專利名稱：側(cè)鏈用硫辛酸修飾的親水性聚合物及其制備和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種改性親水性聚合物，具體涉及一種側(cè)鏈用硫辛酸修飾的親水 性聚合物。
背景技術(shù)：
由雙親性聚合物利用分子間的相互作用在水中可以自組裝形成聚合物納米 粒子(Nanoparticles)。納米粒子作為藥物載體進(jìn)入體內(nèi)，可以有效地減少人體網(wǎng) 狀內(nèi)皮系統(tǒng)(RES)巨噬細(xì)胞的吞噬，能穿越細(xì)胞間隙，可通過人體最小的毛細(xì) 血管及血腦屏障(BBB)并被細(xì)胞組織吸收。納米粒子藥物載體可以控制藥物 在靶向部位控制釋放、減少藥物用量、增強(qiáng)藥物療效并降低藥物毒性。同時， 納米粒子系統(tǒng)可以避免藥物活性喪失，有利于藥物的貯藏和運(yùn)輸。因?yàn)榧{米粒 子的諸多優(yōu)點(diǎn)，使其在藥物的控制釋放上具有巨大應(yīng)用潛力。
在親水主鏈上連上各種疏水鏈段得到雙親結(jié)構(gòu)，是制備兩親聚合物的常用 方法之一，常見的親水主鏈包括聚乙二醇(PEG)或聚氧乙烯(PEO)，多糖類 物質(zhì)如葡聚糖，水溶性殼聚糖或低分子量殼聚糖(chitosan oligosaccharide, CSO)等。常用的可生物降解的疏水鏈段包括聚酯(聚己內(nèi)酯，聚丙交酯等)和 聚氨基酸(如聚e -苯甲酰-L-天冬氨酸、聚Y-芐基-L-谷氨酸和聚天冬氨酸等)。 作為親水主鏈，聚乙二醇(PEG)是pH中性、無毒、水溶性的聚合物，具有髙 度的親水性和良好的生物相容性及血液相容性，并且沒有免疫原性，而天然多 糖葡聚糖來源廣泛，重復(fù)單元中有多個羥基，易于改性。例如，有文獻(xiàn)報道分 另廿以縮酸(Bachelder， et al. J. Am. Chem. Soc.， 2008， 130:10494-10495)和聚 己內(nèi)酯(Gref， et al. Macromolecules， 2002， 35:9861-9867)對葡聚糖進(jìn)行疏水改 性，研究其在溶液中的自組裝行為和生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用。水溶性殼聚糖或低分子量 殼聚糖是殼聚糖的衍生物，重復(fù)單元中有眾多官能團(tuán)，如羥基和氨基，易于改 性，加之良好的水溶性和生物相容性而成為新型的藥物載體。^為疏水鏈段， 天然和合成的聚氨基酸具有良好的生物相容性，代謝產(chǎn)物對人體無害；而脂肪族聚酯包括PGA (聚乙交酯)，PLA (聚丙交脂)，PCL (聚e -己內(nèi)酯)因其生 物降解性、生物相容性、很好的機(jī)械強(qiáng)度和極好的成膜性質(zhì)，在藥物釋放及組 織工程等方面得到廣泛應(yīng)用。
但是兩親聚合物通過自組裝形成的聚集體如膠束、納米粒、聚合物囊泡等 藥釋載體往往不夠穩(wěn)定，注入體內(nèi)由于大量稀釋而解離，造成藥物過早釋放。 化學(xué)交聯(lián)是目前用來提高納米藥物載體穩(wěn)定性的主要方法。交聯(lián)可以是核交聯(lián)， 殼交聯(lián)或界面交聯(lián)(Joralemon， et al. J. Am. Chem. Soc. 2005, 127: 16892-16899; Zhang, et al. Biomacromolecules, 2008， 9: 3321-3331; Xu, et al. J. Mater. Chem. 2009， 19: 4183-4190)。