新除草劑抗性基因本申請(qǐng)是發(fā)明名稱為“新除草劑抗性基因”的PCT申請(qǐng)PCT/US2006/042133的分案申請(qǐng)，所述PCT申請(qǐng)的申請(qǐng)日2006年10月27日，進(jìn)入中國(guó)國(guó)家階段的日期為2008年6月30日，申請(qǐng)?zhí)枮?00680050152.6。發(fā)明背景雜草可以迅速耗盡土壤中作物和其他目的植物所需的有價(jià)值的養(yǎng)分。目前有多種不同類型的除草劑用于控制雜草。一種特別流行的除草劑是草甘膦。已經(jīng)開發(fā)了對(duì)草甘膦具有抗性的作物，如玉米、大豆、蕓苔、棉花、甜菜、小麥、草坪草和稻。因此可以例如對(duì)草甘膦抗性大豆生長(zhǎng)活躍的田地噴灑草甘膦以控制雜草而不顯著損害大豆植物。隨著二十世紀(jì)九十年代中期遺傳改造的草甘膦耐性作物(GTC)的引入，在農(nóng)業(yè)中前所未有地使種植者能夠以簡(jiǎn)單、便利、靈活且廉價(jià)的工具控制廣譜闊葉和禾本科雜草。因此，生產(chǎn)者們迅速采用了GTC，并在很多情況下放棄了多種公認(rèn)最佳的農(nóng)業(yè)實(shí)踐，如作物輪作、除草劑作用方式輪作、罐混、將雜草的化學(xué)防治和栽培防治與機(jī)械防治有機(jī)結(jié)合起來(lái)。目前在美國(guó)和西半球其他地方可以購(gòu)買到草甘膦耐性大豆、棉花、玉米和蕓苔。苜蓿是第一種引入的多年生GTC，助長(zhǎng)了在一定的年限內(nèi)反復(fù)地對(duì)相同的作物和田地重復(fù)使用甘草膦的可能性。取決于全球市場(chǎng)的接受度，更多的GTC(如小麥、稻、甜菜、草坪草等等)正準(zhǔn)備引入。許多其他草甘膦抗性物種正處于實(shí)驗(yàn)至開發(fā)階段(如甘蔗、向日葵、甜菜、豌豆、胡蘿卜、黃瓜、萵苣、洋蔥、草莓、番茄和煙草；林業(yè)物種如白楊和香楓；園藝物種如金盞花、矮牽牛花和秋海棠；參閱站點(diǎn)“isb.vt.edu/cfdocs/fieldtests1.cfm，2005”)。此外，近年來(lái)草甘膦的費(fèi)用已經(jīng)急劇降低，達(dá)到了幾乎沒(méi)有常規(guī)雜草控制程序能在價(jià)格和性能上與草甘膦GTC系統(tǒng)有效競(jìng)爭(zhēng)的程度。草甘膦已經(jīng)在滅生(burndown)地區(qū)和其他非作物地區(qū)成功用于總植被控制15年以上。在許多情況下(如對(duì)于GTC)，可以在連續(xù)的3、5、10直至15年中每年使用草甘膦1-3次。這些情況已經(jīng)導(dǎo)致對(duì)草甘膦和GTC技術(shù)的過(guò)度依賴，并對(duì)天然雜草物種中對(duì)草甘膦天然更具耐受性或已經(jīng)發(fā)展出抗草甘膦除草劑活性機(jī)制的植物施加了高選擇壓。僅用草甘膦的雜草控制程序的廣泛使用正導(dǎo)致對(duì)草甘膦抗性雜草的選擇，并且正在選擇固有地比多數(shù)靶物種更能耐受草甘膦的雜草物種后代(即雜草演替)(Powles和Preston，2006；Ng等，2003；Simarmata等，2003；Lorraine-Colwill等，2003；Sfiligoj，2004；Millar等，2003；Heap，2005；Murphy等，2002；Martin等，2002)。盡管草甘膦已經(jīng)在全球廣泛使用15年以上，僅有少數(shù)雜草據(jù)報(bào)道已發(fā)展出對(duì)草甘膦的抗性(Heap，2005)，然而它們中的大多數(shù)都鑒定于過(guò)去的5年?？剐噪s草包括禾本科植物和闊葉物種一硬直黑麥草(Loliumrigidum)、多花黑麥草(Loliummultiflorum)、牛筋草(Eleusineindica)、假高梁(Sorghumhalepense)、豚草(Ambrosiaartemisiifolia)、小飛蓬(Conyzacanadensis)、野塘蒿(Conyzabonariensis)、長(zhǎng)葉車前(Plantagolanceolata)、長(zhǎng)芒莧(Amaranthuspalmerii)和Amaranthusrudis。此外，在廣泛使用GTC之前并不是農(nóng)業(yè)問(wèn)題的雜草現(xiàn)在開始大大盛行，并且難于在GTC的范圍內(nèi)(包括＞80％的美國(guó)棉花和大豆地區(qū)和＞20％的美國(guó)玉米地區(qū))控制(Gianessi，2005)。這些雜草演替主要與(但不僅與)難于控制的闊葉雜草一起出現(xiàn)。一些實(shí)例包括番薯屬(Ipomoea)、莧屬(Amaranthus)、藜屬(Chenopodium)、蒲公英屬(Taraxacum)和鴨跖草屬(Commelina)的物種。在種植者要面對(duì)草甘膦抗性雜草或演替成更難于控制的雜草物種的地區(qū)，種植者可以通過(guò)罐混或換用能控制遺漏雜草的其他除草劑來(lái)彌補(bǔ)草甘膦的弱點(diǎn)。在許多情況下控制闊葉逃逸的一種流行且有效的罐混伴侶為2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-滴)。2，4-滴已經(jīng)在農(nóng)業(yè)和非作物條件下用于廣譜闊葉雜草控制60年以上。已有關(guān)于更具耐性物種的個(gè)案報(bào)道，但2，4-滴仍是全球最廣泛使用的除草劑之一。對(duì)進(jìn)一步使用2，4-滴的限制在于它在雙子葉農(nóng)作物(如大豆或棉花)中的選擇性極差，因此2，4-滴一般不用于(且一般不靠近)敏感性雙子葉作物。此外，2，4-滴在禾本科作物中的用途在某種程度上受限于會(huì)發(fā)生的作物損傷的性質(zhì)。2，4-滴和草甘膦的組合已經(jīng)用于在種植免耕大豆和棉花之前提供更強(qiáng)的滅生處理，然而，由于這些雙子葉物種對(duì)2，4-滴的敏感性，這些滅生處理必須至少在種植前14-30天進(jìn)行(Agriliance，2005)。和MCPA一樣，2，4-滴是苯氧酸類除草劑。2，4-滴已經(jīng)用于在許多單子葉作物(如玉米、小麥和稻)中選擇性控制闊葉雜草而不嚴(yán)重?fù)p傷目的作物植物。2，4-滴是合成的植物生長(zhǎng)素衍生物，其作用為使正常的細(xì)胞激素內(nèi)穩(wěn)態(tài)失調(diào)，并阻礙平衡的受控生長(zhǎng)，然而其確切的作用模式仍不了解。綠草定和氟草煙是吡啶氧乙酸類除草劑，其作用模式也與合成的植物生長(zhǎng)素相同。這些除草劑對(duì)某些植物具有不同水平的選擇性(如雙子葉植物比禾本科植物更敏感)。不同植物對(duì)這些除草劑的差異代謝是不同水平選擇性的一種解釋。通常植物緩慢代謝2，4-滴，因此靶位點(diǎn)的不同活性更可能解釋植物對(duì)2，4-滴不同的應(yīng)答(WSSA，2002)。2，4-滴的植物代謝一般通過(guò)兩步代謝實(shí)現(xiàn)，通常是羥基化后接著與氨基酸或葡萄糖綴合(WSSA，2002)。隨著時(shí)間的發(fā)展，微生物種群已經(jīng)發(fā)展出降解此特定外來(lái)物的有效的替代途徑，這導(dǎo)致2，4-滴的完全礦化。對(duì)微生物連續(xù)應(yīng)用除草劑選擇了能利用除草劑作為碳源生長(zhǎng)(從而使其在土壤中具有競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì))的微生物。因?yàn)檫@個(gè)原因，目前制備的2，4-滴具有相對(duì)短的土壤半衰期，并且沒(méi)有遇到對(duì)其后的作物明顯的延續(xù)效應(yīng)(carryovereffect)。這促進(jìn)了2，4-滴的除草劑應(yīng)用。已經(jīng)廣泛研究了其降解2，4-滴能力的一種生物是真養(yǎng)雷氏菌(Ralstoniaeutropha)(Streber等，1987)。編碼礦化途徑中第一個(gè)酶促步驟的基因?yàn)閠fdA。參閱美國(guó)專利No.6,153,401和GENBANK登錄號(hào)M16730。TfdA通過(guò)α-酮戊二酸依賴性雙加氧酶反應(yīng)催化2，4-滴酸轉(zhuǎn)化成二氯苯酚(DCP)(Smejkal等，2001)。DCP與2，4-滴相比幾乎不具有除草劑活性。TfdA在轉(zhuǎn)基因植物中用于向通常對(duì)2，4-滴敏感的雙子葉植物(如棉花和煙草)賦予2，4-滴抗性(Streber等(1989)，Lyon等(1989)，Lyon(1993)和美國(guó)專利No.5,608,147)。已在環(huán)境中鑒定了大量編碼能降解2，4-滴的蛋白質(zhì)的tfdA型基因并已保存于Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)。許多同源物與tfdA類似(氨基酸同一性＞85％)并具有與tfdA相似的酶特性。然而，有大量同源物與tfdA具有顯著更低的同一性(25-50％)，但卻具有與α-酮戊二酸雙加氧酶Fe+2雙加氧酶相關(guān)的特征性殘基。因此這些不同的雙加氧酶的底物特異性是什么并不明確。與tfdA具有低同源性(氨基酸同一性31％)的獨(dú)特實(shí)例是來(lái)自食酸戴爾福特菌(Delftiaacidovorans)的sdpA(Kohler等，1999，Westendorf等，2002，Westendorf等，2003)。已經(jīng)顯示此酶催化(S)-2，4-滴丙酸(和其他(S)-苯氧丙酸)以及2，4-滴(苯氧乙酸)礦化的第一步(Westendorf等，2003)。迄今仍沒(méi)有將此基因轉(zhuǎn)化進(jìn)植物的報(bào)道。新除草劑耐受作物(HTC)技術(shù)的開發(fā)很大程度上受到GTC的效力、低費(fèi)用和便利性的限制。因此，GTC在生產(chǎn)者中的采用率非常高。這很難刺激開發(fā)新的HTC技術(shù)。芳氧基鏈烷酸酯化學(xué)亞結(jié)構(gòu)是許多商業(yè)除草劑(包括苯氧乙酸植物生長(zhǎng)素(如2，4-滴和2，4-滴丙酸)、吡啶氧乙酸植物生長(zhǎng)素(如氟草煙和綠草定)、芳氧基苯氧丙酸酯(AOPP)乙酰輔酶A羧化酶(ACC酶)抑制劑(如吡氟氯禾靈(haloxyfop)、喹禾靈(quizalofop)和禾草靈(diclofop))和5-取代的苯氧乙酸原卟啉原氧化酶IX抑制劑(如霸草靈(pyraflufen)和氟胺草酯(flumiclorac)))的通用實(shí)體。然而，這些除草劑類別的差別都很大，并且目前的文獻(xiàn)中沒(méi)有這些化學(xué)制品類別中共有的降解途徑的證據(jù)。最近已描述降解涵蓋多種作用模式的除草劑的多功能酶(PCTUS/2005/014737；2005年5月2日提交)。下文將描述另一種獨(dú)特的多功能酶和潛在用途。發(fā)明概述本發(fā)明提供不僅對(duì)2，4-滴具有抗性，而且還對(duì)吡啶氧乙酸類除草劑具有抗性的新植物。迄今為止，還沒(méi)有預(yù)期或提出可通過(guò)引入單個(gè)基因產(chǎn)生具有這兩種有利特性的植物。本發(fā)明還包括這樣的植物：其產(chǎn)生與一種或多種其他除草劑抗性基因(包括但不僅限于草甘膦-、ALS-(咪唑啉酮、磺酰脲)、芳氧基鏈烷酸酯-、HPPD-、PPO-和草銨膦-抗性基因)“疊加”的一種或多種本發(fā)明的酶，以提供與更廣更多的強(qiáng)雜草控制和除草劑抗性管理選擇相容的除草劑耐性植物。本發(fā)明還包括利用本文舉例說(shuō)明的基因和蛋白質(zhì)的同源物的方法和組合物。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供對(duì)2，4-滴、MCPA、綠草定、氟草煙和一種或多種市售除草劑(如草甘膦、草銨膦、百草枯、ALS抑制劑(如磺酰脲類、咪唑啉酮類、三唑并嘧啶磺酰胺類等)、HPPD抑制劑(如硝草酮(mesotrione)、異唑草酮(isoxaflutole)等)、麥草畏(dicamba)、溴草腈、芳氧基苯氧丙酸酯等等)具有耐受性的單子葉和雙子葉植物。還公開了含有負(fù)責(zé)這類除草劑耐性的核酸序列的載體以及將這些耐性植物和除草劑組合用于雜草控制和防止雜草種群演替的方法。本發(fā)明使得可以以新的方法使用除草劑的新組合。此外，本發(fā)明提供預(yù)防產(chǎn)生并控制對(duì)一種或多種除草劑(如草甘膦)具有抗性的雜草株系的新方法。本發(fā)明賦予除草劑和作物的新組合的新用途，包括在種植否則會(huì)對(duì)該除草劑(如2，4-滴)敏感的植物的種子之前對(duì)將種植的地區(qū)進(jìn)行的種植前應(yīng)用。本發(fā)明部分涉及酶的鑒定，所述酶不僅能降解2，4-滴，而且還令人吃驚地具有例如使本發(fā)明的酶區(qū)別于先前已知的tfdA蛋白質(zhì)的新特性。更具體的，本發(fā)明涉及能降解2，4-滴和吡啶氧乙酸類除草劑的酶的用途。先前已報(bào)道的α-酮戊二酸依賴性雙加氧酶均不具有降解苯氧乙酸和吡啶氧乙酸類植物生長(zhǎng)素除草劑的能力。本發(fā)明使用的優(yōu)選酶和基因在本文中稱為AAD-12(芳氧基鏈烷酸酯雙加氧酶)。這一高度新穎的發(fā)現(xiàn)是重要的除草劑耐性作物(HTC)性狀和選擇標(biāo)記可能性的基礎(chǔ)。本發(fā)明所述植物在其全部生命周期中具有抗性。之前沒(méi)有動(dòng)機(jī)產(chǎn)生含有AAD-12基因(優(yōu)選如本文所示例的具有為了在一種或多種類型植物中表達(dá)而優(yōu)化的序列的AAD-12多核苷酸)的植物，也不會(huì)預(yù)期這類植物能有效的產(chǎn)生AAD-12酶以使植物對(duì)苯氧乙酸類除草劑(如2，4-滴)和/或一種或多種吡啶氧乙酸類除草劑(如綠草定和氟草煙)具有抗性。因此，本發(fā)明提供了許多本領(lǐng)域迄今未曾設(shè)想過(guò)的優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明還部分涉及編碼能降解苯氧乙酸類植物生長(zhǎng)素和/或吡啶氧乙酸類植物生長(zhǎng)素除草劑的芳氧基鏈烷酸酯雙加氧酶的基因的鑒定和用途。篩選蛋白質(zhì)的這些活性的方法也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。因此，本發(fā)明包括通過(guò)重組表達(dá)的AAD-12酶對(duì)2，4-二氯苯氧乙酸和其他芳氧基鏈烷酸酯類植物生長(zhǎng)素除草劑的降解。本發(fā)明還包括控制雜草的方法，其中所述方法包括對(duì)含有AAD-12基因的植物應(yīng)用一種或多種吡啶氧乙酸類或苯氧乙酸類植物生長(zhǎng)素除草劑。本發(fā)明還提供使用AAD-12基因作為鑒定轉(zhuǎn)化了AAD-12的植物細(xì)胞和完整植物的選擇標(biāo)記物的方法，所述植物細(xì)胞和完整植物任選地包含同時(shí)插入靶植物細(xì)胞的一種、兩種或更多外源基因。本發(fā)明的方法包括選擇對(duì)適當(dāng)水平的除草劑具有抗性的轉(zhuǎn)化細(xì)胞。本發(fā)明還包括通過(guò)培養(yǎng)本發(fā)明的植物和/或細(xì)胞制備具有芳氧基鏈烷酸酯雙加氧酶生物活性的多肽的方法。附圖的簡(jiǎn)短說(shuō)明圖1顯示本發(fā)明AAD-12酶催化的一般化學(xué)反應(yīng)。圖2是示例的AAD-12蛋白質(zhì)、TfdA、AAD-2、AAD-1和TauD的氨基酸序列比對(duì)。圖3顯示AAD-12(v2)對(duì)2，4-滴和2，4-滴丙酸對(duì)映異構(gòu)體的活性。序列簡(jiǎn)述SEQIDNO：1為來(lái)自食酸戴爾福特菌的AAD-12核苷酸序列。SEQIDNO：2為翻譯的由SEQIDNO：1編碼的蛋白質(zhì)序列。SEQIDNO：3為植物優(yōu)化的核苷酸序列AAD-12(v1)。SEQIDNO：4為翻譯的由SEQIDNO：3編碼的蛋白質(zhì)序列。SEQIDNO：5為大腸桿菌優(yōu)化的核苷酸序列AAD-12(v2)。SEQIDNO：6為M13正向引物序列。SEQIDNO：7為M13反向引物序列。SEQIDNO：8為正向AAD-12(v1)PTU引物序列。SEQIDNO：9為反向AAD-12(v1)PTU引物序列。SEQIDNO：10為正向AAD-12(v1)編碼PCR引物序列。SEQIDNO：11為反向AAD-12(v1)編碼PCR引物序列。SEQIDNO：12顯示“sdpacodF”AAD-12(v1)引物序列。SEQIDNO：13顯示“sdpacodR”AAD-12(v1)引物序列。SEQIDNO：14顯示“NcolofBrady”引物序列。SEQIDNO：15顯示“SaclofBrady”引物序列。發(fā)明詳述本發(fā)明開發(fā)的2，4-滴抗性基因及相應(yīng)的抗性作物提供用于在作物中控制草甘膦抗性(或高耐性和演替的)闊葉雜草物種的優(yōu)良選擇。2，4-滴是廣譜、相對(duì)便宜且強(qiáng)力的闊葉除草劑，如果在雙子葉和單子葉作物中同樣能提供更強(qiáng)的作物耐性，則可為種植者提供優(yōu)良的效用。2，4-滴耐性轉(zhuǎn)基因雙子葉作物還可在應(yīng)用時(shí)間和用量上具有更高的靈活性。2，4-滴除草劑耐性性狀的另一用途是它可用于預(yù)防2，4-滴漂移、揮發(fā)、轉(zhuǎn)化(inversion)(或其他遠(yuǎn)距離的移動(dòng)現(xiàn)象)、誤用、破壞等等對(duì)正常敏感性作物的損害。AAD-12基因的另一益處是，與目前已表征的所有tfdA同源物不同，AAD-12除了能降解非手性苯氧基植物生長(zhǎng)素(如2，4-滴、MCPA、4-氯苯氧乙酸)以外，還能降解吡啶氧乙酸類植物生長(zhǎng)素(如綠草定、氟草煙)。見表1。圖1所示為本發(fā)明AAD-12酶催化的化學(xué)反應(yīng)的一般圖解(O2的加入是立體特異性的；中間產(chǎn)物自發(fā)分解為苯酚和乙醛酸)。應(yīng)當(dāng)理解圖1中的化學(xué)結(jié)構(gòu)表示分子骨架，還應(yīng)理解圖1包含多種R基團(tuán)以及相似的基團(tuán)(如表1所示)，但并未對(duì)其進(jìn)行必要地具體闡明。已經(jīng)全球使用不同苯氧基植物生長(zhǎng)素組合的多種混合來(lái)處理不同地區(qū)特定的雜草譜和環(huán)境條件。在植物中使用AAD-12基因可以提供對(duì)更廣譜的植物生長(zhǎng)素除草劑的防護(hù)，從而提高靈活性和可控制的雜草譜。本發(fā)明還可用于對(duì)所有市售苯氧基植物生長(zhǎng)素的漂移或其他遠(yuǎn)距離合成的植物生長(zhǎng)素除草劑損傷的防護(hù)。表1詳細(xì)說(shuō)明市售的吡啶氧基和苯氧基植物生長(zhǎng)素，并提供相應(yīng)的化學(xué)結(jié)構(gòu)。現(xiàn)已鑒定了單個(gè)基因(AAD-12)，其在遺傳改造用于植物表達(dá)后具有允許在植物中使用苯氧基植物生長(zhǎng)素除草劑的特性，所述植物中固有耐性根本不存在或不足以允許使用這些除草劑。此外，AAD-12可以在植物天然耐性不足以允許選擇性時(shí)在植物中提供對(duì)吡啶氧乙酸除草劑的防護(hù)，擴(kuò)展了這些除草劑的潛在效用。現(xiàn)在可以以一種、兩種或幾種苯氧基植物生長(zhǎng)素除草劑的組合相繼或罐混地處理僅含AAD-12的植物。用于控制廣譜雙子葉雜草的每種苯氧基植物生長(zhǎng)素除草劑的用量范圍從25到4000gae/ha，更通常從100到2000gae/ha。類似的，可以對(duì)具有降低的來(lái)自吡啶氧乙酸植物生長(zhǎng)素除草劑損傷風(fēng)險(xiǎn)的表達(dá)AAD-12的植物應(yīng)用一種、兩種或幾種所述除草劑化合物的混合物。用于控制其他雙子葉雜草的每種吡啶氧乙酸除草劑的用量范圍可以從25到2000gae/ha，更通常是從35到840gae/ha。草甘膦被廣泛地使用，因?yàn)樗刂品浅V譜的闊葉和禾本科雜草物種。然而，在GTC和非作物應(yīng)用中重復(fù)使用草甘膦已經(jīng)(而且仍將繼續(xù))選擇使雜草演替為天然更具耐性的物種或草甘膦抗性生物型。多數(shù)除草劑抗性管理策略建議使用有效用量的罐混除草劑伴侶作為延緩出現(xiàn)抗性雜草的方法，所述除草劑伴侶提供對(duì)同一物種的控制，但具有不同的作用模式。將AAD-12與草甘膦耐性性狀(和/或其他除草劑耐性性狀)疊加可通過(guò)能對(duì)同一作物選擇性使用草甘膦、苯氧基植物生長(zhǎng)素(如2，4-滴)和吡啶氧乙酸類植物生長(zhǎng)素除草劑(如綠草定)來(lái)提供允許控制GTC中草甘膦抗性雙子葉雜草物種的機(jī)制。這些除草劑的應(yīng)用可以是在含有不同作用模式的兩種或更多除草劑的罐混合物中同時(shí)使用；在相繼應(yīng)用(如種植前、出苗前或出苗后)中單個(gè)除草劑組合物的單獨(dú)使用(使用的間隔時(shí)間范圍從大約2小時(shí)到大約3個(gè)月)；或者備選地，可以在任何時(shí)間(從種植作物大約7個(gè)月內(nèi)到收獲作物時(shí)(或?qū)τ趩蝹€(gè)除草劑為收獲前間隔，取最短者))應(yīng)用代表每種化學(xué)類別的任意數(shù)目除草劑的任意組合。在控制廣譜禾本科和闊葉雜草中具有靈活性是很重要的，即使用時(shí)間、單個(gè)除草劑用量和控制頑固或抗性雜草的能力。作物中與草甘膦抗性基因/AAD-12疊加的草甘膦應(yīng)用的范圍可以是大約250-2500gae/ha；苯氧基植物生長(zhǎng)素除草劑(一種或多種)可按照大約25-4000gae/ha應(yīng)用；而吡啶氧乙酸植物生長(zhǎng)素除草劑(一種或多種)可按照25-2000gae/ha應(yīng)用。這些應(yīng)用的最佳組合和時(shí)間取決于具體的情況、物種和環(huán)境，并可由雜草控制領(lǐng)域得益于本公開內(nèi)容的的技術(shù)人員最佳決定。在完整的生長(zhǎng)周期中，幼苗通常是抗性的。轉(zhuǎn)化的植物在基因表達(dá)的任意時(shí)間一般對(duì)新除草劑應(yīng)用具有抗性。本文顯示貫穿生命周期的對(duì)2，4-滴的耐受性，通過(guò)使用迄今檢測(cè)的組成型啟動(dòng)子(主要是CsVMV和AtUbi10)。一般期望如此，但是這是一種基于其他非代謝活性的改進(jìn)，比如，通過(guò)減少抗性作用機(jī)制位點(diǎn)的表達(dá)顯著影響耐性。一個(gè)例子是抗農(nóng)達(dá)(RoundupReady)棉花，如果在早期噴灑，植物具有抗性，但是如果噴灑太晚，草甘膦在分生組織聚集(因?yàn)槠洳槐淮x和轉(zhuǎn)位)；使用的病毒啟動(dòng)子孟山都(Monsanto)不能在花中很好的表達(dá)。本發(fā)明在這些方面提供改進(jìn)。除草劑制劑(如酯、酸或鹽制劑或可溶濃縮劑、乳化濃縮劑或可溶液體)和罐混添加劑(如佐劑、表面活性劑、漂移阻滯劑或相容劑)可顯著影響給定的除草劑或一種或多種除草劑的組合的雜草控制。這些和任意前述除草劑化學(xué)性質(zhì)的任意組合都在本發(fā)明的范圍內(nèi)。本領(lǐng)域技術(shù)人員還會(huì)了解，兩種或更多作用模式的組合在提高受控雜草譜和/或在控制天然更具耐性或抗性雜草物種方面的益處，并還可擴(kuò)展到通過(guò)人工參與(轉(zhuǎn)基因或非轉(zhuǎn)基因)在作物中產(chǎn)生除GTC外的除草劑耐性的化學(xué)性質(zhì)。事實(shí)上，可以單獨(dú)或以多重組合疊加編碼以下抗性的性狀以提供有效控制或防止雜草演替和/或?qū)θ我馑鲱悇e除草劑的抗性的能力：草甘膦抗性(如抗性植物或細(xì)菌EPSPS、草甘膦氧化還原酶(GOX)、GAT)、草銨膦抗性(如Pat、bar)、乙酰乳酸合酶(ALS)抑制性除草劑抗性(如咪唑啉酮類、磺酰脲類、三唑并嘧啶磺酰胺類、嘧啶硫代苯甲酸類(pyrmidinylthiobenzoates)和其他化學(xué)品如AHAS，Csr1，SurA等)、溴草腈抗性(如Bxn)、對(duì)HPPD(4-羥苯基丙酮酸雙加氧酶)酶抑制劑的抗性、對(duì)八氫番茄紅素去飽和酶(PDS)抑制劑的抗性、對(duì)光系統(tǒng)II抑制性除草劑的抗性(如psbA)、對(duì)光系統(tǒng)I抑制性除草劑的抗性、對(duì)原卟啉原氧化酶IX(PPO)抑制性除草劑的抗性(如PPO-1)、對(duì)苯脲除草劑的抗性(如CYP76B1)、二氯甲氧苯酸降解酶(參閱如US20030135879)等等。體內(nèi)修飾的EPSPS以及I類、II類和III類草甘膦抗性基因可用于某些優(yōu)選的實(shí)施例。關(guān)于其他除草劑，一些其他優(yōu)選的ALS抑制劑包括但不僅限于：磺酰脲類(如綠磺隆(chlorsulfuron)、氯吡嘧磺隆(halosulfuron)、煙嘧磺隆(nicosulfuron)、甲嘧磺隆(sulfometuron)、磺?；锹?sulfosulfuron)、三氟啶磺隆(trifloxysulfuron))、咪唑啉酮類(如甲氧咪草煙(imazamox)、咪草煙(imazethapyr)、滅草喹(imazaquin))、三唑并嘧啶磺酰胺類(如氯酯磺草胺、雙氯磺草安、雙氟磺草胺、唑嘧磺草胺、磺草唑胺(metosulam)和嘧啶并三唑類磺胺(penoxsulam)、嘧啶硫代苯甲酸類(如雙草醚(bispyribac)和嘧草硫醚(pyrithiobac))和氟酮磺隆(flucarbazone)。一些優(yōu)選的HPPD抑制劑包括但不僅限于：甲基磺草酮、異唑草酮和磺草酮。一些優(yōu)選的PPO抑制劑包括但不僅限于：氟胺草酯、丙炔氟草胺、氟噠嗪草酯(flufenpyr)、吡草醚(pyraflufen)、噠草氟(fluthiacet)、氟丙嘧草酯、唑草酮、甲磺草胺和二苯醚(如三氟羧草醚、氟磺胺草醚、乳氟禾草靈和乙氧氟草醚)。此外，可以將AAD-12單獨(dú)或與一種或多種其他HTC性狀疊加后再與一種或多種其他輸入(如昆蟲抗性、真菌抗性或脅迫耐受性等)或輸出(如提高的產(chǎn)量、改進(jìn)的油譜、提高的纖維品質(zhì)等)性狀疊加。因此，本發(fā)明可用于提供以靈活且經(jīng)濟(jì)地控制任何數(shù)目的農(nóng)學(xué)害蟲的能力來(lái)提高作物品質(zhì)的完整農(nóng)學(xué)解決方案。本發(fā)明部分涉及鑒定不僅能降解2，4-滴，而且令人驚奇地具有使本發(fā)明的酶區(qū)別于先前已知的(例如)tfdA蛋白的新特性的酶。盡管此酶與tfdA的同源性很低，但本發(fā)明的基因一般仍可歸類到α-酮戊二酸依賴性雙加氧酶的同一總家族。此家族蛋白質(zhì)的特征在于包含活性位點(diǎn)的“HX(D/E)X23-26(T/S)X114-183HX10-13R”基序中的三個(gè)保守性組氨酸殘基。組氨酸與活性位點(diǎn)中催化活性所必需的Fe+2離子配位(Hogan等，2000)。設(shè)計(jì)了本文所討論的初步體外表達(dá)實(shí)驗(yàn)以幫助選擇新屬性。這些實(shí)驗(yàn)還說(shuō)明AAD-12酶與先前提交的專利申請(qǐng)(PCTUS/2005/014737；2005年5月2日提交)中公開的同類另一種不同的酶有區(qū)別。前一申請(qǐng)中的AAD-1酶與本發(fā)明中AAD-12蛋白質(zhì)只具有大約25％的序列同一性。更具體的，本發(fā)明部分涉及不僅能降解2，4-滴而且還能降解吡啶氧乙酸類除草劑的酶的用途。先前已經(jīng)報(bào)道的α-酮戊二酸依賴性雙加氧酶均不具有降解不同化學(xué)類別和作用方式的除草劑的能力。本發(fā)明用途中優(yōu)選的酶和基因在本文中稱為AAD-12(芳氧基鏈烷酸酯雙加氧酶)基因和蛋白質(zhì)。本發(fā)明還部分涉及編碼能降解苯氧基生長(zhǎng)素和吡啶氧乙酸類除草劑的芳氧基鏈烷酸酯雙加氧酶的基因的鑒定和用途。因此，本發(fā)明部分涉及通過(guò)重組表達(dá)的AAD-12酶降解2，4-二氯苯氧乙酸、其他苯氧乙酸和吡啶氧乙酸類除草劑。在分析測(cè)定中，本發(fā)明的蛋白質(zhì)對(duì)2，4-滴到2，4-二氯苯酚(“DCP”，無(wú)除草劑活性)的轉(zhuǎn)化測(cè)試為陽(yáng)性。部分純化的本發(fā)明蛋白質(zhì)能在體外將2，4-滴迅速轉(zhuǎn)化為DCP。轉(zhuǎn)化AAD-12的植物提供的另一優(yōu)點(diǎn)是母體除草劑代謝為失活形式，從而降低谷物或秸稈中收獲除草劑殘留物的可能。本發(fā)明還包括控制雜草的方法，其中所述方法包括對(duì)含有AAD-12基因的植物應(yīng)用吡啶氧乙酸和/或苯氧基生長(zhǎng)素除草劑。根據(jù)這些發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)在提供了含有編碼這類酶的多核苷酸的新植物。迄今為止還沒(méi)有產(chǎn)生這類植物的動(dòng)機(jī)，也不會(huì)預(yù)期這樣的植物能有效產(chǎn)生此酶，不僅賦予植物對(duì)苯氧乙酸類除草劑(如2，4-滴)的抗性，而且賦予植物對(duì)吡啶氧乙酸類除草劑的抗性。因此，本發(fā)明提供本領(lǐng)域從未設(shè)想過(guò)的許多優(yōu)點(diǎn)?？梢垣@得(保藏于培養(yǎng)物保藏中心如ATCC或DSMZ的)公共可得的菌株并使用本文公開的技術(shù)篩選新基因。本文公開的序列可用于擴(kuò)增同源基因并克隆進(jìn)重組表達(dá)系統(tǒng)，以根據(jù)本發(fā)明進(jìn)一步進(jìn)行篩選和測(cè)試。如上文背景章節(jié)所討論的，已被廣泛研究其降解2，4-滴能力的一種生物為真養(yǎng)雷氏菌(Streber等，1987)。編碼降解途徑中第一種酶的基因?yàn)閠fdA。參閱美國(guó)專利No.6,153,401和GENBANK登錄號(hào)M16730。tfdA通過(guò)α-酮戊二酸依賴性雙加氧酶反應(yīng)催化2，4-滴酸轉(zhuǎn)化成無(wú)除草劑活性的DCP(Smejkal等，2001)。tfdA已在轉(zhuǎn)基因植物中用于將2，4-滴抗性賦予通常對(duì)2，4-滴敏感的雙子葉植物(如棉花和煙草)(Streber等，1989；Lyon等，1989；Lyon等，1993)。已經(jīng)從環(huán)境中鑒定了編碼能降解2，4-滴的蛋白質(zhì)的大量tfdA型基因并保存于Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)。許多同源物與tfdA非常相似(氨基酸同一性>85％)并具有與tfdA相似的酶特性。然而，現(xiàn)在鑒定了與tfdA具有低水平同源性的小部分α-酮戊二酸依賴性雙加氧酶同源物。本發(fā)明部分涉及遠(yuǎn)緣酶sdpA新用途和功能的令人驚奇的發(fā)現(xiàn)，該酶來(lái)自食酸戴爾福特菌(Westendorf等，2002、2003)與tfdA具有低同源性(氨基酸同一性31％)。先前已經(jīng)顯示以其天然形式純化的這種α-酮戊二酸依賴性雙加氧酶可降解2，4-滴和S-2，4-滴丙酸(Westendorf等，2002和2003)。然而，先前已報(bào)道的α-酮戊二酸依賴性雙加氧酶均不具有降解吡啶氧乙酸化學(xué)類別除草劑的能力。從未在植物中表達(dá)過(guò)sdpA，也沒(méi)有動(dòng)機(jī)這樣做，部分是因?yàn)樾翲TC技術(shù)的開發(fā)已經(jīng)在很大程度上受到GTC的效能、低費(fèi)用和便利性的限制(Devine，2005)。根據(jù)新的活性，本發(fā)明的新蛋白質(zhì)和基因在本文中稱為AAD-12蛋白和基因。目前已證實(shí)AAD-12在體外降解多種苯氧乙酸類生長(zhǎng)素除草劑。然而，如本文所第一次報(bào)道的，驚奇地發(fā)現(xiàn)此酶還能降解芳氧基鏈烷酸酯類分子的其他底物。具有重要農(nóng)學(xué)意義的底物包括吡啶氧乙酸類生長(zhǎng)素除草劑。這一高度新穎的發(fā)現(xiàn)是重要的除草劑耐受作物(HTC)和選擇標(biāo)記物性狀可能性的基礎(chǔ)。此酶的獨(dú)特性在于其傳遞對(duì)一系列廣譜闊葉除草劑(苯氧乙酸類和吡啶氧乙酸類生長(zhǎng)素)的除草劑降解活性的能力。因此，本發(fā)明部分涉及通過(guò)重組表達(dá)的芳氧基鏈烷酸酯雙加氧酶(AAD-12)降解2，4-二氯苯氧乙酸、其他苯氧乙酸類生長(zhǎng)素除草劑和吡啶氧乙酸類除草劑。