專利名稱：：一種阿霉素前體藥物的制備方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種阿霉素前體藥物的制備方法以及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：惡性腫瘤嚴(yán)重危害人類健康和生存，是引起死亡的主要原因之一，其發(fā)病率一直高居不下，目前已呈現(xiàn)明顯的年輕化趨勢(shì)。2000年，世界衛(wèi)生組織、報(bào)告，全球癌癥死亡例數(shù)已超過(guò)700萬(wàn)，其中發(fā)達(dá)國(guó)家占21%，發(fā)展中國(guó)家占9%，腫瘤引起的死亡人數(shù)占全球死亡人數(shù)的12%。惡性腫瘤在我國(guó)己成為城鄉(xiāng)居民的首要死亡原因，每年新增病例約200萬(wàn)，死亡I70萬(wàn)。蒽環(huán)類抗生素是臨床最常用且有效的抗腫瘤藥物之一，阿霉素是這類抗腫瘤藥物的代表藥物，最早于上世紀(jì)60年代從鏈球菌的色素代謝產(chǎn)物中獲得。阿霉素是一種廣譜的化療藥物，在臨床上常用于治療乳腺癌，兒童實(shí)體瘤，軟組織瘤，惡心淋巴癌等惡性腫瘤。近年來(lái)的臨床研究發(fā)現(xiàn)，阿霉素的臨床應(yīng)用中，已出現(xiàn)針對(duì)腫瘤細(xì)胞的耐藥性，同時(shí)對(duì)于正常組織的細(xì)胞毒性限制了其進(jìn)一步的應(yīng)用。長(zhǎng)期使用這類藥物最常見的毒性為損傷心肌，可以誘發(fā)充血性心力衰竭。鑒于以上原因，人們針對(duì)阿霉素的改造和修飾一直在繼續(xù)，通過(guò)將具有腫瘤耙向性的特殊轉(zhuǎn)運(yùn)載體或可以被腫瘤組織特異性識(shí)別的分子與阿霉素結(jié)合，制成具有腫瘤靶向性的阿霉素前體藥物，是目前人們一直致力于尋找增加其藥效和安全性的策略之一。目前，依據(jù)前體藥物的設(shè)計(jì)理念，針對(duì)阿霉素結(jié)構(gòu)改造的部位主要集中在13位的撥基和3'位的氨基。其中，可以將13位的羰基與不同分子的,基團(tuán)(修飾基團(tuán))連接，縮水反應(yīng)形成腙鍵連接物，腙鍵在中性環(huán)境下較穩(wěn)定，在偏酸的環(huán)境下可裂解釋放出阿霉素原藥。研究表明，腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)代謝活躍，周圍pH值明顯低于正常組織，因此腙鍵的形成可發(fā)揮酸敏作用，具有腫瘤靶向的作用。不同的載體分子具有不同的特點(diǎn)，其與原藥結(jié)合的方式或者作用于腫瘤組織的特點(diǎn)有所差別。聚乙二醇(PEG)可以延緩藥物清除的速率，延長(zhǎng)藥物的半衰期，增itmfltlt藥物^l中瘤部位的蓄積，局部濃度可達(dá)5-10倍，進(jìn)而辦腫瘤組織被動(dòng)耙向的作用。PEG可與多種藥物通過(guò)共i/^接，從而合j^同的大分子前體藥物，目前BTgffl于藥麟劍及藥物傳絲統(tǒng)中。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種阿霉素前體藥物的制備方法以及應(yīng)用，將阿霉素與修飾的聚乙二醇相結(jié)合得到一種具有酸敏活性的阿霉素靶向前體藥，可能會(huì)增強(qiáng)阿霉素的抗腫瘤作用，降低藥物毒副作用，提高靶向性，為抗腫瘤藥物的開發(fā)提供新的思路。本發(fā)明的前體藥SS霉素與聚乙:^結(jié)合得到的阿霉素前體藥。阿霉素的結(jié)構(gòu)式如下-聚乙二醇的結(jié)構(gòu)式如下HCHCH2CH20)-H通過(guò)高錳酸鉀與聚乙二醇6000(PEG)氧化反應(yīng)，生成聚乙二醇6000二酸；通過(guò)EDCI的催化作用，聚乙二醇6000二酸與肼基甲酸叔丁酯反應(yīng)后并脫去BOC保護(hù)基生成聚乙二醇6000二酰肼(中間產(chǎn)物)；通過(guò)EDCI的催化作用，將中間產(chǎn)物引入阿霉素(DOX)的13-位羰基，得到目標(biāo)化合物阿霉素一聚乙二醇6000二自鍵連接物(PEG-DOXhydrazone)。阿霉素一聚乙二醇6000二酸腙鍵連接物的合成路線附閨說(shuō)明圖1是阿霉素及其前體藥物治療荷瘤裸鼠后腫瘤體積的變化曲線圖。具體實(shí)施旅阿霉素前體藥物的體外抗腫瘤活性研究1目的通過(guò)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)，以阿霉素為陽(yáng)性對(duì)照，評(píng)價(jià)前藥抗腫瘤的活性。2研究方法前體藥物體外細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)將待擁的各種藥物按設(shè)定濃度溶于不含血清的培養(yǎng)液中(DMSO低于0.1%)，用0.25%的胰酶消化生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的肝癌細(xì)胞HepG-2、乳腺癌細(xì)胞MCF-7、乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231，接種于鄰孔板中，密度為lxl04，培養(yǎng)24h后分別加入0.001,0.01,0.1，1，10,100PM(均為阿霉素的濃度)的DOX、DOX-LNA、PEG-DOXamkl、PEG-DOXhydrazone(其中不含血清的培養(yǎng)液為空白對(duì)照)，孵育48后加入20fiLMTT繼續(xù)孵育4h，棄去培養(yǎng)液，用150nLDMSO重新溶解紫色結(jié)晶，酶標(biāo)儀于570nm下讀取OD值，繪制細(xì)胞存活率曲線圖，按公式計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率。