但是，對于理想的藥物釋放而言，需要的是一種對體內(nèi) 環(huán)境敏感的交聯(lián)即在體內(nèi)非常穩(wěn)定能長循環(huán)，進(jìn)入細(xì)胞后，能對體內(nèi)環(huán)境具 有響應(yīng)性而解除交聯(lián)，將藥物釋放出來。近年來，設(shè)計(jì)具有環(huán)境(pH、溫度， 氧化還原環(huán)境等)響應(yīng)性的納米載體成為研究熱點(diǎn)之一 (Meiig， et al. Biomaterials， 2009, 30:2180-2198 ; Li， et al. Macromolecules， 2008 ， 41:6605-6607)。然而，到目前為止，還沒見報道完全可生物降解的、環(huán)境敏感 的、可逆交聯(lián)的納米藥物載體
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一種兩親聚合物。
為達(dá)到上述目的，本發(fā)明具體技術(shù)方案是， 一種兩親聚合物，所述兩親聚 合物的主鏈為親水性聚合物，側(cè)鏈為硫辛酰基。
上述技術(shù)方案中，所述親水聚合物可選用的原料為本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的 原料，所述親水性聚合物可選自但不限于聚乙二醇(PEG)、葡聚糖、聚乙烯醇、 水溶性殼聚糖或低分子量殼聚糖中的一種；所述的親水性聚合物的分子量為 1000~100000D"
上述技術(shù)方案中，所述兩親聚合物包含的硫辛酰基側(cè)鏈?zhǔn)杷?，其中硫辛?基的取代度(每個糖單元中硫辛酸的個數(shù))為20 90%。 .
制備上述兩親聚合物的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的技術(shù)，以葡聚糖-硫辛 酸(Dex-LA)的制備為例來說明兩親聚合物的制備方法，Dex-LA聚合物可通 過酯化反應(yīng)方便得到首先用DCC將硫辛酸活化為硫辛酸酐，然后將葡聚糖與硫辛酸酐反應(yīng)，制備一系列不同硫辛酸取代度的Dex-LA，其合成路線如圖l所 示。
上述技術(shù)方案中，所述兩親聚合物中硫辛酰基的取代度可通過加入的葡聚 糖與硫辛酸酐的比例、反應(yīng)時間、反應(yīng)溫度等來調(diào)節(jié)。
上述技術(shù)方案中，由于將硫辛?；鳛槭杷湺我胗H水聚合物的側(cè)鏈， 得到兩親性聚合物，所述兩親性聚合物可以自組裝形成納米粒，然后可以通過 還原劑如二硫代蘇糖醇(DTT)對硫辛酰基的五元環(huán)進(jìn)行交聯(lián)，來增加納米粒 子的穩(wěn)定性，形成交聯(lián)納米粒子，這種交聯(lián)納米粒子對細(xì)胞內(nèi)的還原環(huán)境敏感， 能解除交聯(lián)。
因此，本發(fā)明的另一目的為提供一種交聯(lián)納米粒子。為達(dá)到上述目的，本 發(fā)明具體技術(shù)方案是， 一種交聯(lián)納米粒子，所述交聯(lián)納米粒子由上述兩親聚合 物構(gòu)成，所述納米粒子的外層親水層由親水性聚合物構(gòu)成，內(nèi)層疏水層由硫辛 ?；奈逶h(huán)交聯(lián)構(gòu)成。 .
