J=10.3Hz)1.20,1.08,0.95,0.84,0.76(each s,3H),0.78(d,3H,J=2.19Hz)實(shí)施例5:A(1)-降烏-2,1-二烯-23-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-2-甲?；?28-甲酸甲酯(7)的制備將上述化合物(5,50mg,0.104mmol)、咪唑(24.8mg)、叔丁基二甲基甲硅烷基氯(62.7mg)減壓干燥并充入氬氣。將所得混合物溶解于無(wú)水二氯甲烷中，并室溫?cái)嚢?小時(shí)。減壓蒸發(fā)除去溶劑。用乙酸乙酯稀釋此殘余物、洗滌、干燥并過(guò)濾。將此濾液減壓濃縮并用柱色譜(己烷∶乙酸乙酯=10∶1)分別純化得到透明的油狀化合物56.2mg(收率90.7％)。IR(neat):1725,1689cm-1Mass(EI):m/e 596(M+)1H-NMR(400MHz,CDCl3):δ9.70(s,1H),6.63(s,1H),5.29(t,1H,J=3.4Hz),3.61(s,3H),3.52,3.37(ABq,2H,J=9.5Hz),2.23(d,1H,J=10.7Hz),1.23,1.08,0.97,0.84(each s,3H),0.93(d,3H,J=5.9Hz),0.85(d,3H,J=6.4Hz),0.88(s,9H),0.05(s,6H)實(shí)施例6:A(1)-降烏-2-羥甲基-2,12-二烯-23-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-28-甲酸甲酯(8)的制備將上述化合物(7,91.7mg,0.154mmol)、硼氫化鈉(11.9mg)減壓干燥并充入氬氣。將所得混合物溶解于無(wú)水甲醇中，并室溫?cái)嚢?小時(shí)。減壓蒸發(fā)除去溶劑并用柱色譜(己烷∶乙酸乙酯=15∶1)分別純化得到混合物91.4mg(收率99.3％)。IR(neat):3449,1724cm-1Mass(EI):m/e 580(M++H2O)1H-NMR(400MHz,CDCl3):δ5.40(s,1H),5.23(t,1H),4.21,4.12(ABq,2H,J=22.9Hz),3.60(s,3H),3.38,329(ABq,2H,J=9.5Hz),2.22(d,1H,J=11.2Hz),1.15,1.10,0.93,0.80(each s,3H),0.86(d,3H,J=6.4Hz),0.88(s,9H),0.02(s,6H)實(shí)施例7:A(1)-降烏-2-溴甲基-2,12-二烯-23-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-28-甲酸甲酯(9,R5=Br)的制備將化合物(8,54mg,0.090mmol)、PPh3(35.8mg)、四溴化碳(45.2mg)減壓干燥并充入氬氣。將所得混合物溶解于無(wú)水二氯甲烷中，室溫?cái)嚢?0分鐘。減壓蒸發(fā)除去溶劑。用乙酸乙酯稀釋此殘余物、洗滌、干燥并過(guò)濾。將此濾液減壓濃縮，用柱色譜(己烷∶乙酸乙酯=10∶1)分別純化得到化合物53.7mg(收率90％)。1H-NMR(500MHz,CDCl3):δ5.57(s,1H),5.25(t,1H,J=3.48Hz),4.08,4.02(ABq,2H,J=11.1Hz),3.58(s,3H),3.35,3.26(ABq,2H,J=9.5Hz),2.20(d,1H,J=3.3Hz),1.10,0.93,0.81(eachs,3H),0.91(d,3H,J=4.05Hz),0.85(s,9H),0.00(s,6H)實(shí)施例8:A(1)-降烏-2-氯甲基-2,12-二烯-23-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-28-甲酸甲酯(9,R5=Cl)的制備將上述化合物(8,10.3mg,0.017mmol)減壓干燥充入氬氣。將所得混合物溶解于無(wú)水二氯甲烷中。0℃加入吡啶(1.38μl)和亞硫酰氯(3.76μl)，攪拌24小時(shí)。加入少量的水并減壓蒸發(fā)除去溶劑。