專利名稱：吞噬的分析方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及程序性細(xì)胞死亡或凋亡領(lǐng)域，尤其涉及凋亡細(xì)胞被其它細(xì)胞迅速吞噬的現(xiàn)象。本發(fā)明提供用于測(cè)定凋亡細(xì)胞吞噬的分析方法和材料。這些分析可用于確定影響凋亡細(xì)胞吞噬并具有潛在藥理學(xué)活性的化學(xué)物質(zhì)。本發(fā)明的分析可適用于用多孔板進(jìn)行的培養(yǎng)基和高通量篩選。
在組織發(fā)育和維持過(guò)程中，大量細(xì)胞歷經(jīng)程序性死亡或凋亡。在脊椎動(dòng)物和無(wú)脊椎動(dòng)物中都可觀察到。例如，在線蟲(chóng)C.elegans中，131個(gè)細(xì)胞經(jīng)歷程序性死亡(Lui和Hengartner(1997)1997國(guó)際蠕蟲(chóng)會(huì)議，摘要371)。凋亡細(xì)胞的裂解是潛在有害的，引起內(nèi)容物可能引起對(duì)周圍組織的毒性損傷。因凋亡細(xì)胞被其他細(xì)胞吞噬并隨之降解，因此可避免這種有害作用。在哺乳動(dòng)物中，吞噬細(xì)胞為專業(yè)性或半專業(yè)性吞噬細(xì)胞，如嗜中性細(xì)胞或吞噬細(xì)胞，或吞噬細(xì)胞為死亡細(xì)胞的鄰近細(xì)胞。
程序性細(xì)胞死亡或凋亡的關(guān)鍵特性之一，是死亡細(xì)胞被吞噬細(xì)胞識(shí)別并吞噬的速度(Sayill,J.等，今日免疫學(xué)，14:131-136,1993)。凋亡觸發(fā)一系列獨(dú)特的事件，如細(xì)胞表面磷脂酰絲氨酸表達(dá)，DNA片段化或梯子化和膜結(jié)合的細(xì)胞片段又稱凋亡小泡和小體的釋放(Cohen,J.J.等免疫學(xué)綜述年刊，10:267-293,1992.；Kerr J.F.R.等，英國(guó)癌癥雜志，26:239,1972.)。凋亡細(xì)胞和小體通過(guò)識(shí)別磷脂酰絲氨酸和其它針對(duì)凋亡物質(zhì)的表面的獨(dú)特的未確定的配體的不同受體而被吞噬(Savill,J.S.等，臨床研究雜志，83:865-875,1989,；Fadok,V.A.等，免疫學(xué)雜志,148:2207-2216,1992。Savill,J.等，自然，343:170-173,1990.)。通過(guò)此種方式，含有潛在發(fā)炎因子的凋亡細(xì)胞被半專業(yè)性吞噬細(xì)胞或巨噬細(xì)胞系的鄰近細(xì)胞迅速清除而不引起炎癥反應(yīng)(Fadok,V.A.等，臨床研究雜志，101:890-898,1998)。
凋亡的過(guò)程與多種人類疾病相關(guān)，包括癌癥，自身免疫疾病，多種神經(jīng)變性疾病，如肌萎縮側(cè)索硬化，遺傳性慢性舞蹈病，和老年性癡呆，中風(fēng)，心肌梗塞和艾滋病(Thompson,CB,科學(xué)267,pp1456-1462)。因此，對(duì)凋亡機(jī)制和控制該機(jī)制的基因的研究贏得愈來(lái)愈多的關(guān)注，人們力圖發(fā)展對(duì)這些疾病的新的治療方法。
某些疾病與吞噬凋亡小體造成的損傷相關(guān)。這樣的疾病包括自身免疫疾病如系統(tǒng)性紅斑狼瘡(Herrmann,M.等，風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，41:1241-1250,1998。),AIDS(Zocchi,M.R.等，AIDS,11:1227-1235,1997.)，急性肺侵染(Cox,G.等，美國(guó)呼吸雜志，細(xì)胞分子生物學(xué)，12:232-237,1995)和過(guò)敏反應(yīng)(Ying,S.等，美國(guó)醫(yī)生聯(lián)合會(huì)會(huì)刊，109:42-50,1997)。很明顯，通過(guò)藥物對(duì)凋亡細(xì)胞吞噬的調(diào)節(jié)是未來(lái)治療的方向。
脊椎動(dòng)物中凋亡細(xì)胞的吞噬作用是非常復(fù)雜的過(guò)程，目前尚不清楚死亡細(xì)胞產(chǎn)生的信號(hào)是如何被吞噬細(xì)胞接收并傳導(dǎo)的。
在雌雄同體的線蟲(chóng)中觀察到凋亡細(xì)胞的迅速吞噬，該蠕蟲(chóng)提供了研究吞噬過(guò)程的有效手段。例如，在線蟲(chóng)中鑒別的影響吞噬的6個(gè)基因，ced-1,ced-2,ced-5,ced-6,ced-7和ced-10。本發(fā)明的單獨(dú)選中ced-6進(jìn)行特別的研究。已知ced-6在染色體Ⅲ的圖譜靠近線蟲(chóng)的daf-4(Lui和Hengartner(1997)；Lui和Hengartner(1996)東海岸蠕蟲(chóng)會(huì)議摘要128)。此項(xiàng)工作表明來(lái)自此區(qū)的兩個(gè)粘粒，F(xiàn)56D2和F43F12可挽救線蟲(chóng)ced-6(n1813)吞噬缺失。來(lái)自F56D2的10kbXhoⅠ的亞克隆具有拯救活性，同時(shí)攜帶ced-6基因。
本發(fā)明者鑒別了線蟲(chóng)ced-6的2個(gè)人類同源物，(hlced-6和h2ced-6)，h2ced-6是h1ced-6的剪切變體，因此作為線性陰性模型。兩種同源物都存在于人細(xì)胞系THP-1中。hCED-6和線蟲(chóng)CED-6之間有驚人的序列同源性。hCED-6具有磷脂酰酪氨酸結(jié)合區(qū)，從氨基酸11-氨基酸190，如圖4所示，說(shuō)明與酪氨酸激酶信號(hào)傳導(dǎo)通路有關(guān)。
H1CED-6和h2CED-6蛋白和它們編碼核酸可用于進(jìn)行本文的分析，鑒定作為促進(jìn)凋亡細(xì)胞吞噬作用的信號(hào)傳導(dǎo)通路的抑制劑或增強(qiáng)劑的化合物。特別地，它們?cè)阼b別h1CED-6和h2CED-6的抑制劑或增強(qiáng)劑，或其轉(zhuǎn)錄的抑制劑或增強(qiáng)劑過(guò)程中有效。這些抑制劑或增強(qiáng)劑可作為有用的治療劑用于對(duì)前述的疾病的治療。
本發(fā)明的第一方面提供了一種能夠表達(dá)h1CED-6或h2CED-6表達(dá)載體，該載體包括編碼圖4或圖5的氨基酸序列或與圖4或圖5的氨基酸相比僅僅發(fā)生生物功能保守性的變化的氨基酸序列的脫氧核苷酸序列。
本文定義的術(shù)語(yǔ)“生物功能”指調(diào)節(jié)或影響凋亡細(xì)胞吞噬作用的能力?！氨Ｊ氐摹卑被嶙兓悄切╇m然比野生型人CED-6蛋白的生物功能水平高或低，但可保持生物功能的變化。這些保守的變化包括一個(gè)或更多氨基酸插入或缺失或一個(gè)或更多氨基酸被其它氨基酸或具有相似化學(xué)特性的酸取代。使氨基酸發(fā)生保守性變化的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，表達(dá)載體為包括圖2或圖3所示的從轉(zhuǎn)錄起始密碼子到轉(zhuǎn)錄終止密碼子的脫氧核苷酸序列和任意的包括圖2或圖3中所示的脫氧核苷酸序列的載體。
在一個(gè)尤其優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的表達(dá)載體包括編碼報(bào)告基因的核苷酸序列，h1CED-6或h2CED-6的表達(dá)可導(dǎo)致該報(bào)告基因的表達(dá)。此報(bào)告基因可置于h1ced-6或h2ced-6的3’或5’端，可作為與h1CED-6或h2CED-6的融合蛋白表達(dá)。合適的報(bào)告基因是可以表達(dá)熒光產(chǎn)物如綠色熒光蛋白(GFP)基因。其它適當(dāng)?shù)膱?bào)告基因有酶，如β-半乳糖苷酶或熒光素酶，這些酶能過(guò)作用于底物產(chǎn)生可檢測(cè)的產(chǎn)物，例如熒光產(chǎn)物或發(fā)光產(chǎn)物。根據(jù)本發(fā)明表達(dá)產(chǎn)物的例子有分別在圖29和10中顯示的pGA3103和pGA3104。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的表達(dá)載體在h1CED-6和h2CED-6蛋白的氨基和/或羧基末端表達(dá)表位標(biāo)簽。例如質(zhì)粒pBAD/HisA-h1ced-6，其序列如

圖17中所示。
上述的表達(dá)載體不僅包括編碼h1CED-6和h2CED-6或其功能變體的序列，還包括可操作的與核酸相連的調(diào)節(jié)序列，如能影響DNA片段表達(dá)的啟動(dòng)子區(qū)。術(shù)語(yǔ)“可操作的連接”指一種并列的關(guān)系，其中描述的組分允許序列以預(yù)期的方式發(fā)揮功能。
表達(dá)所需的調(diào)節(jié)元件包括與RNA多聚酶結(jié)合，指導(dǎo)轉(zhuǎn)錄起始的適當(dāng)水平和的啟動(dòng)子序列和與核糖體結(jié)合的翻譯起始序列。例如，細(xì)菌表達(dá)載體可包括啟動(dòng)子如lac啟動(dòng)子和翻譯起始的核糖體結(jié)合序列和起始密碼子AUG。相似的，真核表達(dá)載體可包括RNA聚合酶Ⅱ的異源或同源啟動(dòng)子，下游聚腺苷酸化信號(hào)，起始密碼子AUG，和核糖體脫離的終止密碼子。這些載體可從商業(yè)渠道獲得或運(yùn)用本領(lǐng)域熟知的方法裝配描述的序列。用于表達(dá)載體的啟動(dòng)子序列包括ΔHSP,CMV,SV40,EF-1α,UbC,SG,RSV,TRE/minCMV,HSV TK,5’,LTR和QBISP136增強(qiáng)的CMV。
本文描述的表達(dá)載體的實(shí)施例為質(zhì)粒，但也可為病毒或噬菌體載體。這些載體通常具有一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)和一或更多選擇標(biāo)記物如抗生素抗性的基因。尤其優(yōu)選本發(fā)明的表達(dá)載體適于哺乳動(dòng)物細(xì)胞轉(zhuǎn)染，從而為載體提供相應(yīng)的選擇標(biāo)記。
本發(fā)明的第二方面提供了用上述的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系。轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞的方法眾所周知。該細(xì)胞系可在單層培養(yǎng)或懸浮培養(yǎng)中生長(zhǎng)。適當(dāng)?shù)募?xì)胞系為成纖維細(xì)胞系或上皮細(xì)胞系如COS1,BHK21,L929,pc12,CV1,SWISS3T3,HT144,IMR32,HEPG2,MDCK,MCF7,293,Hela,A549,SW48或G361。也可用原代細(xì)胞系如人皮膚FIBs，皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞，白細(xì)胞，單核細(xì)胞，淋巴細(xì)胞，樹(shù)突細(xì)胞或巨噬細(xì)胞。在本發(fā)明的吞噬分析中，尤其優(yōu)選表達(dá)h1CED-6和h2CED-6的哺乳動(dòng)物專業(yè)性或半專業(yè)性吞噬細(xì)胞，如鼠巨噬細(xì)胞系J774或人單核細(xì)胞系THP1(見(jiàn)實(shí)施例3和圖6)。以上兩種細(xì)胞系可作為單核細(xì)胞系，因單核細(xì)胞系能分化為本發(fā)明分析所用的巨噬細(xì)胞。
本發(fā)明第三方面提供了測(cè)定化合物為促進(jìn)凋亡細(xì)胞吞噬的信號(hào)傳導(dǎo)通路的增強(qiáng)劑或抑制劑的方法，該方法包括使轉(zhuǎn)染有上述的h1ced-6或h2ced-6的哺乳動(dòng)物細(xì)胞暴露給凋亡顆粒，在化合物存在或缺失時(shí)測(cè)定顆粒的吞噬速率。待測(cè)化合物優(yōu)選在凋亡顆粒前加入。
適當(dāng)?shù)牡蛲鲱w粒是發(fā)生凋亡并視需要而定在血清中調(diào)理的細(xì)胞，如嗜中性粒細(xì)胞，淋巴細(xì)胞，紅細(xì)胞，或樹(shù)突細(xì)胞。適于形成凋亡顆粒的細(xì)胞包括細(xì)胞系L929和PC12。一種特別優(yōu)選用作凋亡顆粒的細(xì)胞系是生長(zhǎng)因子依賴的鼠細(xì)胞系Ba/F3。它們可在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)如實(shí)施例5所述，可在生長(zhǎng)因子IL-3缺失適當(dāng)時(shí)間(例如約20小時(shí))時(shí)生長(zhǎng)，誘導(dǎo)凋亡。細(xì)胞凋亡狀態(tài)可用，例如，BoeringherMannheim(布魯塞爾，比利時(shí))的膜聯(lián)蛋白/碘化丙啶標(biāo)記的試劑盒測(cè)定。如果約20％膜聯(lián)蛋白陽(yáng)性，而不少于5％碘化丙啶陰性，則認(rèn)為細(xì)胞為早期凋亡的。
PC12細(xì)胞系可在神經(jīng)生長(zhǎng)因子缺失的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)誘導(dǎo)凋亡。
除上述細(xì)胞外，凋亡顆?？蔀榉腔钗镔|(zhì)，如染料標(biāo)記的乳膠顆粒。帶有一個(gè)氨基或羧基的0.1μM,1μM,4μM和10μM顆?？少?gòu)自Sigma-Aldrich,Bornem，比利時(shí)，或Molecular Probes,Eugene，美國(guó)。
為使所述的分析適于高通量的化合物篩選，優(yōu)選凋亡顆粒攜帶某種可探測(cè)的標(biāo)記，則當(dāng)該顆粒被轉(zhuǎn)染的哺乳動(dòng)物細(xì)胞吸收時(shí)，非常明顯，可量化。發(fā)明者發(fā)現(xiàn)可通過(guò)用包括報(bào)告基因的表達(dá)載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染包含凋亡顆粒的細(xì)胞，從而實(shí)現(xiàn)上述目的。一個(gè)特別合適的報(bào)告基因編碼β-半乳糖苷酶，它能裂解熒光底物熒光素雙-b-D-吡喃型半乳糖苷為可用標(biāo)準(zhǔn)熒光探測(cè)設(shè)備檢測(cè)的熒光化合物。其它熒光底物也可用于β-半乳糖苷酶。質(zhì)粒pcDNA3.1/HIS/lacZ，表達(dá)β-半乳糖苷酶且適于轉(zhuǎn)染用作凋亡顆粒的細(xì)胞，例如Ba/F3，如圖11所示。其它合適的報(bào)告基因是編碼熒光蛋白如綠色熒光蛋白或能產(chǎn)生發(fā)光信號(hào)如熒光素酶的蛋白的基因。質(zhì)粒pEGFP-N3或pEGFP-C2(Clontech)，適于轉(zhuǎn)染GFP到用作凋亡顆粒的細(xì)胞，如圖7,8,26和27所示。Promega的質(zhì)粒“PGL對(duì)照”適于轉(zhuǎn)染編碼熒光素酶的基因到用作凋亡顆粒的細(xì)胞如Ba/F3細(xì)胞。“PGL對(duì)照”的DNA序列如圖19所示。
優(yōu)選對(duì)凋亡顆粒的報(bào)告基因的選擇由轉(zhuǎn)染的哺乳動(dòng)物細(xì)胞報(bào)告基因的存在控制。例如，在轉(zhuǎn)染h1或h2ced-6的哺乳動(dòng)物細(xì)胞核凋亡細(xì)胞中相同報(bào)告基因的存在，因信號(hào)重疊而不被優(yōu)選，盡管這種情況不多。
更優(yōu)選可檢測(cè)多種化合物，測(cè)其為促進(jìn)凋亡細(xì)胞吞噬的信號(hào)傳導(dǎo)通路的增強(qiáng)劑或抑制劑。化合物可為任意化學(xué)式，聚合體或單體。例如檢測(cè)的化合物可為基因組DNA,cDNA,RNA,PNA,蛋白或多肽，氨基酸，核苷或核苷酸?；衔锟蔀橐阎锘蛩幚砘钚缘?，未知活性的已知化合物或在化合物組合庫(kù)中存在的新分子。
當(dāng)任何化合物的存在導(dǎo)致凋亡顆粒被轉(zhuǎn)染的哺乳動(dòng)物細(xì)胞吞噬的量減少或不發(fā)生吞噬時(shí)，應(yīng)檢測(cè)細(xì)胞的生存力。活細(xì)胞的存在確認(rèn)吞噬的缺乏緣于所測(cè)化合物對(duì)吞噬活性的影響而非其非特異性毒性。
進(jìn)一步的，任何經(jīng)上述分析鑒定為凋亡細(xì)胞吞噬的抑制劑或增強(qiáng)劑的化合物，都將進(jìn)一步檢測(cè)該影響是否通過(guò)CED-6介導(dǎo)。鑒定一種化合物為凋亡細(xì)胞吞噬的抑制劑或增強(qiáng)劑后，可通過(guò)進(jìn)行上述的吞噬分析，但哺乳動(dòng)物細(xì)胞未轉(zhuǎn)染h1ced-6或h2ced-6。如果該化合物在為轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中能誘導(dǎo)與轉(zhuǎn)染h1ced-6的細(xì)胞相同的表型，說(shuō)明該化合物不一定通過(guò)CED-6或CED-6信號(hào)傳導(dǎo)通路發(fā)揮作用。
相似的，如果一種上述分析鑒定為凋亡細(xì)胞吞噬的抑制劑的化合物，通過(guò)鑒定暴露給該化合物的未轉(zhuǎn)染的哺乳動(dòng)物細(xì)胞的表型確認(rèn)其作用是否通過(guò)CED-6或CED-6信號(hào)傳導(dǎo)通路。向野生型表型的恢復(fù)意味著反應(yīng)通過(guò)CED-6或CED-6信號(hào)傳導(dǎo)通路。
本發(fā)明第四方面提供確定用于檢測(cè)一種化合物是否為促進(jìn)吞噬凋亡細(xì)胞的信號(hào)傳導(dǎo)通路的的促進(jìn)物或抑制劑的方法，該方法包括下列步驟(1)向哺乳動(dòng)物細(xì)胞顯微注射包括圖4或圖5所示的氨基酸序列或與圖4或圖5所示的氨基酸序列僅有功能的保守性的氨基酸改變的序列的人CED-6蛋白，和(2)將步驟1制備的哺乳動(dòng)物細(xì)胞暴露給凋亡顆粒，在化合物存在和缺失時(shí)測(cè)量顆粒被細(xì)胞的吞噬速率。
優(yōu)選的，向哺乳動(dòng)物細(xì)胞顯微注射包括h1Ced-6或h2CED-6和報(bào)告基因的融合蛋白，報(bào)告基因可為上述的任意報(bào)告基因。優(yōu)選的融合蛋白通過(guò)表達(dá)圖9或28所示的質(zhì)粒的GFP和h1ced-6編碼序列獲得。
