專利名稱：硅(iv)化合物及其它金屬(iv)化合物的酶合成和修飾及降解的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及重組silicatein-β或從天然來源中分離的silicatein-β及silicatein-β融合蛋白和silicatein-β相關(guān)酶在二氧化硅(硅酸，硅酸鹽的縮合產(chǎn)物)、硅酮和其它硅(IV)或金屬(IV)化合物的合成、降解及修飾中的用途，及其技術(shù)應(yīng)用。
1.技術(shù)領(lǐng)域硅化合物，例如硅酸鹽和硅酮(硅氧烷)是工業(yè)和醫(yī)藥中廣泛使用的材料，以及從經(jīng)濟(jì)觀點(diǎn)考慮也具有重要性。許多諸如光學(xué)和微電子儀器的高科技產(chǎn)品和催化劑都包含或由硅酸鹽或硅酮化合物組成。
設(shè)計(jì)為四面體型的硅酸鹽陰離子([SiO4]4-；單體)趨向于通過SiO4單位的連接來聚合，由此每兩個(gè)Si原子通過O原子來互相連接。因此，從原硅酸中通過脫去水(縮合)產(chǎn)生第一個(gè)原二硅酸(焦硅酸，H6Si2O7)。通過聚硅酸的進(jìn)一步縮合產(chǎn)生偏硅酸[(H2SiO3)n]。在較少量SiO4單位的情況下(n＝3，4or 6)，也可形成環(huán)形分子。隨著縮合進(jìn)一步進(jìn)行，從首先得到的鏈或網(wǎng)中產(chǎn)生與組合物SiO2相應(yīng)的三維結(jié)構(gòu)(參見CDRmpp Chemistry lexicon-1.0版本，斯圖加特/紐約Georg ThiemeVerlag 1995)。
(聚合)二氧化硅(SiO2)可以以晶體和無定形的形式存在。其中，石英、鱗石英以及方石英是屬于不同形式的晶體SiO2。除了其它的以外，無定形二氧化硅礦物還包括瑪瑙、蛋白石以及燧石。通過生物礦化產(chǎn)生的許多骨骼結(jié)構(gòu)由無定形SiO2(又名硅石)組成，例如硅質(zhì)藻類(硅藻)的殼以及硅質(zhì)海綿的針(骨針)。在所有這些SiO2形式中，硅具有配位數(shù)4，且四面體型被四個(gè)氧原子圍繞。
通過使用不參與所述縮合過程的單鍵有機(jī)殘基部分替換硅酸中OH-基團(tuán)，可以產(chǎn)生不同的硅酮(硅氧烷)。它們可以分為線性的、支鏈的以及環(huán)狀聚硅氧烷，以及交聯(lián)聚合物(將鏈狀或環(huán)狀分子連接成二維或三維網(wǎng))。
鏈狀形態(tài)的硅酮(硅油)的粘度隨著鏈的長度的增加而增加。低度交聯(lián)的硅酮顯示出天然橡膠彈性(硅酮天然橡膠)，高度交聯(lián)的鏈類似于樹脂(硅酮樹脂)。
本發(fā)明涉及重組silicatein-β或從天然來源中分離的silicatein-β及silicatein-β-融合蛋白在無定形或晶體二氧化硅(硅酸和硅酸鹽)、硅氧烷的合成和降解以及這些化合物的修飾中的用途，及其技術(shù)應(yīng)用。
本發(fā)明還涉及重組silicatein-β或從天然來源中分離的silicatein-β及silicatein-β-融合蛋白在鑒別這些由酶催化的過程的活化劑或抑制劑中的應(yīng)用。
1.1硅質(zhì)海綿中的生物-礦化(生物源性二氧化硅的形成)硅酸鹽的技術(shù)合成需要?jiǎng)×业臈l件，例如高壓及高溫。相反，硅質(zhì)海綿-例如硅質(zhì)藻類-能夠利用特異性酶，在溫和條件下，即在相對(duì)低溫及低壓下，形成硅酸鹽質(zhì)支架。
所述硅質(zhì)海綿的骨架的主要成分是針形的骨針，在尋常海綿(demosponges)(horn sponges(角海綿))及六放海綿綱(玻璃海綿)的種群中，該骨針由無定形非晶體二氧化硅構(gòu)成。
關(guān)于所述骨針的形態(tài)學(xué)及生源論的現(xiàn)有知識(shí)的評(píng)論參見Uriz等人(2003)Progr Molec Subcell Biol 33163-193；Müller等人(2003)ProgrMolec Subcell Biol 33195-221。海綿-骨針中的蛋白石二氧化硅包含6-13％水，因此大概的分子式為(SiO2)2-5·H2O(參見Schwab & Shore(1971)Nature 232501-502)。在尋常海綿中，骨針的形成圍繞軸絲開始，硅石在該軸絲周圍由酶沉積。
描述了在形成硅酸鹽的有機(jī)體中的SiO2-骨架的合成和/或降解中，兩種所涉及的酶及其技術(shù)應(yīng)用。
一種酶是silicatein-α(簡單命名為silicatein)，另一種是產(chǎn)生軸絲的蛋白，該軸絲填充海綿-骨針(針狀)的軸向槽。(參見PCT/US99/30601。Methods，compositions，and biomimetic catalysts，such as silicateins andblock co-polypeptides，used to catalyze and spatially direct thepolycondensation of silicon alkoxides，metal alkoxides，and their organicconjugates to make silica，polysiloxanes，polymetallo-oxanes，and mixedpoly(silicon/metallo)oxane materials under environmentally benignconditions.(方法，組合物及仿生催化劑，例如silicatein及封閉共聚多肽，用于在環(huán)境友好條件下催化及空間上指導(dǎo)硅醇鹽、金屬醇鹽及其有機(jī)共軛體的縮聚，以產(chǎn)生硅石、聚硅氧烷、聚金屬-環(huán)氧乙烷及混合的聚(硅/金屬)環(huán)氧乙烷材料。)發(fā)明人/申請(qǐng)人Morse DE，Stucky GD，Deming，TD，Cha J，Shimizu K，Zhou Y；DE 10037270 A1.(Silicatein-介導(dǎo)的無定形硅酸鹽和硅氧烷的合成及其應(yīng)用。)Silicatein-mediatedsynthesis of amorphous silicates and siloxanes and their use.德國專利局2000。申請(qǐng)人及發(fā)明人Müller WEG，Lorenz B，Krasko A，Schrder HC；PCT/EP01/08423.Silicatein-mediated synthesis of amorphous silicatesand siloxanes and use thereof.(Silicatein-介導(dǎo)的無定形硅酸鹽和硅氧烷的合成及其應(yīng)用)申請(qǐng)人及發(fā)明人Müller WEG，Lorenz B，Krasko A，Schrder HC)。此酶是從海產(chǎn)硅質(zhì)海綿Suberites domuncula中被克隆(參見Krasko A，Batel R，Schrder HC，Müller IM，Müller WEG(2000)expression of silicatein and collagen genes in the marine sponge S.domuncula is controlled by silicate and myotrophin.(silicatein及膠原基因在海產(chǎn)海綿S.domuncula的表達(dá)是由硅酸鹽和重組胰島素樣生長因子1(myotrophin)來調(diào)控)Europ J Biochem 2674878-4887)。Silicatein能夠從有機(jī)硅化合物(烷氧基硅烷)中合成無定形二氧化硅(聚硅酸和聚硅酸鹽)(參見Cha JN，Shimizu K，Zhou Y，Christianssen SC，Chmelka BF，Stucky GD，Morse DE(1999)Silicatein filaments and subunits from amarine sponge direct the polymerization of silica and silicones in vitro.(來自海產(chǎn)海綿的Silicatein絲和亞基指導(dǎo)硅石和硅酮的體外聚合。)Proc Natl Acad Sci USA 96361-365)。
第二種酶是silicase，其屬于碳脫水酶類(參見DE 102 46 186.4號(hào)。Degradation and modification of silicates and silicones throughsilicase and use ofthe reversible enzyme.(通過silicase及可逆酶的使用，降解和修飾硅酸鹽和硅酮。)德國專利局2002。申請(qǐng)人及發(fā)明人MüllerWE G，Krasko A，Schrder HC)。此酶最初在海產(chǎn)海綿S.domuncula中發(fā)現(xiàn)，其主要與生物源性硅石的降解有關(guān)(參見Schrder HC，Krasko A，Le Pennec G，Adell T，Wiens M，Hassanein H，Müller IM，Müller WEG(2003)Silicase，an enzyme which degrades biogenous amorphous silicaContribution to the metabolism of silica deposition in the demospongeSuberites domuncula.(Silicase，降解生物源的無定形硅石的酶有利于在尋常海綿地中海寄居蟹皮海綿中硅石沉積的新陳代謝。)Progr MolecSubcell Biol，33，250-268)，但是也可在可逆反應(yīng)中合成硅石。
2.發(fā)明內(nèi)容令人驚訝的是發(fā)明人發(fā)現(xiàn)-首先在海產(chǎn)海綿S.domuncula中-在形成硅的有機(jī)體的細(xì)胞中，不僅發(fā)現(xiàn)一種合成硅的酶(silicatein-α)，而且發(fā)現(xiàn)另外的形成硅的酶。因此，本發(fā)明所述的silicatein-β的特征在于其在催化能力和技術(shù)/醫(yī)學(xué)應(yīng)用方面的特別有利的性能，這些性能不能由技術(shù)人員從現(xiàn)有技術(shù)和類似的結(jié)論中獲得。
這些有利性能基于a)不同的底物特異性b)不同的動(dòng)力學(xué)c)不同的結(jié)合常數(shù)d)不同的穩(wěn)定性。