本發(fā)明還部分涉及編碼能降解苯氧基和/或吡啶氧基生長(zhǎng)素除草劑的芳氧基鏈烷酸酯雙加氧酶降解酶(AAD-12)的基因的鑒定和用途。本發(fā)明的酶可進(jìn)行轉(zhuǎn)基因表達(dá)，導(dǎo)致對(duì)控制幾乎所有闊葉雜草的除草劑組合的耐性。AAD-12可作為優(yōu)秀的除草劑耐受作物(HTC)性狀與例如其他HTC性狀(如草甘膦抗性、草銨膦抗性、ALS-抑制劑(如咪唑啉酮類、磺酰脲類、三唑并嘧啶磺酰胺類)抗性、溴草腈抗性、HPPD抑制劑抗性、PPO抑制劑抗性等)和昆蟲抗性性狀(Cry1F、Cry1Ab、Cry34/45、其他蘇云金芽孢桿菌(Bt)蛋白質(zhì)或非芽孢桿菌屬來(lái)源的殺蟲劑蛋白質(zhì)等)疊加。此外，AAD-12可作為選擇標(biāo)記物輔助選擇用另一個(gè)基因或基因群遺傳改造的植物的原代轉(zhuǎn)化體。此外，已經(jīng)重新設(shè)計(jì)了本發(fā)明的微生物基因，以使該蛋白質(zhì)由單子葉和雙子葉植物使用偏好的密碼子編碼(hemicot)。已經(jīng)用含有AAD-12的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化了擬南芥、玉米、煙草、棉花、大豆、蕓苔和稻，并已證明了對(duì)苯氧基和吡啶氧基生長(zhǎng)素除草劑的高水平抗性。因此，本發(fā)明還涉及編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的“植物優(yōu)化的”基因。氧基鏈烷酸酯(Oxyalkanoate)基團(tuán)可用于將穩(wěn)定的酸官能團(tuán)引入除草劑。酸性基團(tuán)可通過(guò)“酸捕獲”賦予韌皮部活動(dòng)性(除草劑作用所需的屬性)，從而可以為了活動(dòng)性目的而整合進(jìn)新除草劑。本發(fā)明的方面還提供產(chǎn)生HTC的機(jī)制。存在很多可能為AAD-12底物的市售和實(shí)驗(yàn)性除草劑。因此，使用本發(fā)明基因還可以導(dǎo)致對(duì)其他除草劑的除草劑耐性。本發(fā)明的HTC性狀可用在與其他HTC性狀(包括但不僅限于草甘膦耐性)的新組合中。由于對(duì)除草劑(如草甘膦)的新獲得的抗性或固有的耐性，這些性狀組合產(chǎn)生控制雜草(等)物種的新方法。因此，除了HTC性狀，本發(fā)明的范圍包括使用除草劑控制雜草的新方法，其中通過(guò)轉(zhuǎn)基因作物中的所述酶產(chǎn)生對(duì)所述除草劑的耐性。本發(fā)明可以用于使(例如)大豆中與目前的草甘膦抗性性狀疊加的2，4-滴抗性性狀商品化。因此，本發(fā)明提供對(duì)抗闊葉雜草物種演替和/或選擇除草劑抗性闊葉雜草的工具，所述任務(wù)由于種植者在多種作物的雜草控制中對(duì)草甘膦極高的依賴性而達(dá)到白熱化的程度。本發(fā)明AAD-12基因的轉(zhuǎn)基因表達(dá)示例于如擬南芥、煙草、大豆、棉花、稻、玉米和蕓苔。大豆是本發(fā)明優(yōu)選轉(zhuǎn)化的作物。不過(guò)，本發(fā)明可應(yīng)用于多種其他單子葉(如牧草禾本科或草坪草禾本科)和雙子葉作物(如苜蓿、三葉草、喬木物種等)。類似的，2，4-滴(或其他AAD-12底物)可更積極地用于耐性適中的禾本科作物中，由此性狀得到的提高的耐性將為種植者提供能以更有效的用量和更廣的施用時(shí)間來(lái)使用這些除草劑而無(wú)作物損傷風(fēng)險(xiǎn)的可能性。另外，本發(fā)明提供了可提供對(duì)控制闊葉雜草除草劑的抗性的單個(gè)基因。此基因可用于多種作物中，能使用廣譜除草劑組合。本發(fā)明還可控制對(duì)目前的化學(xué)品具有抗性的雜草，并輔助控制目前的農(nóng)業(yè)實(shí)踐產(chǎn)生的演替的雜草譜。本發(fā)明的AAD-12還可以用于將其他除草劑底物有效解毒成非除草劑形式的嘗試。因此，本發(fā)明提供了其他HTC性狀和/或選擇標(biāo)記物技術(shù)的發(fā)展。除了使用本發(fā)明基因產(chǎn)生HTC以外，本發(fā)明基因還可用作細(xì)胞培養(yǎng)物、溫室和大田中成功選擇轉(zhuǎn)化體的選擇標(biāo)記物。本發(fā)明基因僅作為生物技術(shù)工程的選擇標(biāo)記物就具有很高的內(nèi)在價(jià)值。AAD-12與其他芳氧基鏈烷酸酯生長(zhǎng)素除草劑的混雜性提供了將此基因用于HTC和/或選擇標(biāo)記物目的的許多可能。本發(fā)明的蛋白質(zhì)(和來(lái)源分離物)。本發(fā)明提供功能蛋白質(zhì)?！肮δ芑钚浴?或“活性”)在本文中指本發(fā)明用途的蛋白質(zhì)/酶(單獨(dú)或與其他蛋白質(zhì)組合)具有降解或減弱除草劑活性的能力。產(chǎn)生本發(fā)明蛋白質(zhì)的植物優(yōu)選產(chǎn)生“有效量”的蛋白質(zhì)，從而在用除草劑處理植物時(shí)，蛋白質(zhì)表達(dá)的水平足以給予植物對(duì)除草劑(若無(wú)特別說(shuō)明則為一般用量；一般應(yīng)用量可見于例如熟知的《HerbicideHandbook》(WeedScienceSocietyofAmerica，第八版，2002))完全或部分的抗性或耐性?？梢砸酝ǔ⑺腊兄参锏挠昧?、正常的大田用量和濃度使用除草劑(由于本發(fā)明，水平和/或濃度可以任選地比先前所使用的更高)。優(yōu)選地，本發(fā)明的植物細(xì)胞和植物被保護(hù)免受除草劑處理引起的生長(zhǎng)抑制或損傷。本發(fā)明的轉(zhuǎn)化植物和植物細(xì)胞優(yōu)選具有對(duì)本文討論的除草劑的抗性或耐性，即轉(zhuǎn)化的植物和植物細(xì)胞能在有效量的一種或多種本文討論的除草劑存在下生長(zhǎng)。本發(fā)明優(yōu)選的蛋白質(zhì)具有代謝一種或多種芳氧基鏈烷酸酯化合物的催化活性。不使用動(dòng)詞“耐受”或形容詞“耐性的”，人們就無(wú)法簡(jiǎn)單地討論術(shù)語(yǔ)“抗性”。工業(yè)界已花費(fèi)無(wú)數(shù)的時(shí)間爭(zhēng)論除草劑耐性作物(HTC)與除草劑抗性作物(HRC)。HTC是工業(yè)界優(yōu)選的術(shù)語(yǔ)。然而，權(quán)威的美國(guó)治草科學(xué)學(xué)會(huì)(WeedScienceSocietyofAmerica)對(duì)抗性的定義是“植物接觸通常對(duì)野生型致死劑量的除草劑后生存和繁殖的遺傳能力，在植物中抗性可以自然發(fā)生或由諸如遺傳工程的技術(shù)誘導(dǎo)產(chǎn)生或挑選通過(guò)組織培養(yǎng)或變異產(chǎn)生的突變體?！背瞧渌f(shuō)明，正如《TheHerbicideHandbook》在本發(fā)明公開遞交之日時(shí)的通用版本所建議的一樣，本文使用的除草劑“抗性”是可遺傳的，并允許植物在除草劑對(duì)給定植物進(jìn)行一般除草劑有效處理的情況下生長(zhǎng)和繁殖。正如本領(lǐng)域中技術(shù)人員認(rèn)可的，即使植物受到除草劑處理的一定損傷程度明顯，植物仍可被認(rèn)為“抗性”。如本文中所用的術(shù)語(yǔ)“耐性”比術(shù)語(yǔ)“抗性”更廣泛，并包括本文定義的“抗性”，以及特定植物具有的抵抗除草劑誘導(dǎo)的各種程度損傷的提高的能力，而在同樣的除草劑劑量下一般導(dǎo)致相同基因型野生型植物損傷。功能活性到植物或細(xì)菌系統(tǒng)的轉(zhuǎn)移可涉及編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)氨基酸序列的核酸序列，所述核酸序列整合進(jìn)蛋白質(zhì)表達(dá)載體，所述載體適于其將居留的宿主。獲得編碼具有功能活性的蛋白質(zhì)的核酸序列的一種方法是使用從本文公開的蛋白質(zhì)的氨基酸序列推出的信息，從產(chǎn)生目的蛋白質(zhì)的細(xì)菌物種中分離天然遺傳物質(zhì)。如下文更詳細(xì)討論的，可以優(yōu)化天然序列進(jìn)行例如植物表達(dá)。也可以基于蛋白質(zhì)序列設(shè)計(jì)優(yōu)化的多核苷酸。本發(fā)明提供具有本文所鑒定新活性的蛋白質(zhì)類別。表征這些蛋白質(zhì)類別和編碼它們的多核苷酸的一種方法是通過(guò)多核苷酸在一系列特定條件下與示例核苷酸序列(其互補(bǔ)物和/或來(lái)自任一鏈的一種或多種探針)雜交的能力和/或其使用來(lái)自示例序列的引物通過(guò)PCR被擴(kuò)增的能力來(lái)定義多核苷酸。有許多獲得本發(fā)明用途的蛋白質(zhì)的方法。例如，可以用本文所公開蛋白質(zhì)的抗體從蛋白質(zhì)混合物中鑒定和分離其他蛋白質(zhì)。具體的，可以針對(duì)蛋白質(zhì)中與其他相關(guān)蛋白質(zhì)相比最保守或最特殊的部分產(chǎn)生抗體。接著可使用這些抗體通過(guò)免疫沉淀、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)或免疫印跡來(lái)具體鑒定具有特征活性的等同蛋白質(zhì)?？梢允褂脴?biāo)準(zhǔn)方案便利的制備針對(duì)本文公開蛋白質(zhì)、或針對(duì)等同蛋白質(zhì)或針對(duì)這些蛋白質(zhì)的片段的抗體。這樣的抗體是本發(fā)明的一個(gè)方面。本發(fā)明的抗體包括單克隆抗體和多克隆抗體，優(yōu)選針對(duì)示例或提出的蛋白質(zhì)產(chǎn)生。本領(lǐng)域技術(shù)人員容易認(rèn)識(shí)到，可以從多種來(lái)源獲得本發(fā)明的蛋白質(zhì)(和基因)。由于已知完整的除草劑降解操縱子可編碼在轉(zhuǎn)座元件(如質(zhì)粒)上、以及整合在基因組中，因此可以從廣泛的多種微生物(如包括重組和/或野生型細(xì)菌)獲得本發(fā)明的蛋白質(zhì)。可以通過(guò)本領(lǐng)域所熟知的方案產(chǎn)生細(xì)菌分離物的突變體。例如，可以通過(guò)分離物的甲基磺酸乙酯(EMS)誘變來(lái)獲得不產(chǎn)孢子突變體?？梢酝ㄟ^(guò)本領(lǐng)域熟知的方案使用紫外光和亞硝基胍產(chǎn)生突變株?！皝?lái)自”或“得自”任意受試分離物的蛋白質(zhì)在本文中指該蛋白質(zhì)(或相似的蛋白質(zhì))可得自該分離物或其他一些來(lái)源，如其他細(xì)菌菌株或植物?！霸醋浴币簿哂羞@一含義，并包括可從經(jīng)修飾用于(例如)在植物中表達(dá)的給定類型的細(xì)菌獲得的蛋白質(zhì)。本領(lǐng)域技術(shù)人員容易理解，在細(xì)菌基因和蛋白質(zhì)公開后就可以改造植物以產(chǎn)生該蛋白質(zhì)。可以使用本文公開的多核苷酸和/或氨基酸序列制備抗體制劑、核酸探針(如DNA、RNA或PNA)等，并用于從其他(天然)來(lái)源篩選和回收其他相關(guān)基因?？梢允褂脴?biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)克隆和測(cè)序本文所述蛋白質(zhì)和基因。其他信息可見于本文引為參考的Sambrook等，1989。多核苷酸和探針。本發(fā)明還提供編碼本發(fā)明用途蛋白質(zhì)的核酸序列。本發(fā)明還提供鑒定和表征編碼具有所需除草劑活性的蛋白質(zhì)的基因的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供可作為雜交探針和/或PCR技術(shù)的引物使用的獨(dú)有核苷酸序列。引物產(chǎn)生可用于鑒定、表征和/或分離特定目的基因的特征性基因片段。本發(fā)明的核苷酸序列編碼與先前已描述蛋白質(zhì)不同的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的多核苷酸可用于形成完整“基因”，以在期望的宿主細(xì)胞中編碼蛋白質(zhì)或肽。例如，本領(lǐng)域技術(shù)人員容易了解，可以如本領(lǐng)域所熟知的那樣，在目的宿主中將本發(fā)明的多核苷酸適當(dāng)?shù)刂糜趩?dòng)子的控制之下?；虮磉_(dá)和時(shí)間/組織特異性表達(dá)的水平可極大地影響本發(fā)明的應(yīng)用。一般而言，降解基因蛋白質(zhì)較高水平的表達(dá)會(huì)導(dǎo)致底物(本文中為靶除草劑)更快更完全的降解。除非高表達(dá)對(duì)植物健康具有繼發(fā)的負(fù)面影響，一般期望啟動(dòng)子以高水平表達(dá)靶基因。為了在全部生長(zhǎng)階段中完全保護(hù)植物，一般希望AAD-12基因在所有組織中組成型表達(dá)。然而，也可以使用無(wú)性繁殖表達(dá)的抗性基因；這允許在植物中使用靶除草劑進(jìn)行雜草控制，接著通過(guò)在開花期使用來(lái)控制靶作物的有性繁殖。此外，表達(dá)所需的水平和時(shí)間還依賴于植物的類型和期望的耐性水平。一些的優(yōu)選的實(shí)施方案使用組合轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子等的強(qiáng)組成型啟動(dòng)子來(lái)增加表達(dá)水平和增強(qiáng)耐性至所需水平。在實(shí)施例部分之前，一些此類的應(yīng)用會(huì)在下面更詳細(xì)討論。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知，DNA一般以雙鏈形式存在。在這種排列下，一條鏈與另一條鏈互補(bǔ)，反之亦然。當(dāng)DNA在(例如)植物中復(fù)制時(shí)產(chǎn)生了額外的互補(bǔ)DNA鏈。本領(lǐng)域中經(jīng)常使用“編碼鏈”指代與反義鏈結(jié)合的鏈。mRNA轉(zhuǎn)錄自DNA的“反義”鏈。“有義”或“編碼”鏈具有一連串密碼子(密碼子是可以作為三殘基單位閱讀以指定特定氨基酸的三個(gè)核苷酸)，所述密碼子可以作為開放讀碼框(ORF)閱讀以形成目的蛋白質(zhì)或多肽。為在體內(nèi)產(chǎn)生蛋白質(zhì)，一般將DNA鏈轉(zhuǎn)錄成用作蛋白質(zhì)模板的mRNA互補(bǔ)鏈。因此，本發(fā)明包括所附序列表中所示的示例多核苷酸和/或等同物(包括互補(bǔ)鏈)的用途。與示例DNA分子功能性等同的RNA和PNA(肽核酸)也包含于本發(fā)明中。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，可以在使微生物高度增殖的條件下培養(yǎng)細(xì)菌分離物。在處理微生物以提供單鏈基因組核酸后，可以用本發(fā)明的引物與DNA接觸并進(jìn)行PCR擴(kuò)增。目的基因的特征性片段將通過(guò)該操作而得以擴(kuò)增，從而鑒定目的基因的存在。本發(fā)明的其他方面包括使用本文公開的方法和核苷酸序列鑒定的基因和分離物。所鑒定的基因可編碼本發(fā)明的除草劑抗性蛋白質(zhì)。可以通過(guò)如使用寡核苷酸探針鑒定和獲得本發(fā)明用途的蛋白質(zhì)和基因。這些探針為可檢測(cè)的核苷酸序列，所述核苷酸序列由于適當(dāng)?shù)臉?biāo)記可被檢測(cè)或如國(guó)際申請(qǐng)WO93/16094所述使其具有固有的熒光性。探針(和本發(fā)明的多核苷酸)可以是DNA、RNA或PNA。除了腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、鳥嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U，RNA分子中)之外，本發(fā)明的合成探針(和多核苷酸)還可以含有肌苷(能與全部四種堿基配對(duì)的中性堿基，有時(shí)用于在合成探針中代替全部四種堿基的混合物)和/或其他合成的(非天然)堿基。因此，當(dāng)本文中提到合成的簡(jiǎn)并寡核苷酸時(shí)一般使用“N”或“n”，“N”或“n”可以是G、A、T、C或肌苷。本文使用的多義密碼子與提交本申請(qǐng)時(shí)的標(biāo)準(zhǔn)IUPAC命名慣例一致(如R為A或G、Y為C或T等)。如本領(lǐng)域所熟知，如果探針?lè)肿优c核酸樣品雜交，可以合理的假設(shè)探針和樣品具有顯著同源性/相似性/同一性。優(yōu)選地，首先進(jìn)行多核苷酸雜交，之后使用本領(lǐng)域所熟知的技術(shù)在低、中或高嚴(yán)格條件下進(jìn)行洗滌，如Keller，G.H.，M.M.Manak(1987)《DNAProbes》，StocktonPress，NewYork，NY，169-170頁(yè)中所述。例如，如文中所述，可以通過(guò)首先在室溫用2×SSC(標(biāo)準(zhǔn)檸檬酸鹽水)/0.1％SDS(十二烷基硫酸鈉)洗滌15分鐘來(lái)得到低嚴(yán)格條件。一般進(jìn)行兩次洗滌。然后可以通過(guò)降低鹽濃度和/或通過(guò)提高溫度得到較高的嚴(yán)格度。例如，在上述洗滌之后可以接著在室溫用0.1×SSC/0.1％SDS洗滌兩次，每次15分鐘，然后在55℃用0.1×SSC/0.1％SDS接著洗滌30分鐘。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知，這些溫度可以與本文所示的其他雜交和洗滌方案一起使用(例如可以用SSPE代替SSC作為鹽使用)。可以通過(guò)向445ml水中加入50ml20×SSC和5ml10％SDS制備2×SSC/0.1％SDS。可以通過(guò)混合NaCl(175.3g/0.150M)、檸檬酸鈉(88.2g/0.015M)和水，用10NNaOH調(diào)整pH至7.0，然后將體積調(diào)整至1升來(lái)制備20×SSC?？梢酝ㄟ^(guò)將10gSDS溶解到50ml高壓滅菌水中，然后稀釋到100ml來(lái)制備10％SDS。檢測(cè)探針提供了用已知方式測(cè)定是否保持了雜交的方法。這樣的探針?lè)治鎏峁┝髓b定本發(fā)明基因的快速方法?？梢允褂肈NA合成儀和標(biāo)準(zhǔn)程序合成本發(fā)明用作探針的核苷酸片段。這些核苷酸片段還可以用作PCR引物以擴(kuò)增本發(fā)明的基因?？梢杂梅肿拥碾s交特征定義本發(fā)明的多核苷酸。因此本發(fā)明包括與本文示例的多核苷酸雜交的多核苷酸(和/或其互補(bǔ)物、優(yōu)選其全長(zhǎng)互補(bǔ)物)。即，定義基因(和其編碼的蛋白質(zhì))的一種方法是通過(guò)其與已知或具體示例的基因(在本文具體公開的任意條件下)雜交的能力。本文使用的“嚴(yán)格”雜交條件指實(shí)現(xiàn)與本申請(qǐng)人所使用條件相同或大致相同程度雜交特異性的條件。具體地，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行固定在Southern(DNA雜交)印跡上的DNA與32P標(biāo)記的基因特異性探針的雜交(參閱如Maniatis等，1982)。一般在允許檢測(cè)靶序列的條件下進(jìn)行雜交和其后的洗滌。對(duì)于雙鏈DNA基因探針，在6×SSPE、5×Denhardt溶液、0.1％SDS、0.1mg/ml變性DNA中在DNA雜合體解鏈溫度(Tm)以下20-25℃進(jìn)行過(guò)夜雜交。按下式描述解鏈溫度(Beltz等，1983)：Tm＝81.5℃+16.6Log[Na+]+0.41(G+C％)-0.61(甲酰胺％)-600/雙鏈體堿基對(duì)長(zhǎng)度一般如下述進(jìn)行洗滌：(1)在1×SSPE、0.1％SDS中室溫15分鐘洗滌兩次(低嚴(yán)格洗滌)。(2)在0.2×SSPE、0.1％SDS中在Tm-20℃15分鐘洗滌一次(中等嚴(yán)格洗滌)。對(duì)于寡核苷酸探針，在6×SSPE、5×Denhardt溶液、0.1％SDS、0.1mg/ml變性DNA中在雜合體解鏈溫度(Tm)以下10-20℃進(jìn)行過(guò)夜雜交。按下式確定寡核苷酸探針的Tm：Tm(℃)＝2(T/A堿基對(duì)數(shù))+4(G/C堿基對(duì)數(shù))(Suggs等，1981)。一般如下述進(jìn)行洗滌：(1)在1×SSPE、0.1％SDS中室溫15分鐘洗滌兩次(低嚴(yán)格洗滌)。(2)在1×SSPE、0.1％SDS中在雜交溫度15分鐘洗滌一次(中等嚴(yán)格洗滌)。一般可以改變鹽和/或溫度以改變嚴(yán)格度。對(duì)于長(zhǎng)度＞70左右堿基的標(biāo)記DNA片段，可以使用以下條件：低：1或2×SSPE，室溫低：1或2×SSPE，42℃中：0.2×或1×SSPE，65℃高：0.1×SSPE，65℃。雙鏈體的形成和穩(wěn)定依賴于雜合體兩條鏈間的顯著互補(bǔ)性，且如上文所提到的，某種程度的錯(cuò)配是允許的。因此，本發(fā)明的探針序列包括所述序列的突變(單突變和多重突變均包括在內(nèi))、缺失、插入及其組合，其中所述突變、插入和缺失允許與目的靶多核苷酸形成穩(wěn)定的雜合體。可以以多種方法在給定的多核苷酸序列中產(chǎn)生突變、插入和缺失，這些方法為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所共知。其他方法可在將來(lái)逐漸被了解。PCR技術(shù)。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)是核酸序列的引發(fā)式重復(fù)性酶合成。此方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知并普遍使用(參閱Mullis，美國(guó)專利No.4,683,195、4,683,202和4,800,159；Saiki等，1985)。PCR是基于目的DNA片段的酶擴(kuò)增，所述DNA片段兩側(cè)側(cè)接與靶序列相反鏈雜交的兩個(gè)寡核苷酸引物。引物優(yōu)選在3’末端彼此指向?qū)Ψ?。模板熱變性、引物與其互補(bǔ)序列退火和用DNA聚合酶延伸退火引物的重復(fù)循環(huán)導(dǎo)致所述PCR引物5’末端所界定片段的擴(kuò)增。每一引物的延伸產(chǎn)物可作為其他引物的模板，因此每個(gè)循環(huán)基本上倍增前一循環(huán)中產(chǎn)生的DNA片段數(shù)量。這導(dǎo)致特定靶片段的指數(shù)積累，可在幾小時(shí)內(nèi)多達(dá)數(shù)百萬(wàn)倍。通過(guò)使用熱穩(wěn)定的DNA聚合酶(如分離自水生棲熱菌(Thermusaquaticus)的Taq聚合酶)能完全自動(dòng)地完成擴(kuò)增過(guò)程?？梢允褂玫钠渌笧楸绢I(lǐng)域技術(shù)人員所公知。示例DNA序列或其片段能用作PCR擴(kuò)增的引物。在PCR擴(kuò)增中，引物和模板間某種程度的錯(cuò)配是可以接受的。因此，示例引物的突變、缺失和插入(特別是在5’末端加入核苷酸)在本發(fā)明的范圍內(nèi)?？梢酝ㄟ^(guò)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的方法在給定的引物中產(chǎn)生突變、插入和缺失?；蚝偷鞍踪|(zhì)的修飾。本發(fā)明的基因和蛋白質(zhì)能與其他基因和蛋白質(zhì)融合以產(chǎn)生嵌合或融合蛋白。用于本發(fā)明的基因和蛋白質(zhì)不僅包括具體示例的全長(zhǎng)序列，還包括這些序列的部分、區(qū)段和/或片段(包括連續(xù)片段和與全長(zhǎng)分子相比內(nèi)部和/或末端缺失)、其變體、突變體、嵌合體和融合物。只要保留所需的功能活性，本發(fā)明的蛋白質(zhì)可以具有取代的氨基酸?！白凅w”基因具有編碼與示例蛋白質(zhì)具有等同或相似的活性的相同蛋白質(zhì)或等同蛋白質(zhì)的核苷酸序列。用天然aad-12核苷酸序列進(jìn)行BLAST搜索的最上面兩個(gè)結(jié)果，顯示超過(guò)120個(gè)堿基對(duì)序列的合理同源性水平(大約85％)。在某種條件下可預(yù)期雜交包括這兩種序列。參閱GENBANK登錄號(hào)DQ406818.1(89329742；紅育菌屬(Rhodoferax))和AJ6288601.1(44903451；鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas))。紅育菌屬與戴爾福特菌屬(Delftia)非常相似，但是鞘氨醇單胞菌屬是系統(tǒng)發(fā)育學(xué)上完全不同的類型。術(shù)語(yǔ)“變體蛋白質(zhì)”和“等同蛋白質(zhì)”指對(duì)靶底物具有相同或基本相同的生物/功能活性的蛋白質(zhì)和與示例蛋白質(zhì)具有等同序列的蛋白質(zhì)。本文所使用的“等同”序列指含有提高或不對(duì)活性產(chǎn)生顯著不利影響的氨基酸取代、缺失、添加或插入的序列。保留活性的片段也包含于此定義中。保留了如示例蛋白質(zhì)相應(yīng)片段的相同或相似功能或活性的片段和其他等同物在本發(fā)明的范圍內(nèi)?？梢詾榱硕喾N目的(如(不嚴(yán)重/顯著降低蛋白質(zhì)功能活性地)提高(或降低)蛋白質(zhì)的蛋白酶穩(wěn)定性、去除或加入限制性位點(diǎn)等)產(chǎn)生變化，如氨基酸取代或添加。例如，可以使用產(chǎn)生點(diǎn)突變的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)便利地構(gòu)建基因的變異。另外，如美國(guó)專利No.5,605,793描述了在隨機(jī)或聚焦破碎后通過(guò)DNA重組裝產(chǎn)生額外的分子多樣性的方法。這可稱為基因“改組”，一般包括混合兩種或更多不同DNA分子的(所需大小的)片段，接著重復(fù)若干輪的復(fù)性。這可以改進(jìn)起始基因所編碼蛋白質(zhì)的活性。結(jié)果為具有改進(jìn)的活性、改變的底物特異性、提高的酶穩(wěn)定性、改變的立體特異性或其他特征的嵌合蛋白。得到并檢查目的蛋白質(zhì)的原子3D(三維)坐標(biāo)和晶體結(jié)構(gòu)之后可設(shè)計(jì)并靶向“改組”。因此，可以針對(duì)修飾理想的蛋白質(zhì)的某些片段，如表面暴露的片段進(jìn)行“聚焦改組”，且優(yōu)選不是參與蛋白質(zhì)折疊和基本的3D結(jié)構(gòu)完整性的內(nèi)部片段。可對(duì)酶“活性點(diǎn)位”進(jìn)行特定變化，以影響固有的與活性或立體特異性有關(guān)的功能性(參閱比對(duì)圖2)。Mullery等(2006)。利用與其固有的底物?；撬峤Y(jié)合時(shí)的已知tauD晶體結(jié)構(gòu)作為雙加氧酶模型確定活性位點(diǎn)殘基。Elkins等(2002)“X-raycrystalstructureofEscerichiacolitaurine/alpha-ketoglutaratedioxygenasecomplexedtoferrousironandsubstrates，”Biochemistry41(16)：5185-5192。關(guān)于酶活位點(diǎn)的序列優(yōu)化和設(shè)計(jì)參閱Chakrabarti等，PNAS，(2005年8月23日)，102(34)：12035-12040?？衫米凅w基因產(chǎn)生變體蛋白質(zhì)；可以使用重組宿主產(chǎn)生變體蛋白質(zhì)。使用這些“基因改組”技術(shù)可以構(gòu)建含有本文示例的任何序列中任何5、10或20個(gè)連續(xù)殘基(氨基酸或核苷酸)的等同基因和蛋白質(zhì)。例如，如本領(lǐng)域技術(shù)人員所了解的，可以調(diào)整基因改組技術(shù)以獲得具有如與任何示例或提出的序列(或其互補(bǔ)物(全長(zhǎng)互補(bǔ)物))中(相同大小)的片段相對(duì)應(yīng)的3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292或293個(gè)連續(xù)殘基(氨基酸或核苷酸)的等同物。類似大小的片段特別是保守區(qū)的片段也能作為探針和/或引物?？梢愿鶕?jù)標(biāo)準(zhǔn)方法使用市售的外切核酸酶或內(nèi)切核酸酶產(chǎn)生全長(zhǎng)基因的片段。例如，可以使用酶如(Bal31)或定點(diǎn)誘變從這些基因的末端系統(tǒng)地切除核苷酸。還可以使用多種限制性酶獲得編碼活性片段的基因?？梢允褂玫鞍酌钢苯荧@得這些蛋白質(zhì)的活性片段。如本文所公開的，可以截短蛋白質(zhì)而仍保留功能活性，這在本發(fā)明的范圍內(nèi)?！敖囟痰牡鞍踪|(zhì)”指蛋白質(zhì)的部分可被切割，而切割后剩下的截短的蛋白質(zhì)仍保留并表現(xiàn)所需活性?？梢酝ㄟ^(guò)多種蛋白酶進(jìn)行切割。另外，使用分子生物學(xué)技術(shù)能產(chǎn)生有效切割的蛋白質(zhì)，其中通過(guò)用限制性內(nèi)切核酸酶消化或本領(lǐng)域技術(shù)人員可使用的其他技術(shù)去除編碼所述蛋白質(zhì)的DNA堿基。截短后，可以在異源系統(tǒng)(如大腸桿菌、桿狀病毒、基于植物的病毒系統(tǒng)、酵母等)中表達(dá)所述蛋白質(zhì)，然后置于本文公開的昆蟲實(shí)驗(yàn)中測(cè)定活性。如本領(lǐng)域所熟知，可以成功地產(chǎn)生小于完整的全長(zhǎng)序列而保留功能活性的截短蛋白質(zhì)。例如，可以以截短(核心蛋白質(zhì))形式使用Bt蛋白質(zhì)(參閱如等(1989)和Adang等，(1985))。本文所使用的術(shù)語(yǔ)“蛋白質(zhì)”包括功能活性的截短物。在一些情況下(特別是植物中的表達(dá))，使用表達(dá)截短蛋白質(zhì)的截短基因是有利的。優(yōu)選的截短基因一般編碼全長(zhǎng)蛋白質(zhì)的40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％。本發(fā)明的某些蛋白質(zhì)已在本文中具體示例。由于這些蛋白質(zhì)僅是本發(fā)明蛋白質(zhì)的范例，很顯然本發(fā)明包括具有與示例蛋白質(zhì)相同或相似活性的變體或等同蛋白質(zhì)(和編碼其等同物的核苷酸序列)。等同蛋白質(zhì)與示例蛋白質(zhì)具有氨基酸相似性(和/或同源性)。氨基酸同一性一般至少為60％，優(yōu)選至少為75％，更優(yōu)選至少為80％，甚至更優(yōu)選至少為90％并可以至少為95％。還可以根據(jù)更具體的同一性和/或相似性范圍定義本發(fā)明優(yōu)選的蛋白質(zhì)。例如，與本文示例或提出的序列相比，同一性和/或相似性可以為49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％。上文列出的任意數(shù)字可用于定義上限和下限。除非另有說(shuō)明，使用如Karlin和Altschul(1993)中所改良的Karlin和Altschul(1990)算法測(cè)定本文所用的兩個(gè)核酸的序列同一性和/或相似性百分比。這樣的算法整合在Altschul等(1990)的NBLAST和XBLAST程序中。使用NBLAST程序進(jìn)行BLAST核苷酸搜索，評(píng)分＝100、字寬＝12?？梢匀鏏ltschul等(1997)中所述使用GappedBLAST。使用BLAST和GappedBLAST程序時(shí)，使用程序(NBLAST和XBLAST)各自的默認(rèn)參數(shù)。參閱NCBI/NIH網(wǎng)址。使用默認(rèn)參數(shù)用VectorNTISuite8(InforMax有限公司，NorthBethesda，MD，U.S.A)中的AlignX函數(shù)得到用于比較目的的空位容許比對(duì)。它們是：空位開放罰分15、空位延伸罰分6.66和空位分隔罰分范圍8。還可以改變蛋白質(zhì)的多種特性和三維特征而不對(duì)蛋白質(zhì)的活性/功能性產(chǎn)生不利影響。保守性氨基酸取代是可以接受的/可以進(jìn)行而不對(duì)分子的活性和/或三維構(gòu)型產(chǎn)生不利影響。氨基酸可按以下分類：非極性、極性不帶電荷、堿性和酸性。只要取代不損害化合物的生物活性，則一類氨基酸被同類其他氨基酸替換的保守取代落在本發(fā)明的范圍內(nèi)。表2提供屬于每一類的氨基酸實(shí)例列表。在一些情況下，還可以進(jìn)行非保守取代。然而，優(yōu)選的取代不顯著降低蛋白質(zhì)的功能/生物活性。