上述所有的周轉(zhuǎn)染的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系分析的特征和實(shí)施方案可用于上述的以h1Ced-6或h2CED-6或其融合蛋白顯微注射的細(xì)胞。
本發(fā)明第五方面提供用于檢測(cè)一種化合物是否為促進(jìn)吞噬凋亡細(xì)胞的信號(hào)傳導(dǎo)通路的的促進(jìn)物或抑制劑的方法，該方法包括下列步驟(1)向哺乳動(dòng)物細(xì)胞顯微注射或轉(zhuǎn)染表達(dá)圖2或圖3所示的核苷酸序列的所有或部分反義的RNA的載體；(2)將步驟1制備的哺乳動(dòng)物細(xì)胞暴露給凋亡顆粒，在化合物存在和缺失時(shí)測(cè)量顆粒被細(xì)胞的吞噬速率。
優(yōu)選的，該反義RNA包括能與圖2或圖3所示的核苷酸序列雜交的核苷酸序列，雜交的嚴(yán)格性條件高于2×SSC；0.1％SDS；25℃到50℃。
上述所有用轉(zhuǎn)染的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系的分析的所有優(yōu)選的特點(diǎn)和實(shí)施方案可應(yīng)用到反義RNA注射的細(xì)胞系。
優(yōu)選用于上述分析的轉(zhuǎn)染的哺乳動(dòng)物細(xì)胞轉(zhuǎn)染h1ced-6或h2ced-6。因h2ced-6被視為h1ced-6的顯性的隱性形式，具有相反的生物學(xué)作用，細(xì)胞對(duì)轉(zhuǎn)染的選擇取決于希望鑒別作為凋亡細(xì)胞吞噬的抑制劑或增強(qiáng)劑的化合物。例如轉(zhuǎn)染h1ced-6的細(xì)胞特別適合鑒別凋亡細(xì)胞吞噬的抑制劑，而轉(zhuǎn)染h2ced-6的細(xì)胞特別適合鑒別增強(qiáng)劑。
因此闡明本發(fā)明也涉及根據(jù)本文描述的任意分析方法，鑒定為促進(jìn)凋亡細(xì)胞吞噬信號(hào)傳導(dǎo)通路的抑制劑或增強(qiáng)劑的任何化合物。
h1ced-6和h2ced-6的核苷酸序列分別如圖2和3所示。此外，編碼可變剪接h2CED-6的cDNAs和從h2ced-6重組h1ced-6的插入片段根據(jù)布達(dá)佩斯條約于1998年6月8日保藏于比利時(shí)微生物協(xié)調(diào)保藏中心(BCCM)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室-質(zhì)粒保藏(LMBP)B9000,Gent，比利時(shí)，保藏號(hào)分別為3868和3869。
從使用T2或T7引物可從存放物種獲得序列(可用一個(gè)或同時(shí)用2個(gè)引物，在不同的實(shí)際插入位點(diǎn))。引物可購(gòu)自Clontech(～1227和～1228)，序列如下T7引物5’(TAATACGACTCACTATAGGGAGA)3’T3引物5’(ATTAACCCTCACTAAAGGGA)3’在發(fā)展基于過(guò)表達(dá)或低表達(dá)人CED-6蛋白的哺乳動(dòng)物細(xì)胞的分析之外，本發(fā)明者鑒定h1CED-6的表位并制備了它有用的抗體。
本發(fā)明第六方面包括具有圖4所示的氨基酸序列的人Ced-6蛋白片段，其中片段包括氨基酸序列HRAFSRKKDKTC,FLGSTEVEQPKGTE或TRNGTQPPPVPSRST。制備包括上述一或更多表位的抗體。按實(shí)施例6描述的方法獲得抗體制備物，它們的特異性如實(shí)施例7使用WesternBlots證實(shí)(圖20到25)。
上述的抗體可用于在與吞噬細(xì)胞過(guò)表達(dá)或低表達(dá)人Ced-6相關(guān)的患者中診斷疾病的方法。特別地，本文提供一種方法用于診斷在個(gè)體中與吞噬細(xì)胞過(guò)表達(dá)或低表達(dá)人Ced-6的相關(guān)的疾病，包括(a)從個(gè)體獲得吞噬細(xì)胞的樣品；(b)暴露吞噬細(xì)胞給如上所述的抗體制備物；(c)定量測(cè)量任何在抗體和Ced-6蛋白間形成的免疫復(fù)合物的存在；并(d)與使用來(lái)自對(duì)照個(gè)體的吞噬細(xì)胞形成的免疫復(fù)合物比較形成的免疫復(fù)合物的量。
上述的抗體可進(jìn)一步用于測(cè)定一種化合物是促進(jìn)凋亡細(xì)胞吞噬信號(hào)傳導(dǎo)通路的抑制劑或增強(qiáng)劑的分析。特別地，本文提供一種方法，用于測(cè)定一種化合物是否為促進(jìn)凋亡細(xì)胞吞噬信號(hào)轉(zhuǎn)到通路的抑制劑或增強(qiáng)劑，該方法包括(a)暴露轉(zhuǎn)染如上所述的表達(dá)載體哺乳動(dòng)物細(xì)胞給待測(cè)化合物；(b)暴露哺乳動(dòng)物細(xì)胞給上述的一種抗體制備物；(c)定量測(cè)量在抗體和細(xì)胞表達(dá)的蛋白見(jiàn)形成的任何免疫復(fù)合物的存在；并(d)與未暴露給化合物的、如步驟(a)描述的轉(zhuǎn)染的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中探測(cè)的免疫復(fù)合物的量比較探測(cè)的免疫復(fù)合物的水平。
在上述方法中，哺乳動(dòng)物細(xì)胞可選自COS1,BHK21,L929,CU1,SWISS 3T3,HT144,IMR32,HEPG2,MDCK,MCF7,293,Hela,A549,SW48或G361,COS1細(xì)胞尤其優(yōu)選。哺乳動(dòng)物細(xì)胞也可為人皮膚FIB，人角質(zhì)形成細(xì)胞，白細(xì)胞，單核細(xì)胞，淋巴細(xì)胞，樹(shù)突細(xì)胞或巨噬細(xì)胞。優(yōu)選專業(yè)性吞噬細(xì)胞如鼠巨噬細(xì)胞細(xì)胞系J774或人單核細(xì)胞細(xì)胞系THP-1。
本發(fā)明抗體的其它應(yīng)用包括h1CED-6的純化和與CED-6相互作用的蛋白的鑒別，則信號(hào)傳導(dǎo)通路可特征化，還包括探測(cè)hCED-6的過(guò)表達(dá)或低表達(dá)、細(xì)胞內(nèi)定位或翻譯后修飾，表位作圖和活化位點(diǎn)和在適當(dāng)載體或稀釋劑中包括所述抗體的藥理學(xué)組合物的鑒定。
本發(fā)明第七方面包括一種用于診斷與在個(gè)體的吞噬細(xì)胞中人CED-6過(guò)表達(dá)或低表達(dá)相關(guān)的疾病的方法，該方法包括(a)從個(gè)體獲得吞噬細(xì)胞樣品，(b)從吞噬細(xì)胞分離RNA，(c)從RNA制備cDNA，(d)在cDNA中進(jìn)行一級(jí)PCR反應(yīng)，(e)在一級(jí)PCR反應(yīng)的反應(yīng)產(chǎn)物上進(jìn)行二級(jí)(嵌套式)PCR，(f)通過(guò)分析一級(jí)和二級(jí)PCR的產(chǎn)物定性和定量測(cè)量人ced-6 RNA的存在，并(g)將在一級(jí)和二級(jí)PCR中形成的反應(yīng)產(chǎn)物與使用對(duì)照個(gè)體的吞噬細(xì)胞形成的反應(yīng)產(chǎn)物比較產(chǎn)物的量和類型。
優(yōu)選的，使用本文定義的h1ced-6或h2ced-6的序列衍生的引物或從cDNA產(chǎn)生使用的載體的衍生的引物進(jìn)行PCR。特別地，所述一級(jí)PCR可用具有以下核苷酸序列的引物1)cgcaaggatccccatgaaccgtgcttttagcaggaag2)gatctactaggtactggag二級(jí)PCR可用具有以下核苷酸序列的引物1)cgcaaggatccccatgaaccgtgcttttagcaggaag2)gcggatggtaccgtcgactgctgatacttgagttattctcag本文描述的分析方法，由本發(fā)明者改進(jìn)用于測(cè)定是否化合物為人CED-6的增強(qiáng)劑或抑制劑，可通用于鑒定在任何機(jī)制下影響凋亡細(xì)胞吞噬的化合物，而不僅涉及人CED-6或由其充當(dāng)組分的信號(hào)傳導(dǎo)通路。
Liu等。(Liu,Y.等，美國(guó)免疫學(xué)家協(xié)會(huì)，1:1999)描述了一種鑒定影響凋亡細(xì)胞吞噬的化合物，其中不同濃度的化合物加入到吞噬細(xì)胞，隨后向吞噬細(xì)胞中接入凋亡細(xì)胞。為量化凋亡細(xì)胞的吞噬，作者對(duì)吞噬的顯微量化，其中對(duì)凋亡細(xì)胞的吸收由電子顯微鏡顯示，并用光學(xué)顯微鏡計(jì)數(shù)計(jì)算的每塊玻片的最少細(xì)胞(Sayill,J.S.Wyllie,A.H.Henson,J.E.Walport,M.J.Henson,P.M.Haslett,C.,J Clin Inyest,83:865-875,1989)。
已知用于量化凋亡細(xì)胞吞噬的技術(shù)不容易對(duì)化合物進(jìn)行高物料通過(guò)量篩選潛在的藥物學(xué)活性。主要因?yàn)橐阎姆治黾夹g(shù)依賴于在暴露給檢測(cè)化合物時(shí)，對(duì)攝取凋亡細(xì)胞的吞噬細(xì)胞的比例顯微計(jì)數(shù)。但是，本發(fā)明克服該缺點(diǎn)，因它們可在多孔分析板中進(jìn)行，并提供不需顯微鏡的探測(cè)系統(tǒng)。
因此，本發(fā)明進(jìn)一步提供一種方法，鑒定一種化合物是否為凋亡細(xì)胞吞噬的增強(qiáng)劑或抑制劑，它包括a)在待測(cè)化合物存在或缺失時(shí)，向穩(wěn)定轉(zhuǎn)染能產(chǎn)生非顯微鏡探測(cè)的信號(hào)的報(bào)告基因凋亡的哺乳動(dòng)物細(xì)胞暴露哺乳動(dòng)物專業(yè)性或半專業(yè)性吞噬細(xì)胞，
b)去除未被吞噬細(xì)胞吞噬的任何凋亡細(xì)胞并c)探測(cè)任何來(lái)自吞噬細(xì)胞的報(bào)告基因的信號(hào)；其中在化合物存在時(shí)與化合物缺失時(shí)的任何信號(hào)差異說(shuō)明化合物是凋亡細(xì)胞吞噬的增強(qiáng)劑或抑制劑。
通常，在上述方法中優(yōu)選先將吞噬細(xì)胞與所測(cè)化合物溫育，然后加入凋亡細(xì)胞。適當(dāng)?shù)臏赜龝r(shí)間為15-30分鐘。
使用本發(fā)明的方法的適當(dāng)?shù)耐淌杉?xì)胞為鼠J774細(xì)胞或人THP-1細(xì)胞，如本文所述。這些細(xì)胞為單核細(xì)胞系，但在加入凋亡細(xì)胞前經(jīng)培養(yǎng)使之分化為巨噬細(xì)胞。
用于上述方法的凋亡細(xì)胞可為凋亡的嗜中性細(xì)胞，凋亡的淋巴細(xì)胞或凋亡的紅細(xì)胞。凋亡細(xì)胞可任選通過(guò)暴露給血清進(jìn)行調(diào)理。優(yōu)選的凋亡細(xì)胞為貼壁細(xì)胞系L929或PC12和，本文描述的生長(zhǎng)因子依賴的鼠細(xì)胞系Ba/F3。
運(yùn)用上述方法穩(wěn)定轉(zhuǎn)染報(bào)告基因到凋亡細(xì)胞。運(yùn)用報(bào)告基因會(huì)遇到的一個(gè)特別問(wèn)題是在有效死亡的凋亡細(xì)胞中基因的表達(dá)，比完全活細(xì)胞中弱很多。如果或細(xì)胞處于加入到吞噬細(xì)胞的凋亡顆粒中，不充分洗未吞噬的顆粒，來(lái)自活細(xì)胞的信號(hào)會(huì)掩蓋來(lái)自凋亡吞噬的細(xì)胞的任何信號(hào)。雖然可以隨后洗滌，本發(fā)明者改進(jìn)了一種特別的實(shí)施方案避免此問(wèn)題。
特別地，它包括使用表達(dá)在細(xì)胞中轉(zhuǎn)換低的蛋白，優(yōu)選酶的報(bào)告基因，則活細(xì)胞和凋亡顆粒具有約相同的蛋白濃度或酶活性。從而克服了上述的缺點(diǎn)。幾種可能的報(bào)告蛋白和底物在熒光探針和研究化學(xué)藥品手冊(cè)，P.Haugland編(Molecular Probes,Eugene,OR,USA)中都有描述。本發(fā)明者還發(fā)現(xiàn)β-半乳糖苷酶(lacZ)是特別合適的報(bào)告基因。此酶相對(duì)低更新，細(xì)胞和凋亡顆粒具有相對(duì)相同量的活性。此外存在幾種適于β-半乳糖苷酶的底物(見(jiàn)Molecular Probes,Eugene，或USA)，本發(fā)明者使用上述的FDG。它使發(fā)展一種高物料通過(guò)量篩選改變凋亡顆粒吞噬的化合物成為可能。
本發(fā)明的方法使用的吞噬細(xì)胞可為野生型細(xì)胞或轉(zhuǎn)基因或突變細(xì)胞。突變的細(xì)胞與野生型相比，可減少或增加吞噬活性。轉(zhuǎn)基因細(xì)胞可穩(wěn)定轉(zhuǎn)染表達(dá)時(shí)影響凋亡細(xì)胞吞噬活性的速率的基因。例如，哺乳動(dòng)物細(xì)胞轉(zhuǎn)染上述的h1ced-6或h2ced-6，優(yōu)選使用任何在描述或附圖中提到的載體。
在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，吞噬細(xì)胞可轉(zhuǎn)染編碼細(xì)胞表面抗原CD36的DNA。運(yùn)用磷脂酰絲氨酸受體或玻聯(lián)蛋白受體的人巨噬細(xì)胞吞噬凋亡細(xì)胞需要CD36的表達(dá)。(Fadok V.A.等，免疫學(xué)雜志1998 Dec1.161(11):6250-7)。轉(zhuǎn)染可采用本文描述的任何方法進(jìn)行，優(yōu)選使用包括編碼如圖31所示的CD36的DNA序列的載體或圖31的完整載體。
本發(fā)明的方法都在多孔板中進(jìn)行，因此特別適合中-高通量篩選。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用96孔板，但本發(fā)明也可使用其它數(shù)的孔板，包括但不限于6,12,24,384,864,1536孔板。
本發(fā)明的所有方法需要對(duì)量化凋亡細(xì)胞吞噬的信號(hào)在待測(cè)化合物存在時(shí)進(jìn)行探測(cè)。本發(fā)明的方法的關(guān)鍵特點(diǎn)在于該信號(hào)(也稱示值)使用非視覺(jué)探測(cè)方法檢測(cè)。本文使用的術(shù)語(yǔ)‘非視覺(jué)探測(cè)方法’指任何檢測(cè)一種不需人眼包括顯微鏡視覺(jué)檢查的信號(hào)的方法。非視覺(jué)探測(cè)系統(tǒng)的運(yùn)用是主要的優(yōu)點(diǎn)，超越已知的需要對(duì)細(xì)胞通過(guò)眼睛進(jìn)行視覺(jué)檢查檢測(cè)凋亡細(xì)胞被吞噬細(xì)胞的吸收的篩選方法。
為能在吞噬分析的高-中物料通過(guò)量篩選中對(duì)凋亡細(xì)胞進(jìn)行非視覺(jué)探測(cè)，報(bào)告基因必須能產(chǎn)生可被自動(dòng)平板計(jì)數(shù)器，如victor2(Wallac,Turku，芬蘭)檢測(cè)的信號(hào)。最優(yōu)選檢測(cè)熒光信號(hào)的自動(dòng)平板計(jì)數(shù)器。
通過(guò)產(chǎn)生自動(dòng)多孔板計(jì)數(shù)器讀數(shù)的信號(hào)，可進(jìn)行量化測(cè)量，從而能夠一次估價(jià)多種化合物的作用，并比較化合物的作用。
需進(jìn)一步指出，待測(cè)化合物可為上述的任何類型的化合物，當(dāng)特定的化合物導(dǎo)致吞噬細(xì)胞降低或消失的信號(hào)，將檢測(cè)吞噬細(xì)胞的活力，從而排除化合物的非特異性毒性原因。
在以下非限制性的實(shí)施例中，參考下1從EST,RACE和集落雜交獲得的2416bp的共有序列的結(jié)構(gòu)(見(jiàn)實(shí)施例1)。序列如下裝配，以aa159394為模板，引物如多重序列所示。rcc代表逆轉(zhuǎn)的補(bǔ)足物。在多種序列中可見(jiàn)ced-6和hced-6；pGA101由集落雜交挑選。
圖2示h1ced-6的共有DNA序列(2416bp)。啟示和終止密碼子為黑體并下劃線。可變剪接區(qū)也下劃線。
圖3示h2ced-6的可變剪接的DNA序列。啟示和終止密碼子為黑體并下劃線。
圖4示h1CED-6的氨基酸序列。殘基數(shù)304，分子量34.4kDa?？勺兗艚訁^(qū)也下劃線。
圖5示h2CED-6的氨基酸序列，可變剪接區(qū)。
圖6示對(duì)實(shí)施例3中描述的嵌套式PCR產(chǎn)物的凝膠分析；泳道分別為(1)100bp標(biāo)記物，(2)初級(jí)活嗜中性細(xì)胞，(3)初級(jí)凋亡嗜中性細(xì)胞，(4)初級(jí)巨噬細(xì)胞，(5)與凋往嗜中性細(xì)胞作用的初級(jí)巨噬細(xì)胞，(6)J774,(7)COS-1,(8)THP-1圖7示實(shí)施例4和8中使用的包括報(bào)告基因GFP的Clonetech載體pEGFP-N3的DNA序列；圖8示pEGFP-N3的質(zhì)粒圖譜；圖9示圖4和8中使用的質(zhì)粒pGA3104的DNA序列，在pEGFP-N3的多克隆位點(diǎn)包括h1ced-6；圖10示質(zhì)粒pGA3104的質(zhì)粒圖譜；圖11示用于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Ba/F3細(xì)胞的可從商業(yè)渠道獲得的質(zhì)粒pcDNA3.1/His/LacZ的DNA序列(見(jiàn)實(shí)施例4)；圖12示熒光強(qiáng)度，當(dāng)β-半乳糖苷酶與熒光底物熒光素-b-D-吡喃型半乳糖苷(FDG)反應(yīng)時(shí)，熒光強(qiáng)度作為轉(zhuǎn)染的細(xì)胞百分比；