應(yīng)用PCR方法(見下文)從S.domuncula中分離編碼所述silicatein-β多肽的cDNA。也可從其它諸如Geodia cydonium的海綿體中分離相關(guān)的cDNAs。
此外，本發(fā)明的新穎之處在于，通過增加培養(yǎng)基中的硅濃度(通常到60μM硅酸鹽或其它硅化合物，該硅化合物的水解導(dǎo)致相似的硅酸鹽濃度)，所述silicatein-β-基因可在動(dòng)物(海綿體)或從中獲得的細(xì)胞/細(xì)胞團(tuán)中被誘導(dǎo)。特別有利的是(實(shí)現(xiàn)甚至更強(qiáng)的誘導(dǎo)作用)，如果除硅之外，在該培養(yǎng)基中還存在增加的離子濃度(高鐵離子或高鐵鹽或絡(luò)合物，例如檸檬酸鐵(+++)鹽)。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了通常用于體外或體內(nèi)合成二氧化硅(硅酸或硅酸鹽的縮合產(chǎn)物)、硅酮和其它硅(IV)或金屬(IV)化合物和這些化合物的混合-聚合物的方法，其中多肽或多肽的金屬配合物用于降解，特征在于該多肽包含動(dòng)物、細(xì)菌、植物或真菌的水解酶(silicatein-β)結(jié)構(gòu)域，其與SEQ ID No.1中所述序列具有至少25％的序列相似性(見

圖1)。目前未知以及從現(xiàn)有技術(shù)中還未意識(shí)到，除silicatein-α之外，其它的酶，如這里描述的silicatein-β能產(chǎn)生硅酸鹽或硅酮。由于這些過程的可逆性，本發(fā)明另一方面涉及降解無定形二氧化硅(硅酸或硅酸鹽的縮合產(chǎn)物)、硅酮和其它硅(IV)或金屬(IV)化合物及這些化合物的混合-聚合物的方法，其中多肽或多肽的金屬配合物用于合成，特征在于該多肽包含動(dòng)物、細(xì)菌、植物或真菌的水解酶(silicatein或組織蛋白酶)結(jié)構(gòu)域，其與SEQ ID No.1中所述序列具有至少25％的序列相似性(見圖1)。
本發(fā)明所用方法，其特征在于化合物，例如硅酸、單烷氧基硅三醇、單烷氧基硅二醇、單烷氧基硅醇、二烷氧基硅二醇、二烷氧基硅醇、三烷氧基硅醇、四烷氧基硅烷、烷基-、芳基-或金屬-硅三醇、烷基-、芳基-或金屬-硅二醇、烷基-、芳基-或金屬-硅醇、烷基-、芳基-或金屬-單烷氧基硅二醇、烷基-、芳基-或金屬-單烷氧基硅醇、烷基-、芳基-或金屬-二烷氧基硅醇、烷基-、芳基-或金屬-三烷氧基硅烷、或其它金屬(IV)化合物用作所述合成的反應(yīng)物(底物)。通過使用所述化合物的確定混合物，其中可隨意選擇所述底物的比例，可產(chǎn)生確定組合物的混合-聚合物。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，可通過以所述多肽或多肽的金屬配合物、或者多肽或多肽的金屬配合物與其它分子或玻璃、金屬、金屬氧化物、塑料、生物聚合物或其它材料的表面的結(jié)合為模板來形成確定的二維和三維結(jié)構(gòu)。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了修飾包含硅酸或硅(IV)-或金屬(IV)化合物的結(jié)構(gòu)或表面的方法，其中多肽或多肽的金屬配合物用于該修飾作用，其特征在于該多肽包含動(dòng)物、細(xì)菌、植物或真菌水解酶(silicatein或組織蛋白酶)結(jié)構(gòu)域，其具與SEQ ID No.1中所述序列有至少25％的序列相似性。優(yōu)選地，包含硅酸的結(jié)構(gòu)或表面以寶石或半寶石的形式存在。
使用本發(fā)明所述方法，其中所述修飾類同于拋光、輕微蝕刻，或包括由所述多肽或多肽的金屬配合物產(chǎn)生所述結(jié)構(gòu)或表面的鉆孔或凹口，該結(jié)構(gòu)或表面包含硅酸或硅(IV)-或金屬(IV)化合物。
本發(fā)明的另一方面涉及利用本發(fā)明方法獲得的化合物或包含硅酸的結(jié)構(gòu)或表面，，特別是以寶石或半寶石的形式獲得。
本發(fā)明的另一方面也涉及按SEQ ID No.1記載的、來自Suberitesdomuncula的水解酶(silicatein-β)的多肽，或者其同源多肽，所述多肽的金屬配合物或其部分，該同源多肽在水解酶(silicatein-β)結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列中顯示與描述于SEQ ID No.1中的序列有至少25％的序列相似性。
本發(fā)明另一方面涉及核酸，特別是SEQ ID No.2的核酸，其特征在于其基本上編碼本發(fā)明的多肽。本發(fā)明所述核酸可以DNA，cDNA，RNA或其混合物的形式存在，其特征在于該核酸的序列具有至少一個(gè)內(nèi)含子和/或聚A序列。本發(fā)明另一方面涉及本發(fā)明的以其互補(bǔ)“反義”序列形式存在的核酸。
本發(fā)明的另一方面還涉及本發(fā)明的核酸，其具有(a)融合蛋白(嵌合蛋白)構(gòu)建體、(b)含有分離蛋白-表達(dá)的構(gòu)建體(蛋白酶裂解位點(diǎn))或(c)具有分離蛋白-表達(dá)的構(gòu)建體(表達(dá)盒)的形式。本發(fā)明所述核酸可合成產(chǎn)生。用于此目的的方法是本領(lǐng)域所公知的。
本發(fā)明另一方面涉及載體，優(yōu)選為質(zhì)粒、穿梭載體、噬粒、粘粒、表達(dá)載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載體或粒子、納米微粒或脂質(zhì)體的形式，其中所述載體包含本發(fā)明的核酸。此外，可提供用于蛋白質(zhì)傳遞的載體，優(yōu)選為包含本發(fā)明所述多肽的納米微?；蛑|(zhì)體形式。
本發(fā)明另一方面，提供宿主細(xì)胞，該宿主細(xì)胞用載體轉(zhuǎn)染或感染或用本發(fā)明的粒子轉(zhuǎn)導(dǎo)。該宿主細(xì)胞的特征是其表達(dá)了權(quán)利要求1所述的多肽、該多肽的金屬配合物或其部分。適合的宿主細(xì)胞為公知的宿主細(xì)胞-有機(jī)體，例如酵母、真菌、海綿、細(xì)菌、CHO細(xì)胞或昆蟲細(xì)胞。
本發(fā)明所述的多肽，除自然形式之外，還包括合成產(chǎn)生的或所述多肽或多肽的金屬配合物存在于原核或真核細(xì)胞提取物或裂解產(chǎn)物中。該細(xì)胞提取物或該裂解產(chǎn)物可得自離體的或ex vitro細(xì)胞，例如重組的細(xì)菌細(xì)胞或海產(chǎn)海綿。
根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)水平中公知的常規(guī)方法純化本發(fā)明所述的多肽，因此該多肽基本上不與其它肽共同存在。
于是，本發(fā)明另一方面還涉及用于鑒定按SEQ ID No.1記載的、來自Suberites domuncula的水解酶(silicatein-β)的多肽或其同源多肽的抑制劑或活化劑的方法，在該水解酶(silicatein-β)結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列中，該同源多肽顯示與SEQ ID No.1中所述序列有至少25％的序列相似性，其中a)提供了按SEQ ID No.1記載的、來自Suberites domuncula的水解酶(silicatein-β)的多肽、或其同源的多肽，在該水解酶(silicatein-β)域的氨基酸序列中，該同源多肽顯示與SEQ ID No.1中所述序列有至少25％的序列相似性，b)將來自步驟a)的多肽與潛在的抑制劑或活化劑接觸，以及c)測(cè)定該多肽的合成或降解硅酸鹽或硅酮的能力。利用這些方法，可檢測(cè)有價(jià)值的物質(zhì)，在某些情況下這些物質(zhì)可適合作治療劑(關(guān)于此，見下文)。用于鑒定這樣的物質(zhì)的方法是技術(shù)人員所公知的，以及例如包括采用放射性標(biāo)記或酶標(biāo)記的候選化合物。用于測(cè)定所述水解酶(silicatein-β)的活性的方法如下文所述，并可容易地由技術(shù)人員使其適應(yīng)于特定的分析模式。因此，抑制劑基本上完全減少所述酶的活性，活化劑誘導(dǎo)活性或在基線水平上增強(qiáng)活性。
根據(jù)備選的方法，按SEQ ID No.1記載的、來自Suberitesdomuncula的水解酶(silicatein-β)的所述多肽或其同源多肽，可以以體內(nèi)、原核或真核細(xì)胞提取物或裂解產(chǎn)物或純化的形式提供，以用于分析，在該水解酶(silicatein-β)結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列中，該同源多肽顯示與SEQ ID No.1中所述序列有至少25％的序列相似性。
本發(fā)明另一方面還涉及用于產(chǎn)生藥物組合物的方法，該方法包括a)根據(jù)權(quán)利要求24或25鑒定抑制劑或活化劑，以及b)將所鑒定的抑制劑或活化劑與藥物可接受的載體或輔助劑混合。利用該組合物，所提供的諸如本發(fā)明所述多肽或核酸的有價(jià)值的藥物可用于矽肺的預(yù)防或治療。此外，本發(fā)明所述多肽或核酸或藥物組合物可用于硅酮和硅酮-植入物的吸收或吸收性的調(diào)節(jié)。最后，本發(fā)明也可利用本發(fā)明所述核酸轉(zhuǎn)染細(xì)胞，用于硅酮和硅酮植入物的吸收或吸收性的調(diào)節(jié)。本發(fā)明的用途和與其有關(guān)的方法是技術(shù)人員所公知的，以及可容易地被調(diào)整以適應(yīng)本發(fā)明所提出的需要和需求。
本發(fā)明現(xiàn)通過以下實(shí)施例來進(jìn)一步闡述，但不限于此。在附圖和序列表中，顯示了在下文中，列出了附圖和序列表的圖解說明。其顯示SEQ ID No.1來自S.domuncula的本發(fā)明的硅石代謝silicatein-β多肽的氨基酸序列(rSILICAβ_SUBDO)。
SEQ ID No.2來自S.domuncula.的本發(fā)明的硅石代謝silicatein-β多肽的cDNA核酸序列。
圖1來自S.domuncula.的本發(fā)明的硅石代謝silicatein-β多肽的cDNA核酸序列。衍生于開放閱讀框架的核酸序列的氨基酸序列標(biāo)示在核酸序列下方。