減壓濃縮濾液并用柱色譜(己烷∶乙酸乙酯=30∶1)分別純化得到化合物0.6mg(收率5.7％)。IR(neat):1726.2928cm-11H-NMR(400MHz,CDCl3):δ5.56(s,1H),5.25(t,1H,J=3.2Hz),4.17,4.16(ABq,2H,J=1.23Hz),3.61(s,3H),3.38,3.29(ABq,2H,J=9.27Hz),2.24(d,1H,J=10.26Hz),1.19,1.12,0.94,0.82(each s,3H),0.95(d,3H,J=5.37Hz),0.87(d,3H,J=7.81Hz),0.88(s,9H),0.02(s,6H)實(shí)施例9:A(1)-降烏-2-碘甲基-2,12-二烯-23-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-28-甲酸甲酯(9,R5=I)的制備將上述化合物(8,31mg,0.052mmol)減壓干燥并充入氬氣。將所得混合物溶解于無(wú)水THF中并在0℃攪拌。將溶解于無(wú)水THF中的甲基三苯氧基碘化磷[(PhO)3P+CH3I-]加入到所得溶液中并攪拌30分鐘。向所得物質(zhì)中加入5％碳酸鉀并減壓蒸發(fā)除去溶劑。將此殘余物用乙酸乙酯稀釋、洗滌并干燥。減壓濃縮此濾液，用柱色譜(己烷∶乙酸乙酯=10∶1)分別純化得到化合物。1H-NMR(500MHz,CDCl3):δ5.57(s,1H),5.26(t,1H),4.06,3.89(ABq,2H,J=10.25Hz),3.58(s,3H),3.32,3.24(ABq,2H,J=9.48Hz),2.24(d,1H,J=10.26Hz),1.23,1.18,1.12,0.81(each s,3H),0.92(d,3H,J=6.4Hz),0.87(d,3H,J=1.15Hz),0.87(s,9H),0.01(s,6H)實(shí)施例10:A(1)-降烏-2-甲基-2,12-二烯-23-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-28-甲酸甲酯(10)的制備將上述化合物(9,15.3mg,0.023mmol)、硼氫化鈉(1.79mg)減壓干燥并用充入氬氣。將所得混合物溶解于無(wú)水DMSO中并室溫?cái)嚢?小時(shí)。減壓蒸發(fā)除去溶劑并用柱色譜(己烷∶乙酸乙酯=30∶1)分別純化得到化合物12mg(收率89％)。IR(neat):2928,1728cm-1Mass(EI):m/e 582(M+)1H-NMR(400MHz,CDCl3):δ5.22(t,1H),5.02(s,1H),3.60(s,3H),3.33,3.24(ABq,2H,J=12.3Hz),2.21(d,1H,J=15.4Hz),1.71(s,3H),1.10,1.08,0.94,0.79(each s,3H),0.88(d,3H,J=9.4Hz),0.87(s,9H),0.00(s,6H)實(shí)施例11:A(1)-降烏-2-甲基-2,12-二烯-23-羥基-28-甲酸甲酯(11)的制備將上述化合物(10,12mg,0.021mmol)減壓干燥并溶解于無(wú)水THF中。向所得混合物中室溫加入四丁基氟化銨(6.0mg)并攪拌24小時(shí)。減壓蒸發(fā)除去溶劑并用柱色譜(己烷∶乙酸乙酯=10∶1)分別純化得到混合物3.8mg(收率54.7％)。IR(neat):3436cm-1Mass(EI):m/e 469(M++1)1H-NMR(300MHz,CDCl3):δ5.22(t,1H,J=3.29Hz),4.98(s,1H),3.59(s,3H),3.37,3.30(ABq,2H,J=8.04Hz),2.07(d,1H,J=8.31Hz),1.75(s,3H),1.10,0.96,0.88,0.79(each s,3H),0.84(d,3H,J=6.33Hz)實(shí)施例12:A(1)-降烏-2-羥甲基-2,12-二烯-23-羥基-28-甲酸甲酯(12)的制備除了用化合物(7)代替化合物(5)外，用與實(shí)施例6相同的方法(收率89.9％)。