上述技術(shù)方案中，所述交聯(lián)納米粒子的粒徑為80 300納米，粒徑分布PDI 為0.02 0.30。
制備上述交聯(lián)納米粒子的方法包括以下步驟
(1) 將上述兩親聚合物通過自組裝形成納米粒子，所述納米粒子的親水外層由 親水性聚合物構(gòu)成，內(nèi)層疏水層由硫辛酰基構(gòu)成；
(2) 將步驟(1)中納米粒子的內(nèi)層疏水層交聯(lián)，通過對硫辛?；奈逶h(huán)的交聯(lián) 來穩(wěn)定納米粒子結(jié)構(gòu)，得到交聯(lián)納米粒子。
上述技術(shù)方案中，步驟(l)中所述兩親聚合物在水中自組裝形成以硫辛酰基 為疏水部分的尺寸穩(wěn)定，分布均一的納米粒子，所述納米粒子的粒徑為80 300證。
上述技術(shù)方案中，步驟(2)中所述的交聯(lián)可采用但不局限于下列方法 利用巰基-二硫鍵交換反應(yīng)，通過1，4-二硫代-D， L-蘇丁醇對歩驟(l)所得納米 粒子中的含二硫鍵的五元環(huán)進(jìn)行化學(xué)交聯(lián)；其中，1，4-二硫代-D，L-蘇丁醇(DTT) 的用量為兩親聚合物中硫辛酰基的摩爾數(shù)的5 30%，納米粒能夠被成功交聯(lián)。 上述技術(shù)方案所得交聯(lián)納米粒子的穩(wěn)定性相對于沒有交聯(lián)的納米粒子大大 提高，即使稀釋1000倍(模擬IV注射)也不發(fā)生解離；對150mM的氯化鈉鹽的水溶液穩(wěn)定，粒徑不變對有機(jī)溶劑如二甲亞砜穩(wěn)定，在一定范圍內(nèi)粒徑只 是稍有變大。
上述技術(shù)方案所得交聯(lián)納米粒子在還原環(huán)境中可以被解交聯(lián)，用以解交聯(lián) 的還原劑可選自但不限于含巰基的分子，如1，4-二硫代-D, L-蘇丁醇(DTT)， 谷胱甘肽(GSH)或含三價磷的化合物，如三(2-氯乙基)磷酸酯 (tris(2-carboxyethyl)-phosphine， TCEP);例如當(dāng)DTT的濃度為10mM的時 候，上述交聯(lián)納米粒子會被解交聯(lián)。
因?yàn)樯鲜鼋宦?lián)納米粒子具有還原敏感性，所以可以應(yīng)用所述交聯(lián)納米粒子 作為藥物載體，可提高交聯(lián)納米粒子對藥物的包載效率，提高交聯(lián)納米粒子在 體內(nèi)血液中循環(huán)的穩(wěn)定性，提髙交聯(lián)納米粒子被腫癍細(xì)胞內(nèi)吞的效率，從而提 高藥物的生物利用度，同時交聯(lián)納米粒子可方便排除體外。
本發(fā)明的另一目的為提供上述交聯(lián)納米粒子的應(yīng)用，所述交聯(lián)納米粒子作 為藥物載體的應(yīng)用。
為達(dá)到上述目的，本發(fā)明的具體技術(shù)方案為，應(yīng)用上述兩親聚合物作為藥 物載體的方法，包括以下步驟
(1) 藥物先溶在有機(jī)溶液中，再與所述兩親聚合物的有機(jī)溶液共同攪拌，然后 再滴加二次水，將得到的溶液攪拌0.5小時后透析，得到包裹藥物的納米粒子；
(2) 利用巰基-二硫鍵交換反應(yīng)，通過1，4-二硫代-D， L-蘇丁醇對步驟(l)所得納 米粒子中的含二硫鍵的五元環(huán)進(jìn)行化學(xué)交聯(lián)；其中，1，4-二硫代-D，L-蘇丁醇的 用量為兩親聚合物中硫辛酰基的摩爾數(shù)的5 30%;
(3) 步驟(2)中包裹藥物的交聯(lián)納米粒子在還原性環(huán)境中，1，4-二硫代-D，L-蘇丁 醇含量大于等于2mM時，解交聯(lián)釋放藥物。
上述技術(shù)方案中，所述藥物可選自但不局限于疏水性藥f中的一種。本 領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)需要選擇所需包封的藥物分子。