本文提到的“分離的”多核苷酸和/或“純化的”蛋白質(zhì)是指這些分子不伴隨有與其天然共存的其他分子。因此，提到“分離的”和/或“純化的”表示與本文所述的“人為”相關(guān)。例如，放入植物進(jìn)行表達(dá)的本發(fā)明細(xì)菌“基因”是“分離的多核苷酸”。同樣，植物所產(chǎn)生的來(lái)自細(xì)菌蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)是“分離的蛋白質(zhì)”。由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性/冗余性，多種不同的DNA序列可以編碼本文公開的氨基酸序列。產(chǎn)生編碼相同或基本相同蛋白質(zhì)的替代DNA序列在受本領(lǐng)域訓(xùn)練的技術(shù)人員的能力范圍內(nèi)。這些變體DNA序列在本發(fā)明的范圍內(nèi)。在下文標(biāo)題為“用于植物表達(dá)的序列優(yōu)化”的章節(jié)中對(duì)此也有更詳細(xì)的描述。用于植物表達(dá)的序列優(yōu)化。為了在植物中實(shí)現(xiàn)異源基因的高表達(dá)，通常優(yōu)選重新設(shè)計(jì)所述基因以使其在植物細(xì)胞(的胞質(zhì))中更有效的表達(dá)。玉米就是這樣的一種植物，其中在轉(zhuǎn)化前重新設(shè)計(jì)異源基因以提高其在所述植物中的表達(dá)水平可能是優(yōu)選的。因此，在設(shè)計(jì)編碼細(xì)菌蛋白質(zhì)的基因中額外的步驟是使用與靶植物序列(雙子葉或單子葉物種)比對(duì)更接近的密碼子偏好性重新改造異源基因以得到最優(yōu)表達(dá)。還可以優(yōu)化序列以在本文別處討論的更多具體類型植物中的任意一種中進(jìn)行表達(dá)。轉(zhuǎn)基因宿主?？梢詫⒈景l(fā)明的蛋白質(zhì)編碼基因引入多種微生物或植物宿主中。本發(fā)明包括轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因植物。優(yōu)選的植物(和植物細(xì)胞)為玉米、擬南芥、煙草、大豆、棉花、蕓苔、稻、小麥、草坪草、豆科植物草料(如苜蓿和三葉草)和牧草等等。還可以根據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生其他類型的轉(zhuǎn)基因植物，如水果、蔬菜、觀賞植物和樹木。更一般的，雙子葉植物和/或單子葉植物可用于本發(fā)明的多個(gè)方面。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，基因的表達(dá)直接或間接導(dǎo)致目的蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的產(chǎn)生(和保持)。植物可以以這種方式得到除草劑抗性。這類宿主可以指轉(zhuǎn)基因、重組、轉(zhuǎn)化和/或轉(zhuǎn)染的宿主和/或細(xì)胞。在本發(fā)明的一些方面(例如克隆和制備目的基因)，可以受益于本發(fā)明的公開內(nèi)容根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)產(chǎn)生和使用微生物(優(yōu)選細(xì)菌)細(xì)胞。轉(zhuǎn)染了本發(fā)明多核苷酸的植物細(xì)胞可以再生為整個(gè)植株。本發(fā)明包括細(xì)胞培養(yǎng)物，包括組織細(xì)胞培養(yǎng)物、液體培養(yǎng)物和固體平板培養(yǎng)物。由本發(fā)明植物所產(chǎn)生和/或用于再生本發(fā)明植物的種子也包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。其他植物組織和部分也包括在本發(fā)明中。本發(fā)明同樣包括產(chǎn)生含有本發(fā)明多核苷酸的植物或細(xì)胞的方法。產(chǎn)生這類植物的一種優(yōu)選方法為通過(guò)種植本發(fā)明的種子。盡管可以優(yōu)選植物，本發(fā)明還包括在如熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens，Pf)宿主菌株中產(chǎn)生高活性的重組AAD-12。本發(fā)明包括優(yōu)選的生長(zhǎng)溫度、發(fā)酵條件、純化方法、純化方案、配制方法以及凍干方法：其中所述生長(zhǎng)溫度以在宿主中保持可溶性的活性AAD-12；所述發(fā)酵條件產(chǎn)生的AAD-12超過(guò)總細(xì)胞蛋白質(zhì)的40％或者至少10g/L；所述純化方法導(dǎo)致來(lái)自pf宿主的活性重組AAD-12的高回收；所述純化方案每Kg細(xì)胞生產(chǎn)至少10g活性AAD-12；所述純化方案每Kg細(xì)胞能產(chǎn)生20g活性AAD-12；所述配制方法能在溶液中貯存和復(fù)原AAD-12活性；而所述凍干方法能長(zhǎng)貯藏期和保質(zhì)期地保留AAD-12活性。插入基因以形成轉(zhuǎn)基因宿主。本發(fā)明的一個(gè)方面是用表達(dá)本發(fā)明蛋白質(zhì)的本發(fā)明多核苷酸轉(zhuǎn)化/轉(zhuǎn)染植物、植物細(xì)胞和其他宿主細(xì)胞。以這種方式轉(zhuǎn)化的植物可以獲得對(duì)多種具有不同作用模式的除草劑的抗性?？梢允褂枚喾N方法在允許穩(wěn)定保持和表達(dá)基因的條件下將編碼所需蛋白質(zhì)的基因引入靶宿主。這些方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知，并描述于如美國(guó)專利No.5,135,867。含有AAD-12多核苷酸的載體包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。例如，大量克隆載體可用于將外來(lái)基因插入到高等植物中，所述載體含有大腸桿菌復(fù)制系統(tǒng)和允許選擇轉(zhuǎn)化的細(xì)胞的標(biāo)記。載體包括如pBR322、pUC系列、M13mp系列、pACYC184等。因此，可以在合適的限制性位點(diǎn)將編碼蛋白質(zhì)的序列插入載體。得到的質(zhì)粒用于轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌中。在合適的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基上培養(yǎng)大腸桿菌細(xì)胞，然后收獲并裂解。通過(guò)純化從基因組DNA中回收質(zhì)粒。作為分析方法，一般進(jìn)行序列分析、限制性分析、電泳和其他生物化學(xué)-分子生物學(xué)方法。每次操作之后，可以限制性消化所使用的DNA序列并與下一個(gè)DNA序列連接。每個(gè)質(zhì)粒序列都可以克隆到同一個(gè)或其他質(zhì)粒中。取決于將所需基因插入到植物中的方法，其他DNA序列可能是必要的。例如，如果使用Ti或Ri質(zhì)粒轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，則必須連接Ti或Ri質(zhì)粒T-DNA序列的至少右邊界(但常為右邊界和左邊界)作為待插入基因的側(cè)翼區(qū)域。T-DNA用于轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的用途已在EP120516、Hoekema(1985)、Fraley等(1986)和An等(1985)中有深入的研究和描述。大量技術(shù)可用于將DNA插入植物宿主細(xì)胞。這些技術(shù)包括使用根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)或發(fā)根農(nóng)桿菌(Agrobacteriumrhizogenes)作為轉(zhuǎn)化劑用T-DNA轉(zhuǎn)化、融合、注射、生物射彈(微粒轟擊)、碳化硅晶須、氣溶膠柱、PEG或電穿孔以及其他可能的方法。如果用農(nóng)桿菌進(jìn)行轉(zhuǎn)化，必須將待插入的DNA克隆進(jìn)特殊的質(zhì)粒中，即中間載體或二元載體中。由于存在與T-DNA中序列同源的序列，中間載體可以通過(guò)同源重組整合進(jìn)Ti或Ri質(zhì)粒。Ti或Ri質(zhì)粒還含有轉(zhuǎn)移T-DNA所必需的vir區(qū)。中間載體不能在農(nóng)桿菌中自我復(fù)制。可以通過(guò)輔助質(zhì)粒(接合)將中間載體轉(zhuǎn)移到根癌農(nóng)桿菌中。二元載體在大腸桿菌和農(nóng)桿菌中都可以自我復(fù)制。它們含有選擇標(biāo)記基因和接頭或多聚接頭，兩側(cè)為右和左T-DNA邊界區(qū)。它們可以直接轉(zhuǎn)化進(jìn)農(nóng)桿菌中(Holsters等，1978)。作為宿主細(xì)胞的農(nóng)桿菌含有攜帶vir區(qū)的質(zhì)粒。vir區(qū)是將T-DNA轉(zhuǎn)移進(jìn)植物細(xì)胞所必需的。還可以含有額外的T-DNA。將這樣轉(zhuǎn)化的細(xì)菌用于轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞?？梢杂欣赜酶┺r(nóng)桿菌或發(fā)根農(nóng)桿菌培養(yǎng)植物外植體，以將DNA轉(zhuǎn)移進(jìn)植物細(xì)胞。然后可以在合適的培養(yǎng)基中從感染的植物材料(如葉碎片、莖節(jié)段、根以及原生質(zhì)體或懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞)再生完整植物，所述培養(yǎng)基可以含有用于選擇的抗生素或殺蟲劑。然后可以測(cè)試這樣得到的植物中插入DNA的存在。在注射和電穿孔的情況下質(zhì)粒沒(méi)有特殊的要求。可以使用普通質(zhì)粒，如pUC衍生物。轉(zhuǎn)化細(xì)胞以通常的方式在植物中生長(zhǎng)。它們可以形成生殖細(xì)胞并將轉(zhuǎn)化的性狀傳遞到子代植物。這樣的植物能以正常方式培養(yǎng)并與具有相同轉(zhuǎn)化遺傳因子或其他遺傳因子的植物雜交。得到的雜合個(gè)體具有相應(yīng)的表型特性。在本發(fā)明一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，從插入植物基因組的轉(zhuǎn)錄單位表達(dá)編碼細(xì)菌蛋白質(zhì)的基因。優(yōu)選地，所述轉(zhuǎn)錄單位是重組載體，所述重組載體能夠穩(wěn)定整合進(jìn)植物基因組，并使得可以選擇表達(dá)編碼蛋白質(zhì)的mRNA的轉(zhuǎn)化植物株系。插入DNA一旦整合進(jìn)基因組，則相對(duì)穩(wěn)定(并不再釋放出來(lái))。它一般包含賦予轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞對(duì)殺蟲劑或抗生素(如卡那霉素、G418、博來(lái)霉素、潮霉素或氯霉素等)抗性的選擇標(biāo)記。植物選擇標(biāo)記一般還提供對(duì)多種除草劑(如草銨膦(如PAT/bar)、草甘膦(EPSPS)、ALS抑制劑(如咪唑啉酮類、磺酰脲類、三唑并嘧啶磺酰胺類等)、溴草腈、HPPD抑制劑抗性、PPO抑制劑、ACC-ase酶抑制劑及許多其他除草劑)的抗性。單獨(dú)使用的標(biāo)記應(yīng)相應(yīng)允許選擇轉(zhuǎn)化細(xì)胞而非不含插入DNA的細(xì)胞。目的基因在植物細(xì)胞中優(yōu)選由組成型或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子表達(dá)。mRNA一旦表達(dá)之后，就被翻譯成蛋白質(zhì)，從而將目的氨基酸摻入蛋白質(zhì)中。在植物細(xì)胞中表達(dá)的編碼蛋白質(zhì)的基因可以在組成型啟動(dòng)子、組織特異性啟動(dòng)子或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的控制下。存在若干將外來(lái)重組載體引入植物細(xì)胞以及獲得穩(wěn)定保持和表達(dá)引入基因的植物的技術(shù)。這類技術(shù)包括將包裹在微粒上的遺傳物質(zhì)直接引入細(xì)胞(Cornell的美國(guó)專利No.4,945,050和DowElanco公司現(xiàn)為陶氏益農(nóng)公司(DowAgroSciences，LLC)的US5,141,131)。此外，可以使用農(nóng)桿菌技術(shù)轉(zhuǎn)化植物，參閱托萊多大學(xué)(UniversityofToledo)的美國(guó)專利No.5,177,010；德克薩斯農(nóng)工大學(xué)(TexasA&M)的US5,104,310；歐洲專利申請(qǐng)0131624B1；Schilperoot的歐洲專利申請(qǐng)120516、159418B1和176112；Schilperoot的美國(guó)專利No.5,149,645、5,469,976、5,464,763和4,940,838和4,693,976；MaxPlanck的歐洲專利申請(qǐng)116718、290799、320500；日本煙草公司(JapanTobacco)的歐洲專利申請(qǐng)604662和627752和美國(guó)專利No.5,591,616；汽巴-嘉基公司(CibaGeigy)現(xiàn)為先正達(dá)公司(Syngenta)的歐洲專利申請(qǐng)0267159和0292435和美國(guó)專利No.5,231,019；Calgene公司的美國(guó)專利No.5,463,174和4,762,785和艾格瑞斯特公司(Agracetus)的美國(guó)專利No.5,004,863和5,159,135。其他轉(zhuǎn)化技術(shù)包括晶須技術(shù)。參閱捷利康公司(Zeneca)現(xiàn)為先正達(dá)公司(Syngenta)的美國(guó)專利No.5,302,523和5,464,765。其他直接DNA遞送的轉(zhuǎn)化技術(shù)包括氣溶膠柱技術(shù)。參閱美國(guó)專利No.6,809,232。還可以使用電穿孔技術(shù)轉(zhuǎn)化植物。參閱鮑依斯·湯普森研究所(BoyceThompsonInstitute)的WO87/06614；迪卡布公司(Dekalb)的美國(guó)專利No.5,472,869和5,384,253和植物遺傳系統(tǒng)公司(PlantGeneticSystems)的WO92/09696和WO93/21335。另外，也可以用病毒載體產(chǎn)生表達(dá)目的蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)基因植物。例如，可以用麥克津植物科學(xué)有限公司(MycogenPlantScience)和汽巴-嘉基公司(Ciba-Giegy)(現(xiàn)為先正達(dá)公司(Syngenta))的美國(guó)專利No.5,569,597以及生物資源公司(Biosource)現(xiàn)為大型生物公司(LargeScaleBiology)的美國(guó)專利No.5,589,367和5,316,931中所述的方法用病毒載體轉(zhuǎn)化單子葉植物。如前所述，將DNA構(gòu)建體引入植物宿主的方法對(duì)于本發(fā)明不是關(guān)鍵的。任何提供有效轉(zhuǎn)化的方法都可以使用。例如，本文描述了多種植物細(xì)胞轉(zhuǎn)化的方法并包括使用Ti或Ri質(zhì)粒等進(jìn)行農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化。在許多情況下，期望用T-DNA邊界(更具體地為右邊界)與用于轉(zhuǎn)化的構(gòu)建體的一側(cè)或兩側(cè)相連。這在構(gòu)建體使用根癌農(nóng)桿菌或發(fā)根農(nóng)桿菌作為轉(zhuǎn)化模式時(shí)特別有用，不過(guò)T-DNA邊界也可在其他轉(zhuǎn)化模式中使用。在將農(nóng)桿菌用于植物細(xì)胞轉(zhuǎn)化時(shí)，可以使用能引入宿主以與宿主中存在的T-DNA或Ti或Ri質(zhì)粒同源重組的載體?？梢酝ㄟ^(guò)電穿孔、三親雜交和本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的用于轉(zhuǎn)化革蘭氏陰性菌的其他技術(shù)進(jìn)行載體引入。載體轉(zhuǎn)化進(jìn)農(nóng)桿菌宿主的方式對(duì)于本發(fā)明不是關(guān)鍵的。含有用于重組的T-DNA的Ti或Ri質(zhì)?？梢阅軌蚧虿荒芤鹆鲂纬?，只要所述宿主中存在vir基因，這對(duì)本發(fā)明就不是關(guān)鍵的。將農(nóng)桿菌用于轉(zhuǎn)化時(shí)，在一些情況下，將T-DNA邊界內(nèi)的表達(dá)構(gòu)建體插入廣譜載體如pRK2或其衍生物中，如Ditta等(1980)和EPO0120515中所述。表達(dá)構(gòu)建體和T-DNA內(nèi)包括一個(gè)或多個(gè)如本文所述允許選擇轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌和轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的標(biāo)記。使用的具體標(biāo)記對(duì)于本發(fā)明并不重要，優(yōu)選的標(biāo)記物取決于所使用的宿主和構(gòu)建體。為了用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，可以將外植體與轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌混合并孵育足夠的時(shí)間以允許其轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化后，通過(guò)用適當(dāng)抗生素的選擇殺死農(nóng)桿菌，并用適當(dāng)?shù)倪x擇培養(yǎng)基培養(yǎng)植物細(xì)胞。一但形成愈傷組織，可以根據(jù)植物組織培養(yǎng)和植物再生領(lǐng)域熟知的方法通過(guò)使用適當(dāng)?shù)闹参锛に卮龠M(jìn)芽形成。然而，愈傷組織中間期并不總是必要的。芽形成以后，可以將所述植物細(xì)胞轉(zhuǎn)移到促進(jìn)根形成的培養(yǎng)基，從而完成植物再生。然后可以培養(yǎng)植物產(chǎn)生種子，所述種子可以用于建立將來(lái)的世代。不論轉(zhuǎn)化技術(shù)如何，優(yōu)選將編碼細(xì)菌蛋白質(zhì)的基因整合進(jìn)基因轉(zhuǎn)移載體中，通過(guò)在載體中納入植物啟動(dòng)子調(diào)節(jié)元件以及3’非翻譯轉(zhuǎn)錄終止區(qū)(如Nos等)使所述轉(zhuǎn)移載體適于在植物細(xì)胞中表達(dá)該基因。除了用于轉(zhuǎn)化植物的大量技術(shù)之外，與外來(lái)基因接觸的組織類型也可以多樣化。這樣的組織包括但不僅限于胚胎發(fā)生組織、I、II和III型愈傷組織、下胚軸、分生組織、根組織、用于韌皮部表達(dá)的組織等。使用本文所述的適當(dāng)技術(shù)可在去分化過(guò)程中轉(zhuǎn)化幾乎所有的植物組織。如上文所述，需要時(shí)可以使用多種選擇標(biāo)記。具體標(biāo)記的優(yōu)選由技術(shù)人員決定，但是任何以下的選擇標(biāo)記以及本文未列出的能發(fā)揮選擇標(biāo)記功能的任意其他基因都可以使用。這些選擇標(biāo)記包括但不僅限于編碼對(duì)抗生素卡那霉素、新霉素和G41的抗性、潮霉素抗性、甲氨碟呤抗性的轉(zhuǎn)座子Tn5氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(AphII)以及編碼對(duì)草甘膦、草丁膦(雙丙氨膦或草銨膦)、ALS-抑制除草劑(咪唑啉酮類、磺酰脲類和三唑并嘧啶類除草劑)、ACC-ase酶抑制劑(如芳氧基丙酸酯類或環(huán)己烯酮類)和其他如溴草腈和HPPD抑制劑(如硝草酮)等抗性或耐性的基因。除了選擇標(biāo)記以外，可能需要使用報(bào)道基因。在一些情況下，報(bào)道基因可以與或不與選擇標(biāo)記一起使用。報(bào)道基因一般是在受體生物或組織中不存在的基因，一般編碼引起一些表型變化或酶特性的蛋白質(zhì)。Weising等1998中提供了這些基因的實(shí)例。優(yōu)選的報(bào)道基因包括大腸桿菌uidA基因座的β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)、來(lái)自大腸桿菌Tn9的氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因、來(lái)自生物發(fā)光水母維多利亞水母(Aequoreavictoria)的綠色熒光蛋白和來(lái)自北美螢火蟲(Photinuspyralis)的熒光素酶基因。接著可以在所述基因引入受體細(xì)胞后的適當(dāng)時(shí)間實(shí)施檢測(cè)報(bào)道基因表達(dá)的試驗(yàn)。優(yōu)選的這類試驗(yàn)可使用編碼Jefferson等1987所述的大腸桿菌uidA基因座的β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)的基因鑒定轉(zhuǎn)化細(xì)胞。除了植物啟動(dòng)子調(diào)節(jié)元件以外，可以在植物細(xì)胞中有效地使用來(lái)自多種來(lái)源的啟動(dòng)子調(diào)節(jié)元件表達(dá)外源基因。例如細(xì)菌來(lái)源的啟動(dòng)子調(diào)節(jié)元件，如章魚堿合酶啟動(dòng)子、胭脂堿合酶啟動(dòng)子、甘露堿合酶啟動(dòng)子；病毒來(lái)源的啟動(dòng)子，如花椰菜花葉病毒(35S和19S)、35T(再改造的35S啟動(dòng)子，參閱美國(guó)專利No.6,166,302，特別是實(shí)施例7E)等。植物啟動(dòng)子調(diào)節(jié)元件包括但不僅限于核酮醣-1，6-二磷酸(RUBP)羧化酶小亞基(ssu)、β-伴大豆球蛋白(conglycinin)啟動(dòng)子、β-菜豆素啟動(dòng)子、ADH啟動(dòng)子、熱休克啟動(dòng)子和組織特異性啟動(dòng)子。還可以存在其他元件，如基質(zhì)附著區(qū)、支架附著區(qū)、內(nèi)含子、增強(qiáng)子、多腺苷酸化序列等，從而提高轉(zhuǎn)錄效率或DNA整合。盡管這些元件能通過(guò)影響轉(zhuǎn)錄、mRNA穩(wěn)定性等提供較好的DNA表達(dá)或功能，但是它們對(duì)DNA功能可能是或不是必需的。這些元件可以如所需包含在DNA中，以得到轉(zhuǎn)化DNA在植物中的優(yōu)化表達(dá)。典型元件包括但不僅限于Adh-內(nèi)含子1、Adh-內(nèi)含子6、苜?；ㄈ~病毒外殼蛋白前導(dǎo)序列、滲調(diào)蛋白(osmotin)UTR序列、玉米線條病毒外殼蛋白前導(dǎo)序列以及其他本領(lǐng)域技術(shù)人員可用的元件。還可以使用組成型啟動(dòng)子調(diào)節(jié)元件從而指導(dǎo)在所有細(xì)胞類型和所有時(shí)間的持續(xù)基因表達(dá)(如肌動(dòng)蛋白、泛素、CaMV35S等)。組織特異性啟動(dòng)子調(diào)節(jié)元件負(fù)責(zé)在特定細(xì)胞或組織類型(如葉或種子)中的基因表達(dá)(如玉米醇溶蛋白、油質(zhì)蛋白、napin、ACP、球蛋白等)，這些也可以使用。啟動(dòng)子調(diào)節(jié)元件也可以在植物發(fā)育的某些階段有活性(或無(wú)活性)以及在植物組織和器官中有活性。這些的實(shí)例包括但不僅限于花粉特異性、胚胎特異性、玉米穗絲特異性、棉花纖維特異性、根特異性、種子胚乳特異性或無(wú)性繁殖期特異性啟動(dòng)子調(diào)節(jié)元件等。在某些情況下可能需要使用誘導(dǎo)型啟動(dòng)子調(diào)節(jié)元件，其負(fù)責(zé)應(yīng)答于特定信號(hào)(如物理刺激(熱休克基因)、光(RUBP羧化酶)、激素(Em)、代謝物、化學(xué)品(四環(huán)素應(yīng)答)和脅迫)的基因表達(dá)?？梢允褂迷谥参镏邪l(fā)揮功能的其他所需的轉(zhuǎn)錄和翻譯元件。本領(lǐng)域已知大量植物特異性基因轉(zhuǎn)移載體。基于植物RNA病毒的系統(tǒng)也可用于表達(dá)細(xì)菌蛋白質(zhì)。為此，可以將編碼蛋白質(zhì)的基因插入感染目的宿主植物的適當(dāng)植物病毒的外殼啟動(dòng)子區(qū)。然后可以表達(dá)蛋白質(zhì)從而為植物提供對(duì)除草劑損害的保護(hù)?；谥参颮NA病毒的系統(tǒng)描述于麥克津植物科學(xué)有限公司(MycogenPlantSciences，Inc.)的美國(guó)專利No.5,500,360和生物資源公司(Biosource)現(xiàn)為大型生物公司(LargeScaleBiology)的美國(guó)專利No.5,316,931和5,589,367。進(jìn)一步增加耐性或抗性水平的方法。本文顯示可賦予本發(fā)明植物新除草劑抗性性狀，并且未觀察到對(duì)表型包括產(chǎn)量的不利影響。這些植物在本發(fā)明范圍之內(nèi)。本文示例和提出的植物能耐受住如至少一種受試除草劑2×、3×、4×和5×一般應(yīng)用水平。這些耐性水平的提高在本發(fā)明范圍之內(nèi)。例如可對(duì)本領(lǐng)域已知的多種技術(shù)進(jìn)行可預(yù)見到的優(yōu)化和進(jìn)一步發(fā)展，以增加給定基因的表達(dá)。這些方法之一包括增加本發(fā)明AAD-12基因的拷貝數(shù)(在表達(dá)盒中等)。也可以選擇具有多拷貝基因的轉(zhuǎn)化事件。強(qiáng)啟動(dòng)子和增強(qiáng)子能用于“過(guò)度”表達(dá)。這類啟動(dòng)子的實(shí)例包括使用35S增強(qiáng)子的優(yōu)選35T啟動(dòng)子。這類使用包括35S、玉米泛素、擬南芥泛素、擬南芥肌動(dòng)蛋白和CSMV啟動(dòng)子。其他強(qiáng)病毒啟動(dòng)子也是優(yōu)選的。增強(qiáng)子包括4OCS和35S雙增強(qiáng)子?；|(zhì)粘附區(qū)(MAR)也能用于如增加轉(zhuǎn)化效率和轉(zhuǎn)基因表達(dá)。根據(jù)本發(fā)明，改組(直接進(jìn)化)和轉(zhuǎn)錄因子也能用于實(shí)施方案。還能設(shè)計(jì)多種蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)在序列水平變化但是保留相同或相似的全部必需的三維結(jié)構(gòu)、表面電荷分布等等。參閱如美國(guó)專利No.7,058,515；Larson等ProteinSci.200211：2804-2813，“Thoroughlysamplingsequencespace：Large-scaleproteindesignofstructuralensembles.”；Crameri等NatureBiotechnology15，436-438(1997)，“MolecularevolutionofanarsenatedetoxificationpathwaybyDNAshuffling.”；Stemmer，W.P.C.1994.DNAshufflingbyrandomfragmentationandreassembly：invitrorecombinationformolecularevolution.Proc.Natl.Acad.Sci.USA91：10747-10751；Stemmer，W.P.C.1994.RapidevolutionofaproteininvitrobyDNAshuffling.Nature370：389-391；Stemmer，W.P.C.1995.Searchingsequencespace.Bio/Technology13：549-553；Crameri，A.，Cwirla，S.和Stemmer，W.P.C.1996.Constructionandevolutionofantibody-phagelibrariesbyDNAshuffling.NatureMedicine2：100-103以及Crameri，A.，Whitehorn，E.A.，Tate，E.和Stemmer，W.P.C.1996.ImprovedgreenfluorescentproteinbymolecularevolutionusingDNAshuffling.NatureBiotechnology14：315-319。插入植物細(xì)胞的重組多核苷酸活性依賴于與插入物相鄰的內(nèi)源植物DNA的影響。因此另一種選擇是利用已知的植物基因組中用于插入的絕佳位置。參閱如WO2005/103266A1，涉及cry1F和cry1Ac棉花事件；在這些基因座本發(fā)明AAD-12基因可以替代cry1F和/或cry1Ac插入。因此，根據(jù)本發(fā)明可以使用如靶向同源重組。這類技術(shù)是例如WO03/080809A2和相應(yīng)的涉及鋅指在靶向重組中的用途的已公開美國(guó)申請(qǐng)(USPA20030232410)的主題。本領(lǐng)域也已知重組酶的用途(例如cre-lox和flp-frt)。確信AAD-12的解毒在細(xì)胞質(zhì)中發(fā)生。因此本發(fā)明的方面包括進(jìn)一步穩(wěn)定這種蛋白質(zhì)和mRNA(包括阻斷mRNA的降解)的方法，并相應(yīng)地應(yīng)用已知的技術(shù)?？梢栽O(shè)計(jì)本發(fā)明蛋白質(zhì)以抵抗蛋白酶的降解等(通過(guò)再設(shè)計(jì)蛋白質(zhì)的氨基酸序列能有效去除蛋白酶的切割位點(diǎn))。這些實(shí)施方案包括使用來(lái)自滲調(diào)蛋白的5’和3’莖環(huán)結(jié)構(gòu)樣UTR及per5(富含AU的5’非翻譯序列)。還可以使用類似7-甲基或2’-O-甲基基團(tuán)的5’帽子，如7-甲基鳥苷酸殘基。參閱如Proc.Natl.Acad.Sci.USA74卷，7期，2734-2738頁(yè)(1977年7月)Importanceof5’-terminalblockingstructuretostabilizemRNAineukaryoticproteinsynthesis。也可以使用蛋白質(zhì)復(fù)合體或配體封閉基團(tuán)。還可以在本發(fā)明范圍內(nèi)進(jìn)行對(duì)于AAD-12最適的5’或3’UTR的計(jì)算機(jī)設(shè)計(jì)(合成的發(fā)夾)。一般的計(jì)算機(jī)建模以及基因改組和直接進(jìn)化在本文的別處進(jìn)行討論。至于更具體的計(jì)算機(jī)建模和UTR，用于預(yù)測(cè)/評(píng)測(cè)本發(fā)明5’和3’UTR衍生物的計(jì)算機(jī)建模技術(shù)包括但不僅限于：從GeneticsCorporationGroup，Madison，WI獲得的MFoldversion3.1(參閱Zucker等AlgorithmsandThermodynamicsforRNASecondaryStructurePrediction：APracticalGuide.InRNABiochemistryandBiotechnology，11-43，J.Barciszewski&B.F.C.Clark編，NATOASISeries，KluwerAcademicPublishers，Dordrecht，NL，(1999)；Zucker等ExpandedSequenceDependenceofThermodynamicParametersImprovesPredictionofRNASecondaryStructure.J.Mol.Biol.288，911-940(1999)；Zucker等RNASecondaryStructurePrediction.InCurrentProtocolsinNucleicAcidChemistryS.Beaucage，D.E.Bergstrom，G.D.Glick和R.A.Jones編，JohnWiley&Sons，NewYork，11.2.1-11.2.10，(2000))，COVE(RNAstructureanalysisusingcovariancemodels(stochasticcontextfreegrammarmethods))v.2.4.2(Eddy&Durbin，Nucl.AcidsRes.1994，22：2079-2088)作為源代碼免費(fèi)分發(fā)并可通過(guò)進(jìn)入網(wǎng)站genetics.wustl.edu/eddy/software/下載，以及FOLDALIGN也是免費(fèi)分發(fā)并可在網(wǎng)站bioinf.au.dk.