圖2顯示了來自S.domuncula(SILICAaSUBDO[數(shù)據(jù)庫登記號(hào)CAC03737.1]，和SILICAbSUBDO[AJ519940])和T.aurantium(SILICAaTETHYA[AAC23951.1]；SILICAbTETHYA[AF098670])的海綿-silicatein-序列silicatein-α和silicatein-β的比較(“序列比對(duì)”)。該序列中保守殘基(其物理-化學(xué)特性是相似的或相關(guān)的)以黑底白字顯示，以及至少兩個(gè)序列中那些相同的以灰底黑字顯示。在該silicatein-序列內(nèi)特征性位置表示為Ser(●)、His(■)和Asn(■)，將酶原轉(zhuǎn)化為成熟酶的加工部位表示為(}{)和絲氨酸簇([Ser])。
圖3
海綿silicatein與原口動(dòng)物的組織蛋白酶L-序列(黑腹果蠅(D.melanogaster)[果蠅屬(DROSOPHILA)]BAA06738；秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditis elegans)[新桿狀線蟲(CAENORHABDITIS)]NP 507199；豐年蝦(Artemia franciscana)[鹵蟲(ARTEMIA)]AAD39513)、后口動(dòng)物的組織蛋白酶L-序列(斑馬魚(Danio rerio)[鮐DANIO]AAN32912.1；人類(Homo sapiens)[人(HUMAN)]X12451)、以及來自S.domuncula的海綿序列([皮海綿(SUBERITES)]；AJ272013)和來自G.榅桲子(G.Cydonium)的海綿序列([GEODIA]；Y10527)的種系發(fā)生關(guān)系。為了顯示組織蛋白酶和silicateins的聚類，該樹保持“無根狀”(無外部種群“根”)。在分枝上的數(shù)字表明該分枝的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(1000對(duì)應(yīng)100％顯著性)。該標(biāo)尺表示所謂的“進(jìn)化距離”，其中該標(biāo)尺的長度對(duì)應(yīng)所述序列內(nèi)每一位置上的0.1氨基酸取代的距離z。
圖4在轉(zhuǎn)移到補(bǔ)加硅酸鹽/Fe(+++)的人造海水中后，S.Domuncula的組織中silicatein的表達(dá)量。RNA或者在添加硅酸鹽/Fe(+++)后立即被提取(第零天)，或者兩和六天后，進(jìn)行RNA印跡分析。
圖5海綿組織中silicatein陽性細(xì)胞的檢測(cè)。(A)從保持在無硅酸鹽/Fe(+++)的海水中的海綿產(chǎn)生冷凍切片，并與DIG標(biāo)記的SDSILICAβ反義DNA雜交。隨后，該樣品用抗洋地黃毒苷/堿性磷酸酯酶進(jìn)行孵育，并用NBT/X-磷酸鹽檢測(cè)信號(hào)。在含有硅酸鹽/Fe(+++)的海水中保持2天(B)、4天(C)或6天(D)的動(dòng)物的切片分析。顯示了在中質(zhì)(m)內(nèi)的含水系統(tǒng)的通路(c)。該通路由扁平細(xì)胞形成的上皮層來定界限。放大倍率×50。
編碼silicatein-β的基因的克隆從cDNA庫中分離編碼S.domuncula的silicatein-β的cDNA(圖1)。對(duì)于silicatein-β，直到現(xiàn)在，僅知該酶是骨針(海綿針)的軸絲的蛋白組分，但是未發(fā)現(xiàn)其參與二氧化硅骨針的酶形成。
silicatein-β的cDNA的分離，例如從S.domuncula中的分離，按以下方式進(jìn)行。對(duì)于同源性篩選，使用來自S.domuncula的Silicatein-α的洋地黃毒苷-11-dUTP標(biāo)記的DNA探針(“DIG random primed DNA labelingkit”(DIG隨機(jī)的引物DNA標(biāo)記試劑盒)；羅氏公司)；公開了該cDNA的序列(數(shù)據(jù)庫登記號(hào)AJ272013；Krasko等人(2000)Europ J Biochem2674878-4887)。如文章所述(參見Kruse等人(1997)Mol Biol Evol141326-1334)，在用于“plaque lifts”的“低嚴(yán)緊”雜交條件下實(shí)施S.domuncula-cDNA-庫的篩選。以BCIP/NBT為底物，利用堿性磷酸酯酶連接的抗洋地黃毒苷抗體鑒定陽性克隆(參見Blake等人(1984)AnalBiochem 13675-179)。通過RNA印跡法，確定是否獲得SDSILICAβ的全序列?？衫肈NA自動(dòng)測(cè)序儀(Li-Cor 4000S)完成該DNA序列測(cè)定。
對(duì)來自海產(chǎn)海綿S.domuncula的silicatein-β多肽進(jìn)行編碼的cDNA和源于所述核酸序列的多肽具有以下特征。該核酸序列包含1372個(gè)殘基，具有從nt122-124至nt1271-1273(終止密碼子)的開放閱讀框架(圖1)。衍生的具有383個(gè)殘基的silicatein-β的氨基酸序列表示具有42,068大小的多肽(圖1和圖2)。
所述海綿-silicatein-β多肽是組織蛋白酶L亞家族的新成員(參見Shimizu等人(1998)Proc Natl Acad Sci USA 956234-6238；Cha等人(1999)Proc Natl Acad Sci USA 96361-365；Krasko等人(2000)Europ JBiochem 2674878-4887)。所述S.domuncula-Silicatein-β多肽與來自Tethya aurantium的silicatein-α(數(shù)據(jù)庫登記號(hào)AAC23951.1；“期望值”[E；Blast-NCBI；(Coligan等人(2000)蛋白質(zhì)科學(xué)中的流行方案(CurrentProtocols in Protein Science.)John Wiley & Sons，Chichester)]＝7e-58)、來自T.aurantium的silicatein-β(AF098670；E＝4e-57)和來自S.domuncula的silicatein-α(CAC03737.1；E＝2e-56)共享最大的相似性；該S.domuncula silicatein-β還與來自長紅錐蝽(Rhodnius prolixus)的組織蛋白酶L(AF320565；E＝3e-55)略微相關(guān)。所有的四種silicatein序列顯示了特征性的三氨基酸Ser(代替存在于所述組織蛋白酶中的Cys)、His和Asn，該三氨基酸構(gòu)成半胱氨酸蛋白酶的催化三聯(lián)體(參見Shimizu等人(1998)Proc Natl Acad Sci USA 956234-6238；Cha等人(1999)Proc NatlAcad Sci USA 96361-365；Krasko等人(2000)Europ J Biochem2674878-4887)；圖2。作為自體分解或者由第二蛋白酶作用的結(jié)果，形成活性酶所必需的加工位點(diǎn)可根據(jù)Nishimura等人((1988)ArchBiochem Biophys 26164-71)來預(yù)測(cè)。根據(jù)與所述組織蛋白酶的比較，所述海綿-silicatein-β中的切割位點(diǎn)可定位在aa139(圖2)；因此，具有42,068Da Mr的酶原將成熟為具有預(yù)測(cè)的26,205Da Mr的活性酶。同在其它半胱氨酸蛋白酶中一樣，三個(gè)推測(cè)的二硫化物橋也存在于海綿silicatein-β中。
silicatein-β-多肽的種系發(fā)生分析至于所述種系發(fā)生分析(圖3)，將來自S.domuncula(silicatein-α和silicatein-β)和T.aurantium(silicatein-a和silicatein-β)的海綿silicatein、與來自原口動(dòng)物(黑腹果蠅，秀麗隱桿線蟲和豐年蝦)和后口動(dòng)物(人類和斑馬魚)的組織蛋白酶L序列、以及來自S.domuncula和G.Cydonium的組織蛋白酶序列進(jìn)行比較(“序列比對(duì)”)。“無根”樹[無外部種群“根”]顯示組織蛋白酶L序列明顯地與四種silicateins分離。
silicatein-β-多肽的上調(diào)可通過向培養(yǎng)基中加入硅酸鹽和Fe(+++)來上調(diào)silicatein-β-基因的表達(dá)。這可通過整體動(dòng)物、組織、細(xì)胞或細(xì)胞聚集物(例如海綿細(xì)胞團(tuán)(sponge-primmorphs))上的RNA印跡法或蛋白質(zhì)印跡法來示例性顯示。
所述后者細(xì)胞團(tuán)是聚集物，其由增殖和分化細(xì)胞組成，并從個(gè)體海綿細(xì)胞中形成。關(guān)于細(xì)胞團(tuán)-系統(tǒng)，已提交了專利(參見德國專利第19824384號(hào)。Production of primmorphs from dissociated cells fromsponges，corals and further invertebratesCulturing-method of cells fromsponges and further invertebrates for the production and detection vonbioactive substances，for a detection of environmental toxins，and forculturing of these animals in aquaria and outdoor.(從來自海綿、珊瑚和其它無脊椎動(dòng)物的游離細(xì)胞中產(chǎn)生細(xì)胞團(tuán)源于海綿和其它無脊椎動(dòng)物的細(xì)胞的培養(yǎng)方法，以產(chǎn)生和檢測(cè)生物活性物質(zhì)、檢測(cè)環(huán)境毒素和在水族館和野外培養(yǎng)這些動(dòng)物。)發(fā)明人和申請(qǐng)人Müller WEG，BrümmerF)。
在如圖4所示的實(shí)驗(yàn)中，測(cè)定了silicatein-β-基因的表達(dá)量，其響應(yīng)所述培養(yǎng)基中的硅酸鹽和Fe(+++)而強(qiáng)烈地上調(diào)。