IR(neat):3368,2926,1733cm-1Mass(EI):m/e 485(M++1)1H-NMR(400MHz,CDCl3):δ5.40(s,1H),5.23(t,1H),4.31,4.22(ABq,2H,J=0.98Hz),3.61(s,3H),3.47,3.35(ABq,2H,J=10.7Hz),2.23(d,1H,J=11.2Hz),1.18,1.12,0.95,0.81(each s,3H),0.94(d,3H,J=6.3Hz),0.85(d,3H,J=6.4Hz)實(shí)施例13:A(1)-降烏-2-氟甲基-23-氟-2,12-二烯-28-甲酸甲酯(13,R5=F)的制備將化合物(12,25mg,51.7μmol)減壓干燥，用氬氣充入并溶解于無(wú)水二氯甲烷中。在-78℃，向所得混合物中加入二乙基氨基三氟化硫(DAST,20.5μl)并室溫?cái)嚢?.5小時(shí)。在0℃向所得物質(zhì)中加入飽和碳酸氫鈉、洗滌并干燥。減壓濃縮濾液并用柱色譜(己烷∶乙酸乙酯=15∶1)分別純化得到混合物8.3mg(收率32.9％)。IR(neat):2928,1732cm-1Mass(EI):m/e 488(M+)實(shí)施例14:A(1)-降烏-2-溴甲基-23-溴-2,12-二烯-28-甲酸甲酯(13,R5=Br)的制備除了用化合物(12)代替化合物(8)外，用與實(shí)施例7相同的方法(收率53.9％)。IR(neat):2962cm-1Mass(EI):m/e 610(M+)1H-NMR(300MHz,CDCl3):δ5.59(s,1H),5.19(t,1H),4.00,3.99(ABq,2H,J=1.71Hz),3.54(s,3H),3.34,3.22(ABq,2H,J=9.9Hz),1.19,1.15,1.06,0.78(each s,3H),0.87(d,3H,J=5.37Hz),0.80(d,3H,J=6.33Hz)實(shí)施例15:A(1)-降烏-2-氯甲基-23-氯-2,12-二烯-28-甲酸甲酯(13,R5=Cl)的制備除了用化合物(12)代替化合物(8)外，用與實(shí)施例8相同的方法(收率12.8％)。IR(neat):1719cm-11H-NMR(400MHz,CDCl3):δ5.61(s,1H),5.27(t,1H),4.21,4.15(ABq,2H,J=9.8Hz),3.82,3.72(ABq,2H,J=9.7Hz),3.63(s,3H),2.22(d,1H),1.23,1.14,1.06,0.98,0.84(each s,3H),0.89(d,3H,J=6.4Hz)實(shí)施例16:A(1)-降烏-2-甲基-2,1-二烯-28-甲酸甲酯(14)的制備除了用化合物(13)代替化合物(9)外，用與實(shí)施例10相同的方法(收率27.0％)。
IR(neat):2925,1726cm-1Mass(EI):m/e 452(M+)實(shí)施例17:A(1)-降烏-2,12-二烯-23-乙酰氧基-2-甲?；?28-甲酸甲酯(15)的制備將化合物(5,101.2mg,0.210mmol)減壓干燥并充入氬氣。將所得混合物溶解于無(wú)水THF中。室溫加入無(wú)水乙酸(39.6μl)并攪拌2小時(shí)。減壓除去溶劑并用乙酸乙酯稀釋此殘余物、洗滌并干燥。將此濾液減壓濃縮并用柱色譜(己烷∶乙酸乙酯=10∶1)分別純化得到化合物94mg(收率85.5％)。IR(neat):2927,1686cm-1Mass(EI):m/e 524(M+)1H-NMR(400MHz,CDCl3):δ9.71(s,1H),6.61(s,1H),5.28(t,1H,J=3.62Hz),4.03,3.96(ABq,2H,J=10.92Hz),3.61(s,3H),2.24(d,1H),2.06(s,3H),1.24,1.08,1.05,0.84(each s,3H),0.93(d,3H,J=6.04Hz),0.84(d,3H,J=6.36Hz)實(shí)施例18:A(1)-降烏-2-二氟甲基-2,12-二烯-23-乙酰氧基-28-甲酸甲酯(16)的制備除了用化合物(15)代替化合物(12)外，用與實(shí)施例13相同的方法(收率38.8％)。