專利名稱：在控制氨水平條件下的棒酸發(fā)酵的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及用產棒酸的微生物發(fā)酵生產棒酸的領域。
一個特殊的實例是β-內酰胺酶抑制劑棒酸的生產，棒酸為β-內酰胺化合物，可由屬于鏈霉菌屬的各種微生物菌株產生，例如帶小棒鏈霉菌(S.clavuligerus)ATCC 27064、S.jumonjinensis(英國專利號1563103)、片村濱鏈霉菌(S.katsurahamanus)IFO 13716 FERM3944(日本專利號83009679B)和鏈霉菌屬種(Streptomyces sp.)P6621 FERM 2804(日本專利申請?zhí)?5162993A)。
鏈霉菌屬的次級代謝有各種調節(jié)方式。這些調控方式可能包括碳分解代謝物、銨鹽或磷酸鹽的阻抑或任何其它種類能阻抑目的次級代謝物的代謝物。碳分解代謝物和銨可以抑制帶小棒鏈霉菌中頭孢菌素的產生(Aharonowitz和Demain 1978和1979)，氮分解代謝產物可以調節(jié)生二素鏈霉菌(S.Ambofaciens)產生螺旋霉素(Untrau 1994)，而磷酸鹽、銨鹽和谷氨酸鹽可以抑制帶小棒鏈霉菌產生棒酸(Romero等1984)。氧濃度可影響銨鹽和磷酸鹽調節(jié)帶小棒鏈霉菌合成抗生素的能力(Fang & Demain,1995)。涉及到在各種鏈霉菌屬中產生頭霉素的各種調控類型在Omstead等(1985)的文獻中有描述。已發(fā)現(xiàn)，高濃度的銨可抑制團片鏈霉菌(S.Flocculus)中鏈黑霉素的生物合成(Wallace等1990)。相似的氨的對銨和磷酸鹽對帶小棒鏈霉菌的頭孢菌素產生的調節(jié)的負面影響已被Aharonowitz和Demain(1979)所描述。此外，因為帶小棒鏈霉菌為脲酶陽性菌株，其中脲酶可被NH4Cl抑制(參照Bascaran等(1989)的2478頁)，在產生棒酸的過程中已產生了ureum(Elson,1993)，當保持低濃度的銨時，據說帶小棒鏈霉菌產生棒酸的量特別高(WO96/18743)。
但是，同專利申請?zhí)枮閃O96/18743中描述的相反，發(fā)現(xiàn)當維持銨濃度在一優(yōu)化的、大約最低為50mg/l的較高濃度范圍時，鏈霉菌屬中棒酸的產量有令人吃驚的大量增加。當應用該濃度范圍銨時，棒酸的產量有超過20％的增加。
在任何以前的文獻中均沒有這樣的描述或提示通過應用最低為50mg/l的銨濃度，從而獲得令人吃驚的高棒酸產量。
根據本發(fā)明，銨濃度維持在等于或高于50mg/l。另一方面，為了減輕對次級代謝的抑制和避免銨的毒性，銨的濃度應足夠的低。例如，銨的濃度可維持在低于2500mg/l，優(yōu)選低于1000mg/l，例如500mg/l。
用于產生棒酸的微生物可以是任何鏈霉菌，任選地通過經典菌株改進或重組DNA技術而來的在生長和/或棒酸產量方面有改進的，例如帶小棒鏈霉菌或S.jumonjinensis。
可通過在一合適的培養(yǎng)基中發(fā)酵鏈霉菌來產生棒酸，該培養(yǎng)基包含各種碳和能量來源像糖類如葡萄糖、果糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、或多糖如淀粉、麥芽糖糊精和菊粉或其他果糖聚合體、蛋白如來自堅果、蔬菜、種子、谷類、草類諸如發(fā)酵工業(yè)中有用的草類的粉；大豆粉、亞麻籽粉、花生粉、馬鈴薯粉、向日葵、豌豆或豆類粉、棉籽粉、麥麩、全麥、大米粉、或來自動物源稱做蛋白胨的蛋白、或來自微生物的蛋白如酵母抽提物、甘油三酯如大豆油、向日葵油、橄欖油、三-油酸酯等、(聚-)醇類如乙醇、丙醇、甘油、山梨醇、或有機酸或有機酸鹽如乙酸鹽、丙酸鹽、琥珀酸鹽、己二酸鹽、丙二酸鹽、延胡索酸鹽、檸檬酸鹽、乳酸鹽、葡萄糖酸鹽等、和氮源如銨鹽、銨、尿素、硝酸鹽、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、賴氨酸和從復合來源而來如來自微生物(酵母抽提物)或植物(玉米浸出液、大豆粉、棉籽粉等)和動物(蛋白胨)的蛋白產品。磷可以以無機鹽形式提供，或以磷蛋白形式如酪蛋白，或在很多種植物蛋白源如大豆粉中同肌醇結合成肌醇六磷酸鹽形式，或在酵母抽提物中結合成核苷酸形式。
此外，維生素和各種無機陰離子如硫酸根離子、磷酸根離子、氯離子、硼酸根離子、鉬酸根離子、碘酸根離子和無機陽離子如鉀離子、鈉離子、鋅離子、錳離子、鎂離子、鐵離子、銅離子、鈷離子、鎳離子也可以加入到發(fā)酵培養(yǎng)基中。