下載獲得。FOLDALIGN/(參閱FindingthemostsignificantcommonsequenceandstructuremotifsinasetofRNAsequences.J.Gorodkin，L.J.Heyer和G.D.Stormo.NucleicAcidsResearch，25卷，18期3724-3732頁(yè)，1997；FindingCommonSequenceandStructureMotifsinasetofRNASequences.J.Gorodkin，L.J.Heyer和G.D.Stormo.ISMB5；120-123，1997)。本發(fā)明的實(shí)施方案可與自然進(jìn)化或化學(xué)誘導(dǎo)的突變體結(jié)合使用(可通過(guò)篩選技術(shù)挑選突變體，然后用AAD-12和其他可能基因轉(zhuǎn)化)。本發(fā)明的植物可聯(lián)合ALS抗性和/或進(jìn)化的草甘膦抗性。例如氨草啶抗性也能與AAD-12基因聯(lián)合或“疊加”。傳統(tǒng)育種技術(shù)也能聯(lián)合本發(fā)明以有力結(jié)合、基因滲入和提高所需性狀。進(jìn)一步的提高還包括使用合適的安全劑來(lái)進(jìn)一步保護(hù)植物和/或增加對(duì)更多除草劑的交叉抗性。(安全劑一般通過(guò)活化/表達(dá)cP450發(fā)揮增強(qiáng)植物免疫系統(tǒng)的作用。安全劑是化學(xué)試劑，通過(guò)生理或分子機(jī)制降低除草劑對(duì)作物植物的植物毒性，并不損害雜草控制功效。)除草劑安全劑包括解草嗪、解毒喹、解草胺腈、二氯丙烯胺、dicyclonon、dietholate、解草唑、解草啶、解草安、肟草安、解草唑、雙苯唑酸、吡唑解草酯、mephenate、萘酐和解草腈。植物激活劑(通過(guò)激活植物的防御機(jī)制保護(hù)植物的新型化合物)也能用于本發(fā)明的實(shí)施方案。激活劑包括阿拉酸式苯和烯丙苯噻唑(probenazole)。商業(yè)安全劑可用于保護(hù)大種子禾本科作物(如玉米、高粱粒和濕地播種稻(wet-sownrice))對(duì)抗種植前摻入土壤的或出土前施用的硫代氨基甲酸酯和氯乙酰苯胺家族除草劑。安全劑還已發(fā)展為保護(hù)冬季谷類作物(如小麥)對(duì)抗出苗后應(yīng)用的芳氧基苯氧丙酸酯類和磺酰脲類除草劑。安全劑在保護(hù)玉米和稻對(duì)抗磺酰脲類、咪唑啉酮類、環(huán)己烯酮類類、異唑類和三酮除草劑中的用途也發(fā)展成熟。在使用安全劑的植物中安全劑誘導(dǎo)的增強(qiáng)除草劑的解毒作為安全劑作用的主要機(jī)制被廣泛接受。安全劑誘導(dǎo)輔因子(如谷胱甘肽)和除草劑解毒酶(如谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶、細(xì)胞色素P450單加氧酶和糖基轉(zhuǎn)移酶)。HatziosKK，BurgosN(2004)“Metabolism-basedherbicideresistance：regulationbysafeners，”WeedScience：52卷，3期454-467頁(yè)。使用疊加AAD-12的細(xì)胞色素p450單加氧酶基因是一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案。P450參與除草劑代謝；cP450可以是如哺乳動(dòng)物或植物來(lái)源。在高等植物中，已知細(xì)胞色素p450單加氧酶(P450)進(jìn)行次生代謝。P450與NADPH-細(xì)胞色素P450氧化還原酶(還原酶)合作在異生物素的氧化代謝中發(fā)揮重要作用。已報(bào)道對(duì)一些除草劑的抗性作為P450和谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶代謝的結(jié)果。許多參與哺乳動(dòng)物的異生物素代謝的微粒體P450物質(zhì)已被分子克隆表征。他們中的某些被報(bào)道有效代謝一些除草劑。因此，用植物或哺乳動(dòng)物P450轉(zhuǎn)基因的植物表現(xiàn)出對(duì)一些除草劑的抗性。前述的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案是使用cP450抵抗乙草胺(基于乙草胺的產(chǎn)品包括KeystoneLA、和除草劑)和/或氟樂(lè)靈(如)。某些優(yōu)選的實(shí)施方案包括在大豆和/或玉米中的這種抗性。關(guān)于這些實(shí)施方案的另外的指導(dǎo)，參閱如Inui等“AselectablemarkerusingcytochromeP450monooxygenasesforArabidopsistransformation，”PlantBiotechnology22，281-286(2005)(涉及通過(guò)使用代謝除草劑的人細(xì)胞色素P450單加氧酶的根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化擬南芥的選擇系統(tǒng)；轉(zhuǎn)化除草劑耐性樹苗，并用除草劑乙草胺、甲基胺草磷、氯苯胺靈、氯磺隆、氟草敏和二甲戊樂(lè)靈選擇)；Siminszky等“ExpressionofasoybeancytochromeP450monooxygenasecDNAinyeastandtobaccoenhancesthemetabolismofphenylureaherbicides，”PNAS96卷，4期，1750-1755，1999年2月16日；Sheldon等WeedScience：48卷，3期，291-295頁(yè)，“AcytochromeP450monooxygenasecDNA(CYP71A10)confersresistancetolinuronintransgenicNicotianatabacum”和“PhytoremediationoftheherbicidesatrazineandmetolachlorbytransgenicriceplantsexpressinghumanCYP1A1，CYP2B6，andCYP2C19，”JAgricFoodChem.2006年4月19日；54(8)：2985-91(涉及在稻中測(cè)試人細(xì)胞色素p450單加氧酶，其中稻植物被報(bào)道顯示對(duì)氯乙酰胺類(乙草胺、甲草胺、異丙草胺、丙草胺和噻吩草胺)、氧乙酰胺類(苯噻草胺)、噠嗪酮類(氟草敏)、2，6-二硝基苯胺類(氟樂(lè)靈和二甲戊樂(lè)靈)、磷酰胺類(甲基胺草磷、硫代氨基甲酸酯類(稗草畏)和尿素類(綠麥隆))高耐性。改變或使用不同的2，4-滴化學(xué)反應(yīng)令本發(fā)明AAD-12基因更有效也是可能的。這種可能的改變包括創(chuàng)造更好的底物和更好的離去基團(tuán)(更高的電負(fù)性)。植物生長(zhǎng)素運(yùn)輸抑制劑(如氟吡草腙)也能用于增加2，4-滴除草劑活性。除非具體說(shuō)明或暗示，如本文中所用，術(shù)語(yǔ)“一”、“一個(gè)/一種”和“所述”表示“至少一個(gè)”。本文提到或引用的所有專利、專利申請(qǐng)、臨時(shí)申請(qǐng)和出版物整體引為參考，引用程度不與本說(shuō)明書的明確教導(dǎo)相沖突。以下為說(shuō)明本發(fā)明操作方法的實(shí)施例。這些實(shí)施例不應(yīng)理解為限制性的。除非另有說(shuō)明，所有的百分比均以重量計(jì)并且所有的溶劑混合物比例以體積計(jì)。實(shí)施例1-鑒定在植物中賦予對(duì)2，4-滴抗性的基因的方法作為鑒定在植物中具有除草劑降解活性的基因的方法，可以發(fā)掘現(xiàn)有的公共數(shù)據(jù)庫(kù)如NCBI(美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心)。為開始此過(guò)程，需要有已鑒定為編碼具有所需特征(即α-酮戊二酸雙加氧酶活性)的蛋白質(zhì)的功能基因序列。接著將此蛋白質(zhì)序列用作BLAST(基本局部比對(duì)檢索工具)(Altschul等，1997)算法的輸入，以與存儲(chǔ)的可用NCBI蛋白質(zhì)序列進(jìn)行比較。使用默認(rèn)設(shè)置，此檢索返回不同水平的100個(gè)以上同源蛋白質(zhì)序列。它們?cè)诎被崴降姆秶鷱母咄恍?85％-98％)到極低同一性(23％-32％)。通常僅高同源性的序列可預(yù)期保留與輸入序列相似的特性。在這種情況下僅選擇具有≤50％的同源性的序列。如本文示例，克隆和重組表達(dá)低至31％氨基酸保守性的同源物(相對(duì)于來(lái)自于真養(yǎng)雷氏菌()的tfdA)不僅可用于賦予對(duì)計(jì)劃內(nèi)的除草劑的商品水平的抗性，還可用于對(duì)以前從未用這些酶測(cè)試過(guò)的底物賦予商品水平的抗性。從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)鑒定了單個(gè)基因(sdpA)，其作為與tfdA僅有31％氨基酸同一性的同源物(參閱ncbi.nlm.nih.gov站點(diǎn)，登錄號(hào)AF516752)。通過(guò)首先將數(shù)據(jù)庫(kù)中保存的sdpA和tfADNA序列翻譯成蛋白質(zhì)，然后用VectorNTI軟件包中的ClustalW進(jìn)行多重序列比對(duì)來(lái)測(cè)定同一性百分比。實(shí)施例2-在植物和細(xì)菌中表達(dá)的序列優(yōu)化2.1-背景為了在植物中得到異源基因的高表達(dá)，可以優(yōu)選重新改造基因的蛋白質(zhì)編碼序列以使其在植物細(xì)胞中更有效的表達(dá)。玉米就是這樣的一種植物，其中在轉(zhuǎn)化前重新設(shè)計(jì)異源蛋白質(zhì)編碼區(qū)域以提高在植物中的基因表達(dá)水平和編碼蛋白質(zhì)的水平可能是優(yōu)選的。因此，在設(shè)計(jì)編碼細(xì)菌蛋白質(zhì)的基因中額外的步驟是重新改造異源基因以得到最優(yōu)表達(dá)。重新改造在玉米中表達(dá)的細(xì)菌蛋白質(zhì)的一個(gè)原因是由于天然基因的非最優(yōu)G+C含量。例如，許多天然細(xì)菌基因極低的G+C含量(和因此高A+T含量的偏移傾向)引起產(chǎn)生模擬或復(fù)制已知為高度富含A+T的植物基因控制序列的序列。在引入植物的基因DNA中存在一些富含A+T的序列(如一般見于基因啟動(dòng)子中的TATA盒區(qū))可能引起基因的異常轉(zhuǎn)錄。另一方面，轉(zhuǎn)錄的mRNA中其他調(diào)節(jié)序列(如多腺苷酸化信號(hào)序列(AAUAAA)或與參與前mRNA剪接的小核RNA互補(bǔ)的序列)的存在可能導(dǎo)致RNA的不穩(wěn)定性。因此，設(shè)計(jì)用于玉米表達(dá)的編碼細(xì)菌蛋白質(zhì)的基因(更優(yōu)選稱為植物優(yōu)化基因)的一個(gè)目的是產(chǎn)生具有較高G+C含量(優(yōu)選與編碼代謝酶的玉米基因具有接近的G+C含量)的DNA序列。設(shè)計(jì)編碼細(xì)菌蛋白質(zhì)的植物優(yōu)化基因的另一個(gè)目的是產(chǎn)生其序列修飾不阻礙翻譯的DNA序列。表3展示了玉米中的G+C含量有多高。對(duì)于表3中的數(shù)據(jù)，基因的編碼區(qū)出自GenBank(第71次發(fā)布)條目，并用MacVectorTM程序(Accelerys公司，SanDiego，California)計(jì)算堿基組成。計(jì)算中忽略了內(nèi)含子序列。a每一類基因的數(shù)目在括號(hào)內(nèi)給出。b標(biāo)準(zhǔn)差在括號(hào)內(nèi)給出。c平均值計(jì)算中忽略了混合組平均值。由于遺傳密碼的冗余性/簡(jiǎn)并性(即一些氨基酸由多于一個(gè)密碼子指定)提供的可塑性，基因組在不同生物或不同綱的生物中的進(jìn)化引起了對(duì)冗余密碼子不同的使用。在蛋白質(zhì)編碼區(qū)的平均堿基組成中反映了這種“密碼子偏好”。例如，具有相對(duì)低G+C含量的生物使用冗余密碼子的第三個(gè)位置上為A或T的密碼子，而具有較高G+C含量的使用第三個(gè)位置上為G或C的密碼子。mRNA中“少見”密碼子的存在被認(rèn)為可降低該mRNA的絕對(duì)翻譯率，特別是對(duì)應(yīng)于少見密碼子的載荷tRNA的相對(duì)豐度低時(shí)。這一事實(shí)可擴(kuò)展為：對(duì)于多個(gè)少見密碼子，單個(gè)少見密碼子對(duì)翻譯率的降低將至少是累加的。因此，具有相對(duì)高含量少見密碼子的mRNA將相應(yīng)的具有低翻譯率。該翻譯率將進(jìn)而反映為低水平的編碼蛋白質(zhì)。在設(shè)計(jì)用于玉米(或其他植物，如棉花或大豆)表達(dá)的編碼細(xì)菌蛋白質(zhì)的基因時(shí)已經(jīng)測(cè)定了所述植物的密碼子偏好。玉米的密碼子偏好是該植物用于編碼其蛋白質(zhì)的密碼子統(tǒng)計(jì)分布，表4顯示了優(yōu)選的密碼子使用。測(cè)定偏好之后，測(cè)定目的基因中密碼子的頻率百分比。應(yīng)該測(cè)定植物優(yōu)選的主要密碼子，在存在多種選擇時(shí)，還要測(cè)定優(yōu)選密碼子的第二、第三和第四選擇。然后設(shè)計(jì)編碼細(xì)菌蛋白質(zhì)的氨基酸序列的新DNA序列，但新DNA序列由于用植物(第一優(yōu)選，第二優(yōu)選、第三優(yōu)選或第四優(yōu)選)密碼子進(jìn)行取代以指定蛋白質(zhì)氨基酸序列內(nèi)每個(gè)位置的氨基酸而區(qū)別于(編碼蛋白質(zhì)的)天然細(xì)菌DNA序列。然后分析新序列中可能由修飾產(chǎn)生的限制性酶切位點(diǎn)。通過(guò)用第一、第二、第三或第四選擇的優(yōu)選密碼子替換該密碼子來(lái)進(jìn)一步修飾鑒定出的位點(diǎn)。序列中可能影響目的基因轉(zhuǎn)錄或翻譯的其他位點(diǎn)為外顯子-內(nèi)含子接合處(5’或3’)、多腺苷酸添加信號(hào)或RNA聚合酶終止信號(hào)。進(jìn)一步分析和修飾序列，以降低TA或GC雙聯(lián)體的頻率。除了雙聯(lián)體之外，具有多于約四個(gè)相同殘基的G或C序列嵌段也能影響序列的轉(zhuǎn)錄。因此，也通過(guò)用下一優(yōu)選的密碼子選擇替換首選或次選等密碼子來(lái)修飾這些嵌段。編碼細(xì)菌蛋白質(zhì)的植物優(yōu)化基因優(yōu)選含有約63％的首選密碼子、約22％到約37％的次選密碼子和約15％到約0％的三選或四選密碼子，其中總百分比為100％。最優(yōu)選植物優(yōu)化基因含有約63％的首選密碼子、至少約22％的次選密碼子、約7.5％的三選密碼子和約7.5％的四選密碼子，其中總百分比為100％。上述方法使本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠修飾就具體植物而言是外來(lái)的基因，從而使基因在植物中優(yōu)化表達(dá)。PCT申請(qǐng)WO97/13402中進(jìn)一步說(shuō)明了該方法。因此，為了設(shè)計(jì)編碼細(xì)菌蛋白質(zhì)的植物優(yōu)化基因，使用建立自密碼子偏好表的冗余遺傳密碼設(shè)計(jì)編碼所述蛋白質(zhì)的氨基酸序列的DNA序列，所述偏好表整理自特定的一種或多種植物的基因序列。得到的DNA序列具有較高程度的密碼子多樣性、所需的堿基組成，可含有策略性放置的限制性酶識(shí)別位點(diǎn)并缺少可能干擾基因轉(zhuǎn)錄或產(chǎn)物mRNA翻譯的序列。因此，功能性等同于本發(fā)明蛋白質(zhì)/基因的合成基因可用于轉(zhuǎn)化包括植物在內(nèi)的宿主。關(guān)于合成基因產(chǎn)生的其他指導(dǎo)可見于如美國(guó)專利No.5,380,831。2.2-AAD-12植物重建分析對(duì)天然AAD-12編碼區(qū)(SEQIDNO：1)876個(gè)堿基對(duì)(bp)DNA序列的深入分析顯示存在若干認(rèn)為不利于最佳植物表達(dá)的序列基序以及非最佳密碼子組成。SEQIDNO：1(AAD-12)編碼的蛋白質(zhì)如SEQIDNO：2所示。為改善重組蛋白在單子葉和雙子葉植物中的生產(chǎn)，產(chǎn)生了“植物優(yōu)化”DNA序列AAD-12(v1)(SEQIDNO：3)，其編碼的蛋白質(zhì)(SEQIDNO：4)除了在第二個(gè)位置(在SEQIDNO：4中以下劃線標(biāo)出)加入丙氨酸殘基外，它與天然SEQIDNO：2相同。額外的丙氨酸密碼子(GCT，在SEQIDNO：3中以下劃線標(biāo)出)編碼跨越ATG翻譯起始密碼子的部分NcoI限制性酶識(shí)別位點(diǎn)(CCATGG)。因此，它服務(wù)于雙重目的，即在改善ATG起始密碼子周圍的序列以優(yōu)化翻譯起始的同時(shí)，促進(jìn)其后的克隆操作。天然和植物優(yōu)化(v1)的編碼區(qū)所編碼的蛋白質(zhì)99.3％相同，僅2號(hào)氨基酸不同。相反，天然和植物優(yōu)化(v1)的編碼區(qū)的DNA序列僅79.7％相同。進(jìn)行了天然和植物優(yōu)化的DNA的序列比對(duì)，表5顯示天然(列A和D)和植物優(yōu)化序列(列B和E)密碼子組成的差化序列(列C和F)比較。表5的研究清楚得出天然和植物優(yōu)化編碼區(qū)盡管編碼幾乎相同的蛋白質(zhì)，但是二者之間有顯著的不同。植物優(yōu)化形式(v1)接近模擬編碼AAD-12蛋白的理論植物優(yōu)化編碼區(qū)的密碼子組成。2.3大腸桿菌表達(dá)的重建特定設(shè)計(jì)的大腸桿菌菌株和相關(guān)的載體系統(tǒng)經(jīng)常用來(lái)產(chǎn)生相對(duì)大量的蛋白質(zhì)，用于生物化學(xué)和分析研究。時(shí)常發(fā)現(xiàn)編碼所需蛋白質(zhì)的天然基因(即使基因的來(lái)源生物是另一種細(xì)菌種類)不是很適合在大腸桿菌中高水平表達(dá)。在這樣的情況下，重新改造基因的蛋白質(zhì)編碼區(qū)使其更適合在在大腸桿菌中表達(dá)是可能和需要的。大腸桿菌II類基因定義為在大腸桿菌細(xì)胞的指數(shù)生長(zhǎng)期可高水平和持續(xù)表達(dá)的基因(Henaut，A.和Danchin，A.(1996)inEscherichiacoliandSalmonellatyphimuriumcellularandmolecularbiology，卷2，2047-2066頁(yè)。Neidhardt，F(xiàn).，CurtissIII，R.，Ingraham，J.，Lin，E.，Low，B.，Magasanik，B.，Reznikoff，W.，Riley，M.，Schaechter，M.和Umbarger，H.(編)AmericanSocietyforMicrobiology，Washington，DC)。通過(guò)研究大腸桿菌II類基因編碼區(qū)的密碼子組成，可以對(duì)這些大腸桿菌II類基因編碼區(qū)設(shè)計(jì)平均密碼子組成。認(rèn)為具有模擬大腸桿菌II類基因密碼子組成的平均密碼子組成的蛋白質(zhì)編碼區(qū)將適宜在大腸桿菌細(xì)胞的指數(shù)生長(zhǎng)期表達(dá)。使用這些指導(dǎo)，根據(jù)大腸桿菌II類基因編碼區(qū)的平均密碼子組成，設(shè)計(jì)編碼AAD-12蛋白(SEQIDNO：4)的新DNA序列；包括，如上面所提到的第二個(gè)位置上的額外的丙氨酸。將最初僅基于密碼子組成設(shè)計(jì)的序列，進(jìn)一步改造為包括適合于克隆進(jìn)大腸桿菌表達(dá)載體的一些限制性酶識(shí)別序列。避免有害的序列特征如高度穩(wěn)定的莖環(huán)結(jié)構(gòu)、以及與16S核糖體RNA的3’末端同源的基因內(nèi)序列(如ShineDalgarno序列)。大腸桿菌優(yōu)化序列(v2)作為SEQIDNO：5公開，并且編碼SEQIDNO：4公開的蛋白質(zhì)。天然和大腸桿菌優(yōu)化(v2)DNA序列具有84.0％同一性，而植物優(yōu)化(v1)和大腸桿菌優(yōu)化(v2)DNA序列具有76.0％同一性。表6顯示天然AAD-12編碼區(qū)(列A和D)、在大腸桿菌中表達(dá)的優(yōu)化AAD-12編碼區(qū)(v2；列B和E)的密碼子組成，以及具有大腸桿菌II類基因優(yōu)化密碼子組成的AAD-12蛋白的理論編碼區(qū)的密碼子組成(列C和F)。表6的研究清楚得出天然和大腸桿菌優(yōu)化編碼區(qū)盡管編碼幾乎相同的蛋白質(zhì)，但是二者之間有顯著的不同。大腸桿菌優(yōu)化形式(v2)接近模擬編碼AAD-12蛋白的理論大腸桿菌優(yōu)化編碼區(qū)的密碼子組成。2.4-設(shè)計(jì)編碼具有賦予草甘膦耐性突變的大豆EPSPS的大豆密碼子偏好DNA序列。此實(shí)施例教導(dǎo)設(shè)計(jì)新的DNA序列，其編碼突變的大豆5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)，但經(jīng)優(yōu)化用于在大豆細(xì)胞中表達(dá)。三重突變的大豆EPSPS的氨基酸序列以SEQIDNO：5公開于WO2004/009761。在其公開的序列中突變的氨基酸為殘基183(用異亮氨酸替換天然蛋白質(zhì)的蘇氨酸)、殘基186(用賴氨酸替換天然蛋白質(zhì)的精氨酸)和殘基187(用絲氨酸替換天然蛋白質(zhì)的脯氨酸)。因此，可以通過(guò)在適當(dāng)位置用天然氨基酸取代WO2004/009761的SEQIDNO：5中的已替換氨基酸來(lái)推出天然大豆EPSPS蛋白的氨基酸序列。這樣的天然蛋白質(zhì)序列作為PCT/US2005/014737(2005年5月2日遞交)的SEQIDNO：20公開。雙突變的大豆EPSPS蛋白序列作為PCT/US2005/014737的SEQIDNO：21公開，其含有殘基183(用異亮氨酸替換天然蛋白質(zhì)中的蘇氨酸)和殘基187(用絲氨酸替換天然蛋白質(zhì)中的脯氨酸)處的突變。用于大豆(Glycinemax)蛋白質(zhì)編碼序列的密碼子使用表得自“kazusa.or.jp/codon”萬(wàn)維網(wǎng)址，它從362,096個(gè)密碼子(約870個(gè)編碼序列)中計(jì)算得到。將這些數(shù)據(jù)重新整理示于表7。表7的D和H列代表大豆基因蛋白質(zhì)編碼區(qū)中每個(gè)氨基酸的同義密碼子分布(以該氨基酸的所有密碼子的使用百分比計(jì))。顯然在大豆蛋白質(zhì)編碼區(qū)中一些氨基酸的一些同義密碼子(一個(gè)氨基酸可以由1、2、3、4或6個(gè)密碼子指代)的存在相對(duì)稀少(例如，比較指代丙氨酸的GCG和GCT密碼子的使用)。從表7的數(shù)據(jù)計(jì)算得到偏好的大豆密碼子使用表。忽略在大豆基因中總出現(xiàn)率小于約10％的特定氨基酸密碼子。為平衡氨基酸剩余密碼子選擇的分布，使用下式計(jì)算每個(gè)密碼子加權(quán)的平均呈現(xiàn)率：C1的加權(quán)百分比=1/(％C1+％C2+％C3+其他)×％C1×100其中C1為所討論的密碼子，C2、C3、其他代表剩余的同義密碼子，相關(guān)密碼子的百分比值取自表7的D和H列(忽略粗體的稀有密碼子的值)。每個(gè)密碼子的加權(quán)百分比值在表7的C和G列給出。任意選擇TGA作為翻譯終止子。接著將偏好密碼子使用頻率輸入專業(yè)遺傳密碼表，以用于OptGeneTM基因設(shè)計(jì)程序(OcimumBiosolutionsLLC，Indianapolis，Indiana)。＊DNU＝不使用為產(chǎn)生編碼雙突變EPSPS蛋白的大豆優(yōu)化DNA序列，使用來(lái)自上文的大豆偏好遺傳密碼通過(guò)OptGeneTM程序反向翻譯來(lái)自PCT/US2005/014737的SEQIDNO：21的蛋白質(zhì)序列。接著通過(guò)補(bǔ)償密碼子變化來(lái)修飾這樣產(chǎn)生的初始DNA序列(而保持密碼子的總體加權(quán)平均呈現(xiàn)率)，以減少相鄰密碼子間CG和TA雙聯(lián)體數(shù)、增加相鄰密碼子間CT和TG雙聯(lián)體數(shù)、去除高度穩(wěn)定的鏈內(nèi)二級(jí)結(jié)構(gòu)、去除或加入限制性酶識(shí)別位點(diǎn)并去除可能不利于所改造基因的表達(dá)或克隆操作的其他序列。進(jìn)一步精加工序列，以消除潛在的植物內(nèi)含子剪接位點(diǎn)、長(zhǎng)段A/T或C/G殘基和可能干擾植物細(xì)胞中RNA穩(wěn)定性、轉(zhuǎn)錄或編碼區(qū)翻譯的其他基序。進(jìn)行其他改變以消除內(nèi)部長(zhǎng)開放閱讀框(除+1之外的框)。這些改變?nèi)诒３稚鲜龃蠖蛊玫拿艽a子組成并保留PCT/US2005/014737的SEQIDNO：21公開的氨基酸序列這一約束下產(chǎn)生。編碼SEQIDNO：21EPSPS蛋白的大豆偏好DNA序列作為PCT/US2005/014737的SEQIDNO：22的堿基1-1575公開。由商業(yè)供應(yīng)商(PicoScript，HoustonTX)進(jìn)行含有PCT/US2005/014737的SEQIDNO：22的DNA片段的合成。實(shí)施例3-表達(dá)和轉(zhuǎn)化載體的克隆3.1大腸桿菌pET表達(dá)載體的構(gòu)建。使用與加入額外克隆接頭位點(diǎn)相應(yīng)的限制性酶(XbaI、XhoI)將AAD-12(v2)從picoscript載體中切出并連接進(jìn)pET280鏈霉素/壯觀霉素抗性載體中。然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)TOP10F’大腸桿菌，并涂在LuriaBroth+50μg/ml鏈霉素&壯觀霉素(LBS/S)瓊脂平板上。為區(qū)分AAD-12(v2)：pET280和pCR2.1：pET280連接，挑取約20個(gè)分離菌落至6mlLB-S/S中，并在37℃搖動(dòng)培養(yǎng)4小時(shí)。然后將每個(gè)培養(yǎng)物點(diǎn)種到LB+50μg/ml卡那霉素平板上，在37℃過(guò)夜孵育。假定在LB-K上生長(zhǎng)的菌落具有連接進(jìn)的pCR2.1載體，將其棄去。如前述從剩余的培養(yǎng)物提取質(zhì)粒，用XbaI/XhoI消化檢驗(yàn)正確性。最終表達(dá)構(gòu)建體被命名為pDAB3222。3.2-假單胞菌表達(dá)載體的構(gòu)建AAD-12(v2)開放閱讀框作為XbaI-XhoI片段最初克隆進(jìn)修飾的pET表達(dá)載體(Novagen)即“pET280S/S”中。用限制性酶消化和測(cè)序反應(yīng)證實(shí)產(chǎn)生的質(zhì)粒pDAB725。來(lái)自pDAB725的AAD-12(v2)開放閱讀框作為XbaI-XhoI片段轉(zhuǎn)移進(jìn)假單胞菌表達(dá)載體pMYC1803中。通過(guò)限制性酶消化確認(rèn)陽(yáng)性克隆。將完成的構(gòu)建體pDAB739轉(zhuǎn)化進(jìn)MB217和MB324假單胞菌表達(dá)菌株中。3.3-二元載體的完成植物優(yōu)化基因AAD-12(v1)得自Picoscript(完成了基因重建設(shè)計(jì)(見上文)并交給Picoscript進(jìn)行構(gòu)建)并內(nèi)部驗(yàn)證了序列(SEQIDNO：3)以證實(shí)預(yù)期序列中不存在改變。如上文使用BeckmanCoulter“DyeTerminatorCycleSequencingwithQuickStartKit”試劑用M13正向(SEQIDNO：6)和M13反向(SEQIDNO：7)引物進(jìn)行測(cè)序反應(yīng)。分析序列數(shù)據(jù)，結(jié)果表明植物優(yōu)化的AAD-12(v1)DNA序列中不存在異常。以NcoI-SacI片段將AAD-12(v1)基因克隆進(jìn)pDAB726。得到的構(gòu)建體命名為pDAB723，其含有：[AtUbi10啟動(dòng)子：NtOSM5’UTR：AAD-12(v1)：NtOSM3’UTR：ORF1polyA3’UTR](用PvuII和NotI限制性消化驗(yàn)證)。然后將含有所述盒的NotI-NotI片段克隆進(jìn)二元載體pDAB3038的NotI位點(diǎn)。(用BamHI、NcoI、NotI、SacI和XmnI)限制性消化得到的二元載體pDAB724以驗(yàn)證正確的方向，pDAB724含有如下的盒：[AtUbi10啟動(dòng)子：NtOSM5’UTR：AAD-12(v1)：NtOSM3’UTR：ORF1polyA3’UTR：CsVMV啟動(dòng)子：PAT：ORF25/263’UTR]。經(jīng)驗(yàn)證的完整構(gòu)建體(pDAB724)用于轉(zhuǎn)化進(jìn)農(nóng)桿菌(參閱7.2章節(jié))。3.4-其他轉(zhuǎn)化構(gòu)建體的克隆。使用本文以前所述的相似程序和其他標(biāo)準(zhǔn)分子克隆方法(Maniatis等，1982)構(gòu)建用于轉(zhuǎn)化進(jìn)合適植物物種的所有其他構(gòu)建體。表8列出了所有使用的具有適當(dāng)啟動(dòng)子和所定義特征的轉(zhuǎn)化構(gòu)建體及其轉(zhuǎn)化的作物。實(shí)施例4-重組AAD-12(v2)在熒光假單胞菌中的表達(dá)和純化4.1-熒光假單胞菌發(fā)酵對(duì)于搖瓶實(shí)驗(yàn)，將200μl攜帶AAD-12(v2)構(gòu)建體pDAB739(3.2節(jié))的熒光假單胞菌菌株MB324甘油保藏物接種到50ml添加了30μg/ml四環(huán)素/HCl的新鮮LB培養(yǎng)基中。將培養(yǎng)物(在250ml擋板錐形瓶中)置于振蕩器(NewBrunswickScientificModelInnova44)上，在300rpm和30℃培養(yǎng)16小時(shí)。將20ml種子培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移進(jìn)2.8L擋板錐形瓶中1L添加了20μg/ml四環(huán)素/HCl和250μlPluronicL61(抗發(fā)泡)的熒光假單胞菌培養(yǎng)基(酵母膏，5g/L；K2HPO4，5g/L；(NH4)2PO4，7.5g/L；(NH4)2SO4；MgSO4-7H2O，1g/L；KCl，0.5g/L；CaCl2-2H2O，0.5g/L；二水合檸檬酸鈉，15g/L；甘油，95g/L；微量元素溶液，10ml/L；微量元素溶液：FeCl3-6H2O，5.4g/L；MnCl2-4H2O，1g/L；ZnSO4-7H2O，1.45g/L；CuSO4-5H2O，0.25g/L；H3BO3，0.1g/L；(NH4)6MO7O24，0.1g/L；濃鹽酸，13ml/L)中。培養(yǎng)物在30℃和300rpm培養(yǎng)24小時(shí)。在培養(yǎng)物中加入終濃度為1mM的異丙基-β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)，在25℃繼續(xù)培養(yǎng)約48小時(shí)。