圖13示FDG濃度對(duì)實(shí)施例5的分析的讀數(shù)的影響；圖14示溫育時(shí)間對(duì)實(shí)施例5的分析的讀數(shù)的影響；圖15示Ba/F3細(xì)胞培養(yǎng)中血清濃度對(duì)實(shí)施例5的分析的影響；圖16示用于產(chǎn)生多克隆抗體的在h1CED-6中的表位的定位；圖17示實(shí)施例7所用的質(zhì)粒pGA1028的DNA序列(pBAD/HisA/-hced-6)；圖18示pGA1028的質(zhì)粒圖譜；圖19示適于轉(zhuǎn)入Ba/F3細(xì)胞的報(bào)告基因熒光素酶的商業(yè)質(zhì)粒pGL2的DNA序列；圖20到25示實(shí)施例7中免疫引跡的結(jié)果。在所有圖中，泳道如下泳道1預(yù)染色的SDS-PAGE低分子量標(biāo)準(zhǔn)(Bio Rad-Hercules,CA,USA)，泳道2pBAD/His A(Invitrogen,Leek,The Netherlands)泳道3pGA1028(pBAD/HisA/-h1CED-6)圖20示用針對(duì)實(shí)施例7中鑒定的表位EP 990044的抗體和對(duì)照抗體Anti-Xpress抗體(Invitrogen,Leek,The Netherlands)和鼠Ig，辣根過(guò)氧化物酶聯(lián)的完整抗體(綿羊)染色的凝膠(ECL Western印跡檢測(cè)試劑和分析系統(tǒng)，Amersham Pharmacia Biotech,UK,England)圖21示用如實(shí)施例7描述的對(duì)表位990044的抗體和免疫血清染色的凝膠；
圖22示用如實(shí)施例7中鑒定的表位990045的抗體和如圖20描述的對(duì)照抗體染色的凝膠；圖23示如實(shí)施例7中描述的表位990045和免疫血清染色染色的凝膠；圖24示如實(shí)施例7中描述的表位990046和對(duì)照抗體染色的凝膠；圖25示如實(shí)施例7中描述的表位990046和免疫血清染色的凝膠圖26示如實(shí)施例8所用的包括報(bào)告基因GFP的商業(yè)Clonetech載體pEGFP-C2的DNA序列；圖27示pEGFP-C2的質(zhì)粒圖譜；圖28示如實(shí)施例8所用的質(zhì)粒pGA3103的DNA序列，其中在pEGFP-C2的多克隆位點(diǎn)包括h1ced-6；圖29示pGA3103的質(zhì)粒圖譜；圖30示來(lái)自轉(zhuǎn)染MOCK(轉(zhuǎn)染的陰性對(duì)照)，pEGFP-N3,pGA3103和pGA3104的COS-1細(xì)胞的細(xì)胞裂解物；與一抗或未與一抗溫育的Ba/F3細(xì)胞的有效免疫共沉淀的對(duì)照裂解物；來(lái)自EGF刺激的A431細(xì)胞的陽(yáng)性對(duì)照裂解物的Western印跡；，使用抗-磷脂酰酪氨酸抗體。印跡A用鼠單抗IgG2檢測(cè)細(xì)胞裂解物中酪氨酸-磷脂?；牡鞍?；印跡B用抗綠色熒光蛋白的多克隆抗體探查；印跡C用h1Ced-6的兔抗血清探查。H1CED-6的分子量為34435.39；GFP的分子量為26886.32；融合蛋白GFP-CED-6或CED-6-GFP的分子量為62385.95；圖31示質(zhì)粒pGA1058的DNA序列，其中包括編碼細(xì)胞表面受體CD36的DNA序列插入導(dǎo)pEGFP-N3的多克隆位點(diǎn)；圖32示pGA1059的質(zhì)粒圖譜；圖33示在IL3撤退后膜聯(lián)蛋白和碘化丙啶陽(yáng)性細(xì)胞在Ba/F3細(xì)胞中的細(xì)胞群體中百分比；圖34示溫度對(duì)FDF溫育的影響，活的和凋亡的Ba/F3細(xì)胞加入巨噬細(xì)胞細(xì)胞系J774中。吞噬分析后，F(xiàn)DG(10μM)在4℃，20℃溫育1小時(shí)，在37℃溫于10和20分鐘。
實(shí)施例1用ced-6序列(圖2hced-6的共有區(qū)DNA序列)對(duì)公共區(qū)域數(shù)據(jù)庫(kù)(EST,Genbank,EMBL,Swissport和PIR)的廣泛研究顯示了在蛋白的羧基末端區(qū)的某些ESTS的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的同源物(AA443368,AA431995,R33389,R53881)。一種Est(T48513)顯示與PTB區(qū)的羧基端和帶電區(qū)的起始區(qū)同源。Marathonready 5’RACE分析，cDNA結(jié)腸腺癌庫(kù)來(lái)自Clontech。RACE和測(cè)序中運(yùn)用的引物的位置如圖1所示。通過(guò)隨后的克隆和序列分析，獲得額外的序列信息。運(yùn)用此額外的序列信息，在數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索，揭示額外的EST，使我們得以構(gòu)建約2400bp的共有序列。該序列可通過(guò)集落雜交和額外的RACE產(chǎn)物測(cè)序進(jìn)一步擴(kuò)大和變化。
實(shí)施例2RNA印跡人多種組織Northern(MTN-1,Clontech)，每泳道分別包括來(lái)自8種不同人組織(心，腦，胎盤，肺，肝，骨骼肌，腎和胰腺)的2mg聚腺苷酸化RNA和MTN-Ⅱ人多種組織Northern，每泳道分別包括來(lái)自脾，胸腺，前列腺，睪丸，卵巢，小腸，結(jié)腸和外周白細(xì)胞的的2mg聚腺苷酸化RNA，根據(jù)生產(chǎn)商說(shuō)明進(jìn)行雜交，在0.1×SSC，0.2％SDS在55℃洗。同樣來(lái)自Clontech，檢測(cè)人癌癥細(xì)胞系(黑色素瘤G361，肺癌A549，結(jié)腸癌SW480，伯基特氏淋巴瘤Raji，淋巴母細(xì)胞白血病Molt-4，慢性髓細(xì)胞性白血病62,Hela S3和原髓細(xì)胞性白血病HL60)的聚腺苷酸化RNA。
HCED-6在正常人組織和癌細(xì)胞中的表達(dá)模式經(jīng)Northern印跡如表1所示A)人多種組織Northern(MTN)印跡B)人多種組織Northern(MTN)印跡ⅡC)人癌細(xì)胞系多組織Northern(MTNTM)印跡。
表ⅠA) B) C) 實(shí)施例3在吞噬細(xì)胞系中CED-6(h1CED-6)及其剪接變體(h2CED-6)的檢測(cè)細(xì)胞系THP-1(美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心ATCC號(hào)TIB-202)，一種人單核細(xì)胞細(xì)胞系，可使用PMA(Sigma-Aldrich,St-Louis,MO,USA)使之分化為巨噬細(xì)胞，細(xì)胞在標(biāo)準(zhǔn)條件下、含2mM L-谷氨酰胺，1.5g/L碳酸氫鈉，4.5g/L葡萄糖，10mM HEPES,1mM丙酮酸鈉，0.05mM β-巰基乙醇的RPMI1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。(藥物均購(gòu)自gibcoBRL，Life Technologies,Merelbeke,Belgium)。
依據(jù)生產(chǎn)商說(shuō)明，或略作改動(dòng)，使用Rneasy mini試劑盒(Westburg,Leusden,the Netherlands)從此細(xì)胞系分離RNA。
依據(jù)生產(chǎn)商說(shuō)明，或略作改動(dòng)，使用Ready-To-Go T-primed第一鏈試劑盒(Pharmacia Biotech Piscataway,NJ,USA)產(chǎn)生第一鏈cDNA。
產(chǎn)生的cDNA在PCR步驟中用于產(chǎn)生DNA片段，使用引物oGA131:5’-CGCAAGGATCCCCATGAACCGTGCTTTTAGCAGGAAG-3’445-10934-13R:5’-GATCTACTAGGTACTGGAG-3’,PCR使用TaKaRa ex Taq試劑盒(Takara Shuzo Co.,LTD,Shiga，日本)進(jìn)行，依據(jù)生產(chǎn)商說(shuō)明，或略作改動(dòng)，質(zhì)粒pGA1025，包括h1ced-6基因，用作陽(yáng)性對(duì)照。
小結(jié)PCR產(chǎn)生第一鏈cDNA，使用Ready-To-Go T-primed第一鏈試劑盒，得到的第一鏈cDNA包括完整的cDNA，其它材料為0.4μloGA131(100pmol/μl),0.4μl 445-10934-13R(100pmol/μl),0.5μl exTaq 5U/μl,65.7μl水。
對(duì)陽(yáng)性對(duì)照進(jìn)行PCR，包括10μl緩沖液exTaq 10×,10μl dNTP混合exTaq 10×,0.4μl oGA131(100pmol/μl),0.4μl 445-10934-13R(100pmol/μl),2μl pGA1025,76.2μl水。
PCR程序 2μl每個(gè)PCR反應(yīng)產(chǎn)物和1μl陽(yáng)性對(duì)照PCR反應(yīng)的產(chǎn)物用于進(jìn)行嵌套式PCR，采用下列引物
oGA131同上oGA1415’-GCGGATGGTACCGTCGACTGCTGATACTTGAGTTATTCTCAG-3’PCR使用TaKaRa ex Taq試劑盒(Takara Shuzo Co.,LTD,Shiga，日本)進(jìn)行，依據(jù)生產(chǎn)商說(shuō)明，或略作改動(dòng)。
主要混合物5μl緩沖液exTaq 10×,5μl dNTP混合exTaq 10×,0.2μl oGA131(100pmol/μl),0.2μl oGA141(100pmol/μl),0.5μl exTaq 5U/μl,37.1μl水。
程序 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法對(duì)10μl嵌套式PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠分析(分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，Sambrook等，1989,CSHL出版社)。
在初級(jí)活嗜中性細(xì)胞，初級(jí)凋亡嗜中性細(xì)胞，初級(jí)巨噬細(xì)胞，與凋亡嗜中性細(xì)胞相互作用的初級(jí)巨噬細(xì)胞，鼠單核細(xì)胞細(xì)胞系J774和COS-1細(xì)胞中重復(fù)上述步驟。結(jié)果如圖6所示。顯著的，僅在細(xì)胞系THP-1中能測(cè)得h1ced-6和其剪接變體h2ced-6(見(jiàn)圖6的泳道8)。
實(shí)施例4人CED-6的穩(wěn)定細(xì)胞系J774鼠單核細(xì)胞腫瘤細(xì)胞系(Morland和Kaplan,1978，實(shí)驗(yàn)細(xì)胞學(xué)研究.115:53-61；Morland和Kaplan,1978,實(shí)驗(yàn)細(xì)胞學(xué)研究.115:63-72 ATCC登記號(hào)TIB67，又稱為J774.1)在DMEM中培養(yǎng)，加glutamaxI,10％myclone血清(均購(gòu)自GIBCoBRL,LifeTechnologies,Merelbeke，比利時(shí))，電穿孔法轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pEGFP-N3(Clonetech,Palo Alto,CA,USA)，(圖7和8)，模擬轉(zhuǎn)染，pGA3104,h1CED-6/GFP融合物(圖9和10)，鮭魚(yú)精子DNA；陰性對(duì)照。
電穿孔用Easyject Plus電穿孔系統(tǒng)(Equibio Ltd,Immunosource,Halle-Zoersel，比利時(shí))，按以下步驟3×106細(xì)胞置于800μl細(xì)胞培養(yǎng)基中，加入30μg DNA.EasyjectPlus電穿孔儀設(shè)為雙脈沖電壓I=750V，電容I=25μF，電阻I=99R，脈沖間延遲=0電壓I=150V，電容I=1500μF，電阻I=99R,Optipulse任選每3500μl電穿孔的細(xì)胞接種到175cm2培養(yǎng)瓶中，G418抗性選擇(400μg/ml)(Duchefa,Haarlem,The Netherlands)72小時(shí)。獲得并檢測(cè)GFP表達(dá)的克隆的亞克隆。
實(shí)施例5吞噬作用分析制備吞噬細(xì)胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pEGFPn3或pGA3104或pGA1058的單核細(xì)胞細(xì)胞系J774以1×105密度接種在黑色96孔板中37℃,5％CO2，進(jìn)行吞噬分析前培養(yǎng)36小時(shí)。
凋亡細(xì)胞的制備穩(wěn)定轉(zhuǎn)染β-半乳糖苷酶作為報(bào)告基因的生長(zhǎng)因子依賴的細(xì)胞系Ba/F3,用作凋亡細(xì)胞的源。轉(zhuǎn)染Ba/F3的適當(dāng)質(zhì)粒為pcDNA3.1/His/LacZ，如圖11所示。Ba/F3細(xì)胞為IL-3依賴的鼠克隆(Palacios和Steinmetz,1985，細(xì)胞41:727-734；Palacios等，1984，自然309:126-131)，在加glutamazI,10％FCS,1％抗生素(均購(gòu)自GIBCOBRL,ibid.)，10％WEHI-3培養(yǎng)物的上清中培養(yǎng)。
WEHI-3(ATCC號(hào):TIB-68)在培養(yǎng)基RPMI 1640,glutamaxI,1O％FCS,3.6μlβ-巰基乙醇/升中生長(zhǎng)，產(chǎn)生IL-3。
Ba/F3細(xì)胞在相互作用分析兩天前傳代(指數(shù)生長(zhǎng)期)，Ba/F3細(xì)胞(5×106細(xì)胞/ml)在無(wú)生長(zhǎng)因子IL-3條件下培養(yǎng)20小時(shí)，而后進(jìn)行分析。凋亡的Ba/F3細(xì)胞使用膜聯(lián)蛋白/碘化丙啶標(biāo)記試劑盒(Boeringher Mannheim,Brussels，比利時(shí))檢測(cè)。如20％膜聯(lián)蛋白陽(yáng)性而少于5％的碘化丙啶陰性，Ba/F3細(xì)胞為早期凋亡。加有生長(zhǎng)因子IL-3的Ba/F3細(xì)胞用作陰性對(duì)照。膜聯(lián)蛋白/碘化丙啶檢測(cè)的結(jié)果如圖33所示。
向吞噬細(xì)胞加入凋亡細(xì)胞200μl Ba/F3細(xì)胞(1×107細(xì)胞/ml)加入到含穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的J774和陰性對(duì)照的孔中，37℃溫育，時(shí)間從20分鐘到5小時(shí)，之后從所有孔中去除凋亡細(xì)胞。吞噬細(xì)胞在PBS緩沖液(GIBCOBRL,ibid)中洗3次，注意不要移去細(xì)胞。
讀數(shù)J774細(xì)胞吞噬的凋亡小體檢測(cè)通過(guò)檢測(cè)Ba/F3細(xì)胞中表達(dá)的β-半乳糖苷酶而實(shí)現(xiàn)。檢測(cè)采用熒光底物，熒光素雙-b-D-吡喃型半乳糖苷(FDG)(Molecular Probes,Eugene,OR，美國(guó))。向孔中加入10μM FDG，黑暗中室溫溫育1小時(shí)。FDG因β-半乳糖苷酶活性水解為FMG和熒光素，在標(biāo)準(zhǔn)平板計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)，480mm激發(fā)光，520mm發(fā)射光，適當(dāng)敏感度，檢測(cè)綠色熒光。
為校準(zhǔn)之目的，熒光讀數(shù)依賴于不同Ba/F3濃度。作為細(xì)胞濃度的熒光讀數(shù)如圖12所示。
進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)運(yùn)用不同F(xiàn)DG濃度，不同分析的溫育時(shí)間，不同分析的溫度和Ba/F3培養(yǎng)基中血清的濃度。結(jié)果分別如圖13,14,15和34。
化合物篩選上述的吞噬分析用于篩選化合物，判斷其影響凋亡細(xì)胞被專業(yè)性吞噬細(xì)胞吞噬的水平。所測(cè)化合物可加到檢測(cè)孔中，約30分鐘，后加入Ba/F3細(xì)胞。因?yàn)榉治龅亩嗫装逍问?，及自?dòng)熒光讀數(shù)使用標(biāo)準(zhǔn)設(shè)備，該分析典型適合高物料通過(guò)量的化合物篩選。
當(dāng)任何化合物的存在導(dǎo)致無(wú)熒光或與未暴露給化合物的吞噬細(xì)胞相比，熒光減弱，則應(yīng)對(duì)該孔中的細(xì)胞進(jìn)行活力檢測(cè)，實(shí)用商業(yè)試劑如Live/Dead Viability/Cytotoxicity試劑盒(MolecularProbes,Eugene,USA)。該試劑盒提供兩種顏色熒光細(xì)胞活性分析，對(duì)活和死細(xì)胞同時(shí)用兩種探針確定，鈣黃綠素AM和溴化乙啶同型二聚體。從而測(cè)定細(xì)胞活力的雙參數(shù)，細(xì)胞內(nèi)酯酶活性和質(zhì)膜完整性。該試劑盒適于熒光多孔板掃描儀?；罴?xì)胞的存在將確認(rèn)熒光的缺失緣于化合物對(duì)吞噬活性的影響，而非僅非特異性的毒性。
進(jìn)一步的，任何經(jīng)本分析鑒定為凋亡細(xì)胞吞噬的抑制劑或增強(qiáng)劑的化合物，將進(jìn)一步檢測(cè)此作用通過(guò)CED-6的調(diào)節(jié)。當(dāng)化合物鑒定為凋亡細(xì)胞吞噬的增強(qiáng)劑時(shí)，通過(guò)進(jìn)行如上述的用為轉(zhuǎn)染h1ced-6或h2ced-6的J774細(xì)胞進(jìn)行吞噬細(xì)胞分析。如果化合物能在J774細(xì)胞中誘導(dǎo)與轉(zhuǎn)染hced-6的細(xì)胞中相同的表型，說(shuō)明化合物不一定通過(guò)CED-6或CED-6信號(hào)傳導(dǎo)通路作用。
相似的，如果化合物鑒定為凋亡細(xì)胞吞噬的抑制劑時(shí)，通過(guò)檢測(cè)暴露給化合物的轉(zhuǎn)染的J774的表型，確認(rèn)該作用通過(guò)CED-6或CED-6信號(hào)傳導(dǎo)通路作用。對(duì)野生型表型的逆轉(zhuǎn)說(shuō)明反應(yīng)通過(guò)CED-6信號(hào)傳導(dǎo)通路。
實(shí)施例6抗人CED-6得多克隆抗體多克隆抗體在兔中培養(yǎng)，抗下列ced-6表位EP990044 H2N-NRA FSR KKD KTC CONH2EP990045 H2N-CFL GST EVE QPK GTE CONH2EP990046 H2N-CTR NGT QPP PVP SRS T CONH2這些表位在ced-6蛋白中的定位如圖16所示。