IR(neat):1239cm-1Mass(EI):m/e 546(M+)1H-NMR(400MHz,CDCl3):δ6.25(t,1H,J=55.4Hz),5.92(s,1H),5.26(t,1H),3.97,3.86(ABq,2H,J=10.7Hz),3.61(s,3H),2.24(d,1H,J=9.92Hz),2.06(s,3H),1.23,1.11,1.03,0.95,0.83(each s,3H),0.94(d,3H,J=6.12Hz),0.86(d,3H,J=6.4Hz)實(shí)施例19:A(1)-降烏-2-羥甲基-2,12-二烯-23-乙酰氧基-28-甲酸甲酯(17)的制備除了用化合物(15)代替化合物(7)外，用與實(shí)施例6相同的方法(收率78.2％)。IR(neat):3503,2926,1718cm-1Mass(EI):m/e 526(M+)1H-NMR(400MHz,CDCl3):δ5.45(s,1H),5.23(t,1H,J=3.4Hz),4.29,4.20(ABq,2H,J=3.54Hz),3.92,3.86(ABq,2H,J=10.56Hz),3.61(s,3H),2.21(d,1H),2.04(s,3H),1.17,1.10,1.00,0.80(each s,3H),0.94(d,3H,J=6.08Hz),0.85(d,3H,J=6.44Hz)實(shí)施例20:A(1)-降烏-2-氟甲基-2,12-二烯-23-乙酰氧基-28-甲酸甲酯(18)的制備除了用化合物(17)代替化合物(12)外，用與實(shí)施例13相同的方法(收率27.9％)。IR(neat):2927,1740cm-1Mass(EI):m/e 528(M-),5291H-NMR(500MHz,CDCl3):δ5.49(s,1H),5.17(t,1H.J=3.7Hz),4.94-4.79(m,2H),3.87,3.80(ABq,2H,J=10.7Hz),3.54(s,3H),2.17(d,1H),1.99(s,3H),1.19,1.11,1.04,0.95,0.75(each s,3H),0.87(d,3H,J=6.2Hz),0.79(d,3H,J=6.5Hz)實(shí)施例21:A(1)-降烏-2-羥甲基-12-烯-23-羥基-28-甲酸甲酯(19)的制備將化合物(12,15mg,0.031mmol)溶解于乙醇中并加入10％Pd/C(3mg)。用氫氣發(fā)生器將所得物質(zhì)反應(yīng)5小時(shí)。濾出Pd/C，用甲醇洗滌。減壓蒸發(fā)除去溶劑，并用乙酸乙酯稀釋此殘余物、洗滌并干燥。減壓濃縮濾液并用柱色譜(己烷∶乙酸乙酯=15∶1)分別純化得到化合物13.6mg(收率90％)。IR(neat):3468,2927cm-1Mass(EI):m/e 486(M+)1H-NMR(500MHz,CDCl3):δ5.23(t,1H,J=4.53Hz),3.61(s,3H),3.32,3.26(d,2H,J=4.50Hz),2.21(d,2H),1.10,0.95,0.89,0.83,0.75(each s,3H),0.91(d,3H,J=8.25Hz),0.87(d,3H,J=8.15Hz)實(shí)施例22化合物(20)的制備將化合物(5,11mg,0.023mmol)減壓干燥并充入氬氣。將所得混合物溶解于無(wú)水二氯甲烷中并連續(xù)加入BF3·0ET2(0.28μl)和1,3-乙二硫醇(2.39μl)。將所得物質(zhì)減壓濃縮并用柱色譜(己烷∶乙酸乙酯=10∶1)分別純化得到化合物7.8mg(收率61.3％)。IR(near):3448.2926cm-11H-NMR(300MHz,CDCl3):δ5.33(t,1H),5.05(s,1H),3.59(s,3H),3.55,3.37(ABq,2H,J=10.5Hz),3.29-3.15(m,4H),2.64(bd,1H),2.47(d,1H,J=13.9Hz),1.09,0.96,0.69,(each s,3H),0.85(d,3H,J=6.87Hz)實(shí)施例23:A(1)-降烏-2-甲基-12-烯-23-羥基-28-甲酸甲酯(21)的制備將上述化合物(20,7.8mg,0.014mmol)減壓干燥并充入氬氣。將所得混合物溶解于無(wú)水乙醇中，加入阮內(nèi)鎳(0.47ml)并攪拌4小時(shí)。過(guò)濾后，減壓蒸發(fā)除去溶劑。