為了測(cè)定硅和離子對(duì)所述基因表達(dá)的作用，在人造海水中培養(yǎng)動(dòng)物兩周，該人造海水包含氯化物(19.0g/kg)、鈉(11.0)、鎂(1.3)、硫酸鹽(2.7)、鈣(0.4)、鉀(0.4)和碳酸氫鹽(0.15)。然后，該動(dòng)物轉(zhuǎn)移至含有60μM硅酸鹽(以硅酸鈉的形式)和30μM Fe(+++)的人造海水中RNA印跡法利用TRIzol試劑(Fa.GibcoBRL)從在液氮中磨成粉的動(dòng)物、組織、細(xì)胞和細(xì)胞聚集物中提取RNA。隨后，按照制造商(Amersham公司)的技術(shù)說明書，將5μg量的總RNA在1％甲醛/瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳分離，并印在雜交-N+尼龍-膜(Hybond-N+-nylon-membrane)上。利用cDNA SDSILICAβ進(jìn)行雜交。可使用silicatein-β-探針，例如，該探針從nt676延伸至nt1198，因而跨越了所述衍生多肽中的特征區(qū)域，即富含絲氨酸簇。該簇在所述S.domuncula silicatein-β-多肽中發(fā)現(xiàn)位于aa309-aa329之間；該區(qū)域也顯示了與silicatein-α-多肽的差別?？墒褂茫?，S.domuncula β-微管蛋白cDNA，SDTUB(數(shù)據(jù)庫登記號(hào)AJ550806)為內(nèi)標(biāo)物。根據(jù)“說明書”(羅氏公司)用PCR-DIG-探針-合成試劑盒標(biāo)記該所述探針。在洗滌后，用抗DIG Fab片斷[與堿性磷酸酯酶連接；以1∶10,000稀釋]檢測(cè)該DIG標(biāo)記的核酸，并根據(jù)制造商(羅氏公司)的技術(shù)說明書用CDP通過化學(xué)發(fā)光技術(shù)進(jìn)行觀察。隨后，所述篩選例如可用GS-525分子圖像儀(Bio-Rad公司)進(jìn)行掃描分析。
所述RNA印跡檢查顯示在所述動(dòng)物從不含硅酸鹽//Fe(+++)的海水中轉(zhuǎn)移至含硅酸鹽//Fe(+++)的海水后，轉(zhuǎn)錄物的量強(qiáng)烈地增加(圖4)。利用所述SDTUB(β-微管蛋白)基因進(jìn)行的平行雜交研究顯示在所述凝膠上裝載著同等量的RNA。
根據(jù)這些結(jié)果，可得出在用硅酸鹽//Fe(+++)對(duì)所述動(dòng)物進(jìn)行孵育后，在完整的動(dòng)物體內(nèi)形成silicatein-β陽性細(xì)胞的結(jié)論。
原位定位研究還可利用在原位的雜交監(jiān)測(cè)所述silicatein-β-基因的表達(dá)。為此，在室溫下，將動(dòng)物組織，例如，在硅酸鹽/Fe(+++)培養(yǎng)基中孵育6天后，在含有30mM的乙二胺四乙酸(EDTA)的海水中處理30分鐘。隨后通過沉降獲得所述骨針，并進(jìn)一步處理來進(jìn)行在原位的雜交。
在下文中，采用基于由Polak & McGee描述的操作步驟(參見“原位雜交”(In situ hybridization)0xford University Press，牛津，1998)的方法，有改動(dòng)(參見Le Pennec等人(2003)J Biotechnol 10093-108)。在-30℃時(shí)借助低溫恒溫器來獲得8-μm厚度的冷凍切片。利用多聚甲醛將該冷凍切片進(jìn)行固定，隨后在室溫下用1×PBS洗滌兩次。該切片用蛋白酶K進(jìn)行孵育，接著再用多聚甲醛固定。為了除去所述海綿的顏色，該切片用乙醇，最后用異丙醇進(jìn)行孵育。用1×PBS再水化后，將洋地黃毒苷(DIG)標(biāo)記的DNA探針加入到雜交溶液中。在45℃下于玻璃容器中過夜進(jìn)行該雜交；在50℃下，如 等人所述(參見 等人(2003)Evo & Devo 5240-250)，進(jìn)行隨后的洗滌步驟。在封閉后，該切片，例如，用與堿性磷酸酯酶連接的抗洋地黃毒苷抗體進(jìn)行孵育。為了觀察所述信號(hào)，可使用顯色劑NBT/X-磷酸鹽。
用于原位定位研究的DNA-探針的產(chǎn)生所述原位雜交，例如，可用洋地黃毒苷標(biāo)記的ssDNA探針來實(shí)施。該探針，例如，用所述“PCR DIG探針合成試劑盒”(羅氏公司)來標(biāo)記。根據(jù)所述S.domuncula cDNA-序列設(shè)計(jì)該DNA探針。應(yīng)用線性化的cDNA通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)產(chǎn)生反義的和有義的探針。該反義探針通過使用在5’至3’有義方向的“正向引物”來獲得；互補(bǔ)有義探針通過使用3’至5’方向的反向引物來獲得。SDSILICAβ-探針跨越520bp(nt676至nt1198)長度的開放閱讀框架內(nèi)一片段。所述PCR，例如，借助GeneAmp9600熱循環(huán)儀(Perkin Elmer)來進(jìn)行。以下反應(yīng)條件已證明適用于該P(yáng)CR在95℃時(shí)初始變性進(jìn)行3分鐘，隨后進(jìn)行35次擴(kuò)增循環(huán)，每次擴(kuò)增循環(huán)通過在95℃進(jìn)行30秒、58℃-30秒，74℃-4分鐘來完成，以及在72℃時(shí)最終的延長步驟進(jìn)行20分鐘。例如，可用“DIG寡聚核苷酸標(biāo)記試劑盒”(羅氏公司)來進(jìn)行標(biāo)記。
Silicatein-陽性細(xì)胞在如圖5所示的實(shí)驗(yàn)中，通過使用所述原位雜交研究，顯示在不含有硅酸鹽/Fe(+++)海水中保存的海綿組織中不存在Silicatein-陽性細(xì)胞。有趣地是，利用所述silicatein-探針(B-D)發(fā)現(xiàn)該Silicatein-陽性細(xì)胞首先出現(xiàn)在上皮層(扁平細(xì)胞)，以及僅稍后，在硅酸鹽/Fe(+++)暴露四天后，發(fā)現(xiàn)在中質(zhì)中的細(xì)胞也是陽性的。
3silicatein-β-多肽的產(chǎn)生silicatein-β-多肽可以從組織或細(xì)胞中純化，或者可以重組產(chǎn)生。
3.1.天然來源的silicatein-β-多肽的純化可以從分離的海綿骨針中，便利地完成所述silicatein-β的純化。通過使用這種操作，除了其它的以外，silicatein-β-多肽還可從S.domuncula中進(jìn)行純化。
為此，骨針(由無定形硅酸鹽組成)可以從海綿，例如Suberitesdomuncula中通過在無Ca++-和Mg++的海水中分離組織，以及沉降而得到。該骨針的無定形硅酸鹽在諸如稀氫氧化鈉溶液的堿性環(huán)境中被除去。包含silicatein-β的骨針的有機(jī)原纖維通過離心(例如20,000xg；1小時(shí)；4℃)來獲得。所述蛋白由諸如1M NaCl的高鹽濃度，也可由“蛋白質(zhì)重折疊試劑盒”被帶入溶液中。
隨后，所述silicatein-β在親和基質(zhì)上進(jìn)行純化。由于silicatein-β-特異性抗體固定在固相上(CNBr活化的瓊脂糖或其它適當(dāng)?shù)妮d體)而產(chǎn)生該親和基質(zhì)。作為抗體，使用標(biāo)準(zhǔn)方法所產(chǎn)生抗silicatein-β的單克隆或多克隆抗體(參見Osterman，L.A.“蛋白和核酸研究的方法”(Methods of protein and Nucleic Acid Research)第2卷；Springer-Verlag[柏林]1984)。根據(jù)制造商(醫(yī)藥公司)的技術(shù)說明書，進(jìn)行所述抗體與所述柱基質(zhì)的偶聯(lián)。利用pH的變化或離子強(qiáng)度的改變進(jìn)行純silicatein-β的洗脫。
3.2.重組體silicatein-β-多肽的產(chǎn)生3.2.1.來自海產(chǎn)海綿的cDNA的克隆上文已描述了來自海產(chǎn)海綿S.domuncula的silicatein-β-cDNA的克隆。
所述silicatein-β基因也可利用PCR技術(shù)，使用來自諸如ZapExpress和大腸桿菌XL1-Blue MRF‘的cDNA庫的適合的簡并引物來鑒定；為此，可使用各自的載體特異性引物。所獲得的合成產(chǎn)物用于篩選各自的cDNA庫。然后，所鑒定的克隆在載體(例如，pGem-T)內(nèi)被亞克隆，隨后測(cè)序。
3.2.2.重組silicatein-β-多肽的表達(dá)和分離重組silicatein-β-多肽的產(chǎn)生優(yōu)選地在E.coli中發(fā)生。然而，在酵母和哺乳動(dòng)物細(xì)胞中也可能產(chǎn)生并已成功地完成。為此，所述cDNA被克隆進(jìn)諸如pQE-30的相應(yīng)的載體內(nèi)。轉(zhuǎn)化E.coli后，所述silicatein-β-多肽的表達(dá)通過用IPTG(異丙基-D-硫代半乳糖吡喃糖苷)的誘導(dǎo)作用來完成(參見Ausubel等人(1995)“”Current Protocols inMolecular Biology(分子生物學(xué)的流行方法)John Wiley and Sons，NewYork)。所述silicatein-β-多肽的表達(dá)和例如通過存在于所述重組蛋白中的組氨酸-標(biāo)簽的重組蛋白的純化，在諸如Ni-NTA-基質(zhì)的相應(yīng)的親和柱上進(jìn)行(參見Skorokhod等人(1997)Cell.Mol.Biol.43509-519)。
在以下的實(shí)例中公開了應(yīng)用“GST(谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶)融合”-系統(tǒng)(Amersham公司)，在E.coli中表達(dá)S.domuncula的silicatein-β-基因。在該實(shí)例中，使用僅包含aa48至aa383氨基酸的插入片段(短形式)；也可使用包含衍生的完全蛋白的插入片斷。相應(yīng)的克隆克隆進(jìn)諸如質(zhì)粒pGEX-4T-2的載體，該載體包含日本吸血蟲(Schistosomajaponicum)的GST-基因。已發(fā)現(xiàn)其它表達(dá)載體也是適合的。在E.coli的轉(zhuǎn)化后，所述silicatein-β-多肽的表達(dá)通常由IPTG來誘導(dǎo)并在37℃中進(jìn)行4或6小時(shí)(參見Ausubel FM，Brent R，Kingston RE，Moore DD，Smith JA，Seidmann JG，Struhl K(1995)Current Protocols in MolecularBiology.(分子生物學(xué)的流行方法)John Wiley and Sons，New York)。所獲得的GST-融合蛋白通過，例如谷胱苷肽-瓊脂糖4B上的親合色譜來純化。為了從所述重組海綿-silicatein-β-多肽中分離谷胱苷肽-S-轉(zhuǎn)移酶，用凝血酶(10單位/mg)剪切所述融合蛋白。隨后在2-巰基乙醇的存在下，所述蛋白進(jìn)行凝膠電泳。該凝膠電泳可在含0.1NaDodSO4的10％聚丙烯酰胺凝膠上來完成(聚丙烯酰胺凝膠電泳法；PAGE)。該凝膠用考馬斯亮藍(lán)進(jìn)行染色。在裂解、純化以及后來的PAGE后獲得所述重組蛋白的截短形式。