進(jìn)一步技術(shù)方案中，為了解決藥物釋放中載體的細(xì)胞穿透/滲透性差的問題， 通常可以通過受體介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)吞(receptor mediated endocytosis)來促進(jìn)細(xì) 胞攝取。受體介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)吞一般通過生物靶向分子如單抗、多肽(如RGD)、 葉酸和一些維生素的主動耙向來實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)吞，從而增加藥物的生物利用度。
以Dextran-LA為例，在聚合物納米粒子表面引入靶向分子半乳糖首先通過Dextran與溴乙酸反應(yīng)在Dextran表面引入羧基，然后與硫辛酸酐反應(yīng)得到 側(cè)鏈用硫辛酸修飾的葡聚糖，再用DCC/NHS法活化Dextran上的羧基，再與半 乳糖氨基衍生物反應(yīng)即得到靶向載體。
優(yōu)選的技術(shù)方案中，Dextran-LA(DS=80%)，其中，Dextran是自然界存在 豐富的一種多糖，具有來源廣，價格低廉，易于改性的優(yōu)點(diǎn)；硫辛酸是FDA批 準(zhǔn)的一種內(nèi)源性的抗氧化劑，可以去除機(jī)體自由基，降低血糖。因此整個體系 具有非常優(yōu)良的生物相容性。
由于上述技術(shù)方案運(yùn)用，本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有下列優(yōu)點(diǎn)
(1) 由于本發(fā)明的兩親聚合物的疏水部分為硫辛?；虼丝梢酝ㄟ^對兩親聚 合物自組裝形成的納米粒子進(jìn)行交聯(lián)，得到穩(wěn)定的交聯(lián)的還原敏感的聚合物納 米粒子，該納米粒子在細(xì)胞外和血液中不易解離，從而保證納米粒子包封的藥 物穩(wěn)定；克服了藥物在體內(nèi)易被泄漏、運(yùn)載效率低等不足。
(2) —旦進(jìn)入腫瘤細(xì)胞，納米粒子則快速解交聯(lián)而解離，藥物快速釋放出來， 從而產(chǎn)生高效治療作用。


附圖1實(shí)施例一、二、三中制備聚合物葡聚糖-硫辛酸(Dex-LA)的合成 路線附圖2實(shí)施例中所得聚合物Dex-LA自組裝成納米粒子、交聯(lián)為還原敏感 的聚合物納米粒子的工作原理示意圖。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合附圖及實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步描述 實(shí)施例一，合成聚合物DeX-LA(Mn dextran =20 kDa， DS = 80 %) 氬氣保護(hù)下，將硫辛酸(0.639 g, 3.10 mmol)溶解在lOmL 二氯甲垸中， 加入到50mL的Schlenk真空密封瓶中，通氬氣條件下，溶解在5.0mL的二氯 甲垸中的DCC (0.384g, 1.86 mmol)加入密封瓶中，把瓶子放在30t:的油浴 中，攪拌反應(yīng)22小時后，冷卻，過濾除去反應(yīng)中生成的脲，濾液旋蒸，除去 溶劑后得到硫辛酸酐。將上面得到的硫辛酸酑加入經(jīng)過無水處理的二甲亞砜3mL。在S(hiiL的三口燒瓶中加入溶解在19mL 二甲亞砜中的葡聚糖(Dextran〉 (0.2Sg， 1.S5mmol AHG)氬氣保護(hù)下再依次加入硫辛酸酐及溶解在2mL 二甲亞砜中的4-二甲氨基吡啶(0.189g, 1.55 mmol),反應(yīng)器放置在30X:的油浴中，攪拌反應(yīng)48小時后，沉淀到冷的乙醇中，沉淀物用乙醇洗滌多次。真空干燥48小時，產(chǎn)率79%。核磁結(jié)果表明其結(jié)構(gòu)為Dex-LA,其中硫辛酸的取代度80%。
實(shí)施例二，合成聚合物Dex-LA(Afn dextran =20 kDa, DS - 20 %)