用柱色譜(己烷∶乙酸乙酯=10∶1)將所得物質(zhì)分別純化得到化合物4.4mg(收率66.97％)。IR(neat):3471,2927cm-11H-NMR(300MHz,CDCl3):δ5.33(t,1H),3.59(s,3H),3.45,3.22(ABq,2H,J=7.31Hz),2.27(d,1H,J=11.4Hz),1.6,1.13,1.08,0.70,(each s,3H),0.96(d,3H,J=3.66Hz),0.93(d,3H,J=5.37Hz),0.86(d,3H,J=6.33Hz)實(shí)施例24:A(1)-降烏-2-甲基氧基甲基-2,12-二烯-23-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-28-甲酸甲酯(22)的制備將上述化合物(8,15mg,0.025mmol)減壓干燥，充入氬氣并溶解于無(wú)水THF中。將所得物質(zhì)加入到用己烷洗滌的氫化鈉(1.505mg)中并在1小時(shí)后加入MeI(1.72μl)。將所得物質(zhì)加熱回流3小時(shí)，減壓濃縮，并用柱色譜(己烷∶乙酸乙酯=30∶1)分別純化得到化合物10.9g(收率71％)。
IR(neat):2927,1725cm-1Mass(EI):612m/e(M+)1H-NMR(400MHz,CDCl3):δ5.38(s,1H),5.22(t,1H),3.98,3.88(ABq,2HJ=6.83Hz),3.59(s,3H),3.36,3.28(ABq,2H,J=9.28Hz),3.32(s,3H).2.20(d,1H,J=10.3Hz),1.12,1.08,0.78,(each s,3H),0.92(d,3H,J=3.42Hz),0.83(d,3H,J=7.32Hz),0.85(s,9H),0.00(s,6H)實(shí)施例25:A(1)-降烏-2-甲基氧基甲基-2,12-二烯-23-羥基-28-甲酸甲酯(23)的制備將上述化合物(22)減壓干燥并溶解于無(wú)水THF中。加入四丁基氟化銨(5μl)。將所得物質(zhì)減壓濃縮，用柱色譜(己烷∶乙酸乙酯=10∶1)分別純化得到化合物4mg(收率70.2％)。Mass(EI):498m/e(M+)1H-NMR(400MHz,CDCl3):δ5.39(s,1H),5.24(t,1H),4.06,3.92(ABq,2H,J=13.7Hz),3.61(s,3H),3.45,3.36(ABq,2H,J=1026Hz),3.39(s,3H).2.23(d,1H,J=11.7Hz),1.17,1.12,0.95,0.81,(each s,3H),0.90(d,3H,J=7.32Hz),0.86(d,3H,J=6.35Hz)實(shí)驗(yàn)實(shí)施例1化合物的細(xì)胞毒性通過(guò)用P388淋巴瘤細(xì)胞系和MTT試驗(yàn)檢測(cè)這些化合物的細(xì)胞毒性，該體系可檢測(cè)源自天然產(chǎn)物的成分的細(xì)胞毒性?？紤]到目前積雪草酸衍生物的臨床用途局限于皮膚等上，故用黑色素瘤細(xì)胞系(Malme-3M)和正常細(xì)胞系(Detoit 551)來(lái)檢測(cè)它們的細(xì)胞毒性。
對(duì)于某種化合物，ED50值達(dá)到4μg/ml被認(rèn)定有細(xì)胞毒性。基于此基礎(chǔ)評(píng)價(jià)其結(jié)果。試驗(yàn)方法如下
在孵育箱(37℃,5％二氧化碳)中，將細(xì)胞與不同濃度的積雪草酸衍生物在微量板上培養(yǎng)1天。向其中加入3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑鎓(MTT,Sigma,St.Louis,MO,U.S.A.)溶液，通過(guò)光譜學(xué)方法分析其中形成的甲的量。用ED50(抑制50％細(xì)胞生長(zhǎng)的化合物濃度)作為細(xì)胞毒性的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)。用阿霉素的ED50值作為對(duì)照。
表1A環(huán)被修飾的積雪草酸衍生物對(duì)不同細(xì)胞系(P388D1、Malme-3M、Detoit551)的細(xì)胞毒性