3.2.3.來自其它有機(jī)體的重組silicatein-β-多肽的表達(dá)和分離對(duì)應(yīng)于上述操作步驟，也可完成來自其它有機(jī)體的，例如來自(產(chǎn)生二氧化硅)六放海綿綱(例如，Rhabdocalyptus dawsoni)的silicatein-β-cDNA的分離，克隆和表達(dá)。
3.3.利用抗體的silicatein-β-多肽的分離和純化繼根據(jù)上述方法之一進(jìn)行提取或部分純化之后，所述silicatein-β-在抗體-親和基質(zhì)上進(jìn)行純化。該操作步驟對(duì)應(yīng)3.1節(jié)中所述的那些操作。(“從天然來源的silicatein-β多肽的純化”)也成功地使用了其它諸如聚合硅酸鹽或共聚物硅酸鹽/鍺酸鹽(germinate)4.silicatein-β-活性的檢測(cè)和硅-烷氧基-化合物的合成在下文中，僅提供了重組海綿silicatein-β-多肽的短形式的活性。
4.1.Silicatein-β-活性
4.1.1.形成聚合物(例如硅石)的活性為了檢測(cè)重組體silicatein-β的酶活性，可使用分析法，該分析法基于在四乙氧基硅烷(TEOS)的水解和隨后的聚合作用后，測(cè)定聚合的和沉淀的硅酸鹽。
所述重組體silicatein-β的酶合成活性的測(cè)定通常如下進(jìn)行。利用適合所述反應(yīng)的緩沖液，例如，50mM MOPS，pH 6.8，將該重組體silicatein-β透析過夜[其它pH為4.5-10.5的緩沖液也適合]。
將1-50μg重組silicatein-β溶解在1ml適當(dāng)?shù)木彌_液中，例如50mM MOPS(pH 6.8)，加入1-4.5mM四乙氧基硅烷溶液。該酶促反應(yīng)可在室溫下進(jìn)行。在60分鐘的孵育期中，通常每100μg silicatein-β合成200nmol的無定形硅酸鹽(作為鉬酸鹽-反應(yīng)性的，可溶的硅酸鹽)。為了檢測(cè)該硅酸鹽產(chǎn)物，該材料在臺(tái)式離心機(jī)中進(jìn)行離心(12000xg；15分鐘；+4℃)，用乙醇洗滌，并空氣干燥。隨后，將所述沉淀物用1MNaOH水解。在得到的溶液中，用諸如硅酮-分析(Merck)的鉬酸鹽支持的檢測(cè)方法對(duì)硅酸鹽進(jìn)行定量測(cè)定。
令人驚訝地，發(fā)現(xiàn)除底物四乙氧基硅烷之外，silicatein-β也聚合另外的硅醇鹽。
以下化合物可用作羧肽酶介導(dǎo)的合成的反應(yīng)物(底物)四烷氧基硅烷、三烷氧基硅醇、二烷氧基硅二醇、單烷氧基硅三醇、二烷氧基硅醇、單烷氧基硅二醇、單烷氧基硅醇、烷基-、芳基-或金屬-三烷氧基硅烷、烷基-、芳基-或金屬-硅醇、烷基-、芳基-或金屬-硅二醇、烷基-、芳基-或金屬-硅三醇、烷基-、芳基-或金屬-單烷氧基硅二醇、烷基-、芳基-或金屬-二烷氧基硅醇、或其它金屬(IV)化合物(鎵(IV)、錫(IV)或鉛(IV)的烷氧化合物)。這些底物的混合物也可為所述酶識(shí)別并聚合。因此，也可產(chǎn)生混合-聚合物。
將諸如四乙氧烷基硅烷的底物在二甲基亞砜中溶解，成為通常為500mM的儲(chǔ)備液，隨后稀釋至所需要的最終濃度。
所述silicatein反應(yīng)也可與硅化學(xué)中公知的其它反應(yīng)結(jié)合，例如氯-甲基甲硅烷的Müller-Rochow-合成、較長鏈硅烷的合成(例如Si8-硅烷)和硅-氮-化合物(例如四氮化三硅，Si3N4)。后者化合物通過硅烷經(jīng)氮或空氣(空氣-氮)的燃燒來產(chǎn)生。較長鏈的硅由熱解產(chǎn)生，例如，在500℃，銅的存在下進(jìn)行。聚甲基硅氧烷的大規(guī)模的技術(shù)合成主要通過Müller-Rochow-方法發(fā)生(催化劑銅；溫度為250-300℃)。這些方法是本領(lǐng)域的現(xiàn)有技術(shù)。較低級(jí)的硅烷非常不穩(wěn)定且極易燃-在劇烈爆炸下-在空氣中或與水接觸時(shí)，而不自燃的較高級(jí)的(較長鏈)硅烷(從正庚硅烷開始)代表有前景的能源(可燃物或燃料)。這些硅烷的燃燒產(chǎn)物是無毒的四氮化三硅(Si3N4)。因?yàn)橛蓅ilicatein催化的酶促反應(yīng)將前體輸送至這些硅烷，這極大促進(jìn)和改進(jìn)了這些硅烷的合成效率和特異性。
作為不限制本專利所要保護(hù)范圍的實(shí)施例，提供以下反應(yīng)方案具有n＞8的Sin鏈長度的短鏈硅烷由生物催化劑silicatein產(chǎn)生。這些短鏈硅烷中的羥基在用氫、釋放氫的還原劑的電誘導(dǎo)水解中，或通過由路易斯酸(Lewis-acids)催化的氫化而被置換。通過適合的方法或通過蒸餾方法從所述反應(yīng)混合物中除去所釋放的水，該適合的方法對(duì)應(yīng)于本領(lǐng)域知識(shí)的用于減少和干燥的方法。所述反應(yīng)方案形式上如下所示(1)(室溫中～中性pH)(2)(除去水并電活化)根據(jù)本發(fā)明，可設(shè)計(jì)兩步法。氫可從水中電化學(xué)地產(chǎn)生。關(guān)于這方面有公知許多方法。與此平行的，在一個(gè)儀器但分開的部分中，具有n≥7的Sin(OH)2n+2寡硅酸鹽在非常溫和的條件下-與本領(lǐng)域現(xiàn)有技術(shù)相反-由本發(fā)明的催化多肽silicatein α和β形成。在隨后的反應(yīng)中用活化的氫新生的除去所述反應(yīng)溶液后，該寡硅酸鹽可經(jīng)氫化轉(zhuǎn)化為寡硅烷，對(duì)應(yīng)的分子式為n≥7的Sin(H)2n+2。因?yàn)槠浠罨瘎?shì)能隨著數(shù)目n的增加而增加，因而從n＝7開始的并對(duì)應(yīng)分子式為Sin(OH)2n+2的硅烷不再自發(fā)地與空氣或水中的氧反應(yīng)，所以該反應(yīng)設(shè)計(jì)是可能的。相反，因?yàn)榈偷幕罨瘎?shì)能，較低級(jí)的硅烷發(fā)生自發(fā)反應(yīng)。
本發(fā)明也促進(jìn)了節(jié)能和環(huán)保方法的引進(jìn)，因?yàn)?，除了其它因素以外，目前所用的氯代硅酸鹽化合物變得不重要。此外，可在非常溫和的反應(yīng)條件實(shí)施全部的反應(yīng)方案。利用本發(fā)明，寡硅酸鹽(oligosilicates)可用作氫源，該氫源可普遍地運(yùn)輸和保存，具有較低的危險(xiǎn)度和低技術(shù)要求。
根據(jù)本發(fā)明，如前所述利用silicateinα和β為催化多肽，可產(chǎn)生n＞2的短鏈寡硅酸鹽。與本領(lǐng)域所用的＞200℃的溫度和常壓以上的壓力相反，在此，50℃以下的溫度和常壓已是足夠的。此外，所述反應(yīng)可在水介質(zhì)中進(jìn)行，這在本領(lǐng)域的知識(shí)水平中是不可能的。這構(gòu)成了對(duì)環(huán)境影響、安全性的實(shí)質(zhì)改善、以及費(fèi)用的減少。在以下反應(yīng)方案中，該寡硅酸鹽形成了許多目前所用的產(chǎn)品基礎(chǔ)，例如硅烷、硅酮或其它有機(jī)硅化合物。
因?yàn)槠淇赡嫘裕缟纤U明的，所述silicatein-反應(yīng)可允許混合-醚-產(chǎn)生(形成Si-O-C鍵)。從這些化合物開始-根據(jù)本領(lǐng)域的知識(shí)-鹵素化合物(例如，含氯)可用其它催化劑來形成，從該鹵素化合物，可在氫氛中獲得不同的硅烷-化合物。
Silicatein，特別地，能合成和降解鍺和鈦化合物，以及也適用于Si-Ti、Si-Ge或Si-Ge-Ti混合結(jié)構(gòu)的產(chǎn)生，該混合物結(jié)構(gòu)對(duì)芯片的生產(chǎn)具有重要性。
4.1.2降解聚合物(例如硅石)的活性(溶解硅石的活性)Silicatein-β也可溶解硅石，特別是如果反應(yīng)在抗壞血酸或其它兒茶酚或含有1，2-聯(lián)苯酚的化合物的存在下發(fā)生。作為silicatein-β的底物，例如，可使用S.domuncula的骨針(無定形二氧化硅)。
在乙二胺四乙酸的存在下(20mM，PBS中；PBS＝磷酸鹽緩沖溶液，包含1.15mM KH2PO4、8.1mM Na2HPO4、137mM NaCl和2.7mMKCl)，所述骨針可通過12小時(shí)的孵育從海綿組織中獲得。用蒸餾水和乙醇(兩次)洗滌后，干燥該骨針(56℃)，然后在乳缽中研磨成粉。
隨后可如下檢測(cè)所述溶解硅石的活性。通常，在2ml Eppendorf-管中，將100μg所干燥的骨針(粉)加入到適合的諸如50mMTris-HCl-緩沖液(pH 7.2；10mM DL-二硫蘇糖醇、100mM NaCl)的緩沖液和0.5mM ZnSO4中。隨后，通常加入50μl所述重組silicatein-β多肽，并在25℃進(jìn)行孵育(該孵育也可在大約5℃-65℃的其它溫度下進(jìn)行)。平均孵育時(shí)間為60分鐘。為了定量檢測(cè)所溶解的二氧化硅，將未溶解的骨針進(jìn)行離心(14000xg；15分鐘；4℃)。所釋放的可溶解的硅酸，例如，可通過使用鉬酸鹽-支持的檢測(cè)法，例如比色“硅測(cè)試”(Merck；1.14794)來定量檢測(cè)。在此情況下，根據(jù)硅標(biāo)準(zhǔn)品的校準(zhǔn)曲線(Merck1.09947)，從810nm處的消光值中計(jì)算硅酸的量。
4.1.3合成硅(IV)化合物的活性所述silicatein-β(但也可以是其它silicateins，例如silicatein-α)的水解烷氧基硅烷活性的可逆性也可用于合成其它硅(IV)化合物或其它金屬(IV)化合物，即由于引入基團(tuán)，優(yōu)選為親核基團(tuán)，所以添加烷氧基硅烷(烷氧基-金屬(IV)-化合物)和包含反應(yīng)混合物的酶。除了諸如四乙氧基硅烷(TEOS)的四烷氧基硅烷之外，還可使用三烷氧基硅烷、二烷氧基硅烷和單烷氧基硅烷以及三烷氧基硅醇、二烷氧基硅二醇、二烷氧基硅醇、單烷氧基硅三醇、單烷氧基硅二醇、單烷氧基硅醇和烷基、芳基或鹵素取代的硅(IV)的烷氧化合物。