多克隆抗體通過(guò)Eurogentec Bel(Herstal，比利時(shí))制備，按照下列步驟第0天去免疫前血清，第一次免疫接種第14天第二次免疫接種第28天第三次免疫接種第38天采血樣(取血2ml)第56天第4次免疫第66天采血樣(取血2+20ml)第80天完成取血實(shí)施例7Western印跡檢測(cè)抗體在TOP10感受態(tài)細(xì)胞中轉(zhuǎn)化質(zhì)粒pGA1028(pBAD/His A-hCED-6)(見(jiàn)圖17和18)。用pBAD/His轉(zhuǎn)化相同的大腸桿菌細(xì)胞作為陰性對(duì)照。pBAD/His A和大腸桿菌TOP10購(gòu)自Invitrogen(Leek,TheNetherlands)。
使用pBAD-載體表達(dá)系統(tǒng)，它為一種已知的高效表達(dá)系統(tǒng)。當(dāng)阿拉伯糖存在時(shí)，pbAD的表達(dá)開(kāi)始，而缺乏阿拉伯糖時(shí)，pBAD轉(zhuǎn)錄水平極低。根據(jù)生產(chǎn)商說(shuō)明進(jìn)行先導(dǎo)表達(dá)，其中阿拉伯糖的量不同，確定蛋白的最高表達(dá)所需的阿拉伯糖的量。方法依據(jù)生產(chǎn)商(Invitrogen,Lekk,The Netherlands)。用同樣方法進(jìn)行大量表達(dá)。
蛋白的純化在轉(zhuǎn)化pGA1028的大腸桿菌細(xì)胞中進(jìn)行5ml裂解緩沖液(10ml TE 1×pH9,0.5mg./ml溶菌酶，0.1mg/ml DNAse,100μl 1M CaCl2400μl蛋白酶抑制劑25×)加入到50ml誘導(dǎo)表達(dá)的培養(yǎng)物沉淀物，沉淀在裂解緩沖液中重懸。重懸物在冰上放置30分鐘，超聲3次，每次5秒(高密度)，隨后重懸物經(jīng)過(guò)3個(gè)凍融循環(huán)(液氮-42℃)，在37℃放置30分鐘。重懸物以最大轉(zhuǎn)速離心5分鐘。沉淀包括不可溶部分和hCED-6融合蛋白，在1ml 2M尿素中重懸，1200rpm振搖5分鐘。重懸物以最大轉(zhuǎn)速離心5分鐘，上清用于凝膠電泳和Western印跡。25μl上清和25μl預(yù)混SDS-聚丙稀酰胺凝膠電泳樣品緩沖液(Bio Rad-Hercules,CA，美國(guó))混合。
來(lái)自陰性對(duì)照的蛋白不純化。pBAD/His轉(zhuǎn)化的大腸桿菌如下制備，沉淀1ml誘導(dǎo)的大腸桿菌培養(yǎng)物，沉淀在1ml預(yù)混SDS-聚丙稀酰胺凝膠電泳樣品緩沖液(Bio Rad-Hercules,CA，美國(guó))中重懸。重懸物用于PAGE凝膠電泳。
制備的樣品加入到凝膠樣品煮沸5分鐘，加樣前置于冰上。向制備的凝膠TrisHCl,4-15％(Bio Rad-Hercules,CA，美國(guó))50μl加樣孔加25μl樣品，電泳依照生產(chǎn)商說(shuō)明進(jìn)行。使用MiniTransBlot electrophoresis cell(Bio Rad-Hercules,CA，美國(guó))將膠上的蛋白轉(zhuǎn)到硝酸纖維素膜(Trans-blot Transfermedim,Bio Rad-Hercules,CA，美國(guó))，依照生產(chǎn)商說(shuō)明進(jìn)行(BioRad-Hercules,CA，美國(guó))。
根據(jù)抗體的供應(yīng)商和檢測(cè)試劑盒進(jìn)行Western印跡。一抗，兔的免疫血清或免疫前血清在PBST(1.44g/L KH2P04,90g/LNaCl,7.75g/L Na2HPO4.7H20,0.1％Tween)中按1/2000稀釋。二抗抗兔，辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的完整抗體(donkey)在PBST(0.1％)中按1/4000稀釋(ECL Western印跡檢測(cè)試劑和分析系統(tǒng)，AmershamPharmacia Biotech，UK,England)。
溫育按生廠商說(shuō)明進(jìn)行，稍做改動(dòng)。第一抗體在PBST而不是在TBST中溫育過(guò)夜。抗體的檢測(cè)根據(jù)生產(chǎn)商的教導(dǎo)進(jìn)行(ECL Western印跡檢測(cè)試劑和分析系統(tǒng)，Amersham PharmaciaBiotech,UK,England)。在ECL試劑盒檢測(cè)，根據(jù)生產(chǎn)商的教導(dǎo)刮去和再標(biāo)記膜。
根據(jù)生產(chǎn)商的教導(dǎo)進(jìn)行抗HisA抗體(Invitrogen,Leek，荷蘭)的Western印跡，同時(shí)有對(duì)照抗體。以1/5000稀釋在PBST(0.1％)(Invitrogen,Leek，荷蘭)中抗-Xpress抗體用作第一抗體。二抗小鼠Ig，辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的全長(zhǎng)抗體(來(lái)源于綿羊)，以1/4000稀釋于PBST中(0.1％)(ECL Western印跡檢測(cè)試劑和分析系統(tǒng)，Amersham Pharmacia Biotech,UK,England)。
實(shí)驗(yàn)中抗體染色依據(jù)依照生產(chǎn)商說(shuō)明進(jìn)行(ECL Western印跡檢測(cè)試劑和分析系統(tǒng)，Amersham Pharmacia Biotech,UK,England)。
結(jié)果如圖20到25所示。
實(shí)施例8H-CED-6與酪氨酸磷酸化蛋白免疫共沉淀抗h1CED-6的3個(gè)表位的抗體用于Western印跡，檢測(cè)CED-6與酪氨酸磷酸化蛋白的相互作用，鑒定CED-6相互作用蛋白。
轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pGA3103(見(jiàn)圖26-29)和pGA3104(見(jiàn)圖7-10)轉(zhuǎn)染175cm2方瓶中的COS-1細(xì)胞(1×107細(xì)胞)。陰性對(duì)照MOCK和pEGFP-N3。調(diào)查全長(zhǎng)人ced-6(處于GFP閱讀框中，N端和C端融合，內(nèi)部控制)。COS-1細(xì)胞用脂質(zhì)轉(zhuǎn)染胺Plus試劑(GIBCO-BRL)轉(zhuǎn)染。下附LifeTechnologies的方法，體積如表2所示。
MOCK轉(zhuǎn)染的蛋白為轉(zhuǎn)染的陰影對(duì)照。向細(xì)胞中僅加入DNA的溶劑而不加DNA。DNA的溶劑為TE緩沖液，pH=8:1M Tris(ICN)ph=8和0.5 M EDTA(Merck-Belgolabo)pH=8溶于水中。
表2 175cm2方瓶中脂質(zhì)轉(zhuǎn)染胺轉(zhuǎn)染(Life Technologies)COS-1細(xì)胞
磷酸化的Ba/F3細(xì)胞的IL-3受體的β-鏈作為磷酸化的陽(yáng)性對(duì)照。
使用毛地黃毒苷制備COS-1細(xì)胞裂解物(盡量輕柔，不要破壞相互作用)，向裂解緩沖液中加入磷酸酶抑制劑(蛋白酶抑制劑，優(yōu)選混合物或pefablock)。
以低嚴(yán)緊型毛地黃毒苷為基礎(chǔ)的緩沖液10ml bidi中毛地黃毒苷的緩沖液1％毛地黃毒苷(Serva 19551，分子量1229.3)SERVA2％母液=250mg溶于12.5ml10mM三羥乙基胺pH7.8(Sigma-Aldrich；Bornem,Belgium 10×母液100mM=185.7mg溶于10ml pH7.8(5ml稀釋為50ml)O.15M NaCl(MW 58.44) 87.66 mg/ml2mM EDTA(Titriplex Ⅲ) 分子量372.24)(Darmstadt，德國(guó))7.444mg每10ml200U/ml抑酶肽-Trazilol(Sigma-Aldrich,Bornem,Belgium)1mg=11TIU=9900KU200x母液10mg溶于2ml PBS中=49500KU(10ml中含50μl)1mM Pefabloc(Merck,Darmstadt，德國(guó))2.4mg每10ml細(xì)胞的裂解轉(zhuǎn)染細(xì)胞在falcon中Dulbeccco氏PBS(GIBCOBRL)洗2次刮細(xì)胞，沉淀在300μl裂解緩沖液中重懸所有操作在4℃進(jìn)行制備物4000rpm離心，上清轉(zhuǎn)移到新管中預(yù)清除蛋白G瓊脂糖CL-4B珠(Amersham Pharmacia,Roosendaal,theNetherlands)以凍干的添加劑形式提供。這些添加物可在中性pH洗去，由乙醇替代裂解緩沖液。
50％v/v蛋白G瓊脂糖懸液吸取1ml 50/50/v/v蛋白G瓊脂糖并以最高轉(zhuǎn)速離心5秒鐘，隨后在等體積裂解緩沖液中重懸。洗3次。
向300μl裂解液中加入50μl蛋白G瓊脂糖CL-4B珠(AmershamPharmacia,ibid.)，作用1小時(shí)。
4℃14000rpm離心10秒，上清轉(zhuǎn)入新管。
免疫共沉淀COS-1裂解物加入5μl抗-綠色熒光蛋白(GFP)多克隆兔抗(Immunosource,Halle-Zoersel，比利時(shí))凍干形式溶于100μl蒸餾水中，-20℃凍存。
Ba/F3裂解物5號(hào)加入5μl抗IL-3受體的β-鏈的兔抗(Vander heyden J.,Devos R.,Plaetinck G.,Fache I.,Fiers W.,Tavernier J.1991.運(yùn)用系列單克隆抗體對(duì)鼠IL-5受體復(fù)合物的鑒定，該復(fù)合物與鼠IL-3受體的關(guān)系。免疫學(xué)雜志。147:3412-3418)Ba/F3裂解物6號(hào)不加抗體樣品在4℃溫育4小時(shí)和24小時(shí)(過(guò)夜)，旋轉(zhuǎn)加入50μl蛋白A珠，4℃溫育1小時(shí)樣品4℃3000rpm離心3分鐘珠子重懸在800μl裂解緩沖液中，倒轉(zhuǎn)幾次或旋轉(zhuǎn)幾分鐘，4℃3000rpm離心3分鐘。重復(fù)3此，最后用毛細(xì)管去除清洗緩沖液珠子在20μl SDS加樣緩沖液(含巰基)中重懸。
裂解液7號(hào)=EGF-刺激的A431細(xì)胞裂解液(抗磷酸酪氨酸)(Upstate Biotechnology,Cat.No.12-302)2.5μl β-巰基乙醇加入到煮沸的100μl裂解液和樣品中。
樣品離心3000rpm，3分鐘(4℃),SN加到SDS PAGE中，使用預(yù)染的SDS-PAGE低分子量標(biāo)準(zhǔn)(BioRad cat.no161-0305)Western印跡細(xì)胞裂解物轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上轉(zhuǎn)移緩沖液=4BmM Tris，39 mM甘氨酸，20％甲醇，pH9.2(5.82g Tris,2.93g甘氨酸，200ml甲醇，溶于1升水中)封閉緩沖液1×PBS,0.1％Tween,5％奶粉，溫育過(guò)夜抗磷酸酪氨酸標(biāo)記Gel(cat.05-321,Upstate Biotechnology):1μg/ml 3小時(shí)，PBS 0.1％Tween洗2次，每次5分鐘蛋白顯色，使用1:4000山羊抗鼠辣根過(guò)氧化物酶(cat.No RPN2108,Amersham Pharmacia biotech)二抗，室溫1小時(shí)。
PBS 0.1％Tween洗膜2次，每次5分鐘，封閉液洗膜2次，每次5分鐘，水洗膜2次，每次5分鐘。
ECL Western印跡分析系統(tǒng)ECL Western印跡檢測(cè)試劑購(gòu)自Amersham PharmaciaBiotech(cat.no RPN 2108)。
ECL檢測(cè)試劑盒檢測(cè)后洗去結(jié)合抗體并重標(biāo)記膜ECL檢測(cè)試劑盒檢測(cè)后洗去結(jié)合抗體并重標(biāo)記膜。每次免疫檢測(cè)后，膜在4℃保鮮膜中保持濕潤(rùn)。
膜浸入剝離緩沖液中(100mM β-巰基乙醇，2％SDS,62.5mM Tris-HCl pH6.7)，50℃溫育30分鐘，偶爾攪拌。
膜在PBS，0.1％Tween中洗2×10分鐘，室溫下使用大體積洗膜緩沖液。
膜在封閉緩沖液中室溫封閉1小時(shí)。
使用抗綠色熒光GFP免疫檢測(cè)，用抗人CED-6重復(fù)結(jié)果所有細(xì)胞裂解物的Western印跡用抗磷酸酪氨酸，抗-綠色熒光蛋白(GFP)或抗CED-6的兔血清標(biāo)記，如圖30印跡(A),(B)和(C)?？沽姿崂野彼崛旧?，一條49和74KD間的條帶出現(xiàn)在專染GFP和CED-6的融合蛋白的COS-1細(xì)胞裂解物中，而在對(duì)照COS-1細(xì)胞裂解物中不出現(xiàn)。抗-GFP和抗-CED-6的Western印跡也染色相同的49和74KD間的條帶。
結(jié)論融合蛋白CED-6-GFP和GFP-CED-6都為酪氨酸磷酸化的。它們的分子量為62385.95，表明在49和74KD間的條帶為抗磷酸酪氨酸，抗綠色熒光蛋白(GFP)和抗-CED-6的陽(yáng)性染色。
實(shí)施例9穩(wěn)定細(xì)胞系用人細(xì)胞表面受體CD36轉(zhuǎn)染。
J774鼠單核細(xì)胞腫瘤細(xì)胞系通過(guò)電穿孔用質(zhì)粒pGA1058轉(zhuǎn)染，如圖31和32所示。方法如實(shí)施例4轉(zhuǎn)染人ced-6描述的。
轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系用作使用實(shí)施例5方法的吞噬分析的陽(yáng)性對(duì)照。
實(shí)施例10從PC12產(chǎn)生凋亡顆粒。
PC-12細(xì)胞系(ATCC號(hào):CRL-1712)(Mesner P.W.,Winters T.R.,Green S.H.，(1992)細(xì)胞生物學(xué)雜志.119:1669-1680)趨于成團(tuán)生長(zhǎng)。加入神經(jīng)生長(zhǎng)因子β(50ng/ml終濃度，Sigma)，PC-12細(xì)胞分化為神經(jīng)元細(xì)胞。神經(jīng)生長(zhǎng)因子撤除5天后，誘導(dǎo)神經(jīng)元大鼠PC12細(xì)胞程序性細(xì)胞死亡。細(xì)胞在含2mM L-谷氨酰胺，1.5g/L碳酸氫鈉，4.5g/L葡萄糖，10mM HEPES和1mM丙酮酸鈉，10％馬血清，5％胎牛血清的RPMI1640(Life Technologies)中培養(yǎng)。
這些細(xì)胞可使用上述的膜聯(lián)蛋白/PI試劑盒檢測(cè)其凋亡特性。
序列表本文如圖所示的核苷酸和氨基酸序列對(duì)應(yīng)下列SEQ ID NOs。
SEQ ID NO:1圖1SEQ ID NO:2圖2SEQ ID NO:3圖3SEQ ID NO:4圖4SEQ ID NO:5圖5SEQ ID NO:6圖7SEQ ID NO:7圖9SEQ ID NO:8圖11
SEQ ID NO:9 圖17SEQ ID N0:10圖19SEQ ID N0:11圖26SEQ ID N0:12圖28SEQ ID N0:13圖31
序列表<110>DEVGEN NV<120>吞噬分析方法<130>SCB/50784/023<140><141><160>15<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>2416<212>DNA<213>人類<220><221>CDS<222>(430)..(1344)<400>1ggtgatgagc ccttgggttc tcgctccgac tgctaaattc gcttggccgg gtccaccttc 60tcgtggcctc actcgccaca cggatcagaa tccggagcag gcagttctct ctattctgag 120gctcctgcgg ctgccgcgct gacttccctg tgtggnggag ggaactctgg gcaggctggt 180tttcttggaa tgtgtttacg atgttgaatg ggacttgaac aggaagctgg acgctgcagc 240tggaactagc gtgccaagtt atttatgatt ccatctgata tacataggag agaaactgat 300agaagaattc tgatggcaac tgtatgatag aagctatata aagtcaagtg tccattttct 360ttcaactata tttgagcata cccaggattt aagtcgtgga actgaacatt tatttggctg 420atcctcatc atg aac cgt gct ttt agc agg aag aaa gac aaa aca tgg atg 471Met Asn Arg Ala Phe Ser Arg Lys Lys Asp Lys Thr Trp Met1 5 10cat aca cct gaa gct tta tca aaa cat ttc att ccc tat aat gca aag 519His Thr Pro Glu Ala Leu Ser Lys His Phe Ile Pro Tyr Asn Ala Lys15 20 25 30ttt ctt ggc agt aca gaa gtg gaa cag cca aaa gga aca gaa gtt gtg 567Phe Leu Gly Ser Thr Glu Val Glu Gln Pro Lys Gly Thr Glu Val Val35 40 45aga gat gct gta agg aaa cta aag ttt gca aga cat atc aag aaa tct 615Arg Asp Ala Val Arg Lys Leu Lys Phe Ala Arg His Ile Lys Lys Ser50 55 60gaa ggc cag aaa att cct aaa gtg gag ttg caa ata tca att tat gga 663Glu Gly Gln Lys Ile Pro Lys Val Glu Leu Gln Ile Ser Ile Tyr Gly65 70 75gta aaa att cta gaa ccc aaa aca aag gaa gtt caa cac aat tgc cag 711Val LVs Ile Leu Glu Pro Lys Thr Lys Glu Val Gln His Asn Cys Gln