細(xì)胞抑制率對(duì)劑量對(duì)數(shù)線性回歸計(jì)算ICso值。細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率(％)=ll-(微組ODft/空白對(duì)照組OD值)，xlOOX2.2阿霉素前體藥物體內(nèi)抗腫瘤活性研究m試驗(yàn)分組雌性裸鼠隨機(jī)分為6組空白對(duì)照組;荷瘤模型組;DOX陽(yáng)性藥組(5mg/kg);PEG-DOXhydrazone大、中、小劑量組(15、10、5mg/kg)。u2荷癍動(dòng),型的建立常規(guī)用100mL培養(yǎng)瓶培養(yǎng)MDA-MB-231細(xì)胞，至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)用0.25%胰酶消化并計(jì)數(shù)，離心后，加入不含血清的DMEM溶液200iiL，吹散制成細(xì)胞懸液(lxl()S個(gè)細(xì)胞)，于第O天將其接種于裸鼠腋下，建立荷瘤動(dòng)物模型，對(duì)照組裸鼠皮下注射不含血清的DMEM溶液200mL?？瞻讓?duì)照組和荷瘤模型組動(dòng)物，給予等量生理鹽水；DOX陽(yáng)性藥組，PKJ-DOXhydrazone大、中、小劑量組動(dòng)物，于腫瘤可觸及(tumorvolume=50>75mm2)時(shí)，按照分組，分別靜脈注射給予不同劑量的藥物，并于給藥后七天再次分別給予相同劑量藥物。給藥劑量均以阿霉素的劑量計(jì)算。:l2j觀察指標(biāo)①裸鼠的體重變化。通過(guò)記錄動(dòng)物體重變化，繪制體重變化曲線，觀察藥物對(duì)動(dòng)物體重的影響。②腫瘤的體積變化及腫瘤生長(zhǎng)抑制率每天觀察腫瘤生長(zhǎng)情況，根據(jù)公式計(jì)算腫瘤體積；試驗(yàn)結(jié)束后，處死動(dòng)物，取下腫瘤組織，稱重根據(jù)公式計(jì)算腫瘤生長(zhǎng)抑制率。TumorVolume=LxW2(L,W分別代表腫癍最長(zhǎng)直徑和最短J[徑)TI=(A-ByAlxlOO%(A和B分別為對(duì)照組和治療組腫瘇重量)③裸鼠存活時(shí)間和存活數(shù)試驗(yàn)過(guò)程中隨時(shí)記錄動(dòng)物死亡情況，試驗(yàn)結(jié)束后計(jì)算裸鼠存活時(shí)間和存活數(shù)，繪制存活時(shí)間曲線圖。3實(shí)驗(yàn)結(jié)果表l游離阿霉素和阿霉素一聚乙二醇腙鍵連接物對(duì)不同癌細(xì)胞的IG<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>*p<0.05,***p<0.001與模型組比較，#p<0.05與阿霉素比較4結(jié)論由以上細(xì)胞、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見，阿霉素一聚乙二醇腙鍵連接物與游離阿霉素相比對(duì)抗腫瘤活性更好，說(shuō)明該前藥可降低阿霉素的給藥劑量，提高療效，并具有一定的靶向性，有很好的開發(fā)前景。權(quán)利要求1、一種阿霉素前體藥物的制備方法，其特征是將高錳酸鉀與聚乙二醇氧化反應(yīng)，生成聚乙二醇二酸；通過(guò)EDCI的催化作用，聚乙二醇二酸與肼基甲酸叔丁酯反應(yīng)后并脫去BOC保護(hù)基生成聚乙二醇二酰肼中間產(chǎn)物；通過(guò)EDCI的催化作用，將中間產(chǎn)物引入阿霉素的13-位羰基，得到目標(biāo)化合物阿霉素-聚乙二醇二酸腙鍵連接物。2、一種阿霉素前體藥物在治療乳腺癌癥中的應(yīng)用。3、一種阿霉素前體藥物在治療肝癌癥中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明提供一種阿霉素前體藥物的制備方法以及應(yīng)用，將高錳酸鉀與聚乙二醇氧化反應(yīng)，生成聚乙二醇二酸；通過(guò)EDCI的催化作用，聚乙二醇二酸與肼基甲酸叔丁酯反應(yīng)后并脫去BOC保護(hù)基生成聚乙二醇二酰肼中間產(chǎn)物；通過(guò)EDCI的催化作用，將中間產(chǎn)物引入阿霉素的13-位羰基，得到目標(biāo)化合物阿霉素-聚乙二醇二酸腙鍵連接物。該前體藥物可能會(huì)增強(qiáng)阿霉素的抗腫瘤作用，降低藥物毒副作用，提高靶向性，為抗腫瘤藥物的開發(fā)提供新的思路。文檔編號(hào)C08G65/48GK101624443SQ20091002355公開日2010年1月13日申請(qǐng)日期2009年8月11日優(yōu)先權(quán)日2009年8月11日發(fā)明者周四元,宦夢(mèng)蕾,張邦樂,梅其炳,滕增輝申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)