氬氣保護(hù)下，將硫辛酸(0.255 g， 1.24mmol)溶解在lOmL二氯甲烷中，加入到50mL的Schlenk真空密封瓶中，通氬氣條件下，溶解在5.0mL的二氯甲烷中的DCC (0.154g, 0.74m加o1)加入密封瓶中，把瓶子放在30"C的油浴中，攪拌反應(yīng)22小時后，冷卻，過濾除去反應(yīng)中生成的脲，濾液旋蒸，除去溶劑后得到硫辛酸酐。
將上面得到的硫辛酸酐加入經(jīng)過無水處理的二甲亞砜3mL。在50mL的三口燒瓶中加入溶解在19mL 二甲亞砜中的Dextmn( 0.25 g,1.55 mmol AHG)氬氣保護(hù)下再依次加入硫辛酸酑及溶解在2mL二甲亞砜中的4-二甲氨基吡啶(0力76g, 0.62mmo1),反應(yīng)器放置在30r的油浴中，攪拌反應(yīng)48小時后，沉淀到冷的乙醇中，沉淀物用乙醇洗滌多次。真空干燥48小時，產(chǎn)率82%。核磁結(jié)果表明其結(jié)構(gòu)為Dex-LA,其中硫辛酸的取代度20%。
實(shí)施例三，合成聚合物Dex-LA(3fn dextran-70 kDa, DS - 40 %)
氬氣保護(hù)下，將硫辛酸(0.352 g， 1.71mmol)溶解在10mL二氯甲烷中，加入到50mL的Schlenk真空密封瓶中，通氬氣條件下，溶解在S.OmL的二氯甲烷中的DCC (0.212g， 1.03 nunol)加入密封瓶中，把瓶子放在30t:的油浴中，攪拌反應(yīng)22小時后，冷卻，過濾除去反應(yīng)中生成的脲，濾液旋蒸，除去溶劑后得到硫辛酸酐。
將上面得到的硫辛酸酑加入經(jīng)過無水處理的二甲亞砜3mL。在5(hnL的三口燒瓶中加入溶解在19姐L 二甲亞砜中的Dextran(0.25 g， 1.55 mmol AHG)氬氣保護(hù)下再依次加入硫辛酸軒及溶解在2mL 二甲亞砜中的4-二甲氨基吡啶(O.l(Mg, 0.86mmo1),反應(yīng)器放置在30t:的油浴中，攪拌反應(yīng)48小時后，沉淀到冷的乙醇中，沉淀物用乙醇洗滌多次。真空干燥48小時，產(chǎn)率78%。核磁結(jié)果表明其結(jié)構(gòu)為Dex-LA，其中硫辛酸的取代度40%。 實(shí)施例四，合成聚合物PEG-LA
氬氣保護(hù)下，將硫辛酸(0.413g， 2mo1)溶解在6ml二氯甲垸中，加入到 25ml的Schlenk真空密封瓶中，通氬氣條件下，溶解在4ml的二氯甲垸中的 DCC (0.249 g， 1.2mol)加入到密封瓶中，把瓶子放在301的油浴中，攪拌反 應(yīng)22h后，冷卻，過濾除去反應(yīng)中的生成的脲。
在25ml的Schlenk反應(yīng)瓶中加入5ml 二氯甲烷，0.5 g支化PEG-NH2(Mn - 14000， NH2 = 0.5mol,平均每個PEG分子有14個NH2),溶解后在氮?dú)獗?護(hù)下，將上述濾液滴加到25ml反應(yīng)瓶中。反應(yīng)瓶放置在30X:的油浴中，攪拌 反應(yīng)24h后，在冷的無水乙醚中沉淀，沉淀物用冷的乙醚洗滌多次。真空干燥 48h,得到淡黃色油固狀物體。平均每個PEG接有14個硫辛酸。
實(shí)施例五，Dex-LA(Mn dextran =20 kDa ， DS = 80 %)納米粒子制備
聚合物Dex-LA納米粒子通過透析方法制備。具體過程是將2mg聚合 物Dex-LA(DS - 80 %)溶在1 mL 二甲亞砜中，在25T攪拌條件下，向其中 滴加5 mL去離子水。得到的溶液攪拌lh后，裝入預(yù)先準(zhǔn)備好的透析袋中 (SPECTRA/POR， MWCO: 3500),用去離子水透析24hr。納米粒子145納 米，粒徑分布為0.23。
實(shí)施例六，Dex-LA(Mn d tran =20 kDa， DS = 20 %)納米粒子制備
聚合物Dex-LA納米粒子通過透析方法制備。具體過程是將2mg聚合 物Dex-LA(DS = 10 %)溶在1 mL 二甲亞砜中，在25'C攪拌條件下，向其中 滴加5 mL去離子水。得到的溶液攪拌lh后，裝入預(yù)先準(zhǔn)備好的透析袋中 (SPECTRA/POR， MWCO: 3500),用去離子水透析24hr。納米粒子尺寸為 262納米，粒徑分布為0.14.