可從預培養(yǎng)物或接種物發(fā)酵按主發(fā)酵培養(yǎng)基1-50％的體積接種，優(yōu)選5-20％，開始發(fā)酵。該過程可持續(xù)24-400小時，優(yōu)選48-168小時。溫度保持在20-40℃，特別25-35℃，更特別25-30℃。pH值應通過滴定優(yōu)選維持在6-8，更優(yōu)選6.5-7.5，滴定物是堿性物質如氨、氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化鈣或有機堿如賴氨酸、精氨酸和組氨酸或這些堿性物質的組合，和酸性物質如無機酸如硫酸、鹽酸、磷酸和硝酸?；蛘?，也可使用有機酸如谷氨酸、檸檬酸、葡萄糖酸或乙酸。
在過程中，通過變化一個或多個下述參數(shù)，可以將溶氧濃度優(yōu)選地控制在優(yōu)化的范圍之內入口氣的氧濃度、使用超壓、攪拌速率或氣流的改變。該范圍可在0-100％氣體飽和度之內變化。
通過增加經過發(fā)酵罐的氣流，使二氧化碳應保持在非毒性濃度，因此出氣口的二氧化碳濃度低于5％，更優(yōu)選少于2.5％。
發(fā)酵可以以批、補料分批或連續(xù)發(fā)酵過程的模式進行。
該過程也可以將各種非生長限制的營養(yǎng)成分控制在優(yōu)化的濃度而進行。根據所選擇限制生長的營養(yǎng)成分，這些生長非限制的營養(yǎng)成分可以包括任何相關的碳、氮、磷或硫源，或可以包含氧。
當然，本發(fā)明發(fā)酵過程中所形成的不純棒酸溶液的回收，以及隨后用本領域所知的方法將其轉換為藥物學上可用鹽的過程，的確也是本發(fā)明的一個方面。其中最有利的程序之一是通過加入相應的氨基(amino)鹽形成化合物例如N,N,N’,N’-四甲基乙二胺，1,3-雙(二甲基氨基)-2-丙醇，t-丁胺，t-辛胺，二苯甲基胺和雙(2-(二甲基胺基)乙基)醚，使不純的棒酸變?yōu)榘被}，并使該胺棒酸鹽同藥物學上可接受的非毒性鹽如乙基己酸鉀反應形成相應的純鹽，例如棒酸鉀。
下述的實施例僅僅用于說明本發(fā)明。參考文獻Strohl W.R.，工業(yè)抗生素生物技術(Biotechnology of IndustrialAntibiotics),Marcel Dekker Inc.,1-48頁(1997)。Aharonowitz Y.和Demain A.L.，抗微生物制劑和化學治療(Antimicrobial Agents and Chemotherapy)Vol.14,No.2,159-164頁(1978)。Aharonowitz Y.和Demain A.L.，加拿大微生物學雜志(Can.J.Microbiol.)25,61-67(1979)。Aharonowitz Y.和Friedrich C.G.，微生物學文獻(Arch.Microbiol.)125,137-142(1980)。Elson S.W.,Baggaley K.H.,Davidson M.,Fulston M.,NickolsonN.H.,Risbridger,G.D．和Tyler,J.W.，化學協(xié)會和化學交流雜志(J.Chem.Soc.,Chem.Commun.)1213(1993)。Butterworth，工業(yè)抗生素生物技術(Biotechnology of IndustrialAntibiotics),Marcel Dekker Inc.,225-235頁(1984)。Romero J.Liras P.和Martin J.F.，應用微生物生物技術(Appl.Microbiol.Biotechnol.)20,318-325(1984)。Omstead D.R.,Hunt G.R.和Buckland B.C.in ComprehensiveBiotechnology Pergamon Press,Vol.3,Harvey W.Blanch,StephenDrew和Daniel I.C.Wang編，187-210頁(1985)。Brana A.F.,Paiva N.和Demain A.L.，普通微生物學雜志(J.Of Gen.Microbiol.)132,1305-1317(1986)。Brana A.F.,Wolfe S.和Demain A.L.，微生物學文獻(Arch.Microbiol.)146,46-51(1986)。Bascaran V.,Hardisson C.和Brana A.F.，普通微生物學雜志(J.Of Gen.Microbiol.)135,2465-2474(1989)。Bascaran V.,Hardisson C.和Brana A.F.，普通微生物學雜志(J.Of Gen.Microbiol.)135,2475-2482(1989)。Wallace K.K.,Payne G.F.和Speedie M.K.，工業(yè)微生物學雜志(J.Of Industrial Microbiology),6,43-48(1990)。Untrau S.,Lebrihi A.,Lefebvre G.和Germain P.，當代微生物學(Curr.Microbiol.)28(1994)。Kasarenini S.和Demain A.L.，工業(yè)微生物學雜志(J.OfIndustrial Microbiology),13,217-219(1994)。Fang A.和Demain A.L.，工業(yè)微生物學雜志(J.Of IndustrialMicrobiology),15,407-410(1995)。