4℃，7krpm離心15分鐘收集細(xì)胞，細(xì)胞糊置于-80℃保存或立即進(jìn)行純化。對(duì)于發(fā)酵罐實(shí)驗(yàn)，將1ml每種甘油保藏物接種到含有添加了30μg/ml四環(huán)素/HCl的200mlLB培養(yǎng)基的1L擋板燒瓶中，300rpm和32℃培養(yǎng)16-24小時(shí)。然后將來(lái)自三個(gè)燒瓶的混合培養(yǎng)物(600ml)無(wú)菌轉(zhuǎn)入含有10L用于支持高細(xì)胞密度生長(zhǎng)的Dowproprietary已知成分培養(yǎng)基(來(lái)自Teknova，Hollister，CA)的20L發(fā)酵罐(B.BraunBioreactorSystems)中。生長(zhǎng)溫度維持在32℃，并通過(guò)加入氨水將pH控制在所需的設(shè)定點(diǎn)。通過(guò)調(diào)節(jié)噴射氣流和攪拌速率將液體培養(yǎng)物中的溶解氧維持在正水平。分批補(bǔ)料發(fā)酵過(guò)程進(jìn)行大約24小時(shí)至細(xì)胞密度達(dá)到170-200OD575。加入1mM的IPTG誘導(dǎo)重組蛋白質(zhì)的表達(dá)，使用循環(huán)的冷水供給降低溫度并維持在25℃。使發(fā)酵的誘導(dǎo)期再持續(xù)24小時(shí)。收集樣品(30ml)進(jìn)行多種分析，以檢測(cè)在誘導(dǎo)后6、12和18小時(shí)時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞密度和蛋白質(zhì)表達(dá)水平。發(fā)酵過(guò)程的最后，10krpm離心30分鐘收集細(xì)胞。細(xì)胞沉淀凍存于-80℃用于進(jìn)一步的處理。4.2-純化AAD-12(v2)用于生物化學(xué)表征和抗體產(chǎn)生融化大約100-200g冷凍(或新鮮)的假單胞菌細(xì)胞并重懸于1-2L含有20mMTris-HCl，pH8.5和25ml蛋白酶抑制劑混合物(Sigmacat#P8465)的抽提緩沖液中。在冰上使用微射流儀(型號(hào)M110L或110Y)(Microfluidics，Newton，MA)以11,000-12,000psi一次性通過(guò)來(lái)裂解細(xì)胞。將裂解物24,000rpm離心20分鐘。轉(zhuǎn)移上清并在4℃用10倍體積的20mMTris-HCl，pH8.5過(guò)夜透析，或在使用層析柱分離之前用這種緩沖液滲濾并經(jīng)0.45μm的膜過(guò)濾。使用法瑪西亞(Pharmacia)AKTAExplorer100進(jìn)行隨后所有蛋白質(zhì)的分離且在4℃操作。在上柱之前，用20mMTris-HCl，pH8.5的緩沖液平衡QSepharoseFastFlow層析柱(PharmaciaXK50/00，柱床體積500ml)。樣品以15ml/min加到層析柱上，然后用這種緩沖液洗滌直到洗脫液的OD280回到基線。用2L0到0.3M的線性梯度NaCl以15ml/min的流速洗脫蛋白質(zhì)，同時(shí)收集45ml級(jí)分。合并用比色酶檢測(cè)法確定為含AAD-12活性的級(jí)分，以及和預(yù)知的AAD-12蛋白分子量(在SDS-PAGE上大約32kDa的條帶)對(duì)應(yīng)的級(jí)分。在樣品中加入終濃度為0.5M的固體硫酸銨，然后施加于在0.5M硫酸銨(溶于20mMTris-HCl，pH8.0)中平衡的PhenylHP層析柱(PharmaciaXK50/20，柱床體積250ml)。該層析柱用10ml/min的結(jié)合緩沖液洗滌，直到洗脫液的OD280回到基線，蛋白質(zhì)用2倍柱體積0.5M到0的線性梯度硫酸銨(溶于20mMTris-HCl，pH8.0)以10ml/min洗脫，收集12.5ml的級(jí)分。合并含有AAD-12的主峰級(jí)分，如果必要的話，使用MWCO10kDa截留膜離心過(guò)濾裝置(Millipore)濃縮。在一些情況下，樣品還用PBS緩沖液以1ml/min的流速施加于Superdex75gelfiltration層析柱(PharmaciaXK16/60，柱床體積110ml)。合并含有純AAD-12的峰級(jí)分并儲(chǔ)存在-80℃。在大部分情況下，經(jīng)過(guò)連續(xù)的離子交換層析柱和疏水相互作用層析柱兩步分離之后，AAD-12蛋白的純度接近或高于99％。純化的AAD-12的一般產(chǎn)量為12-18mg/g濕細(xì)胞。大量的蛋白質(zhì)樣品通過(guò)滲濾配制到20mMTris-HCl，pH8.0、0.1MNaCl、2mMDTT和1％海藻糖中，并在VirtisFreezemobileModel25EL(Virtis，Cardiner，NY)中凍干用于長(zhǎng)期儲(chǔ)存。最初用Bradford檢測(cè)法使用伯樂(lè)蛋白測(cè)定試劑盒(Bio-RadProteinassaykit)(cat#500-0006)測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，用牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)。當(dāng)必要的時(shí)候，通過(guò)使用總氨基酸水解作用測(cè)定更精確的蛋白質(zhì)濃度。在Agilent1100HPLC系統(tǒng)(安捷倫科技有限公司，AgilentTechnologies，SantaClara，CA)中，使用從Agilent購(gòu)買的氨基酸校正標(biāo)準(zhǔn)品(cat#PN5061-3330)分析樣品。在整個(gè)過(guò)程中測(cè)定AAD-12的活性(如下文實(shí)施例5所述)以確保經(jīng)每一次處理和操作，酶活性沒(méi)有喪失。通過(guò)使用SDS-PAGE和分析大小排阻色譜法監(jiān)控蛋白質(zhì)純度。通過(guò)N-末端氨基酸測(cè)序進(jìn)一步檢驗(yàn)和證實(shí)純化的蛋白質(zhì)樣品，并顯示在其N-末端由預(yù)期的AQTTLQITPT殘基組成。在非還原和還原條件下，以酶活性和天然PAGE及SDS-PAGE凝膠分析檢測(cè)短期和長(zhǎng)期蛋白質(zhì)穩(wěn)定性。要注意AAD-12傾向于通過(guò)形成二硫鍵寡聚化，因此通常2mMDTT用于蛋白質(zhì)儲(chǔ)存。在存在和不存在1％海藻糖的條件下，測(cè)試磷酸鹽緩沖液(PBS)和Tris鹽緩沖液(TBS)用于蛋白質(zhì)的凍干。此外，分別檢測(cè)來(lái)自于純化樣品的內(nèi)毒素和DNA雜質(zhì)，并且通過(guò)等電聚焦(IEF)分析評(píng)測(cè)AAD-12蛋白的完整性。10毫克純化的AAD-12(v2)送至ZymedLaboratories，Inc.(SouthSanFrancisco，CA)進(jìn)行兔多克隆抗體的產(chǎn)生。在5周的時(shí)期內(nèi)，兔子接受5次注射，每一注射劑含有懸浮于1ml完全弗氏佐劑中的0.5mg純化的蛋白質(zhì)。在親和純化以及辣根過(guò)氧化物酶(HRP)綴合(ZymedLabInc)之前，用ELISA和免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)血清以證實(shí)特異性和親和性。實(shí)施例5-體外測(cè)定AAD-12活性5.1-通過(guò)比色酚檢測(cè)測(cè)定。通過(guò)產(chǎn)物酚的比色檢測(cè)測(cè)量酶活性，其中使用由Fukumori和Hausinger(1993)(J.Biol.Chem.268：24311-24317)的改良方案以允許使用96孔微孔板形式的方案。已有描述將比色測(cè)定用于測(cè)量雙加氧酶的活性，其裂解2，4-滴和2，4-滴丙酸以釋放產(chǎn)物2，4-二氯苯酚。使用前述檢測(cè)方法將來(lái)自若干酚的顏色與2，4-二氯苯酚的進(jìn)行比較，以確定哪種酚產(chǎn)物便于檢測(cè)。在含有200μMNH4(FeSO4)2、200μM抗壞血酸鈉的0.15ml20mMMOPSpH6.75中以100μM終濃度檢測(cè)酚和酚類似物。來(lái)自氟草煙和綠草定的吡啶酚未產(chǎn)生明顯的顏色。在高至約500μM的測(cè)定中，2，4-二氯苯酚的顏色產(chǎn)生是線性的，并與酚濃度成正比。在標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定條件(160μl終測(cè)定體積)下得到的校正曲線表明從17.2μM酚可得到510nm處0.1的吸收。在含有200μMNH4FeSO4、200μM抗壞血酸鈉、1mMα-酮戊二酸、適當(dāng)?shù)孜?以DMSO中制備的100mM原液加入)和酶的總體積0.16ml的20mMMOPSpH6.75中進(jìn)行酶測(cè)定。在零時(shí)間點(diǎn)加入芳氧基鏈烷酸酯底物、酶或α-酮戊二酸起始反應(yīng)。在25℃孵育5分鐘后，通過(guò)加入30μl1∶1∶1混合的50mMNaEDTA、pH10緩沖液(3.09g硼酸+3.73gKCl+44ml1NKOH)和0.2％4-氨基安替比林終止反應(yīng)。再加入10μl0.8％鐵氰化鉀。5或10分鐘之后，在分光光度微孔板讀數(shù)器中記錄510nm處的吸收?？瞻缀谐敢酝獾乃性噭?，以解釋底物被少量酚造成的偶然的輕微污染。5.2-通過(guò)氯吡啶酚檢測(cè)測(cè)定AAD-12作用于潛在的底物如包含取代吡啶(而非苯環(huán))的除草劑綠草定，在斷裂芳氧基鏈烷酸酯鍵時(shí)，將釋放吡啶酚。使用前面章節(jié)中所述的氨基安替吡啉/鐵氰化苯酚測(cè)定法不能檢測(cè)吡啶酚。然而，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)物氯吡啶酚在近UV處有強(qiáng)吸收，其中λmax出現(xiàn)在pH7325nm處(消光系數(shù)～8,400M-1.cm-1)。這用于創(chuàng)建連續(xù)的基于微孔板的分光光度檢測(cè)法。在總體積為0.2ml，pH6.75的20mMMOPS中進(jìn)行測(cè)定，其中含200μMNH4FeSO4、200μM抗壞血酸鈉、1mMα-酮戊二酸、適當(dāng)?shù)牡孜?加入配制在DMSO中的100mM的貯液)和酶。在零時(shí)間點(diǎn)通過(guò)加入芳氧基鏈烷酸酯底物、酶或α-酮戊二酸起始測(cè)定，并在酶標(biāo)儀中對(duì)325nm處吸光度的增加進(jìn)行10分鐘的跟蹤檢測(cè)。反應(yīng)最初2分鐘用于確定初始速率。在標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定條件下(200μl最終測(cè)定體積)進(jìn)行的校正曲線表明從11.9μM氯吡啶酚獲得510nm處的吸光度為0.1。5.3-使用2-(2-氯，4-硝基苯氧基)丙酸酯的比色測(cè)定法使用2-(2-氯，4-硝基苯氧基)丙酸酯(CNPP)作為底物，發(fā)明了方便的AAD-12測(cè)定法。AAD-12斷裂CNPP釋放2-氯，4-硝基苯酚。苯酚在pH7、410nm處有亮黃吸收，使反應(yīng)隨后能進(jìn)行連續(xù)或終點(diǎn)分析。不需要加入另外的試劑，能可視監(jiān)測(cè)AAD-12活性的存在。在總體積為0.2ml，pH6.75的20mMMOPS中進(jìn)行基于微孔板的分光光度測(cè)定，其中含200μMNH4FeSO4、200μM抗壞血酸鈉、1mMα-酮戊二酸、適量的CNPP(加入配制在DMSO中的10mM貯液)和酶。在零時(shí)間點(diǎn)通過(guò)加入CNPP、酶或α-酮戊二酸起始測(cè)定，并在酶標(biāo)儀中對(duì)410nm處吸光度的增加進(jìn)行10分鐘的跟蹤檢測(cè)。反應(yīng)最初2分鐘用于確定初始速率。在標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定條件下(200μl最終測(cè)定體積)進(jìn)行的校正曲線表明從25.1μM2-氯，4-硝基苯酚獲得410nm處的吸光度為0.1。使用這種測(cè)定法，確定CNPP作為底物的動(dòng)力學(xué)常數(shù)是Km＝31±5.5μM，而kcat＝16.2±0.79min-1。實(shí)施例6-體外AAD-12對(duì)多種底物的活性6.1-AAD-12(v2)對(duì)(R，S)-2，4-滴丙酸、(R)-2，4-滴丙酸、(S)-2，4-滴丙酸和2，4-滴的活性使用實(shí)施例5.1所述苯酚檢測(cè)法，在含有4.4μg純化的AAD-12(v2)的反應(yīng)混合物中測(cè)定四種苯氧基鏈烷酸酯。(R，S)-2，4-滴丙酸(R，S-DP)在1mM檢測(cè)，(R)-2，4-滴丙酸、(S)-2，4-滴丙酸和2，4-滴在0.5mM檢測(cè)。結(jié)果如圖3所示，說(shuō)明AAD-12(v2)對(duì)2，4-滴和2，4-滴丙酸對(duì)映異構(gòu)體的活性。4.4μg的AAD-12(v2)與0.5mM底物(對(duì)于(R，S)-2，4-滴丙酸是1mM)孵育，并通過(guò)加入α-酮戊二酸起始反應(yīng)。5分鐘之后，終止反應(yīng)，加入比色檢測(cè)試劑后確定510nm處的吸收值。減去沒(méi)有酶的背景值。AAD-12(v2)對(duì)(R，S)-2，4-滴丙酸和(S)-2，4-滴丙酸具有極好的活性，對(duì)(R)-2，4-滴丙酸活性最小。這說(shuō)明AAD-12(v2)具有明顯的對(duì)(S)-對(duì)映異構(gòu)體的偏愛。AAD-12(v2)對(duì)2，4-滴的活性與對(duì)(S)-2，4-滴丙酸的活性等同，表明酶能有效處理氧丙酸酯和氧乙酸酯。6.2-AAD-12(v2)對(duì)吡啶氧鏈烷酸酯的活性使用實(shí)施例5.2所述的吡啶酚測(cè)定法，在含有6.8μg純化的AAD-12(v2)的反應(yīng)混合物中檢測(cè)五種1mM的吡啶氧鏈烷酸酯。監(jiān)控每個(gè)反應(yīng)的速率并呈現(xiàn)在表9中。所有五種吡啶氧鏈烷酸酯被AAD-12(v2)分解釋放吡啶酚。氧丙酸酯底物116844和91767的速率在某種程度上比相應(yīng)乙酸酯(分別為綠草定和93833)的速率快，說(shuō)明AAD-12(v2)對(duì)氧丙酸酯的偏愛超過(guò)氧乙酸酯的側(cè)鏈。這些數(shù)據(jù)表明AAD-12(v2)能有效降解吡啶氧鏈烷酸酯除草劑(如綠草定)。6.3-AAD-12(v2)對(duì)2，4-滴、(R，S)-2，4-滴丙酸和綠草定的動(dòng)力學(xué)常數(shù)使用適當(dāng)?shù)臋z測(cè)方法測(cè)定純化的AAD-12(v2)對(duì)除草劑2，4-滴、(R，S)-2，4-滴丙酸和綠草定的Km和kcat值。由于高濃度(＞1mM)的2，4-滴和(R，S)-2，4-滴丙酸發(fā)生底物抑制，因此利用低于此的濃度使用Grafit4.0(Erithacus軟件，UK)使數(shù)據(jù)擬合Michaelis-Menten方程。綠草定濃度達(dá)到2mM，沒(méi)有觀察到底物抑制。表10總結(jié)了動(dòng)力學(xué)常數(shù)。從這些數(shù)據(jù)，在最大速率條件下，AAD-12(v2)分解綠草定的速率大約是2，4-滴的5％。＊由于AAD-12對(duì)(S)-異構(gòu)體偏愛，因此假設(shè)外消旋混合物的50％可作為底物來(lái)計(jì)算Km值。實(shí)施例7-轉(zhuǎn)化進(jìn)擬南芥并選擇7.1-擬南芥培養(yǎng)條件將野生型擬南芥種子懸于0.1％瓊脂糖(希格瑪化學(xué)公司，SigmaChemicalCo.，St.Louis，MO)溶液中。將懸浮的種子在4℃保存2天以完成對(duì)休眠的需要并保證種子同步萌發(fā)(層積)。用細(xì)蛭石覆蓋SunshineMixLP5(SunGroHorticulture公司，Bellevue，WA)并用Hoagland溶液地下灌溉至濕潤(rùn)。使土壤混合物排水24小時(shí)。將層積的種子種在蛭石上并用保濕罩(KORDProducts公司，Bramalea，Ontario，Canada)覆蓋7天。使種子萌發(fā)并在恒溫(22℃)恒濕(40-50％)光強(qiáng)度為120-150μmol/m2秒的長(zhǎng)日照條件(16小時(shí)光照/8小時(shí)黑暗)下在Conviron(型號(hào)CMP4030和CMP3244，ControlledEnvironmentsLimited公司，Winnipeg，Manitoba，Canada)中培養(yǎng)植物。開始用Hoagland溶液灌溉植物，接著用去離子水灌溉，保持土壤潮濕但不濕透。7.2-農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化帶有劃線接種的DH5α菌落的含紅霉素(希格瑪化學(xué)公司，SigmaChemicalCo.，St.Louis，MO)(200mg/L)或壯觀霉素(100mg/L)的LB+瓊脂平板用于提供菌落，接種到4ml小量制備培養(yǎng)物(液體LB+紅霉素)中。將培養(yǎng)物在37℃持續(xù)搖動(dòng)孵育過(guò)夜。按照生產(chǎn)商的說(shuō)明使用Qiagen(Valencia，CA)旋轉(zhuǎn)小量制備試劑盒(SpinMiniPreps)純化質(zhì)粒DNA。使用來(lái)自Weigel和Glazebrook(2002)的方案制備電感受態(tài)的根癌農(nóng)桿菌(菌株Z707、EHA101和LBA4404)細(xì)胞。使用修改自Weigel和Glazebrook(2002)的電穿孔方法轉(zhuǎn)化感受態(tài)農(nóng)桿菌細(xì)胞。在冰上融化50μl感受態(tài)農(nóng)桿菌細(xì)胞并在細(xì)胞中加入10-25ng所需的質(zhì)粒。將DNA和細(xì)胞混合物加入預(yù)冷的電穿孔杯(2mm)中。用以下條件使用Eppendorf電穿孔儀2510進(jìn)行轉(zhuǎn)化：電壓：2.4kV，脈沖長(zhǎng)度：5毫秒。電穿孔后，向杯中加入1mlYEP培養(yǎng)液(每升：10g酵母膏、10gBacto蛋白胨、5gNaCl)并將細(xì)胞-YEP懸液轉(zhuǎn)移到15ml培養(yǎng)管中。將細(xì)胞在水浴中持續(xù)搖動(dòng)以28℃孵育4小時(shí)。孵育后，將培養(yǎng)物涂到含紅霉素(200mg/L)或壯觀霉素(100mg/L)和鏈霉素(希格瑪化學(xué)公司，SigmaChemicalCo.，St.Louis，MO)(250mg/L)的YEP+瓊脂板上。28℃孵育平板2-4天。選取菌落并劃線接種到含紅霉素(200mg/L)或壯觀霉素(100mg/L)和鏈霉素(250mg/L)的新鮮YEP+瓊脂平板上，在28℃孵育1-3天。選取菌落使用載體特異性引物進(jìn)行PCR分析，以確認(rèn)基因插入片段的存在。按照生產(chǎn)商的說(shuō)明使用QiagenSpinMiniPrep從選取的農(nóng)桿菌菌落純化質(zhì)粒DNA，例外是另將15ml過(guò)夜小量制備培養(yǎng)物(液體YEP+紅霉素(200mg/L)或壯觀霉素(100mg/L)和鏈霉素(250mg/L))的4ml等分式樣用于DNA純化。使用QiagenSpinMiniPrepDNA的替代是裂解轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌細(xì)胞，在100℃于10μl水中懸浮5分鐘。來(lái)自農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化中使用的二元載體的質(zhì)粒DNA納入作為對(duì)照。以0.5×的濃度按照生產(chǎn)商的說(shuō)明使用TakaraMirusBioInc.(Madison，Wisconsin)的TaqDNA聚合酶完成PCR反應(yīng)。按以下條件設(shè)置程序在MJResearchPeltier熱循環(huán)儀中進(jìn)行PCR反應(yīng)：1)94℃3分鐘，2)94℃45秒，3)55℃30秒，4)72℃1分鐘，共29個(gè)循環(huán)，其后是72℃10分鐘的一個(gè)循環(huán)。循環(huán)后將反應(yīng)物保持在4℃。通過(guò)1％瓊脂糖凝膠電泳分析擴(kuò)增產(chǎn)物，并通過(guò)溴化乙啶染色顯像。選擇了其PCR產(chǎn)物與質(zhì)粒對(duì)照相同的菌落。7.3-擬南芥轉(zhuǎn)化。使用花浸泡法轉(zhuǎn)化擬南芥。用選取的菌落接種一份或多份15-30ml含紅霉素(200mg/L)或壯觀霉素(100mg/L)和鏈霉素(250mg/L)的YEP培養(yǎng)液的預(yù)培養(yǎng)物。以220rpm將培養(yǎng)物在28℃恒速搖動(dòng)孵育過(guò)夜。每個(gè)預(yù)培養(yǎng)物用于接種兩份500ml含紅霉素(200mg/L)或壯觀霉素(100mg/L)和鏈霉素(250mg/L)的YEP培養(yǎng)液的培養(yǎng)物并將培養(yǎng)物在28℃持續(xù)搖動(dòng)孵育過(guò)夜。室溫以約8700×g離心10分鐘沉淀細(xì)胞，棄去得到的上清液。將細(xì)胞沉淀輕柔重懸于500ml滲透培養(yǎng)基中，所述滲透培養(yǎng)基含有1/2×Murashige和Skoog鹽/GamborgB5維生素、10％(重量/體積)蔗糖、0.044μM芐氨基嘌呤(10μl/升(1mg/mlDMSO中的原液)和300μl/升SilwetL-77。將約1月齡的植物在培養(yǎng)基中浸泡15秒，確保浸沒(méi)最新的花序。接著將植物側(cè)面放倒并覆蓋(透明或不透明)24小時(shí)，接著用水洗滌并豎直放置。在22℃以16小時(shí)光照/8小時(shí)黑暗的光周期培養(yǎng)植物。浸泡約4周后收獲種子。7.4-轉(zhuǎn)化植物的選擇將新收獲的[(AAD-12(v1)基因]T1種子在室溫干燥7天。將種子種在26.5×51cm萌發(fā)盤(T.O.PlasticsInc.有限公司，Clearwater，MN)中，每盤接受200mg等分式樣的層積T1種子(～10,000個(gè)種子)，所述種子事先已懸于40ml0.1％瓊脂糖溶液并在4℃保存2天以完成休眠需要并保證同步的種子萌發(fā)。用蛭石覆蓋SunshineMixLP5(SunGroHorticultureInc.有限公司，Bellevue，WA)并用Hagland溶液地下灌溉至濕透，利用重力排水。用移液管將層積種子的每個(gè)40ml等分式樣均勻地種到蛭石上，并用保濕罩(KORDProducts，Bramalea，Ontario，Canada)覆蓋4-5天。在使用出苗后噴灑草銨膦(選擇共轉(zhuǎn)化的PAT基因)進(jìn)行最初轉(zhuǎn)化體選擇前1天移去罩。在7個(gè)種植后天數(shù)(DAP)并于11DAP再次使用DeVilbiss壓縮空氣噴嘴以10ml/盤(703L/ha)的噴灑體積用Liberty除草劑(200gai/L的草銨膦，拜耳作物科學(xué)集團(tuán)(BayerCropSciences)，KansasCity，MO)的0.2％溶液噴灑T1植物(分別為子葉期和2-4葉期)，以提供每次應(yīng)用280gai/ha有效量的草銨膦。在最后噴灑后4-7天鑒定存活株(活躍生長(zhǎng)的植物)，并分別移植到用盆栽基質(zhì)(MetroMix360)制備的3英寸盆中。用保濕罩覆蓋移植的植物3-4天，并如前置于22℃培養(yǎng)室中或直接移入溫室。接著移去罩并在測(cè)試AAD-12(v1)(植物優(yōu)化基因)提供苯氧基生長(zhǎng)素除草劑抗性的能力之前至少1天將植物栽種到溫室(22±5℃，50±30％RH，14小時(shí)光照：10小時(shí)黑暗，最小500μE/m2s1天然+補(bǔ)充光)。然后將T1植物隨機(jī)分配到多個(gè)用量的2，4-滴。對(duì)于擬南芥，50gae/ha2，4-滴是將敏感植物與具有平均抗性水平的植物區(qū)分開的有效劑量。還使用提高的用量(50、200、800或3200gae/ha)確定抗性的相對(duì)水平。表10和11顯示與先前在PCT/US2005/014737中描述的芳氧基鏈烷酸酯除草劑抗性基因(AAD-1(v3))的比較。如上述使用DeVilbiss噴霧器實(shí)現(xiàn)所有的生長(zhǎng)素除草劑應(yīng)用，以應(yīng)用703L/ha的噴灑體積(0.4ml溶液/3英寸盆)，或者通過(guò)履帶式噴霧機(jī)以187L/ha的噴灑體積應(yīng)用。使用的2，4-滴為溶于DMSO并稀釋于水中(＜1％DMSO終濃度)的工業(yè)級(jí)(希格瑪Sigma，St.Louis，MO)或?yàn)樯逃枚装符}制劑(456gae/L，NuFarm，StJoseph，MO)。使用的2，4-滴丙酸是商業(yè)級(jí)制備成R-2，4-滴丙酸鉀鹽(600gai/L，AHMarks)。隨著除草劑的量提高到超過(guò)800gae/ha，噴灑溶液的pH變的極度酸性，燒傷擬南芥植物的幼小嫩葉，并使評(píng)估除草劑的首效變得復(fù)雜。在200mMHEPES緩沖液(pH7.5)中應(yīng)用這些高用量的除草劑成為標(biāo)準(zhǔn)實(shí)踐。使一些T1個(gè)體接受代替苯氧基生長(zhǎng)素的備選商品除草劑。一個(gè)興趣點(diǎn)是測(cè)定吡啶氧乙酸生長(zhǎng)素除草劑、綠草定和氟草煙在植物中是否可被有效降解。使用履帶式噴霧機(jī)以187L/ha的噴灑體積對(duì)T1植物應(yīng)用除草劑。對(duì)2，4-滴二甲胺鹽表現(xiàn)出耐性的T1植物可進(jìn)一步在T2代使用。7.5-轉(zhuǎn)化植物的選擇結(jié)果用AAD-12(v1)(植物優(yōu)化基因)進(jìn)行首次擬南芥轉(zhuǎn)化。首先使用草銨膦選擇方案從未轉(zhuǎn)化種子背景中選擇T1轉(zhuǎn)化體。篩選了超過(guò)300,000個(gè)T1種子并鑒定了316個(gè)草銨膦抗性植物(PAT基因)，等于0.10％的轉(zhuǎn)化/選擇頻率，該轉(zhuǎn)化頻率處于構(gòu)建體選擇頻率的正常范圍內(nèi)，其中PAT+Liberty用于選擇。其后將上述選擇的T1植物移植到單個(gè)盆中并用多個(gè)用量的商品芳氧基鏈烷酸酯除草劑噴灑。表11比較了AAD-12(v1)和對(duì)照基因賦予擬南芥T1轉(zhuǎn)化體2，4-滴抗性的應(yīng)答。以目測(cè)損傷百分比2WAT顯示應(yīng)答。以表現(xiàn)小或無(wú)損傷(＜20％)、中度損傷(20-40％)或嚴(yán)重?fù)p傷(＞40％)的個(gè)體的直方圖顯示數(shù)據(jù)。由于每株T1是獨(dú)立的轉(zhuǎn)化事件，可以預(yù)計(jì)在給定劑量?jī)?nèi)個(gè)體T1應(yīng)答的顯著差異。顯示了每種處理的算術(shù)平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。還在最后一列標(biāo)出了每一用量和轉(zhuǎn)化的個(gè)體應(yīng)答的范圍。轉(zhuǎn)化PAT/CrylF的擬南芥用作為生長(zhǎng)素敏感型轉(zhuǎn)化對(duì)照。AAD-12(v1)基因賦予個(gè)體擬南芥植物除草劑抗性。在給定的處理內(nèi)，植物應(yīng)答的水平變化顯著，這可能是由于每個(gè)植物代表獨(dú)立的轉(zhuǎn)化事件的事實(shí)。特別需要注意在測(cè)試的每個(gè)2，4-滴用量中都存在未受影響的個(gè)體，而另一些則受到嚴(yán)重的影響。總體種群平均損傷率示于表11，僅證明轉(zhuǎn)化AAD-12(v1)與野生型或轉(zhuǎn)化PAT/CrylF的對(duì)照之間的顯著差異。在升至3,200gae/ha(或6×大田用量)的提高的用量下，損傷水平傾向于提高，且未受損植物的頻率較低。同樣在這些高用量下，如果不進(jìn)行緩沖則噴灑溶液變成高酸性。主要在生長(zhǎng)室中培養(yǎng)的擬南芥角質(zhì)層很薄，嚴(yán)重的燒傷效應(yīng)會(huì)使這些提高劑量下的測(cè)試復(fù)雜化。盡管如此，仍有一些個(gè)體在3200gae/ha2，4-滴的情況下小損傷或無(wú)損傷的存活下來(lái)。表11.與AAD-1v3(T4)純合抗性群、或Pat-Cry1F轉(zhuǎn)化的生長(zhǎng)素敏感對(duì)照相比較，AAD-12(v1)轉(zhuǎn)化的T1擬南芥對(duì)出苗后應(yīng)用一系列2，4-滴用量的應(yīng)答。表11.與AAD-1v3(T4)純合抗性群、或Pat-Cry1F轉(zhuǎn)化的生長(zhǎng)素敏感對(duì)照相比較，AAD-12(v1)轉(zhuǎn)化的T1擬南芥對(duì)出苗后應(yīng)用一系列2，4-滴用量的應(yīng)答。表12顯示T1擬南芥對(duì)苯氧丙酸、2，4-滴丙酸類似的劑量應(yīng)答。數(shù)據(jù)顯示除草劑活性的2，4-滴丙酸(R-)同分異構(gòu)體不能作為AAD-12(v1)合適的底物。事實(shí)上AAD-1代謝R-2，4-滴丙酸足以賦予商業(yè)上可接受的耐性，這是區(qū)分兩種基因一個(gè)顯著特征(表12)。認(rèn)為AAD-1和AAD-12分別是R-和S-特異性的α-酮戊二酸雙加氧酶。表12.T1擬南芥對(duì)出苗后應(yīng)用的一系列R-2，4-滴丙酸用量的應(yīng)答7.6-AAD-12(v1)作為選擇標(biāo)記物。最初用如上述轉(zhuǎn)化的擬南芥分析使用AAD-12(v1)作為選擇標(biāo)記物的能力，其中使用2，4-滴作為選擇劑。將大約50顆T4代擬南芥種子(AAD-12(v1)純合)摻入大約5000顆野生型(敏感)種子。比較一些處理，每盤植物按以下處理方案中的一種接受一次或兩次應(yīng)用2，4-滴的時(shí)間：7DAP、11DAP或7DAP之后11DAP再次應(yīng)用。由于所有個(gè)體在同一轉(zhuǎn)化載體中也含有PAT基因，用2，4-滴選擇的AAD-12能直接與用草銨膦選擇的PAT進(jìn)行比較。如前面所述用DeVilbiss噴嘴實(shí)施處理。在17DAP鑒定植物為抗性或敏感。最佳處理是在種植后7和11天(DAP)運(yùn)用2，4-滴(75gae/ha)，在選擇頻率上同等有效，并導(dǎo)致對(duì)轉(zhuǎn)化個(gè)體的除草劑損傷比Liberty選擇方案小。這些結(jié)果表明對(duì)于轉(zhuǎn)化的擬南芥群，AAD-12(v1)能有效作為替代的選擇標(biāo)記物使用。7.7-遺傳力。使多個(gè)T1事件自花授粉產(chǎn)生T2種子。通過(guò)對(duì)100株隨機(jī)T2同胞應(yīng)用2，4-滴(200gae/ha)對(duì)這些種子進(jìn)行子代測(cè)試。在噴灑應(yīng)用(187L/ha的應(yīng)用量的履帶式噴霧機(jī))之前，先將每個(gè)T2個(gè)體植物移植到7.5cm見方的盆中?？ǚ椒治?P＞0.05)確定75％的T1家系(T2植物)以預(yù)期的孟德爾遺傳單基因座顯性遺傳的3抗性：1敏感模式分離。收集12到20個(gè)T2個(gè)體的種子(T3種子)。如前述對(duì)8個(gè)隨機(jī)選擇T2家系按每個(gè)家系25個(gè)T3同胞進(jìn)行子代測(cè)試。在每個(gè)株系中鑒定了約三分之一的預(yù)期為純合的T2家系(未分離種群)。這些數(shù)據(jù)顯示AAD-12(v1)穩(wěn)定整合，且以孟德爾方式遺傳至少3代。7.8-AAD-12擬南芥中其它除草劑抗性的葉敷應(yīng)用。通過(guò)葉敷應(yīng)用多種底物測(cè)定AAD-12(v1)在轉(zhuǎn)基因擬南芥中提供對(duì)其他芳氧基鏈烷酸酯生長(zhǎng)素除草劑的抗性的能力。使T2代擬南芥種子層積并種到與擬南芥相似的選擇盤(實(shí)施例6.4)中。以類似的方式種植含有PAT和昆蟲抗性基因Cry1F的轉(zhuǎn)化對(duì)照株系。將苗轉(zhuǎn)移到溫室中單獨(dú)的3英寸盆中。以187L/ha用履帶式噴霧機(jī)對(duì)所有植物噴灑。