所述silicatein-β的合成硅(IV)-化合物活性也可與這些底物或這些底物的混合物或從這些底物中產(chǎn)生的產(chǎn)物的聚合作用結(jié)合，其中可能在同一制備中同時(shí)進(jìn)行所述反應(yīng)。因此，可產(chǎn)生不同的聚合物或混合-聚合物。
4.1.4用于測(cè)定所述silicatein-反應(yīng)的耦合光學(xué)試驗(yàn)提供了用于測(cè)定所述silicatein的酶活性的簡單試驗(yàn)。該試驗(yàn)為用于測(cè)定通過由silicatein介導(dǎo)的酶促反應(yīng)，從底物(烷氧基硅烷和衍生物)中釋放的醇的耦合光學(xué)實(shí)驗(yàn)。為此，需要光度計(jì)(例如Eppendorf光度計(jì)1101M)。使用以下緩沖溶液溶液12mmol/l ABTS(連氮基-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸))緩沖溶液，如下產(chǎn)生步驟a從溶液A(8.16g KH2PO4溶于重蒸餾水中，加至600ml)和溶液B(68.4g K2HPO4溶于重蒸餾水中，加至300ml；＝10倍的制備)中制備0.1M磷酸鈉緩沖液(pH 7.5)，即300ml溶液A與溶液B產(chǎn)生pH 7.5。
步驟b將320ml步驟a中產(chǎn)生的溶液用O2飽和30分鐘；隨后將352mg ABTS溶解于該溶液中(注意ABTS對(duì)光和空氣敏感，不要使用超過1小時(shí)的緩沖液)。
溶液2POD(過氧化物酶，羅氏公司)；10mg蛋白/ml，比活度大約為5U/mg。
溶液3醇氧化酶(Sigma公司)溶液，如下制備步驟a將100mg BSA溶解在0.1M磷酸鈉緩沖液中(pH 7.5)。
步驟b將10mg醇氧化酶凍干物溶解在1ml步驟a中制備的(冷的)BSA-0.1M磷酸鈉緩沖液中。
步驟c將135μl步驟b中制備的醇氧化酶溶液用10ml步驟a中制備的BSA-0.1M磷酸鈉緩沖液稀釋。
H2O25μl H2O2(莫克公司)用重蒸餾水稀釋至50ml。
例如，可將在MOPS緩沖液(100mM NaCl、5mM CaCl2、0.1mMZnSO4，pH 6.8)中的4.5mM四乙氧基(TEOS)用作底物溶液。
所述分析如下實(shí)施移入試管2.8ml緩沖液/ABTS10μl POD50μl AO
然后混合，并隨后加入10μl H2O2再混合，將光度計(jì)歸零(調(diào)至0.1)。然后加入100μl底物溶液或底物溶液中的酶(silicatein)，混合，接著至少消光2分鐘(濾光器405nm)。
不同的醇(例如乙醇)濃度用作陽性對(duì)照并用于校準(zhǔn)曲線。
5.silicatein-β的cDNA與其它蛋白的一個(gè)或多個(gè)cDNA(s)的連接5.1.silicatein-β融合蛋白的產(chǎn)生為了產(chǎn)生與所述silicatein-β-多肽的融合蛋白，使用適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體(例如pQE-30載體，Qiagen)。產(chǎn)生所述silicatein-β-cDNA，該silicatein-β-cDNA的5′-端具有，例如，BamHI-限制性位點(diǎn)以及在3′-端具有，例如，SalI-限制性位點(diǎn)。除去在該silicatein-β-cDNA中的終止密碼子。為此，使用所述PCR技術(shù)，為了擴(kuò)增，使用了具有各自限制性位點(diǎn)的引物。分別獲得第二蛋白的cDNA，其中在5′-端上具有與silicatein-β-cDNA 3′-端上相同的限制性位點(diǎn)(在SalI實(shí)例中)，以及在3′-端上具有一個(gè)不同于其它位點(diǎn)的位點(diǎn)(例如，HindIII-位點(diǎn))。如果內(nèi)部的限制性位點(diǎn)存在于各自的cDNAs中，可使用備選的限制性內(nèi)切酶。另外，也可將街頭引入兩個(gè)cDNAs之間。
根據(jù)常規(guī)方法，可將兩個(gè)cDNAs連接、純化并連接至所述pQE-30-載體內(nèi)。在組氨酸-標(biāo)記后(大約6個(gè)組氨酸-密碼子)發(fā)生所述連接作用。通過，例如，存在于所述重組蛋白中的組氨酸標(biāo)簽，可在相應(yīng)的親和層析柱，例如，Ni-NTA-基質(zhì)上(Skorokhod A，Schcke H，Diehl-Seifert B，Steffen R，Hofmeister A，Müller WEG(1997)Cell MolBiol 43509-519)進(jìn)行所述融合蛋白的表達(dá)和純化。
5.2分離表達(dá)I(蛋白酶-裂解位點(diǎn))作為5.1所述的方法的選擇，可在所述silicatein-β-多肽的cDNA和附加蛋白的cDNA之間克隆蛋白酶-裂解位點(diǎn)(例如，腸激酶位點(diǎn))。在此情況下，可將新起始物-蛋氨酸的密碼子插入在所述附加蛋白的基因的編碼區(qū)之前。表達(dá)和純化后，所述融合蛋白被蛋白水解地切割?，F(xiàn)在，兩種蛋白均分別存在。
5.3分離蛋白II(DNA序列組件表達(dá)(表達(dá)盒))可選擇地，兩種蛋白均可在一個(gè)構(gòu)建體上分別進(jìn)行表達(dá)。為此，在表達(dá)載體中將所述silicatein-β-基因設(shè)在在組氨酸標(biāo)簽(His-tag)之后。在所述silicatein-β-cDNA的末端，插入終止密碼子。在所述silicatein-β-多肽的cDNA和所述附加蛋白的cDNA之間，克隆具有起始物-蛋氨酸的密碼子的核糖體結(jié)合位點(diǎn)。再一次，將組氨酸標(biāo)簽設(shè)在在該附加蛋白的cDNA之前。該基因也得到終止密碼子。
當(dāng)在各自宿主細(xì)胞中所述蛋白用于功能性分析時(shí)，可刪除所述組氨酸標(biāo)記。
5.4.延長細(xì)菌細(xì)胞和真核細(xì)胞可用于5.1-5.3所述的表達(dá)。
5.1-5.3所述的表達(dá)也可用于三個(gè)和多個(gè)開放閱讀框架。
6.silicatein-β-多肽和silicatein-β-融合蛋白的應(yīng)用本發(fā)明的另一方面是如下所述的重組silicatein-β-多肽、從不同來源中純化的silicatein-β以及silicatein-β-融合蛋白的應(yīng)用。構(gòu)成這些用途的基礎(chǔ)的方法可容易地由技術(shù)人員從此處和上文所公開的內(nèi)容、各自的文獻(xiàn)中并利用普遍技術(shù)衍生出。
1)用于生物材料的表面修飾(改進(jìn)生物相容性)。除了其它的以外，表面修飾的生物材料還用于，例如，影響細(xì)胞粘附和生長，改進(jìn)血液-相容性或控制蛋白質(zhì)吸附(例如，減少隱形眼鏡的吸附)。文獻(xiàn)綜述參見Ratner BD等人(Eds.)“生物材料科學(xué)-醫(yī)學(xué)材料緒論”學(xué)術(shù)出版社，圣地亞哥(Biomaterials Science-An Introduction to Materials inMedicine.Academic Press，San Diego)1996年。事實(shí)上，問題在于用于產(chǎn)生這些修飾的條件通常對(duì)所用的生物材料具有有害(破壞)作用。與所用的物理/化學(xué)方法相比，“溫和的”和保護(hù)生物材料的方法由所述表面修飾來提供，該修飾僅依賴于生物化學(xué)/酶促反應(yīng)，該生物化學(xué)/酶促反應(yīng)在本發(fā)明所述方法的協(xié)助下成為可能(在所述重組體/純化的silicatein-β-多肽的協(xié)助下，silicatein-β介導(dǎo)的酶合成和-作為可逆反應(yīng)-酶降解含SiO2或硅氧烷的表面)。特別地，所述重組體或從天然來源中純化的silicatein-β用于產(chǎn)生硅酮材料的表面修飾(在包被過程中)。例如硅酮-乳房-埋植物、內(nèi)置假體或金屬埋植物(改善骨與金屬埋植物間的連接，生物學(xué)化該金屬埋植物)和隱形眼鏡/塑料眼鏡。用途還涉及用作骨置換材料的膠原涂層，和諸如用于“組織工程”的膠原羊毛狀物的涂層。在此處，目的是增加穩(wěn)定性和多孔性以及改進(jìn)再吸收性。
2)通過聚硅酸鹽、硅酮或混合-聚合物的共合成，用于產(chǎn)生諸如骨置換材料或牙置換材料的新生物材料。
3)用于(硅)-半導(dǎo)體或硅-芯片的表面修飾(接觸區(qū)-處理)。
4)用于無定形二氧化硅的納米結(jié)構(gòu)的修飾或合成。利用所述重組體silicatein-β、所述重組體silicatein-β-融合蛋白或所述純化的silicatein-β，可以在納米水平中修飾或合成無定形二氧化硅的特異性二維和三維結(jié)構(gòu)。所形成的結(jié)構(gòu)可用在納米技術(shù)中。
5)用于含硅寶石和半寶石的表面修飾。除了其它的以外，瑪瑙、碧玉和縞瑪瑙屬于SiO2的無定形或微晶變體。因?yàn)樵诳刂茥l件下借助所述silicatein-β對(duì)這些礦石的表面進(jìn)行修飾，所以本發(fā)明所述方法用于產(chǎn)生或加工這些寶石/半寶石。在此，也可以選擇性地引入外來分子/原子。
6)用于產(chǎn)生金屬、金屬氧化物、塑料和其它材料的涂層；特別用于在這些材料上產(chǎn)生單分子層。
7)用于產(chǎn)生諸如碳纖維的用于消防的技術(shù)纖維材料的涂層，以更好地加工或進(jìn)一步修飾這些材料的特性。
碳纖維(碳纖維)具有極大的技術(shù)重要性，因?yàn)榕c金屬相比，使用該碳纖維可產(chǎn)生實(shí)質(zhì)上更輕，但更堅(jiān)固和更硬的組分(在航空和航天上特別重要)。
8)用于產(chǎn)生毛線或棉線的涂層以獲得這些材料的新特性，特別是抗過敏特性，改進(jìn)其純化或進(jìn)一步修飾其特性。特別地，因?yàn)檫@些材料對(duì)目前方法所需要的劇烈條件敏感，所以該情況表明了酶促方法的優(yōu)勢(shì)。在二氧化硅涂層的協(xié)助下，可避免所用的部分溶液粘附所述材料。
9)用于產(chǎn)生包衣/層以減少諸如藥劑(片劑)的添加劑(例如淀粉)的過敏性反應(yīng)。