按照實(shí)施例五和例六制備不同取代度的聚合物，并測試所得聚合物在二次 水中形成的納米粒子的尺寸和分布，結(jié)果如表l所示
_表l不同取代度的硫辛酸修飾的葡聚糖納米粒子
納米粒子
序號取代度(％) _
粒徑(nm) 分布
i ^ 262±13 SH2 34 221±1 0.09
3 67 195±3 0.10
4 80 145±6 0.23
實(shí)施例七，PEG-LA(Mn PEG = 14000,平均每個PEG接有14個硫辛酸)納 米粒子制備
聚合物PEG-LA納米粒子通過透析方法制備。具體過程是將1 mg聚合 物PEG-LA溶在1 mL四氫呋喃中，在25"攪拌條件下，向其中滴加2 mL 50 mM PB。得到的溶液攪拌lh后，裝入預(yù)先準(zhǔn)備好的透析袋中(MWCO 3500), 用去離子水透析24hr。納米粒子85納米，粒徑分布為0.25.
實(shí)施例八，Dex-LA(Mn dextran-20 kDa， DS - 80 %)納米粒子交聯(lián) 為了得到交聯(lián)的聚合物納米粒子，將實(shí)施例四中形成的聚合物納米粒子(O. 1毫克/毫升)溶液調(diào)節(jié)pH至8.5，并通氮?dú)?0分鐘，加入1 mg/mL 1，4-二硫 代-D， L-蘇丁醇(DTT)78.8nL，將混合液在室溫氬氣保護(hù)條件下攪拌反應(yīng)22 小時。得到的交聯(lián)的納米粒子用去離子水透析，除去沒反應(yīng)的DTT。交聯(lián)的 納米粒子尺寸為113納米，粒徑分布為0.16，對髙度稀釋(模擬靜脈注射)， 生理鹽度(150 mM)，有機(jī)溶劑(DMSO)有顯著的穩(wěn)定性。
實(shí)施例九，Dex-LA(Mn dextran =20 kDa, DS - 80 。/。)納米粒子交聯(lián) 為了得到交聯(lián)的聚合物納米粒子，將實(shí)施例五中形成的聚合物納米粒子(O. 1毫克/毫升)溶液調(diào)節(jié)pH至8.5，并通氮?dú)?0分鐘，加入lmg/鵬L 1，4-二硫 代-D，L-蘇丁醇(DTT) 158 ML,將混合液在室溫氬氣保護(hù)條件下攪拌反應(yīng)22 小時。得到的交聯(lián)的納米粒子用去離子水透析，除去沒反應(yīng)的DTT。交聯(lián)的 納米粒子尺寸為118納米，粒徑分布為0.20,對高度稀釋(模擬靜脈注射)， 生理鹽度U50inM),有機(jī)溶劑(DMSO)有顯著的穩(wěn)定性。
按照實(shí)施例八制備不同取代度的聚合物的交聯(lián)的納米粒子，并測試形成的 交聯(lián)納米粒子的尺寸和分布，結(jié)果如表2所示
表2不同取代度的硫辛酸修飾的葡聚糖交聯(lián)納米粒子
交聯(lián)納米粒子
序號取代度(％) _
粒徑(nm) 分布
I 251±8 sni2 34 187±3 0.19
3 67 174±4 0.12
4 80 113±1 0.16
實(shí)施例十過量DTT使交聯(lián)的聚合物納米粒子解交聯(lián)Dex-LA (Mn dextnln =20 kDa， DS = 80 0/0)
氬氣保護(hù)下，將稱好的DTT加到2.0ml交聯(lián)了的Dex-LA聚合物納米粒 子(0.001毫克/毫升)的玻璃樣品池中，使最終DTT的濃度分別是0, lOmM， 然后玻璃樣品池用橡膠塞封住，搖晃均勻，置于371C恒溫?fù)u床(200rpm) 中，在選定時間、37 'C下，通過動態(tài)激光光散射(DLS)來跟蹤測定顆粒的 粒徑變化。結(jié)果表明，加10 mM DTT需要8小時使粒徑從原來的220納米降 到68納米。