對(duì)植物噴灑一系列吡啶氧乙酸類除草劑：280-2240gae/ha綠草定(Garlon3A，陶氏益農(nóng)，DowAgroSciences)和280-2240gae/ha氟草煙(Starane，陶氏益農(nóng)，DowAgroSciences)；以及由AAD-12活性引起的2，4-D代謝物2，4-二氯苯酚(DCP，希格瑪，Sigma)(摩爾數(shù)等于280-2240gae/ha2，4-滴，使用工業(yè)級(jí)DCP)。所有的應(yīng)用配制到水中。每個(gè)處理重復(fù)3-4次。在處理后第3和第14天評(píng)估植物。2，4-滴代謝產(chǎn)物2，4-滴丙酸(DCP)對(duì)轉(zhuǎn)基因的非AAD-12對(duì)照擬南芥(Pat/Cry1F)沒(méi)有作用。AAD-12轉(zhuǎn)化的植物還明顯免遭綠草定和氟草煙除草劑的損傷而受到保護(hù)，在轉(zhuǎn)化的非抗性對(duì)照中可見這種損傷(參閱表13)。這些結(jié)果證實(shí)擬南芥中的AAD-12(v1)提供對(duì)測(cè)試的吡啶氧乙酸類生長(zhǎng)素的抗性。這是第一次報(bào)道對(duì)吡啶氧乙酸類除草劑具有顯著活性的酶。其它2，4-滴降解酶未見報(bào)道具有相似的活性。＊該實(shí)驗(yàn)植物發(fā)育遲緩且嚴(yán)重偏上發(fā)育，但仍保持綠色且沒(méi)有遭受＞75％的損傷率。7.9-AAD-12(v1)擬南芥的分子分析。用總DNA進(jìn)行用于PAT基因拷貝數(shù)分析的侵入物測(cè)定(ThirdWaveAgbio試劑盒方案的方法)以確定含有PAT和AAD-12(v1)的植物轉(zhuǎn)化單位的穩(wěn)定整合，所述總DNA使用QiagenDNeasy試劑盒從多個(gè)AAD-12(v1)純合株系獲得。由于它們包含于同一質(zhì)粒，分析假定這些基因直接物理連鎖。結(jié)果顯示測(cè)試的所有2，4-滴抗性植物都含有PAT(從而推斷也含有AAD-12(v1))?？截悢?shù)分析顯示總插入物的范圍從1到5個(gè)拷貝。這也與AAD-12(v1)蛋白表達(dá)數(shù)據(jù)一致，表明酶的存在產(chǎn)生對(duì)所有市售苯氧乙酸和吡啶氧乙酸顯著高水平的抗性。7.10-用AAD-12(v1)和草甘膦抗性基因的分子疊加轉(zhuǎn)化的擬南芥。如前述產(chǎn)生含有編碼推定的草甘膦抗性性狀的pDAB3759質(zhì)粒(AAD-12(v1)+EPSPS)的T1擬南芥種子。如實(shí)施例7.6所述，使用AAD-12(v1)作為選擇標(biāo)記物選擇T1轉(zhuǎn)化體。從第一次選擇嘗試中回收T1植物(個(gè)體轉(zhuǎn)化事件)并如前述轉(zhuǎn)移到溫室中的3英寸盆中。還測(cè)試了三個(gè)不同的對(duì)照擬南芥株系：野生型Columbia-0、AAD-12(v1)+PATT4純合株系(轉(zhuǎn)化了pDAB724)和PAT+Cry1F純合株系(轉(zhuǎn)化對(duì)照)。在幼苗期預(yù)篩選pDAB3759和pDAB724轉(zhuǎn)化植物的2，4-滴耐性。移植4天后，將植物平均分開，如前述通過(guò)履帶式噴霧機(jī)以水中的0、26.25、105、420或1680gae/ha草甘膦(GlyphomaxPlus，陶氏益農(nóng)，DowAgroSciences)進(jìn)行葉處理。所有的處理重復(fù)5到20次。在處理7和14天后評(píng)估植物。最初抗性評(píng)估表明當(dāng)與三種對(duì)照株系的應(yīng)答比較時(shí)，對(duì)2，4-滴具耐性的植物隨后對(duì)草甘膦具耐性。這些結(jié)果說(shuō)明可賦予植物對(duì)兩種具有不同作用模式的除草劑的抗性，包括2，4-滴和草甘膦耐性，允許出苗后使用兩種除草劑。此外，對(duì)真正的抗性選擇，AAD-12+2，4-D可有效作為選擇標(biāo)記物。表14.T1擬南芥對(duì)出苗后(14DAT)使用的一定量草甘膦的應(yīng)答7.11-AAD-12擬南芥與AAD-1遺傳性疊加以提供更廣的除草劑耐性譜。AAD-12(v1)(pDAB724)和AAD-1(v3)(pDAB721)植物相互雜交并收集F1種子。種植8顆F1種子且允許生長(zhǎng)產(chǎn)生種子。從8個(gè)F1植物獲得組織樣品并經(jīng)Western(蛋白質(zhì))分析確定兩個(gè)基因的存在。得出結(jié)論所有8個(gè)測(cè)試植物表達(dá)AAD-1和AAD-12蛋白。將種子混合并允許在種植前干燥一個(gè)星期。播種100顆F2種子并使用280gai/ha草銨膦。96個(gè)F2植物經(jīng)草銨膦選擇存活，符合對(duì)于兩個(gè)獨(dú)立分配的草銨膦抗性位點(diǎn)預(yù)期的分離率(15R：1S)。然后用560gae/haR-2，4-滴丙酸+560gae/ha綠草定處理草銨膦抗性植物，以與用于其它測(cè)試相同的噴灑方式運(yùn)用到植物中。在3和14DAT將植物分級(jí)。經(jīng)草銨膦選擇存活的96個(gè)植物中的63個(gè)經(jīng)使用除草劑也存活下來(lái)。這些數(shù)據(jù)與預(yù)期的兩個(gè)獨(dú)立分配的顯性性狀(其中每個(gè)基因只對(duì)一種生長(zhǎng)素除草劑(R-2，4-滴丙酸或綠草定)產(chǎn)生抗性)分離模式(9R：6S)一致。結(jié)果表明AAD-12(pDAB724)能與AAD-1(pDAB721)成功疊加，因此增加了可運(yùn)用于目的作物的除草劑譜[分別為(2，4-滴+R-2，4-滴丙酸)和(2，4-滴+氟草煙+綠草定)]。這對(duì)于通過(guò)常規(guī)的疊加兩個(gè)單獨(dú)的2，4-滴抗性基因，給非常敏感物種帶來(lái)2，4-滴耐性是有用的。此外，如果通過(guò)獨(dú)立轉(zhuǎn)化活性使用任一基因作為第三和第四個(gè)目的基因的選擇標(biāo)記物，則可以通過(guò)常規(guī)育種行為將每個(gè)基因?qū)M合在一起，并隨后通過(guò)成對(duì)除草劑(專屬AAD-1和AAD-12酶)的噴霧在F1代中進(jìn)行選擇(如上文所示R-2，4-滴丙酸和綠草定分別對(duì)應(yīng)AAD-1和AAD-12)。其它AAD疊加也在本發(fā)明范圍之內(nèi)。例如本文別處討論的TfdA蛋白(Streber等)能與本發(fā)明AAD-12基因一起使用，賦予本發(fā)明轉(zhuǎn)基因植物新的除草劑抗性譜。實(shí)施例8-使用咪草煙選擇，晶須介導(dǎo)玉米轉(zhuǎn)化8.1-AAD-12(v1)的克隆。AAD-12(v1)基因作為NcoI/SacI片段從中間載體pDAB3283切離。將其定向連接到包含ZmUbi1單子葉植物啟動(dòng)子的同樣進(jìn)行切割的pDAB3403載體中。使用T4DNA連接酶將兩個(gè)片段連接在一起并轉(zhuǎn)化進(jìn)DH5α細(xì)胞。使用Qiagen的QIASpin小量制備試劑盒對(duì)得到的菌落進(jìn)行小量制備，并消化菌落以檢查方向。第一個(gè)中間構(gòu)建體(pDAB4100)包含ZmUbi1：AAD-12(v1)盒。用NotI和PvuI消化此構(gòu)建體以釋放基因盒并消化不需要的骨架。基因盒與NotI切割的pDAB2212連接，其含有由稻肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子OsAct1驅(qū)動(dòng)的AHAS選擇標(biāo)記。最終的構(gòu)建體命名為pDAB4101或pDAS1863，含有ZmUbi1/AAD-12(v1)/ZmPer5：：OsAct1/AHAS/LzmLip。8.2-愈傷組織/懸液起始。為得到進(jìn)行愈傷組織培養(yǎng)物起始的未成熟胚，進(jìn)行溫室培養(yǎng)的Hi-II親本A和B(Armstrong等1991)之間的F1雜交。當(dāng)胚大小為1.0-1.2mm(授粉后約9-10天)時(shí)，收獲穗并通過(guò)用皂擦洗、浸入70％乙醇2-3分鐘、接著浸入20％商品漂白劑(0.1％次氯酸鈉)30分鐘來(lái)表面滅菌。在無(wú)菌蒸餾水中洗滌穗，無(wú)菌切下未成熟合子胚并在15Ag10培養(yǎng)基(N6培養(yǎng)基(Chu等，1975)、1.0mg/L2，4-滴、20g/L蔗糖、100mg/L酪蛋白水解物(酶消化)、25mML-脯氨酸、10mg/LAgNO3、2.5g/L固化劑(Gelrite)，pH5.8)上培養(yǎng)2-3周，使子葉盤背對(duì)著培養(yǎng)基。在約6周中以兩周間隔選擇性的將顯示正確形態(tài)(Welter等，1995)的組織轉(zhuǎn)移到新的15Ag10培養(yǎng)基上，接著在約2個(gè)月中以兩周間隔轉(zhuǎn)移到4培養(yǎng)基(N6培養(yǎng)基、1.0mg/L2，4-滴、20g/L蔗糖、100mg/L酪蛋白水解物(酶消化)、6mML-脯氨酸、2.5g/L固化劑，pH5.8)上。為起始胚胎發(fā)生的懸液培養(yǎng)物，將約3ml細(xì)胞壓積(PCV)來(lái)源于單個(gè)胚的愈傷組織加入約30mlH9CP+液體培養(yǎng)基(MS基礎(chǔ)鹽混合物(Murashige和Skoog，1962)、改良的MS維生素(含有更少煙酸(10倍)和更多(5倍)硫胺-HCl)、2.0mg/L2，4-滴、2.0mg/Lα-萘乙酸(NAA)、30g/L蔗糖、200mg/L酪蛋白水解物(酸消化)、100mg/Lmyo-肌醇、6mML-脯氨酸、5％(體積/體積)椰汁(在馬上進(jìn)行傳代培養(yǎng)前加入)，pH6.0)中。在暗條件下，以28℃、125rpm在控溫振蕩器上的125ml錐形瓶中維持懸浮培養(yǎng)。一般在起始后2到3個(gè)月建立細(xì)胞系。在建立中，每3.5天通過(guò)使用廣口移液管將3mlPCV的細(xì)胞和7ml條件培養(yǎng)基加入20ml新鮮H9CP+液體培養(yǎng)基中進(jìn)行懸浮物傳代培養(yǎng)。當(dāng)組織開始倍增生長(zhǎng)時(shí)，將懸液擴(kuò)大規(guī)模并在500ml瓶中維持，其中把12mlPCV的細(xì)胞和28ml條件培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到80mlH9CP+培養(yǎng)基中。一旦懸液完全建立后將其深低溫保藏以備將來(lái)使用。8.3-懸液的深低溫保藏和融化傳代培養(yǎng)后兩天，將4mlPCV的懸浮細(xì)胞和4ml條件培養(yǎng)基加入8ml冷凍保護(hù)劑(1M甘油、1MDMSO、2M蔗糖，溶于無(wú)椰汁的H9CP+培養(yǎng)基中，過(guò)濾滅菌)中，并在125ml瓶中以125rpm在4℃振蕩1小時(shí)。1小時(shí)之后，將4.5ml加入冷的5.0mlCorning凍存瓶中。裝滿后，將單個(gè)瓶在控速制冷器中在4℃保持15分鐘，接著以-0.5℃/分鐘的速度將其冷凍，直至達(dá)到-40℃的終溫度。達(dá)到終溫度后，將瓶轉(zhuǎn)移到充滿液氮蒸汽的Cryoplus4存儲(chǔ)單元(FormaScientific)內(nèi)架子上的盒內(nèi)。融化時(shí)，將瓶從存儲(chǔ)單元中取出并置于封閉的干冰容器中，接著投入保持于40-45℃的水浴中直至“沸騰”平息。融化后，將內(nèi)含物倒在有蓋的100×25mm皮氏培養(yǎng)皿中約8層的無(wú)菌70mmWhatman濾紙(No.4)層上。使液體吸收到濾紙中幾分鐘，然后將含有細(xì)胞的頂層濾紙轉(zhuǎn)移到GN6培養(yǎng)基(N6培養(yǎng)基、2.0mg/L2，4-滴、30g/L蔗糖、2.5g/L固化劑，pH5.8)上1周。1周后，僅將形態(tài)有希望的組織直接從濾紙上轉(zhuǎn)移到新鮮的GN6培養(yǎng)基上。每7-14天傳代培養(yǎng)此組織至1到3克，可用于125mlErlenmeyer錐形瓶中約30mlH9CP+培養(yǎng)基中的懸液起始。每3.5天將3mlPCV在新的H9CP+培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)，直至得到總計(jì)12mlPCV，此時(shí)如前述傳代培養(yǎng)。8.4-穩(wěn)定轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化前約24小時(shí)，將12ml前述冷凍保存的胚胎發(fā)生玉米懸浮細(xì)胞加28ml條件培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)到500mlErlenmeyer錐形瓶中的80mlGN6液體培養(yǎng)基(缺少固化劑的GN6培養(yǎng)基)中，并置于28℃125rpm的振蕩器上。使用相同細(xì)胞系重復(fù)2次，以將總共36mlPCV分配到3個(gè)錐形瓶中。24小時(shí)后去除GN6液體培養(yǎng)基，用每瓶72mlGN6S/M滲透培養(yǎng)基(N6培養(yǎng)基、2.0mg/L2，4-滴、30g/L蔗糖、45.5g/L山梨醇、45.5g/L甘露醇、100mg/Lmyo-肌醇，pH6.0)代替，以使細(xì)胞質(zhì)壁分離。將瓶在黑暗中置于振蕩器上在28℃以125rpm振蕩30-35分鐘，其間通過(guò)將8.1ml適當(dāng)體積的GN6S/M液體培養(yǎng)基加入約405mg預(yù)先高壓滅菌的碳化硅晶須(AdvancedCompositeMaterials，Inc.有限公司)來(lái)制備50mg/ml的碳化硅晶須懸液。在GN6S/M中孵育后，將每個(gè)瓶的內(nèi)含物在250ml離心瓶中混合。當(dāng)細(xì)胞沉降到底部時(shí)，去除GN6S/M液體至只余約14ml并收集在無(wú)菌1L瓶中以備將來(lái)使用。將預(yù)濕潤(rùn)的晶須懸液以最大速度渦旋60秒，然后將8.1ml加入瓶中，最后一步在其中加入170μgDNA。立即將瓶置于改良的RedDevil5400商品油漆混合器中振蕩10秒。振蕩后，細(xì)胞、培養(yǎng)基、晶須和DNA的混合物與125ml新的GN6液體培養(yǎng)基一起加入1L瓶的內(nèi)含物中以減少滲透劑(osmoticant)。使細(xì)胞在振蕩器上在28℃以125rpm振蕩2小時(shí)進(jìn)行恢復(fù)，之后使用與房間真空線連接的玻璃細(xì)胞收集單元過(guò)濾到Whatman#4濾紙(5.5cm)上。將約2mL分散的懸液吸到用真空抽吸的濾紙表面。將濾紙置于GN6培養(yǎng)基的60×20mm平板上。在28℃將平板在暗盒中培養(yǎng)1周。1周后，將濾紙轉(zhuǎn)移到GN6(3P)培養(yǎng)基(N6培養(yǎng)基、2.0mg/L2，4-滴、30g/L蔗糖、100mg/Lmyo-肌醇、3μM咪草煙(DG)、2.5g/L固化劑、pH5.8)的60×20mm平板。將平板置于盒中并再培養(yǎng)一周。轉(zhuǎn)化兩周后，通過(guò)刮下平板上的全部細(xì)胞至3.0mL融化的含有3μM咪草煙(DG)的GN6瓊脂糖培養(yǎng)基(N6培養(yǎng)基、2.0mg/L2，4-滴、30g/L蔗糖、100mg/Lmyo-肌醇、7g/LSeaPlaque瓊脂糖，pH5.8，在121℃僅高壓滅菌10分鐘)來(lái)包埋組織。破碎組織并將3mL瓊脂糖和組織均勻倒在GN6(3P)的100×15mm平板的表面上。對(duì)所有剩余的平板重復(fù)此處理。包埋后，用或單個(gè)密封平板，然后培養(yǎng)直至推定的分離物出現(xiàn)。8.4.1-分離物恢復(fù)和再生的方案。通過(guò)在60×20mm平板中轉(zhuǎn)移同樣濃度的新鮮選擇培養(yǎng)基，約轉(zhuǎn)化后9周，從含有的包埋的平板中分離出推定的轉(zhuǎn)化事件。如果在約2-3周后持續(xù)生長(zhǎng)很明顯，則認(rèn)為事件是有抗性的并進(jìn)行分子分析。通過(guò)將愈傷組織轉(zhuǎn)移到基于細(xì)胞分裂素的28(3P)誘導(dǎo)培養(yǎng)基中起始再生，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基含有3μM咪草煙(DG)、MS鹽和維生素、30.0g/L蔗糖、5mg/LBAP、0.25mg/L2，4-滴、2.5g/L固化劑，pH5.7。在轉(zhuǎn)移到再生培養(yǎng)基36(3P)之前，先使細(xì)胞在低光照(13μEm-2s-1)下生長(zhǎng)一周，接著在較高光照(40μEm-2s-1)下再生長(zhǎng)一周，所述再生培養(yǎng)基除了缺乏植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑之外與28(3P)相同。移出3-5cm的小植株并置于含有非選擇SHGA培養(yǎng)基(Schenk和Hildebrandt基礎(chǔ)鹽和維生素，1972、1g/Lmyo-肌醇、10g/L蔗糖、2.0g/L固化劑，pH5.8)的150×25mm培養(yǎng)管中。一旦小植株發(fā)育出足夠的根和芽系統(tǒng)，將其移植到溫室的土壤中。在前述4種實(shí)驗(yàn)之后，在黑暗條件下，沒(méi)有經(jīng)歷傳統(tǒng)的愈傷組織期，在體外包埋的選擇平板上形成完整幼苗(包括芽和根)。來(lái)源于9個(gè)這些“早再生體”的葉組織對(duì)AAD-12基因和基因盒分別進(jìn)行編碼區(qū)PCR和植物轉(zhuǎn)錄單位(PTU)PCR。所有9個(gè)都具有完整的AAD-12編碼區(qū)，而3個(gè)沒(méi)有全長(zhǎng)的PTU(表15)。這些“早再生體”被鑒定為4101事件將他們與被鑒定為“1283”事件的傳統(tǒng)來(lái)源的事件區(qū)分開來(lái)。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的選擇和再生獲得的來(lái)自19個(gè)另外的事件的植物送到溫室，培養(yǎng)到成熟，與專有近交株株系異花授粉，用來(lái)產(chǎn)生T1種子。由于Southern印跡之后相似的帶型，一些事件似乎互為克隆，因此只有14個(gè)獨(dú)特事件具代表性。事件來(lái)源的T0植物對(duì)70g/ha咪草煙具有耐性。侵入物分析(AHAS基因)表明插入復(fù)雜度范圍為1至＞10個(gè)拷貝。13個(gè)事件含有完整的AAD-12編碼區(qū)；然而，進(jìn)一步分析表明完整的植物轉(zhuǎn)化單位沒(méi)被整合到9個(gè)事件中。受損的1863事件未能越過(guò)T1期，因而進(jìn)一步的表征利用4101事件進(jìn)行。8.5-分子分析：玉米材料和方法。8.5.1-收獲組織的DNA的分離和定量。將新鮮組織置于試管中并在4℃凍干兩天。組織完全干燥后，將鎢珠(Valenite)放進(jìn)管中并使用Kelco玻珠研磨機(jī)對(duì)樣品干磨1分鐘。其后遵循標(biāo)準(zhǔn)DNeasyDNA分離方案(Qiagen，DNeasy69109)。然后將提取的DNA的等分試樣用PicoGreen(MolecularProbesP7589)染色并與已知標(biāo)準(zhǔn)品一起在熒光計(jì)(BioTek)中讀數(shù)，以得到以ng/μl計(jì)的濃度。侵入物測(cè)定分析。將DNA樣品稀釋到20ng/ul，接著通過(guò)在熱循環(huán)儀中在95℃孵育10分鐘變性。接著使用提供的寡核苷酸混合物和MgCl2(ThirdWaveTechnologies)制備信號(hào)探針混合物。在侵入物測(cè)定板的每個(gè)孔中放入7.5μl的等分式樣，接著放入7.5μl對(duì)照、標(biāo)準(zhǔn)品和20ng/μl稀釋的未知樣品的等分式樣。用15μl礦物油(希格瑪，Sigma)覆蓋每個(gè)孔。接著將平板在63℃孵育1小時(shí)并在熒光計(jì)(Biotek公司)上讀數(shù)。用靶探針信號(hào)占背景的百分比除以內(nèi)參探針信號(hào)占背景的百分比計(jì)算出比值。由Southern印跡分析得到并確認(rèn)的已知拷貝數(shù)標(biāo)準(zhǔn)品的比值用于鑒定未知事件的估計(jì)拷貝數(shù)。8.5.3-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。用總計(jì)100ng總DNA作為模板。使用20mM每種引物和TakaraExTaqPCR聚合酶試劑盒(MirusTAKRR001A)。用于AAD-12(v1)PTU的引物為正向-GAACAGTTAGACATGGTCTAAAGG(SEQIDNO：8)和反向-GCTGCAACACTGATAAATGCCAACTGG(SEQIDNO：9)。在9700Geneamp熱循環(huán)儀(AppliedBiosystems)中進(jìn)行PCR反應(yīng)：將樣品置于94℃3分鐘，94℃30秒、63℃30秒、72℃1分45秒的35個(gè)循環(huán)和其后72℃的10分鐘。用于AAD-12(v1)編碼區(qū)PCR的引物為正向-ATGGCTCAGACCACTCTCCAAA(SEQIDNO：10)和反向-AGCTGCATCCATGCCAGGGA(SEQIDNO：11)。在9700Geneamp熱循環(huán)儀(AppliedBiosystems)中進(jìn)行PCR反應(yīng)：將樣品置于94℃3分鐘，94℃30秒、65℃30秒、72℃1分45秒的35個(gè)循環(huán)和其后72℃的10分鐘。通過(guò)用溴化乙啶染色的1％瓊脂糖凝膠上的電泳分析PCR產(chǎn)物。8.5.4-Southern印跡分析。用得自QiagenDNeasy試劑盒的基因組DNA進(jìn)行Southern印跡分析。用BSMI和SWAI限制性酶過(guò)夜消化總計(jì)2μg的葉子基因組DNA或10μg的愈傷組織基因組DNA以得到PTU數(shù)據(jù)。過(guò)夜消化后在1％凝膠上電泳約100ng的等分試樣以確認(rèn)完全消化。確認(rèn)后將樣品在大塊0.85％瓊脂糖凝膠上以40伏電泳過(guò)夜。接著在0.2MNaOH、0.6MNaCl中使凝膠變性30分鐘。然后將膠在pH7.5的0.5MTrisHCl、1.5MNaCl中中和30分鐘。接著裝配含有20×SSC的凝膠裝置以過(guò)夜實(shí)現(xiàn)凝膠到尼龍膜(MilliporeINYC00010)的重力轉(zhuǎn)移。過(guò)夜轉(zhuǎn)移之后，以1200×100微焦耳通過(guò)交聯(lián)儀(stratageneUVstratalinker1800)將膜置于UV光下。接著在0.1％SDS、0.1SSC中洗膜45分鐘。洗滌45分鐘后，將膜在80℃烘干3小時(shí)并保存于4℃直至雜交。使用上述用質(zhì)粒DNA通過(guò)編碼區(qū)PCR制備雜交模板片段。產(chǎn)物在1％瓊脂糖凝膠上電泳并切開，接著使用Qiagen(28706)凝膠提取方案提取凝膠。接著將膜在PerfectHyb緩沖液(SigmaH7033)中進(jìn)行60℃的預(yù)雜交步驟1小時(shí)。使用PrimeitRmTdCTP標(biāo)記反應(yīng)(Stratagene300392)方案開發(fā)基于p32的探針(PerkinElmer)。使用ProbeQuant.G50柱(Amersham27-5335-01)提純探針。用二百萬(wàn)計(jì)數(shù)的CPM與southern印跡雜交過(guò)夜。過(guò)夜雜交后將印跡置于65℃在0.1％SDS、0.1SSC中洗滌兩次，每次20分鐘。接著使印跡過(guò)夜曝光于膠片，在-80℃孵育。8.6-AAD-12轉(zhuǎn)化的T0玉米的出苗后除草劑耐性使適應(yīng)溫室的4個(gè)T0事件植物生長(zhǎng)至從輪生體長(zhǎng)出2-4片新的外觀正常的葉(即植物已由組織培養(yǎng)轉(zhuǎn)變到溫室生長(zhǎng)條件)。在溫室中在16小時(shí)光照：8小時(shí)黑暗的條件下在27℃培養(yǎng)植物。然后用商品制劑(咪草煙)或2，4-滴胺4處理植物。噴灑以證明受測(cè)事件內(nèi)存在選擇標(biāo)記物基因的功能。以187L/ha的噴灑體積、50cm的噴灑高度用履帶式噴霧機(jī)使用除草劑。用咪草煙致死劑量(70gae/ha)或能嚴(yán)重?fù)p傷未轉(zhuǎn)化玉米株系的2，4-滴二甲胺鹽鹽用量(2240gae/ha)噴灑植物。致死劑量定義為引起Hi-II近交株＞95％損傷的劑量。Hi-II是本發(fā)明轉(zhuǎn)化體的遺傳背景。一些個(gè)體由于相應(yīng)基因提供對(duì)除草劑的抗性，因此具有除草劑安全性。然而來(lái)源于事件“001”(a.k.a.，4101(0)-001-001)的單個(gè)克隆‘001’確實(shí)招致小損傷，但是經(jīng)14DAT復(fù)原。4個(gè)事件中的三個(gè)有進(jìn)展，且個(gè)體與5XH751雜交并帶到下一代。對(duì)于2，4-滴和咪草煙耐性植物，每種除草劑耐性植物對(duì)于分別存在AAD-12編碼區(qū)(PCR測(cè)定)或存在AHAS基因(侵入物測(cè)定)是陽(yáng)性的。在所有含有完整編碼區(qū)的2，4-滴耐性T0植物事件中檢測(cè)到AAD-12蛋白。轉(zhuǎn)基因(AHAS和推定的AAD-12)的拷貝數(shù)從1至15個(gè)拷貝顯著變化。個(gè)體T0植物生長(zhǎng)至成熟并與專有近交株株系異花授粉，以產(chǎn)生T1種子。8.7-T1玉米中高2，4-滴耐性的驗(yàn)證。T1AAD-12(v1)種子種植到含有MetroMix培養(yǎng)基的3英寸盆中，并在雙葉期用70gae/ha咪草煙噴霧以消除無(wú)效事件。存活的植物移植到含有MetroMix培養(yǎng)基的1加侖盆且置于如前相同的生長(zhǎng)條件下。在V3-V4期，用187L/ha履帶式噴霧機(jī)對(duì)植物噴灑560或2240gae/ha2，4-滴二甲胺鹽。植物在3和14DAT分級(jí)并與5XH751xHiII對(duì)照植物比較。建立0-10的分級(jí)范圍(無(wú)損傷至極度生長(zhǎng)素?fù)p傷)以區(qū)別支柱根損傷。在14DAT進(jìn)行支柱根分級(jí)來(lái)顯示2，4-滴耐性。2，4-滴引起支柱根畸形并且是有關(guān)玉米中生長(zhǎng)素除草劑損傷的穩(wěn)定指標(biāo)。支柱根數(shù)據(jù)(如下表中所見)證明3個(gè)測(cè)試事件中的2個(gè)對(duì)2240gae/ha2，4-滴二甲胺鹽強(qiáng)耐性。事件“pDAB4101(0)001.001”明顯不穩(wěn)定；然而，其它兩個(gè)事件對(duì)2，4-滴和2，4-滴+咪草煙或2，4-滴+草甘膦強(qiáng)耐性(參閱表16)。8.8-玉米中AAD-12(v1)遺傳性。對(duì)7個(gè)已與5XH751雜交的AAD-12(v1)T1家系也進(jìn)行子代測(cè)試。將種子種植到如上述的3英寸盆中。在3葉期，如前述用履帶式噴霧機(jī)對(duì)所有的植物噴灑70gae/ha咪草煙。14DAT之后，對(duì)抗性和敏感植物進(jìn)行計(jì)數(shù)。來(lái)自6個(gè)檢測(cè)株系的4個(gè)分離為卡方分析確定的單基因座顯性孟德性狀(1R：1S)。隨后用2，4-滴噴霧存活的植物且認(rèn)為所有的植物對(duì)2，4-滴(用量≥560gae/ha)耐性。當(dāng)互交為商業(yè)雜合體時(shí)，AAD-12在多物種中作為強(qiáng)芳氧基鏈烷酸酯生長(zhǎng)素抗性基因是可遺傳的。8.9-疊加AAD-12(v1)增加除草劑譜AAD-12(v1)(pDAB4101)和原種抗農(nóng)達(dá)(eliteRoundupReady)近交株(BE1146RR)互交并收集F1種子。種植來(lái)自兩個(gè)F1系的種子并在V2期用70gae/ha咪草煙處理以消除無(wú)效事件。對(duì)于存活的植物，分離重復(fù)事件(reps)并使用履帶式噴霧機(jī)(校準(zhǔn)為187L/ha)，用1120gae/ha2，4-滴二甲胺鹽+70gae/ha咪草煙(確定存在AHAS基因)或1120gae/ha2，4-滴二甲胺鹽+1680gae/ha草甘膦(確定存在抗農(nóng)達(dá)基因)進(jìn)行處理。植物在3和16DAT進(jìn)行分級(jí)。噴霧數(shù)據(jù)顯示AAD-12(v1)可常規(guī)疊加草甘膦耐性基因(如抗農(nóng)達(dá)CP4-EPSPS基因)或其它除草劑耐性基因，來(lái)提供可安全用于玉米的增加的除草劑譜。同樣地在F1植物中觀察到咪唑啉酮+2，4-滴+草甘膦耐性，說(shuō)明通過(guò)這些多重轉(zhuǎn)基因的分子或育種的疊加組合，沒(méi)有陰性表型。8.10-pDAB4101轉(zhuǎn)化的玉米植物對(duì)2，4-滴、綠草定和氟草煙除草劑的大田耐性。對(duì)2個(gè)AAD-12(v1)pDAB4101事件(4101(0)003.R.003.AF和4101(0)005.R001.AF)和1個(gè)抗農(nóng)達(dá)(RR)對(duì)照雜合體(2P782)在印地安那州的Fowler和密西西比州的Wayside進(jìn)行大田水平耐性試驗(yàn)。用錐形播種機(jī)在Wayside以40英寸行距種植種子，在Fowler以30英寸行距種植種子。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)是3次重復(fù)的隨機(jī)完全區(qū)組設(shè)計(jì)。除草劑處理包括以1120、2240和4480gae/ha使用的2，4-滴(二甲胺鹽)、以840gae/ha使用的綠草定、以280gae/ha使用的氟草煙和未處理的對(duì)照。AAD-12(v1)事件包含AHAS基因作為選擇標(biāo)記物。F2玉米事件分離，因此用70gae/ha咪草煙處理AAD-12(v1)植物以消除無(wú)效植物。當(dāng)玉米到達(dá)V6期，使用以130-200kpa壓力遞送187L/ha載體體積的壓縮空氣背包式噴霧機(jī)進(jìn)行除草劑處理。在處理后7、14和21天進(jìn)行目測(cè)損傷評(píng)估。在28DAT使用0-10的級(jí)別進(jìn)行支柱根損傷評(píng)估，其中0-1為輕度支柱根融合、1-3為中度支柱根膨大/蜿蜒(wandering)和根增殖、3-5為中度支柱根融合、5-9為重度支柱根融合和畸形以及10為完全抑制支柱根。表18顯示處理后14天AAD-12(v1)事件對(duì)2，4-滴、綠草定和氟草煙的應(yīng)答。在14DAT作物損傷最嚴(yán)重。RR對(duì)照玉米(2P782)被以4480gae/ha(8倍于正常大田使用量)使用的2，4-滴嚴(yán)重?fù)p傷(44％在14DAT)。所有AAD-12(v1)事件表明在14DAT對(duì)分別1、2和4倍于大田使用量的2，4-滴的優(yōu)秀耐性(0％損傷)。對(duì)照玉米(2P782)被2倍于正常用量的綠草定(840gae/ha)嚴(yán)重?fù)p傷(31％在14DAT)。AAD-12(v1)事件證明對(duì)2倍于正常使用量的綠草定具有耐性(在14DAT兩個(gè)事件平均3％損傷)。在14DAT以280gae/ha使用的氟草煙引起野生型玉米11％目測(cè)損傷。AAD-12(v1)事件表明在5DAT增加的耐性(平均8％損傷)。在V6生長(zhǎng)期對(duì)玉米使用生長(zhǎng)素除草劑能引起支柱根的畸形。表18顯示2，4-滴、綠草定和氟草煙引起的嚴(yán)重的支柱根損傷。在2P782對(duì)照型玉米中，以840gae/ha使用的綠草定引起最嚴(yán)重的支柱根融合和畸形，導(dǎo)致平均是7的支柱根損傷分值。兩個(gè)AAD-12(v1)玉米事件均未顯示綠草定處理造成的支柱根損傷。隨著2，4-滴用量的增加，2P782玉米中的支柱根損傷增強(qiáng)。AAD-12事件沒(méi)有顯示以4480gae/ha使用的2，4-滴造成的支柱根損傷；然而，在2P782雜合體中見到嚴(yán)重的支柱根融合和畸形。在野生型玉米中，氟草煙只引起中度支柱根膨大和蜿蜒而AAD-12(v1)事件沒(méi)有顯示支柱根損傷。此數(shù)據(jù)清楚表明AAD-12(v1)賦予玉米對(duì)2，4-滴、綠草定和氟草煙的高水平耐性，其中除草劑的用量遠(yuǎn)超商業(yè)用量，并引起非AAD-12(v1)玉米嚴(yán)重的目測(cè)和支柱根損傷。