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表2A環(huán)被修飾的積雪草酸衍生物與分化促進(jìn)劑的合用對(duì)P338D1的作用

P338D1:(ATCC CCL 46)細(xì)胞系，來(lái)自鼠的淋巴瘤MTT采用微培養(yǎng)四唑試驗(yàn)。
ED50(μl/mg，平均值，+sd,n=3)HMPA六亞甲基二乙酰胺DMSO二甲基亞砜NaB硼化鈉LiCl氯化鋰實(shí)驗(yàn)實(shí)施例2積雪草酸衍生物對(duì)四氯化碳或半乳糖胺引起的肝細(xì)胞毒性的肝臟保護(hù)和治療作用在本發(fā)明的化合物(1)中，檢測(cè)了A(1)-降烏-2-甲基-2,12-二烯-23-羥基-28-甲酸甲酯、A(1)-降烏-2,12-二烯-23-琥珀酰氧基-2-甲?；?28-甲酸甲酯、A(1)-降烏-2,12-二烯-23-戊二酰氧基-2-甲?；?28-甲酸甲酯、A(1)-降烏-2,12-二烯-23-苯甲酰氧基-2-甲?；?28-甲酸甲酯、A(1)-降烏-2,12-二烯-23-肉桂酰氧基-2-甲?；?28-甲酸甲酯和A(1)-降烏-2-羥甲基-2,12-二烯-23-羥基-28-甲酸甲酯的肝臟保護(hù)和治療作用。
試驗(yàn)中，使用體重為150-200g的雄性Wistars鼠。試驗(yàn)前，動(dòng)物禁食一天，用2-步膠原酶流出方法[D.M.Crips和C.I.Pogson,Biochem.,126,1009(1972)]分離出肝細(xì)胞，該方法某種程度上對(duì)Berry和Friend方法的改進(jìn)[M.N.Berry,D.S.Friend,J.CellBiol,.43,5006(1969)]。
用四氯化碳(CCl4)將分離的肝細(xì)胞培養(yǎng)24小時(shí)，然后將其在含10mM四氯化碳的培養(yǎng)基中培養(yǎng)1.5小時(shí)引起肝細(xì)胞毒性[Y.Kiso,Y.Suzuki和H.Hikino,Planta.Med.,49,222(1983)]。
另一方面，通過(guò)將分離的肝細(xì)胞培養(yǎng)1.5小時(shí)，然后將其在含1.5mM半乳糖胺的培養(yǎng)基中培養(yǎng)14小時(shí)用半乳糖胺引起肝細(xì)胞毒性[Y.Kris,M.Tohkin和H.Hikino,J.Nat.Prod.,46，841(1983)]。
將引起細(xì)胞毒性的肝細(xì)胞在含濃度為5μg/ml或50μg/ml化合物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。然后，用Reiman-Frankel方法檢測(cè)此培養(yǎng)液的谷氨酸丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶(GPT)活性[S.Reitman和S.Frankel,Am.J.Cil.Pathol.,228,56(1957)]。
將未中毒的正常肝細(xì)胞的GPT值定為100％，并將中毒但未接受任何化合物治療的肝細(xì)胞的該值定為0％。然后，將通過(guò)使用化合物對(duì)肝臟毒性的恢復(fù)作用表達(dá)為相對(duì)保護(hù)率(％)。結(jié)果見(jiàn)表3。
表3積雪草酸衍生物對(duì)中毒肝細(xì)胞的肝臟保護(hù)作用

本發(fā)明的A環(huán)被修飾的式(1)化合物A(1)-降烏-2,12-二烯-23-琥珀酰氧基-2-甲?；?28-甲酸甲酯、A(1)-降烏-2-羥甲基-2,12-二烯-23-羥基-28-甲酸甲酯在5μg/ml四氯化碳引起毒性的肝細(xì)胞中顯示出23-41％的肝臟保護(hù)作用，而在半乳糖胺引起毒性的肝細(xì)胞中顯示出40-72％的保護(hù)作用。制劑實(shí)施例1．片劑的制備(抗癌劑)活性組份 2.5mg乳糖BP151.0mg淀粉BP30.0mg預(yù)凝膠玉米淀粉BP 15.0mg將活性組份過(guò)篩，并與乳糖、淀粉和預(yù)凝膠玉米淀粉混合。向其中加入適量的純水并將此混合物制粒。干燥后，將此顆粒與硬脂酸鎂混合并壓制成片劑。