80 85 90ctt cat aga ata tct ttt tgt gca gat gat aaa act gac aag agg ata759Leu His Arg Ile Ser Phe Cys Ala Asp Asp Lys Thr Asp Lys Arg Ile95 100 105 110ttc act ttc ata tgc aaa gat tct gag tca aat aaa cat ttg tgc tat807Phe Thr Phe Ile Cys Lys Asp Ser Glu Ser Ash Lys His Leu Cys Tyr115 120 125gta ttt gac agc gaa aag tgt gct gaa gag atc act tta aca att ggc855Val Phe Asp Ser Glu Lys Cys Ala Glu Glu Ile Thr Leu Thr Ile Gly130 135 140caa gca ttt gac ctg gca tac agg aaa ttt cta gaa tca gga gga aaa903Gln Ala Phe Asp Leu Ala Tyr Arg Lys Phe Leu Glu Ser Gly Gly Lys145 150 155gat gtt gaa aca aga aaa cag atc gca ggg tta caa aaa aga atc caa951Asp Val Glu Thr Arg Lys Gln Ile Ala Gly Leu Gln Lys Arg Ile Gln160 165 170gac tta gaa aca gaa aat atg gaa ctt aaa aat aaa gta caa gat ttg999Asp Leu Glu Thr Glu Asn Met Glu Leu Lys Asn Lys Val Gln Asp Leu175 180 185 190gaa aac caa ctg aga ata act caa gta tca gca cct cca gca ggc agt1047Glu Asn Gln Leu Arg Ile Thr Gln Val Ser Ala Pro Pro Ala Gly Ser195 200 205atg aca cct aag tcg ccc tcc act gac atc ttt gat atg att cca ttt1095Met Thr Pro Lys Ser Pro Ser Thr Asp Ile Phe Asp Met Ile Pro Phe210 215 220tct cca ata tca cac cag tct tcg atg cct act cgc aat ggc aca cag1143Ser Pro Ile Ser His Gln Ser Ser Met Pro Thr Arg Asn Gly Thr Gln225 230 235cca cct cca gta cct agt aga tct act gag att aaa cgg gac ctg ttt1191Pro Pro Pro Val Pro Ser Arg Ser Thr Glu Ile Lys Arg Asp Lcu Phe240 245 250gga gca gaa cct ttt gac cca ttt aac tgt gga gca gca gat ttc cct1239Gly Ala Glu Pro Phe Asp Pro Phe Asn Cys Gly Ala Ala Asp Phe Pro255 260 265 270cca gat att caa tca aaa tta gat gag atg cag gag ggg ttc aaa atg1287Pro Asp Ile Gln Ser Lys Leu Asp Glu Met Gln Glu Gly Phe Lys Met275 280 285gga cta act ctt gaa ggc aca gta ttt tgt ctc gac ccg tta gac agt1335Gly Leu Thr Leu Glu Gly Thr Val Phe Cys Leu Asp Pro Leu Asp Ser290 295 300agg tgc tga catcaagaac aagaaatcct gattcatgtt aaatgtgttt1384Arg Cys305gtatacacat gtcatttatt attattactt taagataggt attattcatg tgtcaatgtg 1444tttgaatatt ttaatatttt gaaaattttc tcagttaaat ttcctcacct tcactattga 1504tctgtaattt ttattttaaa aacagcttac tgtaaagtag atcatacttt tatgttcctt 1564tctgtttcta ctgtagatga atttgtaatt gaaagacata ttatacaaat acctgccttg 1624tgtctgagtt ctatttagtt agcatcttga aatttgtatt cattttccag atggctagtt 1684tattaatgat ttcccaaaag ccatacctta aagataactt tttaaattct gaagagacat 1744gccaatgtca aactaaacat gttctgtttt taaaccaaca aacatgttac tattcattgg 1804acagatstca ttttatgtat aaatactgtt cacatcactg ggaaaatgta aactttaaac 1864staatgccac aaggtcacta atttctagca ggtaasatta taaggatata aattccaata 1924staaaccaaa tgtatttags gtatttatta gtaaatgcaa ggtgatgtta gttatgatca 1984gttatactct aaatatttaa tttgttttat aaaggtagtg aaaaaatgaa aatttgctat 2044ttattaaaaa acattaaatt tcattccaaa tgagataagt gatattacta taacatctaa 2104gcatcatctg atttgatatt ccctaaaaaa catttggaat atatgctatc tatagattca 2164gtatctacta cccatattta ctttaccaaa tatatttctc ctcactgcat aaggactsct 2224cttctcatat tttcttcttt gatgaagata tttttcacca aagtttattt tgtgatgccc 2284tcttggtttt gatactttaa aatctgtggc acccgttcta catgaattat caatatttgg 2344taaattcaat ctgtatttgt tttgttaaag tcaaaaatct cattttccaa aaaaaaaaaa 2404aaaaaactcg ag 2416<210>2<21l>304<212>蛋白質(zhì)<213>人類<400>2Met Asn Arg Ala Phe Ser Arg Lys Lys Asp Lys Thr Trp Met His Thr1 5 10 15Pro Glu Ala Leu Ser Lys His Phe Ile Pro Tyr Asn Ala Lys Phe Leu20 25 30Gly Ser Thr Glu Val Glu Gln Pro Lys Gly Thr Glu Val Val Arg Asp35 40 45Ala Val Arg Lys Leu Lys Phe Ala Arg His Ile Lys Lys Ser Glu Gly50 55 60Gln Lys Ile Pro Lys Val Glu Leu Gln Ile Ser Ile Tyr Gly Val Lys65 70 75 80Ile Leu Glu Pro Lys Thr Lys Glu Val Gln His Asn Cys Gln Leu His85 90 95Arg Ile Ser Phe Cys Ala Asp Asp Lys Thr Asp Lys Arg Ile Phe Thr100105 110Phe Ile Cys Lys Asp Ser Glu Ser Asn Lys His Leu Cys Tyr Val Phe115 120 125Asp Ser Glu Lys Cys Ala Glu Glu Ile Thr Leu Thr Ile Gly Gln Ala130 135 140Phe Asp Leu Ala Tyr Arg Lys Phe Leu Glu Ser Gly Gly Lys Asp Val145 150 155 160Glu Thr Arg Lys Gln Ile Ala Gly Leu Gln Lys Arg Ile Gln Asp Leu165 170 175Glu Thr Glu Ash Met Glu Leu Lys Ash Lys Val Gln Asp Leu Glu Ash180 185 190Gln Leu Arg Ile Thr Gln Val Ser Ala Pro Pro Ala Gly Ser Met Thr195 200 205Pro Lys Ser Pro Ser Thr Asp Ile Phe Asp Met Ile Pro Phe Ser Pro210 215 220Ile Ser His Gln Ser Ser Met Pro Thr Arg Asn Gly Thr Gln Pro Pro225 230 235 240Pro Val Pro Ser Arg Ser Thr Glu Ile Lys Arg Asp Leu Phe Gly Ala245 250 255Glu Pro Phe Asp Pro Phe Asn Cys Gly Ala Ala Asp Phe Pro Pro Asp260 265 270Ile Gln Ser Lys Leu Asp Glu Met Gln Glu Gly Phe Lys Met Gly Leu275 280 285Thr Leu Glu Gly Thr Val Phe Cys Leu Asp Pro Leu Asp Ser Arg Cys290 295 300<210>3<211>2278<212>DNA<213>人類<220><221>CDS<222>(430)..(1206)<400>3ggtgatgagc ccttgggttc tcgctccgac tgctaaattc gcttggccgg gtccaccttc 60tcgtggcctc actcgccaca cggatcagaa tccggagcag gcagttctct ctattctgag 120gctcctgcgg ctgccgcgct gacttccctg tgtggnggag ggaactctgg gcaggctggt 180tttcttggaa tgtgtttacg atgttgaatg ggacttgaac aggaagctgg acgctgcagc 240tggaactagc gtgccaagtt atttatgatt ccatctgata tacataggag agaaactgat 300agaagaattc tgatggcaac tgtatgatag aagctatata aagtcaagtg tccattttct 360ttcaactata tttgagcata cccaggattt aagtcgtgga actgaacatt tatttggctg 420atcctcatc atg aac cgt gct ttt agc agg aag aaa gac aaa aca tgg atg 471Met Asn Arg Ala Phe Ser Arg Lys Lys Asp Lys Thr Trp Met1 5 10cat aca cct gaa gct tta tca aaa cat ttc att ccc tat aat gca aag 519His Thr Pro Glu Ala Leu Ser Lys His Phe Ile Prc Tyr Asn Ala Lys15 20 25 30ttt ctt ggc agt aca gaa gtg gaa cag cca aaa gga aca gaa gtt gtg 567Phe Leu Gly Ser Thr Glu Val Glu Gln Pro Lys Gly Thr Glu Val Val35 40 45aga gat gct gta agg aaa cta aag ttt gca aga cat atc aag aaa tct 615Arg Asp Ala Val Arg Lys Leu Lys Phe Ala Arg His Ile Lys Lys Ser50 55 60gaa ggc cag aaa att cct aaa gtg gag ttg caa ata tca att tat gga 663Glu Gly Gln Lys Ile Pro Lys Val Glu Leu Gln Ile Ser Ile Tyr Gly65 70 75gta aaa att cta gaa ccc aaa aca aag gct gaa gag atc act tta aca 711Val Lys Ile Leu Glu Pro Lys Thr Lys Ala Glu Glu Ile Thr Leu Thr80 85 90att ggc caa gca ttt gac ctg gca tac agg aaa ttt cta gaa tca gga 759Ile Gly Gln Ala Phe Asp Leu Ala Tyr Arg Lys Phe Leu Glu Ser Gly95 100 105 110gga aaa gat gtt gaa aca aga aaa cag atc gca ggg tta caa aaa aga 807Gly Lys Asp Val Glu Thr Arg Lys Gln Ile Ala Gly Leu Gln Lys Arg115 120 125atc caa gac tta gaa aca gaa aat atg gaa ctt aaa aat aaa gta caa 855Ile Gln Asp Leu Glu Thr Glu Asn Met Glu Leu Lys Asn Lys Val Gln130 135 140gat ttg gaa aac caa ctg aga ata act caa gta tca gca cct cca gca 903Asp Leu Glu Asn Gln Leu Arg Ile Thr Gln Val Ser Ala Pro Pro Ala145 150 155ggc agt atg aca cct aag tcg ccc tcc act gac atc ttt gat atg att 951Gly Ser Met Thr Pro Lys Ser Pro Ser Thr Asp Ile Phe Asp Met Ile160 165 170cca ttt tct cca ata tca cac cag tct tcg atg cct act cgc aat ggc 999Pro Phe Ser Pro Ile Ser His Gln Ser Ser Met Pro Thr Arg Asn Gly175 180 185 190aca cag cca cct cca gta cct agt aga tct act gag att aaa cgg gac 1047Thr Gln Pro Pro Pro Val Pro Ser Arg Ser Thr Glu Ile Lys Arg Asp195 200 205ctg ttt gga gca gaa cct ttt gac cca ttt aac tgt gga gca gca gat 1095Leu Phe Gly Ala Glu Pro Phe Asp Pro Phe Asn Cys Gly Ala Ala Asp210 215 220ttc cct cca gat att caa tca aaa tta gat gag atg cag gag ggg ttc 1143Phe Pro Pro Asp Ile Gln Ser Lys Leu Asp Glu Met Gln Glu Gly Phe225 230 235aaa atg gga cta act ctt gaa ggc aca gta ttt tgt ctc gac ccg tta 1191Lys Met Gly Leu Thr Leu Glu Gly Thr Val Phe Cys Leu Asp Pro Leu240 245 250gac agt agg tgc tga catcaagaac aagaaatcct gattcatgtt aaatgtgttt 1246Asp Ser Arg Cys255gtatacacat gtcatttatt attattactt taagataggt attattcatg tgtcaatgtt 1306tttgaatatt ttaatatttt gaaaattttc tcagttaaat ttcctcacct tcactattga 1366tctgtaattt ttattttaaa aacagcttac tgtaaagtag atcatacttt tatgttcctt 1426tctgtttcta ctgtagatga atttgtaatt gaaagacata ttatacaaat acctgccttg 1486tgtctgagtt ctatttagtt agcatcttga aatttgtatt cattttccag atggctagtt 1546tattaatgat ttcccaaaag ccatacctta aagataactt tttaaattct gaagagacat 1606gccaatgtca aactaaacat gttctgtttt taaaccaaca aacatgttac tattcattgg 1666acagatatca ttttatgtat aaatactgtt cacatcactg ggaaaatgta aactttaaac 1726ataatgccac aaggtcacta atttctagca ggtaaaatta taaggatata aattccaata 1786ataaaccaaa tgtatttaga gtatttatta gtaaatgcaa ggtgatgtta gttatgatca 1846gttatactct aaatstttaa