實(shí)施例9.通過(guò)抗體進(jìn)行轉(zhuǎn)化植物的蛋白質(zhì)檢測(cè)9.1-從植物的葉提取AAD-12(v1)。將約50到100mg的葉組織切成小塊(或4個(gè)單孔沖壓葉片)并放入含有兩個(gè)不銹鋼BB珠(4.5mm；DaisyCo.，目錄號(hào)145462-000)的2-ml蔟集管中。將500μL植物提取緩沖液(含有0.05％吐溫20和1％牛血清白蛋白的PBS)加入每個(gè)樣本中。試管蓋上蓋并緊固在Geno/Grinder(型號(hào)2000-115，Certiprep，Metuchen，NJ)中，設(shè)置以1×500rpm振蕩6分鐘。試管以5000×g離心10分鐘，使用Western印跡和ELISA對(duì)含有可溶性蛋白的上清液分析AAD-12(v1)。9.2-酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)。除非另外說(shuō)明，否則在室溫進(jìn)行測(cè)定。將100μL純化的抗AAD-12抗體(0.5μg/mL)包被96孔微孔板并在4℃孵育16小時(shí)。使用平板洗滌器用洗滌緩沖液(含有0.05％Tween20的100mM磷酸緩沖鹽水(PBS；pH7.4))洗滌平板四次，接著用溶解在PBS中的4％脫脂乳封閉1小時(shí)。洗滌后，在孔中孵育100μL已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)AAD-12或來(lái)自于不同樣本的植物提取物。對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)曲線，一式三份地對(duì)純化的AAD-12進(jìn)行2倍的系列稀釋，濃度范圍從52到0.813ng/mL。將植物提取物在PBS中稀釋5、10、20和40倍，一式二份進(jìn)行分析。孵育1小時(shí)后，如上文洗滌板。洗滌前在每個(gè)孔中孵育100μl抗AAD-12抗體-HRP綴合物(0.5μg/mL)1小時(shí)。在加入100μl0.4NH2SO4終止反應(yīng)之前，在每個(gè)孔中孵育100μlHRP底物1-StepTMUltraTMB-ELISA(Pierce公司，Rockford，IL)10分鐘。使用微孔板讀數(shù)器在450nm處測(cè)量每個(gè)孔的OD。為測(cè)定植物提取物中AAD-12(v1)的濃度，平均兩次重復(fù)的OD值，并使用Pro4.0版(MolecularDevices)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行外推。為了進(jìn)行比較，每個(gè)樣品用其鮮重標(biāo)準(zhǔn)化并計(jì)算表達(dá)百分比。9.3-Western印跡分析。將植物提取物或AAD-12標(biāo)準(zhǔn)品(5和0.5μg/mL)與Laemmli樣品緩沖液在95℃孵育10分鐘并在8-16％Tris-甘氨酸預(yù)制凝膠上電泳分離。接著使用標(biāo)準(zhǔn)方案將蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。用PBS中的4％脫脂乳封閉后，通過(guò)抗AAD-12抗血清和其后的山羊抗兔/HRP綴合物檢測(cè)AAD-12(v1)蛋白。通過(guò)化學(xué)發(fā)光底物ECLWestern分析試劑(Amersham公司，NJ)使檢測(cè)的蛋白質(zhì)顯像。實(shí)施例10-煙草轉(zhuǎn)化通過(guò)與已發(fā)表的方法(Horsch等，1988)類似但不完全相同的方法用根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化煙草。為提供用于轉(zhuǎn)化的來(lái)源組織，將煙草種子(Nicotianatabacum栽培種KY160)表面滅菌并種到TOB培養(yǎng)基的表面上，TOB培養(yǎng)基是用瓊脂固化的無(wú)激素Murashige和Skoog培養(yǎng)基(Murashige和Skoog，1962)。在有光照的培養(yǎng)室中在28-30℃培養(yǎng)植物6-8周，無(wú)菌收集葉用于轉(zhuǎn)化方案。從這些葉上無(wú)菌切下約1平方厘米不含中脈的塊。將在設(shè)置為250rpm振蕩器上，28℃瓶中培養(yǎng)過(guò)夜的農(nóng)桿菌菌株(含有pDAB3278，akapDAS1580，AAD-12(v1)+PAT的EHA101S)培養(yǎng)物離心沉淀并重懸于無(wú)菌Murashige&Skoog鹽中，調(diào)整至600nm處的終光密度為0.5。將葉塊在此細(xì)菌懸液中浸泡約30秒，接著在無(wú)菌紙巾上蘸干，右側(cè)朝上放在TOB+培養(yǎng)基(含有1mg/L吲哚乙酸和2.5mg/L芐基腺嘌呤的Murashige和Skoog培養(yǎng)基)上并在28℃在黑暗中孵育。兩天后將葉塊移至含有250mg/L頭孢噻肟(Agri-Bio，NorthMiami，F(xiàn)lorida)和5mg/L草銨膦(Basta的活性成分，拜耳作物科學(xué)集團(tuán)(BayerCropSciences))的TOB+培養(yǎng)基并在28-30℃光照條件下孵育。前兩周每周兩次將葉塊轉(zhuǎn)移到含有頭孢噻肟和Basta的新鮮TOB+培養(yǎng)基，其后每周一次。用細(xì)菌處理葉塊四到六周后，從此組織制備物中取出從轉(zhuǎn)化灶發(fā)出的小植物并種到PhytatrayTMII管(Sigma)中含有250mg/L頭孢噻肟和10mg/LBasta的培養(yǎng)基TOB中。在光照孵育室中培養(yǎng)這些小植株。3周后，進(jìn)行枝插并在相同的培養(yǎng)基中重新生根。再過(guò)2-3周后，植物即可移出至溫室。通過(guò)以下步驟將植物移至溫室中：從根上洗掉瓊脂，移植到13.75cm見方盆的土壤中，將盆放在袋子(SCJohnson&Son，Inc.)中，在袋子的底部放入自來(lái)水并在30℃溫室中間接光照下放置一周。3-7天后，打開袋子，給植物施肥并使其在打開的袋子中生長(zhǎng)直至植物適應(yīng)溫室，此時(shí)去掉袋子。在普通溫暖溫室條件(30℃，16小時(shí)白天、8小時(shí)黑夜、最小自然光+補(bǔ)充光＝500μE/m2s1)下培養(yǎng)植物。繁殖前，對(duì)T0植物取樣用于DNA分析以測(cè)定其插入物拷貝數(shù)。為方便起見，測(cè)定與AAD-12(v1)分子連接的PAT基因。將新鮮組織置于管中并在4℃凍干兩天。組織完全干燥后，將鎢珠(Valenite)放入管中并使用Kelco玻珠研磨機(jī)干磨樣品1分鐘。然后遵循標(biāo)準(zhǔn)DNeasyDNA分離方法(Qiagen，DNeasy69109)。接著用PicoGreen(MolecularProbesP7589)對(duì)提取的DNA的等分試樣進(jìn)行染色，并與已知標(biāo)準(zhǔn)品一起在熒光計(jì)(BioTek)中讀數(shù)，以得到以ng/μl計(jì)的濃度。將DNA樣品稀釋到9ng/μl，接著通過(guò)在熱循環(huán)儀中以95℃孵育10分鐘變性。然后使用提供的寡核苷酸混合物和MgCl2(ThirdWaveTechnologies)制備信號(hào)探針混合物。在侵入物測(cè)定板的每個(gè)孔中加入7.5μl的等分試樣，接著加入7.5μl對(duì)照、標(biāo)準(zhǔn)品和20ng/μl稀釋的未知樣品的等分試樣。用15μl礦物油(希格瑪，Sigma)覆蓋每個(gè)孔。然后將平板在63℃孵育1.5小時(shí)并在熒光計(jì)(Biotek)上讀數(shù)。計(jì)算的靶探針信號(hào)占背景的百分比除以內(nèi)參探針信號(hào)占背景的百分比得出比率。使用用southern印跡分析獲得和確認(rèn)的已知拷貝數(shù)標(biāo)準(zhǔn)品的比率來(lái)鑒定未知事件的估計(jì)拷貝數(shù)。還使用相同的提取的DNA樣品通過(guò)PCR測(cè)定所有事件中AAD-12(v1)基因的存在。使用總計(jì)100ng總DNA作為模板。使用20mM的每種引物和TakaraExTaqPCR聚合酶試劑盒。用于植物轉(zhuǎn)錄單位(PTU)PCRAAD-12的引物為(SdpacodF：ATGGCTCATGCTGCCCTCAGCC)(SEQIDNO：12)和(SdpacodR：CGGGCAGGCCTAACTCCACCAA)(SEQIDNO：13)。在9700Geneamp熱循環(huán)儀(AppliedBiosystems)中進(jìn)行PCR反應(yīng)，將樣品置于94℃3分鐘，接著是94℃30秒、64℃30秒和72℃1分45秒的35個(gè)循環(huán)，接著是72℃10分鐘。在溴化乙啶染色的1％瓊脂糖凝膠上通過(guò)電泳分析PCR產(chǎn)物。再生了來(lái)自具有1-3個(gè)PAT基因(推測(cè)具有AAD-12(v1)，因?yàn)檫@些基因是物理連鎖的)拷貝的18個(gè)PCR陽(yáng)性事件中每一個(gè)事件4到12個(gè)克隆譜系，并移至溫室。10.1AAD-12(v1)轉(zhuǎn)化的T0煙草中出苗后除草劑耐性通過(guò)對(duì)3-4英寸高的植物噴灑廣泛范圍的2，4-滴、綠草定或氟草煙來(lái)攻擊來(lái)自19個(gè)事件中每一事件的T0植物。如前述以187L/ha的噴灑體積使用履帶式噴霧機(jī)進(jìn)行噴灑應(yīng)用。以0、140、560或2240gae/ha(在去離子水中混合)的對(duì)每一事件的代表性克隆應(yīng)用2，4-滴二甲胺鹽(RiversideCorp)。同樣的35、140或560gae/ha應(yīng)用氟草煙。每個(gè)處理重復(fù)1-3次。在3和14DAT記錄損傷評(píng)定。測(cè)試的每個(gè)事件都比未轉(zhuǎn)化的對(duì)照株系KY160對(duì)2，4-滴更具有耐性。在幾個(gè)事件中，2，4-滴在560gae/ha或更低劑量下，出現(xiàn)一些最初的與生長(zhǎng)素除草劑相關(guān)的偏上發(fā)育。2，4-滴在2240gae/ha(等同于4×大田用量)應(yīng)用時(shí)，一些事件未受損傷。大體上，AAD-12(v1)事件對(duì)氟草煙更加敏感，其次是綠草定，受2，4-滴的影響最小。利用T0植物對(duì)560gae/ha氟草煙的應(yīng)答辨別關(guān)于抗性大小的事件質(zhì)量。將事件分為“低”(14DAT＞40％損傷)、“中”(20-40％損傷)、“高”(＜20％損傷)三類。一些事件的重復(fù)之間應(yīng)答不一致，視為“可變”。表20.用pDAS1580(AAD-12(v1)+PAT)轉(zhuǎn)化的煙草T0事件@當(dāng)用導(dǎo)致不同事件耐性可變的560gae/ha氟草煙處理時(shí)，除草劑耐性表現(xiàn)差異的事件需要評(píng)估相對(duì)耐性。10.2在T1煙草中高2，4-滴耐性的驗(yàn)證。在每個(gè)事件中保留在高用量2，4-滴和氟草煙下存活的2到4個(gè)T0個(gè)體，并使其在溫室中自花授粉產(chǎn)生T1種子。使T1種子層積，并以與擬南芥(實(shí)施例7.4)十分相似的方式播種到選擇盤中，隨后用560gai/ha草銨膦(PAT基因選擇)在此分離群體中選擇性去除未轉(zhuǎn)化無(wú)效事件。將存活株轉(zhuǎn)移到溫室中的單個(gè)3英寸盆中。這些株系在T0代中提供對(duì)2，4-滴高水平的抗性。預(yù)期在不直接來(lái)自組織培養(yǎng)的T1植物中具有提高的應(yīng)答一致性。將這些植物與野生型KY160煙草進(jìn)行比較。使用設(shè)置為187L/ha的履帶式噴霧機(jī)對(duì)所有植物噴灑。用140-2240gae/ha范圍的2，4-滴二甲胺鹽(DMA)、70-1120gae/ha范圍的綠草定或35-560gae/ha范圍的氟草煙噴灑植物。所有的應(yīng)用配制在水中。每個(gè)處理重復(fù)2-4次。在處理后3和14天評(píng)估植物。就發(fā)育障礙、缺綠癥和壞死確定植物損傷率。T1代是分離的，因此由于接合性的差異可以預(yù)計(jì)到一些不同的應(yīng)答。在4×大田用量(2240gae/ha)或之下的2，4-滴用量下未觀察到損傷。在一個(gè)事件株系中用綠草定處理觀察到一些損傷，但是用氟草煙處理觀察到最大的損傷。氟草煙損傷是短期的，且14DAT時(shí)一個(gè)事件的新生長(zhǎng)和未處理的對(duì)照幾乎沒(méi)有區(qū)別(表21)。值得注意的是，未轉(zhuǎn)化的煙草對(duì)氟草煙極度敏感。這些結(jié)果表明AAD-12(v1)可提供商業(yè)水平的2，4-滴耐性，甚至是在對(duì)生長(zhǎng)素非常敏感的雙子葉作物(如煙草)中。這些結(jié)果還顯示，可以賦予對(duì)吡啶氧乙酸類除草劑綠草定和氟草煙的抗性。能夠規(guī)定用具有不同雜草控制譜的多種活性成分處理受AAD-12保護(hù)的除草劑耐性作物，這對(duì)于種植者極其有用。10.3AAD-12(v1)在煙草中的遺傳性還對(duì)AAD-12(v1)株系中的7個(gè)T1株系進(jìn)行了100個(gè)植物子代測(cè)定。按以上方法使種子層積、播種并移植，只是不通過(guò)Liberty選擇去除無(wú)效植物。然后，如前述用560gae/ha2，4-滴二甲胺鹽噴灑所有的植物。14DAT后，對(duì)抗性和敏感植物計(jì)數(shù)。經(jīng)卡方分析測(cè)定，7個(gè)檢測(cè)株系中的5個(gè)均以單基因座顯性孟德爾性狀分離(3R：1S)。AAD-12可在多個(gè)物種中作為強(qiáng)芳氧基鏈烷酸酯生長(zhǎng)素抗性基因遺傳。10.4-pDAS1580煙草植物對(duì)2，4-滴、2，4-滴丙酸、綠草定和氟草煙除草劑的大田耐性。在印地安納州和密西西比州的大田中，對(duì)3個(gè)AAD-12(v1)株系(事件pDAS1580-[1]-018.001、pDAS1580-[1]-004.001和pDAS1580-[1]-020.016)和一個(gè)野生型株系(KY160))進(jìn)行大田水平耐性試驗(yàn)。按照上文所示的生長(zhǎng)條件，通過(guò)在包含Metro360培養(yǎng)基的72孔移植平臺(tái)(HummertInternational)上種植T1種子，讓煙草移植物在溫室中生長(zhǎng)。如前述通過(guò)Liberty選擇來(lái)選擇性去除無(wú)效植物。移植的植物運(yùn)送到大田中，使用工業(yè)蔬菜種植機(jī)以14或24英寸的間隔種植。密西西比州基地的滴灌和印地安納州基地的噴灌用于保持植物旺盛生長(zhǎng)。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)為四次重復(fù)的分割區(qū)設(shè)計(jì)。主區(qū)為除草劑處理，小區(qū)為煙草株系。除草劑處理包括以280、560、1120、2240和4480gae/ha使用的2，4-滴(二甲胺鹽)、以840gae/ha使用的綠草定、以280gae/ha使用的氟草煙和未處理對(duì)照。區(qū)為25-30ft的一行。移植后3-4周使用以130-200kpa壓力遞送187L/ha載體體積的壓縮空氣背包式噴霧機(jī)進(jìn)行除草劑處理。在處理后7、14和21天進(jìn)行損傷、生長(zhǎng)抑制和偏上發(fā)育的目測(cè)評(píng)估。表22顯示AAD-12(v1)事件對(duì)2，4-滴、綠草定和氟草煙的應(yīng)答。以560gae/ha(被認(rèn)為1X大田用量)使用的2，4-滴嚴(yán)重?fù)p傷非轉(zhuǎn)化煙草株系(63％在14DAT)。所有AAD-12(v1)株系表現(xiàn)在14DAT對(duì)2，4-滴的優(yōu)秀耐性，即分別在2、4和8X用量觀察到平均1、4和4％損傷。2X劑量的綠草定(840gae/ha)嚴(yán)重?fù)p傷非轉(zhuǎn)化煙草株系(53％在14DAT)；然而，AAD-12(v1)株系表現(xiàn)在14DAT3個(gè)株系平均5％損傷的耐性。以280gae/ha使用的氟草煙在14DAT引起非轉(zhuǎn)化株系嚴(yán)重的損傷(99％)。AAD-12(v1)株系表現(xiàn)在14DAT平均11％損傷的增強(qiáng)的耐性。這些結(jié)果說(shuō)明在典型的大田條件下，AAD-12(v1)轉(zhuǎn)化事件株系顯示對(duì)多倍于商業(yè)用量的2，4-滴、綠草定和氟草煙高水平的耐性，其中多倍于商業(yè)用量的除草劑對(duì)非轉(zhuǎn)化煙草是致死的或引起嚴(yán)重偏上畸形。10.5AAD-12(v1)保護(hù)作用對(duì)抗升高的2，4-滴用量表23顯示在溫室中AAD-12(v1)保護(hù)作用對(duì)抗升高的2，4-滴二甲胺鹽用量的結(jié)果。當(dāng)用如前述的相同方法以560gai/haLiberty選擇時(shí)，從3R：1S分離事件得到T1AAD-12(v1)植物。還種植T1AAD-1(v3)種子作為轉(zhuǎn)化的煙草對(duì)照(參閱PCT/US2005/014737)。未轉(zhuǎn)化的KY160作為敏感對(duì)照。使用設(shè)置為187L/ha的履帶式噴霧機(jī)對(duì)植物噴灑140、560、2240、8960和35840gae/ha的2，4-滴二甲胺鹽，并在3和14DAT評(píng)估。AAD-12(v1)和AAD-1(v3)均有效保護(hù)煙草對(duì)抗劑量升至4X商業(yè)用量的2，4-滴損傷。然而，當(dāng)升至64X標(biāo)準(zhǔn)大田劑量時(shí)，AAD-12(v1)明顯表現(xiàn)出比AAD-1(v3)顯著的保護(hù)優(yōu)勢(shì)。10.6疊加AAD-12增加除草劑譜純合的AAD-12(v1)(pDAS1580)和AAD-1(v3)(pDAB721)植物(后者參閱PCT/US2005/014737)均互交并收集F1種子。將來(lái)自于每個(gè)基因兩次互交的F1種子層積和處理。每次雜交重復(fù)4次以與用于其它測(cè)試相同的噴霧方法處理，即使用以下處理之一：70、140、280gae/ha氟草煙(選擇AAD-12(v1)基因)；280、560、1120gae/haR-2，4-滴丙酸(選擇AAD-1(v3)基因)；或560、1120、2240gae/ha2，4-滴二甲胺鹽(證實(shí)2，4-滴耐性)。每個(gè)基因的純合T2植物還可用作對(duì)照種植。在3和14DAT對(duì)植物進(jìn)行分級(jí)。表24顯示噴灑結(jié)果。結(jié)果證實(shí)AAD-12(v1)能成功疊加AAD-1(v3)，因此增加可以應(yīng)用到目的作物的除草劑譜(分別用于AAD-1和AAD-12的苯氧乙酸類+苯氧丙酸與苯氧乙酸類+吡啶氧乙酸類)。除草劑交叉抗性模式的互補(bǔ)性質(zhì)允許方便地使用這兩個(gè)基因作為互補(bǔ)和疊加的大田選擇標(biāo)記物。在單基因耐性也許不重要的作物中，本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)識(shí)到一個(gè)基因通過(guò)疊加第二耐性基因能增加對(duì)相同除草劑的耐性。使用具有相同或不同啟動(dòng)子的同一基因能完成這些任務(wù)；然而，正如本文觀察到的，通過(guò)區(qū)別對(duì)苯氧丙酸類[AAD-1(v3)]或吡啶氧乙酸類[AAD-12(v1)]的交叉保護(hù)作用能促進(jìn)疊加和追蹤兩種互補(bǔ)性狀。實(shí)施例11-大豆轉(zhuǎn)化已通過(guò)基因轉(zhuǎn)移技術(shù)完成了對(duì)大豆以下性狀的改良：如除草劑耐性(Padgette等，1995)、氨基酸修飾(Falco等，1995)和昆蟲抗性(Parrott等，1994)。將外源性狀引入作物物種需要允許使用含有簡(jiǎn)單插入物的選擇標(biāo)記序列常規(guī)產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因株系的方法。轉(zhuǎn)基因應(yīng)以單個(gè)功能基因座遺傳以簡(jiǎn)化育種。已經(jīng)報(bào)道了通過(guò)合子胚軸(McCabe等，1988)或體細(xì)胞胚發(fā)生培養(yǎng)物(Finer和McMullen，1991)的微粒轟擊和農(nóng)桿菌介導(dǎo)的子葉外植體(Hinchee等，1988)或合子胚(Chee等，1989)的轉(zhuǎn)化將外源基因遞送到栽培大豆。來(lái)自農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化體往往具有低拷貝數(shù)的簡(jiǎn)單插入物(Birch，1991)。研究用于將基因轉(zhuǎn)移進(jìn)大豆的三種靶組織(合子胚軸(Chee等，1989；McCabe等，1988)、子葉(Hinchee等，1988)和體細(xì)胞胚發(fā)生培養(yǎng)物(Finer和McMullen，1991))都有各自的優(yōu)缺點(diǎn)。后者已經(jīng)被廣泛研究作為直接基因轉(zhuǎn)移的靶組織。胚發(fā)生培養(yǎng)物往往相當(dāng)高效，并可長(zhǎng)期維持。然而，原代轉(zhuǎn)化體的不育和染色體畸變與胚發(fā)生懸液的胚齡相關(guān)(Singh等，1998)，因此持續(xù)起始新的培養(yǎng)物對(duì)使用這種組織的大豆轉(zhuǎn)化系統(tǒng)似乎是必要的。這種系統(tǒng)需要高水平的2，4-滴(40mg/L濃度)來(lái)起始胚性愈傷組織，由于培養(yǎng)基中含有2，4-滴時(shí)轉(zhuǎn)化的基因座不能進(jìn)一步發(fā)育，因此這使AAD-12(v1)基因的使用產(chǎn)生了根本的問(wèn)題。因此，基于分生組織的轉(zhuǎn)化可理想地用于開發(fā)使用AAD-12(v1)的2，4-滴抗性植物。11.1二元構(gòu)建體的Gateway克隆將AAD-12(v1)編碼序列克隆到5個(gè)含有不同植物啟動(dòng)子的不同Gateway供體載體中。隨后通過(guò)LR克隆酶反應(yīng)(InvitrogenCorporation，CarlsbadCa，目錄號(hào)11791-019)將得到的AAD-12(v1)植物表達(dá)盒克隆到Gateway指定二元載體中。包含AAD-12(v1)編碼序列的NcoI-SacI片段從DASPICO12水解下來(lái)，連入相應(yīng)的以下Gateway供體載體的NcoI-SacI限制性位點(diǎn)中：pDAB3912(attL1//CsVMV啟動(dòng)子//AtuORF233’UTR//attL2)、pDAB3916(attL1//AtUbi10啟動(dòng)子//AtuORF233’UTR//attL2)、pDAB4458(attL1//AtUbi3啟動(dòng)子//AtuORF233’UTR//attL2)、pDAB4459(attL1//ZmUbi1啟動(dòng)子//AtuORF233’UTR//attL2)和pDAB4460(attL1//AtAct2啟動(dòng)子//AtuORF233’UTR//attL2)。命名含有以下植物表達(dá)盒的得到的構(gòu)建體：pDAB4463(attL1//CsVMV啟動(dòng)子//AAD-12(v1)//AtuORF233’UTR//attL2)、pDAB4467(attL1//AtUbi10啟動(dòng)子//AAD-12(v1)//AtuORF233’UTR//attL2)、pDAB4471(attL1//AtUbi3啟動(dòng)子//AAD-12(v1)//AtuORF233’UTR//attL2)、pDAB4475(attL1//ZmUbi1啟動(dòng)子//AAD-12(v1)//AtuORF233’UTR//attL2)和pDAB4479(attL1//AtAct2啟動(dòng)子//AAD-12(v1)//AtuORF233’UTR//attL2)。經(jīng)限制性酶水解和測(cè)序證實(shí)這些構(gòu)建體。植物表達(dá)盒通過(guò)GatewayLR克隆酶反應(yīng)重組到Gateway指定二元載體pDAB4484(RB7MARv3//attR1-ccdB-氯霉素抗性-attR2//CsVMV啟動(dòng)子//PATv6//AtuORF13’UTR)中。Gateway技術(shù)使用基于λ噬菌體的位點(diǎn)特異性重組代替限制性內(nèi)切核酸酶和連接酶將目的基因插入表達(dá)載體中。Invitrogen公司，Gateway技術(shù)：AUniversalTechnologytoCloneDNASequencesforFunctionalAnalysisandExpressioninnultipleSystems，技術(shù)手冊(cè)，目錄號(hào)是12535-019和12535-027，Gateway技術(shù)版本E，9/22/2003，#25-022。DNA重組序列(attL和attR)以及LR克隆酶混合物允許兩側(cè)為重組位點(diǎn)的任一DNA片段轉(zhuǎn)移到含有相應(yīng)位點(diǎn)的任一載體中。供體載體的attL1位點(diǎn)與二元載體的attR1相對(duì)應(yīng)。同樣地，供體載體的attL2位點(diǎn)與二元載體的attR2相對(duì)應(yīng)。使用Gateway技術(shù)，兩側(cè)為attL位點(diǎn)的植物表達(dá)盒(來(lái)自于供體載體)能重組到二元載體的attR位點(diǎn)。含有以下植物表達(dá)盒的得到的構(gòu)建體標(biāo)記為：pDAB4464(RB7MARv3//CsVMV啟動(dòng)子//AAD-12(v1)//AtuORF233’UTR//CsVMV啟動(dòng)子//PATv6//AtuORF13’UTR)、pDAB4468(RB7MARv3//AtUbi10啟動(dòng)子//AAD-12(v1)//AtuORF233’UTR//CsVMV啟動(dòng)子//PATv6//AtuORF13’UTR)、pDAB4472(RB7MARv3//AtUbi3啟動(dòng)子//AAD-12(v1)//AtuORF233’UTR//CsVMV啟動(dòng)子//PATv6//AtuORF13’UTR)、pDAB4476(RB7MARy3//ZmUbi1啟動(dòng)子//AAD-12(v1)//AtuORF233’UTR//CsVMV啟動(dòng)子//PATv6//AtuORF13’UTR)和pDAB4480(RB7MARv3//AtAct2啟動(dòng)子//AAD-12(v1)//AtuORF233’UTR//CsVMV啟動(dòng)子//PATv6//AtuORF13’UTR)(參閱表8)。經(jīng)限制性酶水解和測(cè)序證實(shí)這些構(gòu)建體。11.2轉(zhuǎn)化方法1：根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的大豆子葉節(jié)轉(zhuǎn)化。最先報(bào)道的大豆轉(zhuǎn)化靶向子葉節(jié)區(qū)中的分生組織細(xì)胞(Hinchee等，1988)和來(lái)自頂端分生組織的芽增殖物(McCabe等，1988)。在基于根癌農(nóng)桿菌的子葉節(jié)方法中，外植體制備物和培養(yǎng)基組合物刺激節(jié)中輔助分生組織的增殖(Hinchee等，1988)。仍不清楚這些處理是否起始了真正去分化而全能的愈傷組織培養(yǎng)物。從單個(gè)外植體回收多個(gè)轉(zhuǎn)化事件克隆和少見的嵌合體植物回收(Clemente等，2000；Olhoft等，2003)表明單細(xì)胞來(lái)源和其后的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞增殖產(chǎn)生增殖的轉(zhuǎn)基因分生組織培養(yǎng)物或單一轉(zhuǎn)化的芽(再經(jīng)歷芽增殖)。由于此系統(tǒng)是基于種系嵌合體的成功鑒定，大豆芽增殖方法(最初基于微粒轟擊(McCabe等，1988)，最近改造用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化(Martinell等，2002))顯然不經(jīng)歷與子葉節(jié)方法相同的去分化水平或類型。通過(guò)基于農(nóng)桿菌的子葉節(jié)方法轉(zhuǎn)化的基因型范圍正穩(wěn)步擴(kuò)大(Olhoft和Somers，2001)。這種從頭開始的分生組織和芽增殖方法較少受到具體基因型的限制。這還是不基于2，4-滴的方案，可理想地用于2，4-滴選擇系統(tǒng)。因此，子葉節(jié)方法可能是開發(fā)2，4-滴抗性大豆栽培種應(yīng)選擇的方法。盡管此方法早在1988年(Hinchee等，1988)即有所描述，但直到最近才將其優(yōu)化用于若干大豆基因型的常規(guī)高頻轉(zhuǎn)化(Zhang等，1999；Zeng等，2004)。11.2.1-AAD-12(v1)耐性表型的植物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物。種子來(lái)源的“Maverick”外植體和農(nóng)桿菌介導(dǎo)鞘節(jié)(cot-node)轉(zhuǎn)化的方法用于產(chǎn)生AAD-12(v1)轉(zhuǎn)基因植物。11.2.2-農(nóng)桿菌的制備和接種攜帶5個(gè)二元pDAB載體(表8)中每一個(gè)的農(nóng)桿菌菌株EHA101(Hood等，1986)用于起始轉(zhuǎn)化。每個(gè)二元載體包含位于T-DNA區(qū)內(nèi)的AAD-12(v1)基因和植物選擇基因(PAT)盒。表8所列的啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)每個(gè)基因并且這些質(zhì)粒通過(guò)電穿孔移入農(nóng)桿菌EHA101菌株中。然后在農(nóng)桿菌處理大豆外植體之前對(duì)選擇的菌落進(jìn)行基因整合分析。Maverick種子用于所有的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)并且從密蘇里大學(xué)，Columbia，MO獲得種子。遵循Zeng等(2004)改良的程序，使用PAT基因作為選擇標(biāo)記偶聯(lián)作為選擇試劑的除草劑草銨膦進(jìn)行農(nóng)桿菌介導(dǎo)的大豆(Glycinemax)轉(zhuǎn)化。種子在用3g/L植物凝膠(Sigma-Aldrich，St.Louis，Mo.)固化的B5基礎(chǔ)培養(yǎng)基(Gamborg等1968)上萌發(fā)；在共培培養(yǎng)基中加入400mg/L1-半胱氨酸并共培養(yǎng)持續(xù)5天(Olhoft和Somers2001)；出芽起始、芽伸長(zhǎng)和生根培養(yǎng)基補(bǔ)充50mg/L頭孢噻肟、50mg/L特美汀、50mg/L萬(wàn)古霉素并用3g/L植物凝膠固化。然后將選擇的芽轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基。最佳選擇方案是貫穿第一和第二出芽起始期在培養(yǎng)基中使用8mg/L草銨膦以及在芽伸長(zhǎng)期在培養(yǎng)基中使用3-4mg/L草銨膦。將伸長(zhǎng)芽(3-5cm)轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基之前，切除的節(jié)間末端浸泡在1mg/L吲哚3-丁酸中1-3分鐘促進(jìn)生根(Khan等1994)。芽在含有生根培養(yǎng)基的25×100mm玻璃培養(yǎng)管中扎根，然后轉(zhuǎn)移到Conviron打開的Magenta盒中用于幼苗適應(yīng)的土壤混合物的Metro-mix200(HummertInternational，EarthCity，Mo.)中。Liberty除草劑(拜耳作物科學(xué)(BayerCropScience))中的活性成分草銨膦用于在出芽起始和伸長(zhǎng)期進(jìn)行選擇。