2．注射劑的制備(抗癌劑)活性組份 800μg/ml稀鹽酸BP 調(diào)節(jié)至pH3.5注射用氯化鈉溶液BP最多1ml將活性組份溶解于適量的注射用氯化鈉溶液BP中，通過(guò)加入稀鹽酸BP將所得溶液的pH調(diào)節(jié)至3.5。然后用注射用氯化鈉溶液BP調(diào)節(jié)溶液的體積，并將此溶液徹底混合。將此溶液裝入5ml的1型透明玻璃安瓿中，通過(guò)熔斷玻璃將此安瓿在上部劃點(diǎn)處封口。然后將此安瓿在120℃高壓滅菌15分鐘或更長(zhǎng)的時(shí)間，得到注射液。
3．片劑的制備(肝臟保護(hù)劑)A(1)-降烏-2-甲基-2,12-二烯-28-甲 5.0mg酸甲酯乳糖BP150.0mg淀粉BP30.0mg預(yù)凝膠玉米淀粉BP 15.0mg硬脂酸鎂 1.0mg
將A(1)-降烏-2-羥甲基-2,12-二烯-28-甲酸甲酯過(guò)篩，并與乳糖、淀粉和預(yù)凝膠玉米淀粉混合。向其中加入適量的純水并將此混合物制粒。干燥后，將此顆粒與硬脂酸鎂混合并壓制成片劑。
4．膠囊的制備(肝臟保護(hù)劑)A(1)-降烏-2-甲基-2,12-二烯-28-甲 5.0mg酸甲酯淀粉BP100.0mg硬脂酸鎂 1.0mg將A(1)-降烏-2-甲基-2,12-二烯-28-甲酸甲酯過(guò)篩并與載體混合。將此混合物填入明膠膠囊。
5．注射劑的制備(肝臟保護(hù)劑)A(1)-降烏-2-羥甲基-2,12-二烯-23- 1000μg/ml羥基-28-甲酸甲酯稀鹽酸BP 調(diào)節(jié)至pH3.5注射用氯化鈉溶液BP最多1ml將A(1)-降烏-2-羥甲基-2,12-二烯-23-羥基-28-甲酸甲酯溶解于適量的注射用氯化鈉溶液BP中，通過(guò)加入稀鹽酸BP將所得溶液的pH調(diào)節(jié)至3.5。然后用注射用氯化鈉溶液BP調(diào)節(jié)溶液的體積，并將此溶液徹底混合。將此溶液裝入5ml的1型透明玻璃安瓿中，通過(guò)熔斷玻璃將此安瓿在上部劃點(diǎn)處封口。然后將此安瓿在120℃高壓滅菌15分鐘或更長(zhǎng)的時(shí)間，得到注射液。
正如實(shí)驗(yàn)實(shí)施例中所見(jiàn)，本發(fā)明的積雪草酸衍生物在試驗(yàn)中顯示出優(yōu)異的作用，即對(duì)黑素瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用和對(duì)四氯化碳或半乳糖胺引起毒性的肝細(xì)胞的肝臟保護(hù)作用。
權(quán)利要求
1．一種A環(huán)被修飾的積雪草酸衍生物或其藥用鹽或酯，該衍生物由式1表示
其中R1表示含1-4個(gè)碳原子的低級(jí)烷基、含1-4個(gè)碳原子的烷氧基、羥甲基、鹵代甲基或可被乙二硫醇保護(hù)的醛基；R2表示含1-4個(gè)碳原子的低級(jí)烷基、叔丁基二甲基甲硅烷氧基甲基、鹵代甲基、-CH2OCO(CH2)nCO2H(n=0-3)、-CH2OCOCHCHC6H5或可被乙酰基或苯甲?；Ｗo(hù)的羥甲基；R3表示氫原子或甲基；而2位的雙鍵可被還原為單鍵。
2．一種抗癌劑，其中含有權(quán)利要求1所述的、用式1表示的、A環(huán)被修飾的積雪草酸衍生物或其藥用鹽或酯。
3．一種肝臟保護(hù)劑，其中含有權(quán)利要求1所述的、用式1表示的、A環(huán)被修飾的積雪草酸衍生物或其藥用鹽或酯。
全文摘要
本發(fā)明涉及式1表示的A環(huán)被修飾的積雪草酸衍生物，及含上述衍生物作為活性組分的抗癌劑和肝功能保護(hù)劑。
文檔編號(hào)C07C69/757GK1238755SQ97180127
公開(kāi)日1999年12月15日 申請(qǐng)日期1997年11月27日 優(yōu)先權(quán)日1996年11月27日
發(fā)明者朱尚涉, 樸亨根, 金熙斗, 鄭英薰, 金榮中, 金洪杓, 李美卿, 崔嬉晟, 李應(yīng)碩, 劉知炯, 林斗然, 金廷勛, 金姬萬(wàn), 徐城基, 南泰圭, 韓德熙, 沈必鐘, 丁珠銀, 犯姬英 申請(qǐng)人:東國(guó)制藥株式會(huì)社