tttgttttat aaaggtagtg aaaaaatgaa aatttgctat 1906ttattaaaaa acattaaatt tcattccaaa tgagataagt gatattacta taacatctaa 1966gcatcatctg atttgatatt ccctaaaaaa catttggaat atatgctatc tatagattca 2026gtatctacta cccatattta ctttaccaaa tatatttctc ctcactgcat aaggactact 2086cttctcatat tttcttcttt gatgaagata tttttcacca aagtttattt tgtgatgccc 2146tcttggtttt gatactttaa aatctgtggc acccgttcta catgaattat caatatttgg 2206taaattcaat ctgtatttgt tttgttaaag tcaaaaatct cattttccaa aaaaaaaaaa 2266aaaaaactcg ag 2278<210>4<211>258<212>蛋白質(zhì)<213>人類<400>4Met Asn Arg Ala Phe Ser Arg Lys Lys Asp Lys Thr Trp Met His Thr1 5 10 15Pro Glu Ala Leu Ser Lys His Phe Ile Pro Tyr Asn Ala Lys Phe Leu20 25 30Gly Ser Thr Glu Val Glu Gln Pro Lys Gly Thr Glu Val Val Arg Asp35 40 45Ala Val Arg Lys Leu Lys Phe Ala Arg His Ile Lys Lys Ser Glu Gly50 55 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gagcagaacc 780ttttgaccca tttaactgtg gagcagcaga tttccctcca gatattcaat caaaattaga 840tgagatgcag gaggggttca aaatgggact aactcttgaa ggcacagtat tttgtctcga 900cccgttagac agtaggtgcg tcgacggtac cgcgggcccg ggatccatcg ccaccatggt 960gagcaagggc gaggagctgt tcaccggggt ggtgcccatc ctggtcgagc tggacggcga 1020cgtaaacggc cacaagttca gcgtgtccgg cgagggcgag ggcgatgcca cctacggcaa 1080gctgaccctg aagttcatct gcaccaccgg caagctgccc gtgccctggc ccaccctcgt 1140gaccaccctg acctacggcg tgcagtgctt cagccgctac cccgaccaca tgaagcagca 1200cgacttcttc aagtccgcca tgcccgaagg ctacgtccag gagcgcacca tcttcttcaa 1260ggacgacggc aactacaaga cccgcgccga ggtgaagttc gagggcgaca ccctggtgaa 1320ccgcatcgag ctgaagggca tcgacttcaa ggaggacggc aacatcctgg ggcacaagct 1380ggagtacaac tacaacagcc acaacgtcta tatcatggcc gacaagcaga agaacggcat 1440caaggtgaac ttcaagatcc gccacaacat cgaggacggc agcgtgcagc tcgccgacca 1500ctaccagcag aacaccccca tcggcgacgg ccccgtgctg ctgcccgaca accactacct 1560gagcacccag tccgccctga gcaaagaccc caacgagaag cgcgatcaca tggtcctgct 1620ggagttcgtg accgccgccg ggatcactct cggcatggac gagctgtaca agtaaagcgg 1680ccgcgactct agatcataat cagccatacc acatttgtag aggttttact tgctttaaaa 1740aacctcccac acctccccct gaacctgaaa cataaaatga atgcaattgt tgttgttaac 1800ttgtttattg cagcttataa tggttacaaa taaagcaata gcatcacaaa tttcacaaat 1860aaagcatttt tttcactgca ttctagttgt ggtttgtcca aactcatcaa tgtatcttaa 1920ggcgtaaatt gtaagcgtta atattttgtt aaaattcgcg ttaaattttt gttaaatcag 1980ctcatttttt aaccaatagg ccgaaatcgg caaaatccct tataaatcaa aagaatagac 2040cgagataggg ttgagtgttg ttccagtttg gaacaagagt ccactattaa agaacgtgga 2100ctccaacgtc aaagggcgaa aaaccgtcta tcagggcgat ggcccactac gtgaaccatc 2160accctaatca agttttttgg ggtcgaggtg ccgtaaagca ctaaatcgga accctaaagg 2220gagcccccga tttagagctt gacggggaaa gccggcgaac gtggcgagaa aggaagggaa 2280gaaagcgaaa ggagcgggcg ctagggcgct ggcaagtgta gcggtcacgc tgcgcgtaac 2340caccacaccc gccgcgctta atgcgccgct acagggcgcg tcaggtggca cttttcgggg 2400aaatgtgcgc ggaaccccta tttgtttatt tttctaaata cattcaaata tgtatccgct 2460catgagacaa taaccctgat aaatgcttca ataatattga aaaaggaaga gtcctgaggc 2520ggaaagaacc agctgtggaa tgtgtgtcag ttagggtgtg gaaagtcccc aggctcccca 2580gcaggcagaa gtatgcaaag catgcatctc aattagtcag caaccaggtg tggaaagtcc 2640ccaggctccc cagcaggcag aagtatgcaa agcatgcatc tcaattagtc agcaaccata 2700gtcccgcccc taactccgcc catcccgccc ctaactccgc ccagttccgc ccattctccg 2760ccccatggct gactaatttt ttttatttat gcagaggccg aggccgcctc ggcctctgag 2820ctattccaga agtagtgagg aggctttttt ggaggcctag gcttttgcaa agatcgatca 2880agagacagga tgaggatcgt ttcgcatgat tgaacaagat ggattgcacg caggttctcc 2940ggccgcttgg gtggagaggc tattcggcta tgactgggca caacagacaa tcggctgctc 3000tgatgccgcc gtgttccggc tgtcagcgca ggggcgcccg gttctttttg tcaagaccga 3060cctgtccggt gccctgaatg aactgcaaga cgaggcagcg cggctatcgt ggctggccac 3120gacgggcgtt ccttgcgcag ctgtgctcga cgttgtcact gaagcgggaa gggactggct 3180gctattgggc gaagtgccgg ggcaggatct cctgtcatct caccttgctc ctgccgagaa 3240agtatccatc atggctgatg caatgcggcg gctgcatacg cttgatccgg ctacctgccc 3300attcgaccac caagcgaaac atcgcatcga gcgagcacgt actcggatgg aagccggtct 3360tgtcgatcag gatgatctgg acgaagagca tcaggggctc gcgccagccg aactgttcgc 3420caggctcaag gcgagcatgc ccgacggcga ggatctcgtc gtgacccatg gcgatgcctg 3480cttgccgaat atcatggtgg aaaatggccg cttttctgga ttcatcgact gtggccggct 3540gggtgtggcg gaccgctatc aggacatagc gttggctacc cgtgatattg ctgaagagct 3600tggcggcgaa tgggctgacc gcttcctcgt gctttacggt atcgccgctc ccgattcgca 3660gcgcatcgcc ttctatcgcc ttcttgacga gttcttctga gcgggactct ggggttcgaa 3720atgaccgacc aagcgacgcc caacctgcca tcacgagatt tcgattccac cgccgccttc 3780tatgaaaggt tgggcttcgg aatcgttttc cgggacgccg gctggatgat cctccagcgc 3840ggggatctca tgctggagtt cttcgcccac cctaggggga ggctaactga aacacggaag 3900gagacaatac cggaaggaac ccgcgctatg acggcaataa aaagacagaa taaaacgcac 3960ggtgttgggt cgtttgttca taaacgcggg gttcggtccc agggctggca ctctgtcgat 4020accccaccga gaccccattg gggccaatac gcccgcgttt cttccttttc cccaccccac 4080cccccaagtt cgggtgaagg cccagggctc gcagccaacg tcggggcggc aggccctgcc 4140atagcctcag gttactcata tatactttag attgatttaa aacttcattt ttaatttaaa 4200aggatctagg tgaagatcct ttttgataat ctcatgacca aaatccctta acgtgagttt 4260tcgttccact gagcgtcaga ccccgtagaa aagatcaaag gatcttcttg agatcctttt 4320tttctgcgcg taatctgctg cttgcaaaca aaaaaaccac cgctaccagc ggtggtttgt 4380ttgccggatc aagagctacc aactcttttt ccgaaggtaa ctggcttcag cagagcgcag 4440ataccaaata Ctgtccttct agtgtagccg tagttaggcc accacttcaa gaactctgta 4500gcaccgccta catacctcgc tctgctaatc ctgttaccag tggctgctgc cagtggcgat 4560aagtcgtgtc ttaccgggtt ggactcaaga cgatagttac cggataaggc gcagcggtcg 4620ggctgaacgg ggggttcgtg cacacagccc agcttggagc gaacgaccta caccgaactg 4680agatacctac agcgtgagct atgagaaagc gccacgcttc ccgaagggag aaaggcggac 4740aggtatccgg taagcggcag ggtcggaaca ggagagcgca cgagggagct tccaggggga 4800aacgcctggt atctttatag tcctgtcggg tttcgccacc tctgacttga gcgtcgattt 4860ttgtgatgct cgtcaggggg gcggagccta tggaaaaacg ccagcaacgc ggccttttta 4920cggttcctgg ccttttgctg gccttttgct cacatgttct ttcctgcgtt atcccctgat 4980tctgtggata accgtattac cgccatgcat tagttattaa 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1020tgataaaaca gaatttgcct ggcggcagta gcgcggtggt cccacctgac cccatgccga 1080actcagaagt gaaacgccgt agcgccgatg gtagtgtggg gtctccccat gcgagagtag 1140ggaactgcca ggcatcaaat aaaacgaaag gctcagtcga aagactgggc ctttcgtttt 1200atctgttgtt tgtcggtgaa cgctctcctg agtaggacaa atccgccggg agcggatttg 1260aacgttgcga agcaacggcc cggagggtgg cgggcaggac gcccgccata aactgccagg 1320catcaaatta agcagaaggc catcctgacg gatggccttt ttgcgtttct acaaactctt 1380tttgtttatt tttctaaata cattcaaata tgtatccgct catgagacaa taaccctgat 1440aaatgcttca ataatattga aaaaggaaga gtatgagtat tcaacatttc cgtgtcgccc 1500ttattccctt ttttgcggca ttttgccttc ctgtttttgc tcacccagaa acgctggtga 1560aagtaaaaga tgctgaagat cagttgggtg cacgagtggg ttacatcgaa ctggatctca 1620acagcggtaa gatccttgag agttttcgcc ccgaagaacg ttttccaatg atgagcactt 1680ttaaagttct gctatgtggc gcggtattat cccgtgttga cgccgggcaa gagcaactcg 1740gtcgccgcat acactattct cagaatgact tggttgagta ctcaccagtc acagaaaagc 1800atcttacgga tggcatgaca gtaagagaat tatgcagtgc tgccataacc atgagtgata 1860acactgcggc 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ctaatcctgt taccagtggc tgctgccagt ggcgataagt 2760cgtgtcttac cgggttggac tcaagacgat agttaccgga taaggcgcag cggtcgggct 2820gaacgggggg ttcgtgcaca cagcccagct tggagcgaac gacctacacc gaactgagat 2880acctacagcg tgagctatga gaaagcgcca cgcttcccga agggagaaag gcggacaggt 2940atccggtaag cggcagggtc ggaacaggag agcgcacgag ggagcttcca gggggaaacg 3000cctggtatct ttatagtcct gtcgggtttc gccacctctg acttgagcgt cgatttttgt 3060gatgctcgtc aggggggcgg agcctatgga aaaacgccag caacgcggcc tttttacggt 3120tcctggcctt ttgctggcct tttgctcaca tgttctttcc tgcgttatcc cctgattctg 3180tggataaccg tattaccgcc tttgagtgag ctgataccgc tcgccgcagc cgaacgaccg 3240agcgcagcga gtcagtgagc gaggaagcgg aagagcgcct gatgcggtat tttctcctta 3300cgcatctgtg cggtatttca caccgcatat ggtgcactct cagtacaatc tgctctgatg 3360ccgcatagtt aagccagtat acactccgct atcgctacgt gactgggtca tggctgcgcc 3420ccgacacccg ccaacacccg ctgacgcgcc ctgacgggct tgtctgctcc cggcatccgc 3480ttacagacaa gctgtgaccg tctccgggag ctgcatgtgt cagaggtttt caccgtcatc 3540accgaaacgc gcgaggcagc agatcaattc 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構(gòu)建包括克隆到載體pEGFP-C2多克隆位點(diǎn)的人hlced-6 cDNA<400>7tcgacggtac cgcgggcccg ggatccaccg gatctagata actgatcata atcagccata 60ccacatttgt agaggtttta cttgctttaa aaaacctccc acacctcccc ctgaacctga 120aacataaaat gaatgcaatt gttgttgtta acttgtttat tgcagcttat aatggttaca 