實(shí)施例十一包裹模型小分子抗癌藥物阿霉素及其DTT觸發(fā)釋放
聚合物Dex-LA(Mn dextran =20 kDa， DS = 80 %) (2 mg)和阿霉素(0.2 mg) 溶解在二甲亞砜中，攪拌l小時，在25 X:攪拌條件下，向其中滴加5mL去 離子水。得到的溶液攪拌lh后，裝入預(yù)先準(zhǔn)備好的透析袋中(SPECTRA/POR， MWCO:3500)，用去離子水透析。
將形成的載藥聚合物納米粒子溶液取一半體積，調(diào)節(jié)pH至8.5,并通氮 氣10分鐘，加入1 mg/mL 1，4-二硫代-D， L-蘇丁醇(DTT) 39.4pL,將混合液 在室溫氮?dú)獗Ｗo(hù)條件下攪拌22小時。交聯(lián)的載藥納米粒子溶液用去離子水透 析，除去沒反應(yīng)的DTT。
把載有DOX的交聯(lián)NPs用PB(pH = 7.4， 20mM)稀釋50倍，分成兩份 一個加入等體積DTT的PB溶液(20mM)，另一個只加入等體積的PB溶液， 溫度為37"，這些溶液被馬上分別轉(zhuǎn)移到透析袋中，置于37"恒溫?fù)u床 (200rpm)中。前者被浸入25 mL相同DTT濃度，相同溫度的PB中，后者 被浸入25 mL相同溫度的PB (20mM)中，到一定時間取6mL的透析袋外 的透析液用來測定其熒光強(qiáng)度，并把6mL的相應(yīng)的新鮮液體加入透析袋外。
DOX在聚合物納米粒子中的包封率的確定取一定量的交聯(lián)和未交聯(lián)的 載藥納米粒子溶液，先通過冷凍干燥法將溶液中的水除去，然后加入0.5 mL DMSO超聲1 h充分溶解冷凍干燥后的固體，取該溶液20 nL，加入3 mLDMSO,通過熒光測試，結(jié)合阿霉素的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算包封率。
包封率=(納米粒子中阿霉素的質(zhì)量/投入的阿霉素的質(zhì)量)xlOO %結(jié)果表明DOX不影響納米粒子的形成且尺寸基本不變，包封率為84%。
載有DOX的交聯(lián)納米粒子在10 mM DTT、371C下20 mM PB中，很快解交聯(lián)，
DOX在11小時內(nèi)釋放出約93%。
權(quán)利要求
1.一種兩親聚合物，其特征在于所述兩親聚合物的主鏈為親水性聚合物，側(cè)鏈為硫辛?；?。
2. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的兩親聚合物，其特征在于所述親水性聚合物選 自聚乙二醇、葡聚糖、水溶性殼聚糖或低分子量殼聚糖中的一種；所述親水 性聚合物的分子量為1000 100000Da。
3. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的兩親聚合物，其特征在于硫辛酰基的取代度為 20 90。/"
4. 一種交聯(lián)納米粒子，其特征在于所述交聯(lián)納米粒子由權(quán)利要求1、 2 或3所述的兩親聚合物構(gòu)成，所述交聯(lián)納米粒子的外部親水層由親水性聚合物 構(gòu)成，內(nèi)部疏水層由硫辛?；奈逶h(huán)交聯(lián)構(gòu)成。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的交聯(lián)納米粒子，其特征在于所述交聯(lián)納米粒子 的粒徑為80 300納米，粒徑分布PDI為0.02 0.30。