10)用于產(chǎn)生硅-氮-化合物。
11)用于合成硅-有機(jī)化合物。
12)用于與多磷酸鹽產(chǎn)生硅復(fù)合物，該硅復(fù)合物也可由二價(jià)陽離子來連接。
13)用于產(chǎn)生觸變材料。Silicatein也可用于(酶促或部分的酶促)產(chǎn)生觸變材料。這些材料顯示了在搖動(dòng)或攪拌過程中，其粘度減少(或增加)的特征-具有稍微時(shí)間延遲(chronological delay)。在此，位于硅酸鹽(硅酸)納米顆粒的表面上的親水OH基間的氫鍵的形成和斷裂起作用。通過適當(dāng)?shù)剡x擇反應(yīng)條件，利用silicatein可產(chǎn)生高度分散的硅酸(硅酸鹽)?，F(xiàn)有技術(shù)中，高度分散的硅酸代表有效的觸變劑。觸變液體和材料具有極大的技術(shù)重要性(例如，用于有色油漆)。
14)通過silicatein介導(dǎo)的包被或包囊進(jìn)二氧化硅中，促進(jìn)藥劑或RNAs和DNAs的膜傳送性。
序列表<110>海洋生物技術(shù)有限公司<120>硅(IV)化合物及其它金屬(IV)化合物的酶合成和修飾及降解<130>U30063PCT<160>2<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>383<212>PRT<213>Suberites domuncula<400>1Met Ser Ala Leu Lys Phe Val Val Ala Leu Cys Val Val His Thr Ser1 5 10 15Leu Gly Ile Ala Glu Ser Val Gly Lys Ser Lys Thr Ala Gly Leu Ser20 25 30Asp Asp Gly Asn Tyr Thr Ala Val Thr Lys Ser Val Arg Leu Thr Pro35 40 45Val Leu Glu Phe Glu Glu Asp Trp Lys Gln Trp Thr Thr Asp His His50 55 60Lys Val Tyr Ser Asp Val Arg Glu Arg Val Asp Lys Tyr Thr Val Trp65 70 75 80Arg Ala Asn Lys Glu Tyr Ile Asp Gln His Asn Gln Asn Ala Gln Arg85 90 95Leu Gly Tyr Thr Leu Lys Met Asn Lys Phe Gly Asp Leu Thr Thr Lys100 105 110Glu Phe Ile Glu Gly Tyr His Cys Val Gln Asp Tyr Gln Pro Thr Asn115 120 125Ala Ser His Leu Asn Lys Lys His Lys Thr His Ala Phe Val Asp Tyr130 135 140Gly Asp Phe Val Arg Gly Gly Thr Gly Glu Gly Val Arg Gly Val Gly145 150 155 160Asn Met Pro Glu Thr Met Asp Trp Arg Thr Ser Gly Val Val Thr Lys165 170 175
Val Lys Asp Gln Leu Arg Cys Gly Ser Ser Tyr Ala Phe Ser Ala Met180 185 190Ala Ser Leu Glu Gly Ile Asn Ala Leu Ser Tyr Gly Ser Leu Val Thr195 200 205Leu Ser Glu Gln Asn Ile Val Asp Cys Ser Val Thr Tyr Gly Asn His210 215 220Gly Cys Ala Cys Gly Asp Val Asn Arg Ala Leu Leu Tyr Val Ile Glu225 230 235 240Asn Asp Gly Val Asp Thr Trp Lys Gly Tyr Pro Ser Gly Gly Asp Pro245 250 255Tyr Arg Ser Lys Gln Tyr Ser Cys Lys Tyr Glu Arg Gln Tyr Arg Gly260 265 270Ala Ser Ala Arg Gly Ile Val Ser Leu Ala Ser Gly Asp Glu Asn Thr275 280 285Leu Leu Thr Ala Val Ala Asn Ser Gly Pro Val Ser Val Tyr Val Asp290 295 300Ala Thr Ser Thr Ser Phe Gln Phe Tyr Ser Asp Gly Val Leu Asn Val305 310 315 320Pro Tyr Cys Ser Ser Ser Thr Leu Ser His Ala Leu Val Val Ile Gly325 330 335Tyr Gly Lys Tyr Ser Gly Gln Asp Tyr Trp Leu Val Lys Asn Ser Trp340 345 350Gly Pro Asn Trp Gly Val Arg Gly Tyr Gly Lys Leu Ala Arg Asn Lys355 360 365Gly Asn Lys Cys Gly Ile Ala Thr Ala Ala Ser Phe Pro Thr Leu370 375 380<210>2<211>1372<212>DNA<213>Suberites domuncula<400>2acttagtata ttatggtagt gtacaatacc tatctccata gaggcatgca taactaggtt 60tattgaatag ctgctggcac aatttgttct caagttggtg ctattagatt tgtgttctag120
aatgtcagca ttgaagtttg tagttgcctt gtgtgtagtt cacacaagct taggaatagc180tgagtcagtt ggtaagagca agactgcagg cctaagtgac gatggcaact acacagctgt240caccaaatct gtaagactga ctccagttct agagtttgag gaagattgga agcaatggac300aactgatcat cacaaggtct actctgatgt gagggagaga gtggacaagt acactgtatg360gagagctaat aaagagtaca ttgatcaaca caaccagaac gcacagagat tgggatacac420actcaaaatg aacaaatttg gagatttgac taccaaggag ttcattgaag gctatcactg480tgttcaggac taccaaccta ccaatgcatc acatttgaat aagaaacaca aaacgcacgc540gtttgtcgac tatggtgact ttgtgagggg tggaactggt gagggtgtga ggggtgtagg600aaacatgccg gagactatgg actggagaac ttctggagtt gtcacaaaag ttaaagatca660gcttcgttgt ggtagcagct atgcgttctc tgccatggct tcattggaag gaataaatgc720tctttcctac ggatctttgg tgacactcag tgaacaaaac attgtagact gctcggttac780ctatggcaac catggttgcg cctgtggtga tgtaaaccgt gctctactgt atgtgataga840gaatgatggc gttgacacgt ggaagggtta tccttctggt ggggatcctt atcgatcaaa900gcaatactct tgcaaatacg agagacagta tcgtggggcc tctgctagag gtatagtcag960tctagctagt ggtgatgaga acacattgtt gacagcagta gctaactctg gaccagtgag 1020tgtgtatgtg gacgctactt caacatcctt ccagttttac agtgatggag tgttgaatgt 1080tccctattgc tcctctagca cgctgagtca tgccttggtt gtcattggtt acgggaagta 1140cagcggacaa gattactggc ttgttaaaaa cagctggggt cctaactggg gagtgcgggg 1200ctatgggaag ttggcaagaa acaagggcaa caaatgtgga atagccacag cggctagttt 1260cccaacatta tgacacttta gttgatcaaa caattaatca taaattatta caacatgtag 1320tataatgatg cccccccatt gctcaatagc ttatctttga acaagaaaaa aa 137權(quán)利要求
1.用于體外或體內(nèi)合成二氧化硅(硅酸或硅酸鹽的縮合產(chǎn)物，也稱為硅石)、硅酮和其它硅(IV)或金屬(IV)化合物及這些化合物的混合-聚合物的方法，其中多肽或多肽的金屬配合物用于所述合成，其特征在于所述多肽包含動(dòng)物、細(xì)菌、植物或真菌的silicatein-β-結(jié)構(gòu)域，其與SEQ ID No.1中所述序列有至少25％的的序列相似性。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于化合物例如硅酸、單烷氧基硅三醇、單烷氧基硅二醇、單烷氧基硅醇、二烷氧基硅二醇、二烷氧基硅醇、三烷氧基硅醇、四烷氧基硅烷、烷基-、芳基-或金屬-硅三醇、烷基-、芳基-或金屬-硅二醇、烷基-、芳基-或金屬-硅醇、烷基-、芳基-或金屬-單烷氧基硅二醇、烷基-、芳基-或金屬-單烷氧基硅醇、烷基-、芳基-或金屬-二烷氧基硅醇、烷基-、芳基-或金屬-三烷氧基硅烷、或其它金屬(IV)化合物用作所述合成的反應(yīng)物(底物)。
3.如權(quán)利要求3所述的方法，其中通過使用所述化合物的確定混合物，產(chǎn)生確定組成的混合-聚合物。
4.如權(quán)利要求1-3中任一權(quán)利要求所述的方法，其中確定的二維和三維結(jié)構(gòu)的形成通過以所述多肽或所述多肽的金屬配合物或所述多肽或所述多肽的金屬配合物與其它分子或玻璃、金屬、金屬氧化物、塑料、生物聚合物或其它材料的表面的結(jié)合為模板來產(chǎn)生。