180aataaagcaa tagcatcaca aatttcacaa ataaagcatt tttttcactg cattctagtt 240gtggtttgtc caaactcatc aatgtatctt aacgcgtaaa ttgtaagcgt taatattttg 300ttaaaattcg cgttaaattt ttgttaaatc agctcatttt ttaaccaata ggccgaaatc 360ggcaaaatcc cttataaatc aaaagaatag accgagatag ggttgagtgt tgttccagtt 420tggaacaaga gtccactatt aaagaacgtg gactccaacg tcaaagggcg aaaaaccgtc 480tatcagggcg atggcccact acgtgaacca tcaccctaat caagtttttt ggggtcgagg 540tgccgtaaag cactaaatcg gaaccctaaa gggagccccc gatttagagc ttgacgggga 600aagccggcga acgtggcgag aaaggaaggg aagaaagcga aaggagcggg cgctagggcg 660ctggcaagtg tagcggtcac gctgcgcgta accaccacac ccgccgcgct taatgcgccg 720ctacagggcg cgtcaggtgg cacttttcgg ggaaatgtgc gcggaacccc tatttgttta 780tttttctaaa tacattcaaa tatgtatccg ctcatgagac aataaccctg ataaatgctt 840caataatatt gaaaaaggaa gagtcctgag gcggaaagaa ccagctgtgg aatgtgtgtc 900agttagggtg tggaaagtcc ccaggctccc cagcaggcag aagtatgcaa agcatgcatc 960tcaattagtc agcaaccagg tgtggaaagt ccccaggctc cccagcaggc agaagtatgc 1020aaagcatgca tctcaattag tcagcaacca tagtcccgcc cctaactccg cccatcccgc 1080ccctaactcc gcccagttcc gcccattctc cgccccatgg ctgactaatt ttttttattt 1140atgcagaggc cgaggccgcc tcggcctctg agctattcca gaagtagtga ggaggctttt 1200ttggaggcct aggcttttgc aaagatcgat caagagacag gatgaggatc gtttcgcatg 1260attgaacaag atggattgca cgcaggttct ccggccgctt gggtggagag gctattcggc 1320tatgactggg cacaacagac aatcggctgc tctgatgccg ccgtgttccg gctgtcagcg 1380caggggcgcc cggttctttt tgtcaagacc gacctgtccg gtgccctgaa tgaactgcaa 1440gacgaggcag cgcggctatc gtggctggcc acgacgggcg ttccttgcgc agctgtgctc 1500gacgttgtca ctgaagcggg aagggactgg ctgctattgg gcgaagtgcc ggggcaggat 1560ctcctgtcat ctcaccttgc tcctgccgag aaagtatcca tcatggctga tgcaatgcgg 1620cggctgcata cgcttgatcc ggctacctgc ccattcgacc accaagcgaa acatcgcatc 1680gagcgagcac gtactcggat ggaagccggt cttgtcgatc aggatgatct ggacgaagag 1740catcaggggc tcgcgccagc cgaactgttc gccaggctca aggcgagcat gcccgacggc 1800gaggatctcg tcgtgaccca tggcgatgcc tgcttgccga atatcatggt ggaaaatggc 1860cgcttttctg gattcatcga ctgtggccgg ctgggtgtgg cggaccgcta tcaggacata 1920gcgttggcta cccgtgatat tgctgaagag cttggcggcg aatgggctga ccgcttcctc 1980gtgctttacg gtatcgccgc tcccgattcg cagcgcatcg ccttctatcg ccttcttgac 2040gagttcttct gagcgggact ctggggttcg aaatgaccga ccaagcgacg cccaacctgc 2100catcacgaga tttcgattcc accgccgcct tctatgaaag gttgggcttc ggaatcgttt 2160tccgggacgc cggctggatg atcctccagc gcggggatct catgctggag ttcttcgccc 2220accctagggg gaggctaact gaaacacgga aggagacaat accggaagga acccgcgcta 2280tgacggcaat aaaaagacag aataaaacgc acggtgttgg gtcgtttgtt cataaacgcg 2340gggttcggtc ccagggctgg cactctgtcg ataccccacc gagaccccat tggggccaat 2400acgcccgcgt ttcttccttt tccccacccc accccccaag ttcgggtgaa ggcccagggc 2460tcgcagccaa cgtcggggcg gcaggccctg ccatagcctc aggttactca tatatacttt 2520agattgattt 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aattacgggg tcattagttc atagcccata tatggagttc 3420cgcgttacat aacttacggt aaatggcccg cctggctgac cgcccaacga cccccgccca 3480ttgacgtcaa taatgacgta tgttcccata gtaacgccaa tagggacttt ccattgacgt 3540caatgggtgg agtatttacg gtaaactgcc cacttggcag tacatcaagt gtatcatatg 3600ccaagtacgc cccctattga cgtcaatgac ggtaaatggc ccgcctggca ttatgcccag 3660tacatgacct tatgggactt tcctacttgg cagtacatct acgtattagt catcgctatt 3720accatggtga tgcggttttg gcagtacatc aatgggcgtg gatagcggtt tgactcacgg 3780ggatttccaa gtctccaccc cattgacgtc aatgggagtt tgttttggca ccaaaatcaa 3840cgggactttc caaaatgtcg taacaactcc gccccattga cgcaaatggg cggtaggcgt 3900gtacggtggg aggtctatat aagcagagct ggtttagtga accgtcagat ccgctagcgc 3960taccggtcgc caccatggtg agcaagggcg aggagctgtt caccggggtg gtgcccatcc 4020tggtcgagct ggacggcgac gtaaacggcc acaagttcag cgtgtccggc gagggcgagg 4080gcgatgccac ctacggcaag ctgaccctga agttcatctg caccaccggc aagctgcccg 4140tgccctggcc caccctcgtg accaccctga cctacggcgt gcagtgcttc agccgctacc 4200ccgaccacat gaagcagcac gacttcttca 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Lys Asp Lys Thr Cys1 5 10<210>10<211>14<212>蛋白質(zhì)<213>人類<400>10Phe Leu Gly Ser Thr Glu Val Glu Gln Pro Lys Gly Thr Glu1 5 10<210>11<211>15<212>蛋白質(zhì)<213>人類<400>11Thr Arg Asn Gly Thr Gln Pro Pro Pro Val Pro Ser Arg Ser Thr1 5 10 15<210>12<211>37<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述PCR引物<400>12cgcaaggatc cccatgaacc gtgcttttag caggaag 37<210>13<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述PCR引物<400>13gatctactag gtactggag 19<210>14<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述T7引物<400>14taatacgact cactataggg aga23<210>15<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述T3引物<400>15attaaccctc actaaaggga20
權(quán)利要求
1．一種表達(dá)載體，包括編碼人CED-6蛋白的脫氧核苷酸序列，其中人CED-6蛋白包括圖4或圖5的氨基酸序列或其與圖4或圖5的氨基酸序列的差異僅有功能保守性的氨基酸變化的氨基酸序列。
2．權(quán)利要求1的表達(dá)載體，包括圖2或圖3所示的從轉(zhuǎn)錄起始密碼子到轉(zhuǎn)錄終止密碼子的脫氧核苷酸序列。
3．權(quán)利要求1或2的表達(dá)載體，它包括編碼位于所述載體中的報(bào)告基因的脫氧核苷酸序列，結(jié)果是人CED-6蛋白或其功能保守的變體的表達(dá)導(dǎo)致該報(bào)告基因表達(dá)報(bào)告蛋白。
4．權(quán)利要求3的表達(dá)載體，其中報(bào)告基因位于編碼人CED-6蛋白或其功能保守的變體的脫氧核苷酸序列的5’端。
5．權(quán)利要求3的表達(dá)載體，其中報(bào)告基因位于編碼人CED-6蛋白或其功能保守的變體的脫氧核苷酸序列的3’端。
6．權(quán)利要求3到5中任意一項(xiàng)的表達(dá)載體，其中報(bào)告基因編碼綠色熒光蛋白(GFP)。
7．權(quán)利要求4的表達(dá)載體，它為在多克隆位點(diǎn)插入了編碼人CED-6蛋白的脫氧核苷酸序列的pEGFP-C2，其中人CED-6蛋白包括如圖4或圖5所示的氨基酸序列或其功能保守的變體。
8．權(quán)利要求5的表達(dá)載體，它為在多克隆位點(diǎn)插入了編碼人CED-6蛋白的脫氧核苷酸序列的pEGFP-N3，其中人CED-6蛋白包括如圖4或圖5所示的氨基酸序列或其功能保守的變體。
9．權(quán)利要求4或7的表達(dá)載體，其中所述的載體包括圖28的核苷酸序列(pGA3103)。
10．權(quán)利要求5或8的表達(dá)載體，其中所述載體包括圖9的核苷酸序列(pGA3104)。
11．權(quán)利要求1或2的表達(dá)載體，其中所述載體表達(dá)人CED-6蛋白或其功能保守的變體，且在載體的氨基和/或羧基端包括表位標(biāo)記。
12．權(quán)利要求11的表達(dá)載體，其中表位標(biāo)記為HisA。
13．權(quán)利要求11的表達(dá)載體，它為pBAD/HisA，插入有編碼人CED-6蛋白的脫氧核苷酸序列，人CED-6蛋白包括如圖4或圖5所示的氨基酸序列，或其功能保守的變體。
14．權(quán)利要求12的表達(dá)載體，它具有圖17所示的脫氧核苷酸序列(pGA1028)。
15．用權(quán)利要求1到13中任一項(xiàng)的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系。
16．權(quán)利要求15的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系，其中所述細(xì)胞選自成纖維細(xì)胞細(xì)胞系或上皮細(xì)胞細(xì)胞系。
17．權(quán)利要求16的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系，其中所述細(xì)胞系選自COS1,BHK21,L929,CV1,SWISS 3T3,HT144,IMR32,HEPG2,MDCK,MCF7,293,Hela,A549,SW48，或G361。
18．權(quán)利要求15的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系，其中所述細(xì)胞系為初級(jí)細(xì)胞系。
19．權(quán)利要求18的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系，其中所述細(xì)胞系選自人皮膚FIBs，皮膚角質(zhì)細(xì)胞，白細(xì)胞，單核細(xì)胞，淋巴細(xì)胞，樹(shù)突細(xì)胞或巨噬細(xì)胞。
20．權(quán)利要求19的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系，它為鼠巨噬細(xì)胞系J774或人單核細(xì)胞細(xì)胞系THP-1。
21．一種方法，該方法用于確定一種化合物是否是促進(jìn)凋亡細(xì)胞吞噬的信號(hào)傳導(dǎo)通路的抑制劑或增強(qiáng)劑，該方法包括將權(quán)利要求15到20中任意一項(xiàng)的轉(zhuǎn)化的哺乳動(dòng)物細(xì)胞暴露給凋亡顆粒，并測(cè)定在化合物存在或缺乏時(shí)，顆粒被轉(zhuǎn)染細(xì)胞吞噬的速率。
22．權(quán)利要求21的方法，其中在加入凋亡顆粒前將轉(zhuǎn)染的細(xì)胞暴露給化合物。
23．權(quán)利要求21或22的方法，其中凋亡顆粒選自凋亡嗜中性細(xì)胞，凋亡淋巴細(xì)胞或視需要而定經(jīng)過(guò)調(diào)理的紅細(xì)胞。
24．權(quán)利要求21到23中任意一項(xiàng)的方法，其中凋亡顆粒包括貼壁細(xì)胞系PC12。
25．權(quán)利要求21到23中任意一項(xiàng)的方法，其中凋亡顆粒包括生長(zhǎng)因子依賴性的小鼠細(xì)胞系Ba/F3。
26．權(quán)利要求25的方法，其中Ba/F3細(xì)胞通過(guò)在缺乏生長(zhǎng)因子IL-3時(shí)培養(yǎng)以發(fā)生凋亡。
27．權(quán)利要求23到26中任意一項(xiàng)的方法，其中包括凋亡顆粒的細(xì)胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了報(bào)告基因。
28．權(quán)利要求27的方法，其中報(bào)告基因選自編碼β-半乳糖苷酶的基因，編碼熒光蛋白的基因或編碼能夠產(chǎn)生熒光的蛋白的基因。
29．權(quán)利要求28的方法，其中能發(fā)光的蛋白為熒光素酶。
30．權(quán)利要求28的方法，其中所述的熒光蛋白為綠色熒光蛋白。
31．權(quán)利要求26的方法，其中凋亡顆粒包括穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了β-半乳糖苷酶或熒光素酶的Ba/F3細(xì)胞。
32．權(quán)利要求26的方法，其中吞噬作用的水平通過(guò)添加一種能夠被β-半乳糖苷酶轉(zhuǎn)化為熒光化合物的底物進(jìn)行檢測(cè)的。
33．權(quán)利要求21到32中任意一項(xiàng)的方法，其中如果在暴露給待測(cè)化合物時(shí)，沒(méi)有觀察到吞噬作用或吞噬的量減少，應(yīng)檢測(cè)哺乳動(dòng)物轉(zhuǎn)染細(xì)胞的活力。
34．權(quán)利要求33的方法，其中如果細(xì)胞有活力，將哺乳動(dòng)物轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的表型與相同細(xì)胞系的未轉(zhuǎn)染的哺乳動(dòng)物細(xì)胞表型相比。
35．權(quán)利要求21到32中任意一項(xiàng)的方法，其中如果在待測(cè)化合物存在時(shí)，觀察到吞噬的量的增加，該方法包括進(jìn)一步將所述的化合物暴露給未轉(zhuǎn)染的相同細(xì)胞系的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，并觀察化合物是否誘導(dǎo)與轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞表現(xiàn)的表型相同的表型。
36．通過(guò)權(quán)利要求21到35任意一項(xiàng)的方法鑒定的化合物，它被鑒定為促進(jìn)凋亡細(xì)胞吞噬的信號(hào)傳導(dǎo)通路的抑制劑或增強(qiáng)劑。
37．一種方法，該方法用于確定一種化合物是否為促進(jìn)凋亡細(xì)胞吞噬的信號(hào)傳導(dǎo)通路的抑制劑或增強(qiáng)劑，該方法包括以下步驟(1)向哺乳動(dòng)物細(xì)胞顯微注射包括圖4或圖5的氨基酸序列或其與圖4或圖5的氨基酸序列的差異僅有功能保守性的氨基酸變化的氨基酸序列的人CED-6蛋白；(2)將步驟(1)產(chǎn)生的哺乳動(dòng)物細(xì)胞暴露給凋亡顆粒并測(cè)定顆粒被細(xì)胞在化合物存在或缺乏時(shí)吞噬的速率。
38．權(quán)利要求37的方法，其中顯微注射的哺乳動(dòng)物細(xì)胞在加入凋亡顆粒前被暴露給化合物。