6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的交聯(lián)納米粒子，其特征在于制備上述交聯(lián)納米 粒子的方法包括以下步驟-(1) 將權(quán)利要求1、 2或3所述的兩親聚合物通過自組裝形成納米粒子，所述 納米粒子的親水外層由親水性聚合物構(gòu)成，內(nèi)層疏水層由硫辛?；鶚?gòu)成；(2) 將步驟(1)中納米粒子的內(nèi)層疏水層交聯(lián)，通過對硫辛酰基的五元環(huán)的交聯(lián) 來穩(wěn)定納米粒子結(jié)構(gòu)，得到交聯(lián)納米粒子。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的交聯(lián)納米粒子，其特征在于步驟(2)中所述的交 聯(lián)方法為利用巰基-二硫鍵交換反應(yīng)，通過1，4-二硫代-D， L-蘇丁醇對步驟(l)所得納米 粒子中的含二硫鍵的五元環(huán)進(jìn)行化學(xué)交聯(lián)其中，1，4-二硫代-D，L-蘇丁醇的用 量為兩親聚合物中硫辛?；哪枖?shù)的5 30%。
8. 權(quán)利要求4、 5、 6、或7所述的交聯(lián)納米粒子作為藥物載體的應(yīng)用。
9. 應(yīng)用權(quán)利要求1、 2或3所述兩親聚合物作為藥物載體的方法，其特征 在于包括以下步驟(1) 藥物先溶在有機(jī)溶液中，再與所述兩親聚合物的有機(jī)溶液共同攪拌，然后 再滴加二次水，將得到的溶液攪拌后透析，得到包裹藥物的納米粒子；(2) 利用巰基-二硫鍵交換反應(yīng)，通過1,4-二硫代-D， L-蘇丁醇對步驟(l)所得納 米粒子中的含二硫鍵的五元環(huán)進(jìn)行化學(xué)交聯(lián)其中，1，4-二硫代-D，L-蘇丁醇的用量為兩親聚合物中硫辛?；哪枖?shù)的5 30%;(3)步驟(2)中包裹藥物的交聯(lián)納米粒子在還原性環(huán)境中，1，4-二硫代-D，L-蘇丁 醇含量大于等于2mM時，解交聯(lián)釋放藥物。
全文摘要
本發(fā)明公開了側(cè)鏈用硫辛酸修飾的親水性聚合物及其制備和應(yīng)用，所述側(cè)鏈用硫辛酸修飾的親水性聚合物為兩親聚合物，所述兩親聚合物的主鏈為親水性聚合物，側(cè)鏈為硫辛酰基，硫辛?；c親水性聚合物中的羥基或胺基縮合形成酯鍵或酰胺鍵；可以通過對兩親聚合物自組裝形成的納米粒子進(jìn)行交聯(lián)，得到穩(wěn)定的交聯(lián)的還原敏感的聚合物納米粒子，使得納米粒子在細(xì)胞外和血液中不易解離，從而保證納米粒子包封的藥物穩(wěn)定；一旦進(jìn)入腫瘤細(xì)胞，納米粒子則快速解交聯(lián)而解離，藥物快速釋放出來，產(chǎn)生高效治療作用；克服了藥物在體內(nèi)易被泄漏、運(yùn)載效率低、細(xì)胞內(nèi)釋放慢等不足。
文檔編號C08G65/48GK101665569SQ20091018192
公開日2010年3月10日 申請日期2009年7月23日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月23日
發(fā)明者劉兆忠, 磊 周, 孟鳳華, 李玉玲, 鐘志遠(yuǎn) 申請人:蘇州大學(xué)