5.用于降解無定性二氧化硅(硅酸或硅酸鹽的縮合產(chǎn)物，也稱為硅石)、硅酮和其它硅(IV)或金屬(IV)化合物及這些化合物的混合-聚合物的方法，其中多肽或多肽的金屬配合物用于所述降解，其特征在于所述多肽包含動(dòng)物、細(xì)菌、植物或真菌的silicatein-β-結(jié)構(gòu)域，其與SEQID No.1中所述序列具有至少25％的的序列相似性。
6.用于修飾含硅酸或硅(IV)-或金屬(IV)-化合物的結(jié)構(gòu)或表面的方法，其中多肽或多肽的金屬配合物用于所述修飾，其特征在于所述多肽包含動(dòng)物、細(xì)菌、植物或真菌的silicatein-β-結(jié)構(gòu)域，其與SEQ ID No.1中所述序列具有至少25％的的序列相似性。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其中所述含硅酸的結(jié)構(gòu)或表面以寶石、半寶石或無定性硅酸鹽的形式存在，例如人造玻璃或天然硅酸鹽。
8.化合物或含硅酸的結(jié)構(gòu)或表面，其根據(jù)以上權(quán)利要求所述的方法來獲得。
9.如權(quán)利要求8所述的含硅酸的結(jié)構(gòu)或表面，其以寶石、半寶石或無定性硅酸鹽的形式存在，例如人造玻璃或天然硅酸鹽。
10.按SEQ ID No.1記載的來自Suberites domuncula的silicatein-β的多肽或其同源多肽、所述多肽的金屬配合物或其部分，在所述silicatein-β-結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列中，所述同源多肽顯示與SEQ ID No.1中所述序列有至少25％的的序列相似性。
11.核酸，特別是按SEQ ID No.2記載的核酸，其特征在于其基本上編碼如權(quán)利要求10所述的多肽。
12.如權(quán)利要求11所述的核酸，其特征在于其以DNA、cDNA、RNA或其混合物的形式存在。
13.如權(quán)利要求11或12所述的核酸，其特征在于所述核酸序列具有至少一個(gè)內(nèi)含子和/或polyA-序列。
14.如權(quán)利要求11-13中任一權(quán)利要求所述的以其互補(bǔ)“反義”序列形式存在的核酸。
15.如權(quán)利要求11-14中任一權(quán)利要求所述的核酸，其以(a)融合蛋白-(嵌合蛋白)構(gòu)建體，(b)具有分離蛋白-表達(dá)的構(gòu)建體(蛋白酶-裂解位點(diǎn))或(c)具有分離蛋白-表達(dá)的構(gòu)建體(表達(dá)盒)。
16.如權(quán)利要求11-15重任一權(quán)利要求所述的核酸，其特征在于所述核酸為合成產(chǎn)生。
17.優(yōu)選為質(zhì)粒、穿梭載體、噬粒、粘粒、表達(dá)載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載體或粒子、納米微?；蛑|(zhì)體形式的載體，其包含權(quán)利要求11-16中任一權(quán)利要求所述的核酸。
18.優(yōu)選為納米微?；蛑|(zhì)體形式的載體，其包含權(quán)利要求10所述的多肽。
19.宿主細(xì)胞，其經(jīng)權(quán)利要求17或18的載體轉(zhuǎn)染或粒子感染或轉(zhuǎn)導(dǎo)。
20.如權(quán)利要求19所述的宿主細(xì)胞，其特征在于所述宿主細(xì)胞表達(dá)權(quán)利要求1所述的多肽、所述多肽的金屬配合物或其部分。
21.如權(quán)利要求10所述的多肽，其特征在于所述多肽為合成產(chǎn)生。
22.如權(quán)利要求10所述的多肽，其特征在于所述多肽或所述多肽的金屬配合物存在于原核或真核細(xì)胞提取物或裂解物中。
23.如權(quán)利要求22所述的多肽，其特征在于所述純化的多肽或所述多肽的金屬配合物基本上不與其它蛋白共同存在。
24.用于鑒定按SEQ ID No.1記載的來自Suberites domuncula的silicatein-β多肽或其同源多肽的抑制劑或活化劑的方法，在silicatein-β-結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列中，所述同源多肽顯示與SEQ ID No.1中所述序列有至少25％的的序列相似性，其中a)提供按SEQ ID No.1記載的來自Suberites domuncula的silicatein-β多肽或其同源多肽，在silicatein-β-結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列中，所述同源多肽顯示與SEQ ID No.1中所述序列有至少25％的的序列相似性，b)來自步驟a)的所述多肽與潛在的抑制劑或活化劑接觸，以及c)測(cè)定所述多肽合成或降解硅酸鹽或硅酮的能力。
25.如權(quán)利要求24所述的方法，其中按SEQ ID No.1記載的來自Suberites domuncula的silicatein-β多肽或其同源多肽以體內(nèi)細(xì)胞提取物或裂解物或者純化的形式提供，在silicatein-β-結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列中，所述同源多肽顯示與SEQ ID No.1中所述序列有至少25％的序列相似性。
26.產(chǎn)生藥物組合物的方法，所述方法包括a)鑒定權(quán)利要求24或25所述的抑制劑或活化劑，以及b)將所鑒定的抑制劑或活化劑與藥物可接受的載體或輔助劑混合。
27.前述任一權(quán)利要求所述的多肽或核酸或藥物組合物在硅酮和硅酮-埋植物的再吸收或再吸收的修飾中的用途。
28.前述任一權(quán)利要求所述的核酸在用于硅酮和硅酮-埋植物的再吸收或再吸收修飾的細(xì)胞轉(zhuǎn)染中的用途。
29.特別是通過Silicatein-β和Silicatein-α酶促產(chǎn)生的二氧化硅(硅酸或硅酸鹽的縮合產(chǎn)物，也稱為硅石)或其它硅(IV)化合物或金屬(IV)化合物的用途，所述二氧化硅或其它硅(IV)化合物或金屬(IV)化合物用作金屬、金屬氧化物、塑料和其它材料的涂層；特別是用于在這些材料上產(chǎn)生單分子層。
30.特別是通過Silicatein-β和Silicatein-α酶促產(chǎn)生的二氧化硅(硅酸或硅酸鹽的縮合產(chǎn)物，也稱為硅石)或其它硅(IV)化合物或金屬(IV)化合物的用途，所述二氧化硅或其它硅(IV)化合物或金屬(IV)化合物用作諸如碳纖維的用于消防的技術(shù)纖維材料的涂層，以改進(jìn)加工性或進(jìn)一步修飾這些材料的特性。
31.特別是通過Silicatein-β和Silicatein-α酶促產(chǎn)生的二氧化硅(硅酸或硅酸鹽的縮合產(chǎn)物，也稱為硅石)或其它硅(IV)化合物或金屬(IV)化合物的用途，所述二氧化硅或其它硅(IV)化合物或金屬(IV)化合物作為毛線或棉線的涂層以獲得這些材料的新特性，特別是抗過敏性，改進(jìn)其純化或進(jìn)一步修飾其特性。
32.特別是通過Silicatein-β和Silicatein-α酶促產(chǎn)生的二氧化硅(硅酸或硅酸鹽的縮合產(chǎn)物，也稱為硅石)或其它硅(IV)化合物或金屬(IV)化合物的用途，所述二氧化硅或其它硅(IV)化合物或金屬(IV)化合物作為包蓋/包衣，用于減少藥劑(片劑)的添加劑(例如，淀粉)的過敏反應(yīng)。
33.Silicatein-β和Silicatein-α的用途，其特征在于其用于產(chǎn)生單體的或交聯(lián)的硅-氮-化合物。
34.Silicatein-β和Silicatein-α的用途，其特征在于其用于產(chǎn)生單體的或交聯(lián)的硅-有機(jī)化合物。
35.Silicatein-β和Silicatein-α的用途，其特征在于其用于與多磷酸鹽產(chǎn)生線性的或交聯(lián)的的硅復(fù)合物，所述硅復(fù)合物也可通過二價(jià)陽離子來連接。
36.本發(fā)明所述的方法，其特征在于在50℃以下的溫度和常壓下，在水溶液和/或水/有機(jī)溶液中，使用Silicatein-β和Silicatein-α進(jìn)行具有n≥2的Sin(OH)2n+2的寡硅酸鹽的合成。
37.如權(quán)利要求36所述的本發(fā)明的方法，其特征在于使用Silicatein-β和Silicatein-α進(jìn)行具有n≥2的Sin(OH)2n+2的寡硅酸鹽的合成，以及隨后這些反應(yīng)產(chǎn)物用于硅烷、硅酮和硅-有機(jī)化合物的合成，所述硅烷和硅酮包括它們的交聯(lián)結(jié)構(gòu)，所述硅-有機(jī)化合物包括酯、醚、氮、硫和其環(huán)狀化合物。
38.如權(quán)利要求36所述的本發(fā)明的方法，其特征在于用Silicatein-β和Silicatein-α進(jìn)行具有n≥7的Sin(OH)2n+2的寡硅酸鹽的合成，以及隨后使用路易斯酸、氫化催化劑和/或電化學(xué)方法，用氫進(jìn)行這些化合物的氫化，以用作氫儲(chǔ)庫、能源、易燃物或燃料。
39.如權(quán)利要求1-36所述的方法，其特征在于使用Silicatein-β和Silicatein-α來進(jìn)行觸變材料的生產(chǎn)。
40.如權(quán)利要求1-36所述的方法，其特征在于通過使用Silicatein-β和Silicatein-α，所述藥劑、RNA和DNA或多肽的膜傳送性和/或耐受性的增加由Silicatein-介導(dǎo)的、利用和/或在硅石內(nèi)的完全或部分包被或包囊來完成。
全文摘要
本發(fā)明涉及重組silicatein－β或從天然來源中分離的silicatein－β以及silicatein－β－融合蛋白和silicatein－β相關(guān)的酶在二氧化硅(硅酸、硅酸鹽的縮合產(chǎn)物)、硅酮和其它硅(IV)－或金屬(IV)－化合物的合成、降解和修飾中的用途，及其技術(shù)應(yīng)用。
文檔編號(hào)C08G77/08GK1922315SQ200480040186
公開日2007年2月28日 申請(qǐng)日期2004年11月9日 優(yōu)先權(quán)日2003年11月10日
發(fā)明者維爾訥·E.G.·米勒, ?？肌な┩鉅柼卦G, 海因茨·C.·施羅德 申請(qǐng)人:海洋生物技術(shù)有限公司