39．權(quán)利要求38的方法，其中凋亡顆粒選自凋亡嗜中性細(xì)胞，凋亡淋巴細(xì)胞或視需要而定經(jīng)調(diào)理的凋亡紅細(xì)胞。
40．權(quán)利要求37或38中的方法，其中凋亡顆粒包括貼壁細(xì)胞系PC12。
41．權(quán)利要求37到39中任意一項(xiàng)的方法，其中凋亡細(xì)胞包括生長(zhǎng)因子依賴的小鼠細(xì)胞系Ba/F3。
42．權(quán)利要求41的方法，其中Ba/F3細(xì)胞通過(guò)在生長(zhǎng)因子IL-3缺乏時(shí)培養(yǎng)產(chǎn)生凋亡。
43．權(quán)利要求39到42中任意一項(xiàng)的方法，其中包括凋亡顆粒的細(xì)胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了報(bào)告基因。
44．權(quán)利要求27的方法，其中報(bào)告基因選自編碼β-半乳糖苷酶的基因，編碼熒光蛋白的基因或編碼能發(fā)光的蛋白的基因。
45．權(quán)利要求44的方法，其中所述的蛋白能產(chǎn)生的熒光為熒光素酶。
46．權(quán)利要求44的方法，其中熒光蛋白是綠色熒光蛋白。
47．權(quán)利要求42的方法，其中凋亡顆粒包括穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了β-半乳糖苷酶的Ba/F3細(xì)胞。
48．權(quán)利要求47的方法，其中吞噬作用的水平通過(guò)加入能夠被β-半乳糖苷酶轉(zhuǎn)換化熒光化合物的底物進(jìn)行探測(cè)。
49．權(quán)利要求37到48中任意一項(xiàng)的方法，其中哺乳動(dòng)物細(xì)胞是成纖維細(xì)胞或上皮細(xì)胞。
50．權(quán)利要求49的方法，其中哺乳動(dòng)物細(xì)胞選自COS1,BHK21,L929,CV1,SWISS 3T3,HT144,IMR32,HEPG2,MDCK,MCF7,293,Hela,A549,SW48或G361。
51．權(quán)利要求37到48中任意一項(xiàng)的方法，其中哺乳動(dòng)物細(xì)胞為一種初級(jí)細(xì)胞。
52．權(quán)利要求51的方法，其中所述的哺乳動(dòng)物細(xì)胞選自人皮膚FIBs，皮膚角質(zhì)細(xì)胞，白細(xì)胞，單核細(xì)胞，淋巴細(xì)胞，樹(shù)突細(xì)胞或巨噬細(xì)胞。
53．權(quán)利要求52的方法，其中哺乳動(dòng)物細(xì)胞是小鼠巨噬細(xì)胞J774或人單核細(xì)胞THP-1。
54．權(quán)利要求37到53中任意一項(xiàng)的方法，如果在暴露給待測(cè)化合物時(shí)，沒(méi)有觀察到吞噬作用或吞噬的量減少，應(yīng)檢測(cè)哺乳動(dòng)物轉(zhuǎn)染細(xì)胞的活力。
55．權(quán)利要求54的方法，其中如果細(xì)胞有活力，將哺乳動(dòng)物轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的表型與相同細(xì)胞系的未轉(zhuǎn)染的哺乳動(dòng)物細(xì)胞表型相比。
56．權(quán)利要求21到32中任意一項(xiàng)的方法，其中如果在待測(cè)化和物存在時(shí)，觀察到吞噬的量的增加，該方法包括進(jìn)一步暴露化合物給未轉(zhuǎn)染的相同細(xì)胞系的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，并觀察化合物是否誘導(dǎo)與轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞表現(xiàn)的表型相同的表型。
57．通過(guò)權(quán)利要求37到56任意一項(xiàng)的方法鑒定的化合物，它被鑒定為促進(jìn)凋亡細(xì)胞吞噬的信號(hào)傳導(dǎo)通路的抑制劑或增強(qiáng)劑。
58．一種方法，該方法用于確定一種化合物是否為促進(jìn)凋亡細(xì)胞吞噬的信號(hào)傳導(dǎo)通路的抑制劑或增強(qiáng)劑，該方法包括以下步驟(1)向哺乳動(dòng)物細(xì)胞顯微注射或轉(zhuǎn)染一種載體，該載體表達(dá)與如圖2或圖3所示的核苷酸序列的所有或一部分反義的RNA序列；(2)向凋亡顆粒暴露步驟1制備的哺乳動(dòng)物細(xì)胞并測(cè)量當(dāng)化合物存在或缺失時(shí)顆粒被細(xì)胞吞噬的速率。
59．權(quán)利要求58的方法，其中反義RNA包括在高于2×SSC；0.1％SDS；25℃-50℃嚴(yán)格條件下能與圖2或圖3的所示的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。
60．權(quán)利要求58或59的方法，包括權(quán)利要求38到56任意一項(xiàng)的特征。
61．通過(guò)權(quán)利要求58到60任意一項(xiàng)的方法確定的化合物，其中的方法可以確定所述化合物是否是促進(jìn)凋亡細(xì)胞吞噬的信號(hào)傳導(dǎo)通路的抑制劑或增強(qiáng)劑。
62．一種肽，它包括具有如圖4的氨基酸序列的人CED-6同源物的片段，其中所述片段包括氨基酸序列NRAFSRKKDKTC,FLGSTEVEQPKGTE或TRNGTQPPPVPSRST。
63．權(quán)利要求62的肽，由氨基酸序列NRAFSRKKDKTC,FLGSTEVEQPKGET或TRNGTQPPPVPSRST組成。
64．一種抗體制備物，它包括抗下列如圖4的人CED-6同源物的一或更多表位的抗體NRAFSRKKDKTC,FLGSTEVEQPKGTE或TRNGTQPPPVPSRST。
65．一種抗體制備物，包括抗人CED-6同源物表位NRAFSRKKDKTC的抗體。
66．一種抗體制備物，包括抗人CED-6同源物表位FLGSTEVEQPKGTE的抗體。
67．一種抗體制備物，包括抗人CED-6同源物表位TRNGTQPPPVPSRST的抗體。
68．權(quán)利要求63到66中任意一項(xiàng)的抗體制備物，其中所述抗體為多克隆抗體。
69．一種方法，用于診斷與個(gè)體吞噬細(xì)胞中人CED-6蛋白的過(guò)表達(dá)或低表達(dá)相關(guān)的疾病，包括(a)從所述個(gè)體獲得吞噬細(xì)胞樣品；(b)向權(quán)利要求64到68中任意一項(xiàng)的抗體制備物暴露吞噬細(xì)胞；(c)定量測(cè)定在抗體和所述CED-6蛋白之間形成的任意的免疫復(fù)合物的存在；(d)與來(lái)自對(duì)照個(gè)體的吞噬細(xì)胞比較形成免疫復(fù)合物的量。
70．一種方法，用于確定一種化合物是否是促進(jìn)凋亡細(xì)胞吞噬的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的抑制劑或增強(qiáng)劑，包括(a)向檢測(cè)的化合物暴露轉(zhuǎn)染了權(quán)利要求1到14中任意一項(xiàng)的表達(dá)載體的轉(zhuǎn)染的哺乳動(dòng)物細(xì)胞；(b)向哺乳動(dòng)物細(xì)胞暴露權(quán)利要求64到68中任意一項(xiàng)的抗體制備物；(c)定量測(cè)量抗體和所述細(xì)胞表達(dá)的蛋白之間形成的免疫復(fù)合物的存在；(d)將檢測(cè)的免疫復(fù)合物量與未暴露給化合物的如步驟(a)轉(zhuǎn)染的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中檢測(cè)的免疫復(fù)合物的量的水平進(jìn)行比較。
71．權(quán)利要求70的方法，其中哺乳送物細(xì)胞選自COS1,BHK21,L929,CU1 SWISS 3T3,HT144,IMR32,HEPG2,MDCK,MCF7,293,Hela,A549,SW48或G361。
72．權(quán)利要求71的方法，其中哺乳動(dòng)物細(xì)胞是COS1細(xì)胞。
73．權(quán)利要求70的方法，其中哺乳動(dòng)物細(xì)胞是人皮膚FIB，皮膚角質(zhì)細(xì)胞，白細(xì)胞，單核細(xì)胞或巨噬細(xì)胞。
74．權(quán)利要求73的方法，其中所述細(xì)胞是小鼠單核細(xì)胞J774或人單核細(xì)胞THP-1。
75．一種融合蛋白，包括(1)一種圖4或圖5的氨基酸序列或其與圖4或圖5的序列的差異僅僅有功能保守型的氨基酸變化的氨基酸序列；和(2)一種為報(bào)告基因的表達(dá)產(chǎn)物的蛋白。
76．權(quán)利要求75的融合蛋白，它由表達(dá)GFP和圖9或28所示的h1ced-7編碼序列而獲得。
77．一種融合蛋白，包括(1)一種如圖4或圖5的氨基酸序列或其與圖4或圖5的氨基酸序列的差異僅在功能保守性上發(fā)生氨基酸變化的序列，和(2)一種表位標(biāo)記。
78．權(quán)利要求77的融合蛋白，它通過(guò)表達(dá)HisA和圖17所示的hlced-6編碼序列而獲得。
79．一種方法，該方法用于確定一種化合物是否是促進(jìn)凋亡細(xì)胞吞噬的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的抑制劑或增強(qiáng)劑，該方法包括(a)在待測(cè)化合物存在或缺乏時(shí)，向凋亡的哺乳動(dòng)物細(xì)胞暴露哺乳動(dòng)物專業(yè)性或半專業(yè)性吞噬細(xì)胞，該凋亡的哺乳動(dòng)物細(xì)胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了能夠產(chǎn)生無(wú)需顯微鏡探測(cè)的信號(hào)的報(bào)告基因，(b)移除未被所述吞噬細(xì)胞吞噬的凋亡細(xì)胞(c)探測(cè)任何來(lái)自吞噬細(xì)胞的信號(hào)；其中在化合物存在時(shí)與化合物缺乏時(shí)相比任何信號(hào)的差異說(shuō)明該化合物是凋亡細(xì)胞吞噬作用的抑制劑或增強(qiáng)劑。
80．權(quán)利要求79的方法，其中吞噬細(xì)胞是小鼠細(xì)胞系J774或人單核細(xì)胞系THP-1。
81．權(quán)利要求80的方法，其中單核細(xì)胞系經(jīng)培養(yǎng)使之在暴露給凋亡顆粒前分化為巨噬細(xì)胞。
82．權(quán)利要求79到81中任意一項(xiàng)的方法，其中吞噬細(xì)胞是轉(zhuǎn)基因細(xì)胞。
83．權(quán)利要求82的方法，其中吞噬細(xì)胞用權(quán)利要求1到14的任意一項(xiàng)的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染。
84．權(quán)利要求82的方法，其中吞噬細(xì)胞用編碼細(xì)胞表面受體CD36的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染。
85．權(quán)利要求84的方法，其中吞噬細(xì)胞用圖31的載體轉(zhuǎn)染。
86．權(quán)利要求79到85的方法，其中凋亡細(xì)胞包括貼壁細(xì)胞PC12。
87．權(quán)利要求79到85的方法，其中凋亡細(xì)胞包括生長(zhǎng)因子依賴的小鼠細(xì)胞系Ba/F3。
88．權(quán)利要求26的方法，其中Ba/F3細(xì)胞在生長(zhǎng)因子IL-3缺乏條件下培養(yǎng)時(shí)發(fā)生凋亡。
89．權(quán)利要求88的方法，其中在約20％膜聯(lián)蛋白陽(yáng)性且少于5％碘化丙啶陰性時(shí)，細(xì)胞被認(rèn)為是凋亡。
90．權(quán)利要求79的方法，其中報(bào)告基因選自編碼β-半乳糖苷酶的基因，編碼熒光蛋白的基因或編碼能夠產(chǎn)生熒光的蛋白的基因。
91．權(quán)利要求90的方法，其中能夠產(chǎn)生熒光的蛋白是熒光素酶。
92．權(quán)利要求91的方法，其中凋亡細(xì)胞被穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了表現(xiàn)圖19的PGL2對(duì)照的表達(dá)特性的質(zhì)粒。
93．權(quán)利要求92的方法，其中凋亡細(xì)胞被穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了包括圖19的脫氧核糖核苷酸序列的質(zhì)粒。
94．權(quán)利要求79-89中任意一項(xiàng)的方法，其中熒光蛋白是綠色熒光蛋白(GFP)。
95．權(quán)利要求94的方法，其中凋亡細(xì)胞被穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了表現(xiàn)表達(dá)特性的質(zhì)?；蛉鐖D10或29的質(zhì)粒。
96．權(quán)利要求95的方法，其中所述的凋亡細(xì)胞被穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了包括圖9或28的脫氧核糖核苷酸序列的質(zhì)粒。
97．權(quán)利要求79-89中任意一項(xiàng)的方法，其中凋亡細(xì)胞被穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了表達(dá)β-半乳糖苷酶的質(zhì)粒。
98．權(quán)利要求97的方法，其中所述質(zhì)粒具有圖11所示的質(zhì)粒的表達(dá)特性。
99．權(quán)利要求98的方法，其中所述質(zhì)粒包括圖11所示的脫氧核糖核苷酸序列。
100．權(quán)利要求79-89中任意一項(xiàng)的方法，其中凋亡顆粒包括穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了β-半乳糖苷酶的細(xì)胞系Ba/F3。
101．權(quán)利要求100的方法，其中吞噬的水平通過(guò)加入一種能夠被β-半乳糖苷酶轉(zhuǎn)換為熒光化合物的底物而被檢測(cè)。
102．權(quán)利要求79-101中任意一項(xiàng)的方法，其中如果在暴露給待測(cè)化合物時(shí)，未觀察到吞噬作用或吞噬的量減少，應(yīng)檢測(cè)哺乳動(dòng)物轉(zhuǎn)染細(xì)胞的活力。
103．權(quán)利要求79-102中任意一項(xiàng)的方法，其中吞噬細(xì)胞在多孔板中培養(yǎng)，向其中每個(gè)孔加入凋亡細(xì)胞和待測(cè)化合物。
104．前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中來(lái)自報(bào)告基因的信號(hào)通過(guò)自動(dòng)平板讀數(shù)儀檢測(cè)。
105．權(quán)利要求101的方法，其中來(lái)自報(bào)告基因的信號(hào)通過(guò)能檢測(cè)熒光信號(hào)的自動(dòng)平板讀數(shù)儀檢測(cè)。
106．一種化合物，經(jīng)過(guò)權(quán)利要求79-105中任意一項(xiàng)的方法鑒定為凋亡細(xì)胞吞噬的抑制劑或增強(qiáng)劑。
107．權(quán)利要求22-35,39-56,58-60中任意一項(xiàng)的方法，其中吞噬通過(guò)非顯微鏡方式測(cè)量。
108．權(quán)利要求107的方法，其中非顯微鏡方式為多孔平板讀數(shù)儀。
109．權(quán)利要求108的方法，其中多孔平板讀數(shù)儀測(cè)量發(fā)光，熒光或進(jìn)行分光光度檢測(cè)。
110．權(quán)利要求79-105中任意一項(xiàng)的方法，具有權(quán)利要求108和109的特點(diǎn)。
111．一種方法，用于診斷與個(gè)體中吞噬細(xì)胞的人CED-6過(guò)表達(dá)或低表達(dá)相關(guān)的疾病，包括(a)從所述個(gè)體中獲得吞噬細(xì)胞樣品，(b)從吞噬細(xì)胞分離RNA，(c)從RNA制備DNA(d)在所述cDNA上進(jìn)行第一次PCR反應(yīng)，(e)在所述第一次PCR反應(yīng)的反應(yīng)產(chǎn)物上進(jìn)行第二次(嵌套式)PCR，(f)通過(guò)分析第1次和第2次PCR的反應(yīng)產(chǎn)物，定量和定性測(cè)量CED-6RNA的存在，(g)與來(lái)自對(duì)照個(gè)體的吞噬細(xì)胞形成的反應(yīng)產(chǎn)物比較在第1次和第2次PCR形成的反應(yīng)產(chǎn)物的量和類型。
112．權(quán)利要求111的方法，其中PCR使用從人CED-6的序列衍生的引物，或從cDNA產(chǎn)生時(shí)使用的載體衍生的引物。
113．權(quán)利要求111或112的方法，其中第1次PCR使用的引物具有核苷酸序列1)cgcaaggatccccatgaaccgtgcttttagcaggaag2)gatctactaggtactggag
114．權(quán)利要求111,112或113的方法，其中第2次PCR使用的引物具有核苷酸序列1)cgcaaggatccccatgaaccgtgcttttagcaggaag2)gcggatggtaccgtcgactgctgatacttgagttattctcag。
全文摘要
本發(fā)明提供分析方法,該方法用于檢測(cè)一種化合物是否是促進(jìn)吞噬凋亡細(xì)胞的信號(hào)傳導(dǎo)通路的的促進(jìn)物或抑制劑。此方法包括將吞噬細(xì)胞暴露給視需要而定,轉(zhuǎn)染有報(bào)告基因的凋亡細(xì)胞,在待測(cè)化合物存在或缺失時(shí)測(cè)量吞噬的程度。使用表達(dá)載體轉(zhuǎn)染DNA序列到哺乳動(dòng)物細(xì)胞中,該DNA序列表達(dá)時(shí)影響凋亡細(xì)胞被吞噬的速率,DNA序列例如線蟲(chóng)C.elegansced－6基因。
文檔編號(hào)C07K16/18GK1305525SQ99807222
公開(kāi)日2001年7月25日 申請(qǐng)日期1999年6月10日 優(yōu)先權(quán)日1998年6月11日
發(fā)明者E·斯米茨, W·M·R·范克里金格, T·A·O·E·波格爾特 申請(qǐng)人:德福根有限公司