將1ml的凍存菌絲體接種到100ml的滅菌(121℃,30分鐘)預培養(yǎng)培養(yǎng)基中，其中含有5-20g/l的麥芽糖.1aq,15-30g/l細菌用胰蛋白胨，1-10g/l細菌用豆胨，磷酸二氫鉀(1-5g/l)和0.2g/l的合成除沫劑。
在27℃培養(yǎng)72小時之后，將100ml的培養(yǎng)物轉移到接種發(fā)酵罐，其中有70l的經蒸氣滅菌的培養(yǎng)基，pH值為7.0，含有甘油(20-25g/l)、大豆粉(20-40g/l)、酪蛋白水解物(10-15g/l)、磷酸二氫鉀(2-5g/l)、合適的痕量元素混合物和合成抗泡沫劑(1g/l)。接種發(fā)酵罐在26-30℃再培養(yǎng)72小時，如果需要，可通過增加氣流、攪拌和反壓來保持溶氧濃度高于25％的氣飽和度。
用壓力將9l的接種物肉湯接種到將含有1501培養(yǎng)基的主發(fā)酵罐，該培養(yǎng)基接種前經蒸氣滅菌。該培養(yǎng)基含有甘油(50-100g/l)、大豆粉(5-20g/l)、酪蛋白水解物(10-50g/l)、磷酸二氫鉀(0.5-2g/l)、合適的痕量元素混合物和合成除沫劑(0.2-2g/l)。
用NaOH和硫酸滴定使pH值維持在7+/-0.25，而通過發(fā)酵罐的夾套泵入冷水使溫度保持在26-29℃。如果需要，可通過增加氣流、反壓和攪拌子速率來保持溶氧濃度高于25％的氣飽和度。
在控制銨的發(fā)酵中，將0.58g/l的硫酸銨加入到滅菌后的主發(fā)酵培養(yǎng)基，用含12g/l NH3的硫酸鹽滅菌稀釋溶液加料入銨到發(fā)酵罐。通過每2小時脫線測定銨濃度，調節(jié)流量使銨濃度到達預期濃度范圍。當在肉湯中的銨濃度高于500mg/l時，加入堿性滴定劑升高pH值0.2單位，以降低銨濃度的水平。
從表1中我們可以看出，當銨濃度控制在高于50mg/l時，在兩個獨立的運行系列中，棒酸的產量增加均超過25％。在對照發(fā)酵實驗中，銨濃度低于50mg/l持續(xù)35小時；在接種后5-40小時之間。經過這段時間后，由于棒酸的產生，銨濃度也升高。
表1．在300l規(guī)模的棒酸發(fā)酵中，控制銨水平和不控制銨水平實驗的結果
權利要求
1．一種在含有碳源和氮源的合適培養(yǎng)基中，通過產棒酸的微生物發(fā)酵生產棒酸的方法，其中在該產棒酸的微生物發(fā)酵過程中，銨濃度維持在大約等于或高于50mg/l。
2．根據權利要求1的方法，其中銨的濃度維持在大約等于或高于75mg/l。
3．根據權利要求2的方法，其中銨的濃度維持在大約等于或高于100mg/l。
4．根據權利要求1、2或3中的任一項的方法，其中銨濃度是通過應用下述一或兩個措施調控的銨加入速率的調節(jié)或加入一或多個滴定劑的調節(jié)。
5．根據權利要求4的方法，其中銨濃度的調節(jié)是通過加入硫酸銨或尿素。
6．根據權利要求4的方法，其中銨濃度的調節(jié)是通過加入一或多個滴定劑，這些滴定劑選自氨和氫氧化銨，同硫酸或任選地氫氧鈉組合。
7．根據權利要求1-6中任一項的方法，特征在于pH值維持在6.5-7.5。
8．根據權利要求1-7中任一項的方法，其中發(fā)酵是以補料分批，連續(xù)或半連續(xù)方式進行。
9．一種純化棒酸的方法，其中從根據權利要求1-8中的任何一種方法產生的發(fā)酵液中分離不純棒酸，且然后純化。
10．根據權利要求9的方法，且通過加入相應的胺鹽形成化合物，使不純的棒酸變?yōu)榘符}，和使該胺棒酸鹽同非毒性的藥物學上可接受的鹽反應形成棒酸相應的純化的鹽而轉化為其非毒性的可藥用鹽。
全文摘要
提供了在控制氨水平在至少50mg/l的條件下,用產棒酸的微生物發(fā)酵生產棒酸的方法。當應用這些反應條件時,可以獲得令人吃驚的高產量棒酸。
文檔編號C07D503/00GK1320166SQ99811511
公開日2001年10月31日 申請日期1999年9月23日 優(yōu)先權日1998年9月29日
發(fā)明者G·維瑟－魯伊林克, W·T·A·M·迪拉特, J·M·克洛普 申請人:Dsm公司