生根的幼苗在篩選和轉(zhuǎn)移到溫室進(jìn)行進(jìn)一步適應(yīng)和建立之前先在打開的Magenta盒中適應(yīng)幾周。11.2.3-測(cè)定推斷的轉(zhuǎn)化幼苗并分析在溫室中建立的T0植物。這些幼苗選擇出的葉子的末端小葉是在1周間隔用50mg/L草銨膦涂抹2次的葉子，來(lái)觀察篩選推定轉(zhuǎn)化體的結(jié)果。然后將篩選的幼苗轉(zhuǎn)移到溫室，并在適應(yīng)之后，再次在葉子上涂抹草銨膦以證實(shí)GH中這些幼苗的耐性狀態(tài)并認(rèn)為是推定的轉(zhuǎn)化體。轉(zhuǎn)移到溫室中的植物通過(guò)用草銨膦溶液[0.05-2％v/vLiberty除草劑，優(yōu)選地0.25-1.0％(v/v)，＝500-2000ppm草銨膦，拜耳作物科學(xué)(BayerCropScience)]涂抹T0原代轉(zhuǎn)化體或其子代的葉子部分這種無(wú)害方法，進(jìn)一步測(cè)定活性PAT基因的存在。取決于使用濃度，在處理后1-7天可進(jìn)行草銨膦損傷評(píng)估。通過(guò)對(duì)新擴(kuò)張的具三小葉的一個(gè)或兩個(gè)(優(yōu)選兩個(gè))節(jié)點(diǎn)(位于最嫩的新形成的具三小葉下面)的末端小葉選擇應(yīng)用2，4-滴水溶液(0.25-1％v/v商業(yè)2，4-滴二甲胺鹽成分，優(yōu)選0.5％v/v＝2280ppm2，4-滴ae)這種無(wú)害方式，植物還可用于檢測(cè)2，4-滴耐性。這種測(cè)定通過(guò)評(píng)估從相鄰小葉的平面翻轉(zhuǎn)或旋轉(zhuǎn)＞90度的葉子，允許在應(yīng)用后6小時(shí)至幾天評(píng)估2，4-滴敏感性植物。對(duì)2，4-滴耐性的植物將不對(duì)2，4-滴應(yīng)答。允許T0植物在溫室中自花授粉以產(chǎn)生T1種子。用一定劑量范圍的除草劑噴射T1植物(就產(chǎn)生足夠T0植物克隆而言)來(lái)確定轉(zhuǎn)基因大豆中，由AAD-12(v1)和PAT基因提供的除草劑保護(hù)水平。T0植物的2，4-滴用量一般包含100-1120gae/ha范圍內(nèi)的一種或兩種選擇用量，使用如前述的履帶式噴霧機(jī)。用更廣的除草劑劑量范圍(50-3200gae/ha2，4-滴)處理T1植物。同樣地，通過(guò)出苗后分別用200-800和50-3200gae/ha草銨膦處理，可篩選草銨膦抗性的T0和T1植物。通過(guò)出苗后應(yīng)用劑量范圍為280-2240gae/ha的草甘膦，可評(píng)估T1代中草甘膦抗性(在用含有EPSPS的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的植物中)或其它草甘膦耐性基因。蛋白質(zhì)表達(dá)分析按下述進(jìn)行。個(gè)體T0植物用于評(píng)估目的基因(AAD-12(v1)或PATv6)編碼區(qū)的存在和拷貝數(shù)。如前面實(shí)施例所述，使用T1和T2子代就除草劑耐性的分離進(jìn)行AAD-12(v1)遺傳性的確定。根據(jù)上文方法在T0代評(píng)估最初轉(zhuǎn)化體子集。被證實(shí)為具有AAD-12(v1)編碼區(qū)的任一植物(不論驅(qū)動(dòng)基因的啟動(dòng)子如何)不對(duì)涂抹葉子的2，4-滴應(yīng)答，而野生型Maverick大豆應(yīng)答(11.2.3部分的表)。只轉(zhuǎn)化PAT的植物和野生型植物一樣對(duì)涂抹葉子使用的2，4-滴應(yīng)答。應(yīng)用2，4-滴的植物子集，與使用560或1120gae2，4-滴的野生型對(duì)照植物大小相似。與野生型Maverick大豆相比，所有含有AAD-12(v1)的植物明顯對(duì)使用除草劑具有抗性。2個(gè)AAD-12(v1)植物觀察到輕度水平的損傷(2DAT)，但損傷是暫時(shí)的且7DAT沒(méi)有觀察到損傷。7-14DAT以560gae/ha使用的2，4-滴嚴(yán)重?fù)p傷野生型對(duì)照植物并且在1120gae/ha對(duì)其致死。這些數(shù)據(jù)與AAD-12(v1)能賦予敏感作物(如大豆)高耐性(＞2X大田用量)的事實(shí)一致。然后對(duì)篩選的植物取樣進(jìn)行分子和生物化學(xué)分析，用來(lái)證實(shí)如下文所述和表25所報(bào)道的AAD12(v1)基因整合、拷貝數(shù)和它們的基因表達(dá)水平。11.2.4-分子分析：大豆11.2.4.1-收集的組織的DNA分離和定量。將新鮮的組織放置在試管中并在4℃凍干2天。組織完全干燥之后，將鎢珠(Valenite)放置在試管中并使用Kelco砂磨機(jī)對(duì)樣本進(jìn)行1分鐘的干燥研磨。然后進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)的DNeasyDNA分離程序(Qiagen，DNeasy69109)。然后用PicoGreen(分子探針P7589)對(duì)提取的DNA等分試樣染色，并在具有已知標(biāo)準(zhǔn)的熒光計(jì)(BioTek)中讀數(shù)以獲得濃度(ng/μL)。11.2.4.2-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)?？偭繛?00ng的總DNA用作模板。用TakaraExTaqPCR聚合酶試劑盒(MirusTAKRR001A)使用20mM的每種引物。用于AAD-12(v1)PTU的引物是(正向-ATAATGCCAGCCTGTTAAACGCC)(SEQIDNO：8)和(反向-CTCAAGCATATGAATGACCTCGA)(SEQIDNO：9)。在9700Geneamp熱循環(huán)儀(AppliedBiosystems)中進(jìn)行PCR反應(yīng)，將樣品置于94℃3分鐘，接著是94℃30秒、63℃30秒和72℃1分45秒的35個(gè)循環(huán)，然后是72℃10分鐘。用于AAD-12(v1)編碼區(qū)PCR的引物是(正向-ATGGCTCATGCTGCCCTCAGCC)(SEQIDNO：10)和(反向-CGGGCAGGCCTAACTCCACCAA)(SEQIDNO：11)。在9700Geneamp熱循環(huán)儀(AppliedBiosystems)中進(jìn)行PCR反應(yīng)，將樣品置于94℃3分鐘，接著是94℃30秒、65℃30秒和72℃1分45秒的35個(gè)循環(huán)，然后是72℃10分鐘。通過(guò)在1％用EtBr染色的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳分析PCR產(chǎn)物。11.2.4.3-Southern印跡分析。從QiagenDNeasy試劑盒獲得的總DNA進(jìn)行Southern印跡分析。將總量為10μg的基因組DNA過(guò)夜消化以得到整合數(shù)據(jù)。過(guò)夜消化之后～100ng的測(cè)試樣品在1％的凝膠上跑電泳以確保完全消化。確信之后樣品在大的0.85％的瓊脂糖凝膠上40伏特過(guò)夜跑電泳。然后凝膠在0.2MNaOH、0.6MNaCl中變性30分鐘。然后凝膠在0.5MTrisHCl、1.5MNaClpH7.5中中和30分鐘。然后設(shè)置含有20xSSC的凝膠裝置以實(shí)現(xiàn)凝膠向尼龍膜(MilliporeINYC00010)過(guò)夜重力轉(zhuǎn)移。過(guò)夜轉(zhuǎn)移之后通過(guò)交聯(lián)儀(StratageneUVstratalinker1800)再將膜在1200X100微焦耳照射UV光。然后膜在0.1％SDS、0.1SSC中洗滌45分鐘。45分鐘洗滌之后，膜在80℃烘烤3個(gè)小時(shí)，然后4℃儲(chǔ)存直至雜交。通過(guò)上文編碼區(qū)PCR使用質(zhì)粒DNA制備雜交模板片斷。產(chǎn)物在1％瓊脂糖凝膠上跑電泳，然后切割，再使用Qiagen(28706)凝膠提取方法提取凝膠。然后膜在PerfectHyb緩沖液(SigmaH7033)中60℃預(yù)雜交1個(gè)小時(shí)。PrimeitRmTdCTP-labelingrxn(Stratagene300392)程序用于開發(fā)基于p32的探針(PerkinElmer)。使用ProbeQuant.G50柱(Amersham27-5335-01)提純探針。2百萬(wàn)計(jì)數(shù)的CPM用于southern印跡過(guò)夜雜交。過(guò)夜雜交之后，再將印記在0.1％SDS、0.1SSC中65℃進(jìn)行2次20分鐘洗滌。然后將印記進(jìn)行過(guò)夜膠片曝光，-80℃孵育。11.2.5-生物化學(xué)分析：大豆11.2.5.1-組織取樣以及從大豆葉子中提取AAD-12(v1)蛋白。從涂抹2，4-滴、但是1DAT之后的N-2葉子取大約50至100mg的葉組織樣本。去除末端N-2小葉并且切成小塊或者2個(gè)單孔沖壓葉片(直徑～0.5cm)，立即在干冰上冷凍。根據(jù)實(shí)施例9所述方法完成進(jìn)一步的蛋白質(zhì)分析(ELISA和Western分析)。11.2.6-T1子代評(píng)估。允許T0植物自花授粉以得到T1家系。使用在V1-V2生長(zhǎng)階段應(yīng)用的560gai/ha的草銨膦作為選擇劑測(cè)定子代檢驗(yàn)(分離分析)。存活的植物將進(jìn)一步測(cè)定V2-V6中的一個(gè)或更多生長(zhǎng)階段的2，4-滴耐性。通過(guò)自花授粉產(chǎn)生的種子允許在轉(zhuǎn)基因的大豆中進(jìn)行更廣泛的除草劑檢驗(yàn)。通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的鞘節(jié)轉(zhuǎn)化系統(tǒng)已產(chǎn)生AAD-12(v1)轉(zhuǎn)基因Maverick大豆植物。T0植物獲得高達(dá)2倍于大田應(yīng)用水平的2，4-滴耐性并發(fā)育成可育種子。可育的轉(zhuǎn)基因大豆植物的頻率升至5.9％。經(jīng)Southern印跡分析證實(shí)AAD1-12(v1)基因整合到大豆基因組中。此分析表明大多數(shù)轉(zhuǎn)基因植物含有低拷貝數(shù)。用AAD-12(v1)抗體篩選的植物表現(xiàn)出ELISA陽(yáng)性和Western分析中正確的帶。11.3轉(zhuǎn)化方法2：氣溶膠束介導(dǎo)的胚胎發(fā)生大豆愈傷組織的轉(zhuǎn)化。如美國(guó)專利No.6,809,232(Held等)所述，使用表8中一個(gè)或多個(gè)構(gòu)建體，完成胚胎發(fā)生大豆愈傷組織的培養(yǎng)和其后的傳代(beaming)，以創(chuàng)建轉(zhuǎn)化體。11.4轉(zhuǎn)化方法3.基因槍轟擊大豆使用成熟種子來(lái)源的胚軸分生組織能完成此方法(McCabe等(1988))。隨后建立的基因槍轟擊方法能讓人期待轉(zhuǎn)化的大豆植物的回收。一旦植物再生，事件的評(píng)估可如實(shí)施例11.2所述進(jìn)行。11.5轉(zhuǎn)化方法4.晶須介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化。根據(jù)先前Terakawa等(2005)描述的方法能預(yù)期晶須制備和晶須轉(zhuǎn)化。隨后建立的基因槍轟擊方法能讓人期待轉(zhuǎn)化的大豆植物的回收。一旦植物再生，事件的評(píng)估可如實(shí)施例11.2所述進(jìn)行。Maverick種子在70％乙醇中1分鐘進(jìn)行表面消毒，隨后浸沒(méi)于1％次氯酸鈉中20分鐘，然后用無(wú)菌的蒸餾水沖洗3次。種子在蒸餾水中浸泡18-20個(gè)小時(shí)。從種子中切除胚軸，通過(guò)去除初級(jí)葉子暴露頂端分生組織。胚軸放置在轟擊培養(yǎng)基中[BM：MS(Murashige和Skoog1962)基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基，3％蔗糖和0.8％植物凝膠Sigma，pH5.7]中，在含有12ml培養(yǎng)基的5-cm培養(yǎng)皿中心，尖區(qū)指向上方。11.6轉(zhuǎn)化方法5。根據(jù)以前的方法(Khalafalla等2005；El-Shemy等2004，2006)可優(yōu)化顆粒轟擊介導(dǎo)的胚性愈傷組織的轉(zhuǎn)化。根據(jù)實(shí)施例11.2也能評(píng)估再生植物。實(shí)施例12-棉花中的AAD-12(v1)12.1-棉花轉(zhuǎn)化方案。使棉花種子(Co310基因型)在95％乙醇中表面滅菌1分鐘、洗滌、用50％商品漂白劑滅菌20分鐘、然后用無(wú)菌蒸餾水漂洗三次，其后使其在MagentaGA-7容器中的G培養(yǎng)基(表26)上萌發(fā)并在40-60μE/m2的高光強(qiáng)下維持，光周期設(shè)置為28℃16小時(shí)光照和8小時(shí)黑暗。從7-10天齡的苗分離子葉節(jié)段(約5mm見方)到皮氏培養(yǎng)皿(Nunc，款號(hào)0875728)中的液體M液體培養(yǎng)基(表26)。用農(nóng)桿菌溶液處理切下的節(jié)段(約30分鐘)，其后轉(zhuǎn)移到半固體M培養(yǎng)基(表26)共培養(yǎng)2-3天。共培養(yǎng)之后將節(jié)段轉(zhuǎn)移至MG培養(yǎng)基(表26)。用羧芐青霉素作為殺死農(nóng)桿菌的抗生素，用草銨膦作為僅允許含有轉(zhuǎn)移基因的細(xì)胞生長(zhǎng)的選擇劑。農(nóng)桿菌的制備。接種35mlY培養(yǎng)基(表26)(含有鏈霉素(100mg/ml貯液)和紅霉素(100mg/ml貯液))和1菌環(huán)細(xì)菌在28℃在黑暗中生長(zhǎng)過(guò)夜，同時(shí)在150rpm振蕩。第二天將農(nóng)桿菌溶液倒入無(wú)菌oakridge管(Nalge-Nunc，3139-0050)中并在BeckmanJ2-21中以8,000rpm離心5分鐘。倒掉上清液并將沉淀重懸于25mlM液體(表26)中并渦旋。將等分試樣放入玻璃培養(yǎng)管(Fisher，14-961-27)用于Klett讀數(shù)(Klett-Summerson，model800-3)。以總體積40ml用M液體培養(yǎng)基將新懸液稀釋到Klett計(jì)讀數(shù)為每ml108個(gè)菌落形成單位。三周后，分離來(lái)自子葉節(jié)段的愈傷組織并轉(zhuǎn)移至新鮮MG培養(yǎng)基。愈傷組織轉(zhuǎn)移到MG培養(yǎng)基上再過(guò)3周。在并行比較中，既然2，4-滴丙酸不是AAD-12酶的底物，而在棉花中2，4-滴丙酸比2，4-滴更有作用，因此用2，4-滴丙酸(以0.01和0.05mg/L濃度加入培養(yǎng)基)補(bǔ)充MG培養(yǎng)基以補(bǔ)償2，4-滴的降解。在獨(dú)立的比較中，與標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基相比，放置在不含有生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的MG培養(yǎng)基上的節(jié)段顯示減少的愈傷組織但仍有愈傷組織生長(zhǎng)。然后將愈傷組織轉(zhuǎn)移至CG培養(yǎng)基(表26)，并在三周后再轉(zhuǎn)移至新鮮的選擇培養(yǎng)基。再經(jīng)過(guò)三周后，將愈傷組織轉(zhuǎn)移至缺少植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的D培養(yǎng)基(表26)用于胚性愈傷組織誘導(dǎo)。在此培養(yǎng)基上經(jīng)過(guò)4-8周后形成了胚性愈傷組織，可通過(guò)其淡黃白色的顏色和顆粒細(xì)胞區(qū)別于非胚性愈傷組織。胚在其后很快開始再生，顏色為明顯的綠色。棉花需要時(shí)間再生和形成胚，加速這種過(guò)程的方法之一是脅迫組織。干燥是完成此過(guò)程的常見方法，通過(guò)使用較少的培養(yǎng)基和/或采用多種平皿密封方式(膠帶和parafilm封口膜)改變組織和平皿的微環(huán)境。分離較大的發(fā)育良好的胚轉(zhuǎn)移到DK培養(yǎng)基(表26)用于胚發(fā)育。3周后(或當(dāng)胚已發(fā)育時(shí))將萌發(fā)的胚轉(zhuǎn)移至新鮮培養(yǎng)基用于芽和根發(fā)育。4-8周后，將任何發(fā)育良好的植物轉(zhuǎn)移到土壤中培養(yǎng)至成熟。在接下來(lái)的兩三個(gè)月中，植物已經(jīng)生長(zhǎng)至可以噴灑以確定其是否具有2，4-滴抗性的時(shí)間點(diǎn)。12.2-細(xì)胞轉(zhuǎn)化。起始一些用含有pDAB724的農(nóng)桿菌處理子葉節(jié)段的實(shí)驗(yàn)。使用多種用于pDAB724棉花愈傷組織增殖的生長(zhǎng)素選擇處理超過(guò)2000個(gè)得到的節(jié)段：0.1或0.5mg/LR-2，4-滴丙酸、標(biāo)準(zhǔn)2，4-滴濃度和無(wú)生長(zhǎng)素處理。由于構(gòu)建體中包含PAT基因，在草銨膦上選擇愈傷組織。以PCR和侵入物形式進(jìn)行愈傷組織株系分析用于測(cè)定是否和確定在愈傷組織期中存在基因；接著將胚胎發(fā)生的愈傷組織株系用于Western分析，基本上如11.2.3節(jié)所述。使用干燥技術(shù)脅迫胚胎發(fā)生的棉花愈傷組織，以提高回收組織的質(zhì)和量。對(duì)幾乎200個(gè)愈傷組織事件進(jìn)行了完整的PTU篩選，使用Western分析AAD-12(v1)基因的表達(dá)。下文是已檢驗(yàn)的一些棉花愈傷組織的數(shù)據(jù)的子集。12.3-植物再生。將按上述方案產(chǎn)生植物的AAD-12(v1)棉花株系送至溫室。為證明AAD-12(v1)基因在棉花中提供對(duì)2，4-滴的抗性，用噴灑體積為187L/ha的履帶式噴霧機(jī)遞送560gae/ha2，4-滴噴灑AAD-12(v1)和野生型兩種棉花植物。在處理后3和14天評(píng)估植物。2，4-滴選擇量下存活的植物自花授粉產(chǎn)生T1種子或與原種棉花株系遠(yuǎn)交產(chǎn)生F1種子。種植隨后產(chǎn)生的種子并如前述評(píng)估除草劑抗性。如實(shí)驗(yàn)18、19、22和23所述，AAD-12(v1)事件能與其它所需的HT或IR性狀組合。實(shí)施例13-其他作物的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化按照本文公開的內(nèi)容，可以根據(jù)本發(fā)明使用本領(lǐng)域已知的技術(shù)轉(zhuǎn)化其他作物。對(duì)于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的黑麥轉(zhuǎn)化，參閱如Popelka和Altpeter(2003)。對(duì)于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的大豆轉(zhuǎn)化，參閱如Hinchee等，1988。對(duì)于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的高粱轉(zhuǎn)化，參閱如Zhao等，2000。對(duì)于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的大麥轉(zhuǎn)化，參閱如Tingay等，1997。對(duì)于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的小麥轉(zhuǎn)化，參閱如Cheng等，1997。對(duì)于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的稻轉(zhuǎn)化，參閱如Hiei等，1997。下文給出了這些和其他植物的拉丁名。應(yīng)該明確，這些和其他(非農(nóng)桿菌)轉(zhuǎn)化技術(shù)可用于將例如AAD-12(v1)轉(zhuǎn)化進(jìn)這些植物和其他植物，包括但不僅限于玉蜀黍(Zeamays)、小麥(小麥屬物種(Triticumspp.))、稻(稻屬物種(Oryzaspp.)和菰屬物種(Zizaniaspp.))、大麥(大麥屬物種(Hordeumspp.))、棉花(水麻(Abromaaugusta)和棉花屬物種(Gossypiumspp.))、大豆(Glycinemax)、甜菜以及食用甜菜(甜菜屬物種(Betaspp.))、甘蔗(桄榔(Arengapinnata))、番茄(番茄(Lycopersiconesculentum)和番茄屬其他物種)、粘果酸漿(Physalisixocarpa)、Solariumincanum和茄屬其他物種，以及樹番茄(Cyphomandrabetacea))、馬鈴薯(Solanumtubersoum)、甘薯(Ipomoeabetatas)、黑麥(黑麥屬物種(Secalespp.))、胡椒(辣椒(Capsicumannuum)、C.sinense和鳥辣椒(C.frutescens))、萵苣(生菜(Lactucasativa)、山萵苣(L.perennis)和野萵苣(L.pulchella))、卷心菜(蕓苔屬物種(Brassicaspp.))、芹菜(旱芹(Apiumgraveolens))、茄子(Solanummelongena)、花生(Arachishypogea)、高粱(所有高粱屬(Sorghum)物種)、苜蓿(紫花苜蓿(Medicagosativum))、胡蘿卜(Daucuscarota)、豆類(菜豆屬物種(Phaseolusspp.)和其他屬)、燕麥(燕麥(AvenaSativa)和粗燕麥(A.Strigosa))、豌豆(豌豆屬(Pisum)、豇豆屬(Vigna)和四棱豆屬物種(Tetragonolobusspp.))、向日葵(Helianthusannuus)、南瓜(南瓜屬物種(Cucurbitaspp.))、黃瓜(Cucumissativa)、煙草(煙草屬物種(Nicotianaspp.))、擬南芥(Arabidopsisthaliana)、草坪草(黑麥草屬(Lolium)、剪股穎屬(Agrostis)、早熟禾屬(Poa)、狗牙根屬(Cynadon)和其他屬)、三葉草(三葉草屬(Tifolium))、野豌豆(野豌豆屬(Vicia))。帶有如AAD-12(v1)基因的這些植物包括于本發(fā)明中。在許多落葉和常綠木材的耕作制度中，AAD-12(v1)乃具有增加主要生長(zhǎng)素除草劑應(yīng)季使用的實(shí)用性的潛能。綠草定、2，4-滴和/或氟草煙抗性木材物種增加了過(guò)分使用這些除草劑而不擔(dān)心損傷的靈活性。這些物種包括但不局限于：榿木(榿木屬物種(Alnusspp.))、梣(梣屬物種(Fraxinusspp.))、白楊和楊木物種(楊屬物種(Populusspp.))、山毛櫸(水青岡屬物種(Fagusspp.))、樺(樺木屬物種(Betulaspp.))、櫻桃(李屬物種(prunusspp.))、桉樹(桉屬物種(Eucalyptusspp.))、山核桃樹(山核桃屬物種(Caryaspp.))、楓樹(楓屬物種(Acerspp.))、橡樹(櫟屬物種(Quercusspp.))和松樹(松屬物種(Pinusspp.))。在觀賞性和結(jié)果物種中利用生長(zhǎng)素抗性進(jìn)行選擇性雜草控制也在本發(fā)明范圍內(nèi)。實(shí)例包括但不局限于：玫瑰(薔薇屬物種(Rosaspp.))、地膚(burningbush)(衛(wèi)矛屬物種(Euonymusspp.))、矮牽牛(矮牽牛屬物種(Petuniaspp.))、秋海棠(秋海棠屬物種(Begoniaspp.))、杜鵑(杜鵑屬物種(Rhododendronspp.))、山楂或蘋果(蘋果屬物種(Malusspp.))、梨(梨屬物種(pyrusspp.))、桃(李屬物種)和萬(wàn)壽菊(萬(wàn)壽菊屬物種(Tagetesspp.))。實(shí)施例14-令人驚奇的結(jié)果的其他證據(jù)：AAD-12對(duì)AAD-214.1-AAD-2(V1)起始克隆。從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)(參閱ncbi.nlm.nih.gov網(wǎng)址；登錄號(hào)AP005940)鑒定了另一個(gè)基因，該基因?yàn)榕ctfdA只有44％氨基酸同一性的同源物。為保持一致性，此基因在本文中稱為AAD-2(v1)。通過(guò)以下測(cè)定同一性百分比：首先將AAD-2和tfdADNA序列(分別為PCT/US2005/014737的SEQIDNO：12和GENBANK登錄號(hào)M16730)翻譯成蛋白質(zhì)(分別為PCT/US2005/014737的SEQIDNO：13和GENBANK登錄號(hào)M16730)，接著使用VectorNTI軟件包中的ClustalW進(jìn)行多重序列比對(duì)。含有AAD-2(v1)基因的慢生型大豆根瘤菌(Bradyrhizobiumjaponicum)菌株得自北方地區(qū)研究實(shí)驗(yàn)室(NorthernRegionalResearchLaboratory)(NRRL，菌株號(hào)B4450)。按照NRRL方案復(fù)蘇凍干的菌株并作為Dow細(xì)菌菌株DB663在20％甘油中保存于-80℃用于內(nèi)部用途。將來(lái)自此冰凍原種的一菌環(huán)細(xì)菌鉤在Triptic大豆瓊脂平板上用于分離，并在28℃孵育3天。將單菌落接種到500ml三角擋板瓶中的100ml胰蛋白酶大豆培養(yǎng)液中，以150rpm在平板振蕩器上28℃孵育過(guò)夜。使用Qiagen的DNeasy試劑盒(Qiagen目錄號(hào)69504)的革蘭氏陰性方案從其中分離總DNA。設(shè)計(jì)以下引物以從基因組DNA中擴(kuò)增靶基因，正向：5’ACTAGTAACAAAGAAGGAGATATACCATGACGAT3’[brjap5’(speI)PCT/US2005/014737的SEQIDNO：14(加入了SpeI限制性位點(diǎn)和核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS))]和反向：5’TTCTCGAGCTATCACTCCGCCGCCTGCTGCTGC3’[brjap3’(xhol)PCT/US2005/014737的SEQIDNO：15(加入了XhoI位點(diǎn))]。按如下建立50μl的反應(yīng)：FailSafe緩沖液25μl、各種引物1μl(50ng/μl)、gDNA1μl(200ng/μl)、H2O21μl、Taq聚合酶1μl(2.5單位/μl)。在三個(gè)獨(dú)立的反應(yīng)中使用三種FailSafe緩沖液-A、B和C。然后使用FailSafePCR系統(tǒng)(Epicenter目錄號(hào)FS99100)在以下條件下進(jìn)行PCR反應(yīng)：95℃3.0分鐘的熱變性循環(huán)；95℃1.0分鐘、50℃1.0分鐘、72℃1.5分鐘的30個(gè)循環(huán)；接著是72℃5分鐘的終循環(huán)。用化學(xué)感受態(tài)的TOP10F’大腸桿菌作為宿主菌株，按照所包含的方案將得到的約1kb的PCR產(chǎn)物克隆到pCR2.1(Invitrogen目錄號(hào)K4550-40)中來(lái)驗(yàn)證核苷酸序列。挑取10個(gè)得到的白色克隆至3μlLuria培養(yǎng)液+1000μg/ml氨芐青霉素(LBAmp)并在37℃搖動(dòng)培養(yǎng)過(guò)夜。按照所包含的方案使用NucleospinPlus質(zhì)粒小量制備試劑盒(BDBiosciences目錄號(hào)K3063-2)從每個(gè)培養(yǎng)物中純化質(zhì)粒。完成分離DNA的限制性消化以證實(shí)pCR2.1載體中存在PCR產(chǎn)物。用限制性酶EcoRI(NewEnglandBiolabs目錄號(hào)R0101S)消化質(zhì)粒DNA。按照生產(chǎn)商的說(shuō)明使用M13正向[5’GTAAAACGACGGCCAG3’](SEQIDNO：6)和反向[5’CAGGAAACAGCTATGAC3’](SEQIDNO：7)引物，用BeckmanCEQQuickStart試劑盒(BeckmanCoulter目錄號(hào)608120)進(jìn)行測(cè)序。為了內(nèi)部一致性，給予此基因序列及其相應(yīng)蛋白質(zhì)新的通用名AAD-2(v1)。14.2-AAD-2(v1)二元載體的完成。從pDAB3202中PCR擴(kuò)增AAD-2(v1)基因。在PCR反應(yīng)中，在引物內(nèi)進(jìn)行了改變，以在5’引物和3’引物中分別引入AflIII和SacI限制性位點(diǎn)。參閱PCT/US2005/014737。使用FailSafePCR系統(tǒng)(Epicentre)用引物“NcoIofBrady”[5’TATACCACATGTCGATCGCCATCCGGCAGCTT3’](SEQIDNO：14)和“SacIofBrady”[5’GAGCTCCTATCACTCCGCCGCCTGCTGCTGCAC3’](SEQIDNO：15)擴(kuò)增DNA片段。將PCR產(chǎn)物克隆到pCR2.1TOPOTA克隆載體(Invitrogen)中，使用BeckmanCoulter“DyeTerminatorCycleSequencingwithQuickStartKit”測(cè)序試劑用M13正向和M13反向引物驗(yàn)證序列。測(cè)序數(shù)據(jù)鑒定了一個(gè)具有正確序列的克隆(pDAB716)。接著將AflIII/SacIAAD-2(v1)基因片段克隆到NcoI/SacIpDAB726載體中。通過(guò)限制性消化(用NcoI/SacI)驗(yàn)證得到的構(gòu)建體(pDAB717)：AtUbi10啟動(dòng)子：NtOSM5’UTR：AAD-2(v1)：NtOSM3’UTR：ORF1polyA3’UTR。將此構(gòu)建體以NotI-NotIDNA片段克隆到二元載體pDAB3038中。限制性消化(用NotI，EcoRI，HinDIII，NcoI，PvuII和SalI)得到的構(gòu)建體(pDAB767)：AtUbil0啟動(dòng)子：NtOSM5’UTR：AAD-2(V1)：NtOSM3’UTR：ORF1polyA3’UTR：CsVMV啟動(dòng)子：PAT：ORF25/263’UTR以驗(yàn)證正確的方向。然后將完成的構(gòu)建體(pDAB767)轉(zhuǎn)化進(jìn)農(nóng)桿菌中。14.3-評(píng)估轉(zhuǎn)化的擬南芥。種植新鮮收集的用植物優(yōu)化的AAD-12(v1)或天然AAD-2(v1)基因轉(zhuǎn)化的T1種子，然后將選擇的如前述草銨膦抗性植物隨機(jī)分配多種劑量的2，4-滴(50-3200gae/ha)。通過(guò)噴霧體積為187L/ha的履帶式噴霧機(jī)應(yīng)用除草劑。使用的2，4-滴是商業(yè)二甲胺鹽制劑(456gae/L，NuFarm，StJoseph，MO)混合到200mMTris緩沖液(pH9.0)或200mMHEPES緩沖液(pH7.5)中。相對(duì)于轉(zhuǎn)化和未轉(zhuǎn)化對(duì)照株系，AAD-12(v1)和AAD-2(v1)確實(shí)提供了可檢測(cè)到的2，4-滴抗性，然而，單個(gè)構(gòu)建體在其向個(gè)體T1擬南芥植物賦予2，4-滴抗性的能力上存在廣泛的可變性。令人驚奇地，從高耐性植物的頻率和整體平均損傷來(lái)看，AAD-2(v1)和AAD-2(v2)轉(zhuǎn)化體對(duì)2，4-滴的抗性都比AAD-12(v1)基因差很多。AAD-2(v1)轉(zhuǎn)化的植物不能在200gae/ha2，4-滴下相對(duì)無(wú)損傷(＜20％的目測(cè)損傷)地存活，且總體種群損傷約為83％(參閱PCT/US2005/014737)。相反，用3,200gae/ha2，4-滴處理AAD-12(v1)時(shí)，其種群平均損傷約為6％(表11)。植物優(yōu)化的AAD-2(v2)的耐性比天然基因略有提高，然而，AAD-12和AAD-2植物優(yōu)化基因的比較表明AAD-12(v1)在植物中具有顯著的優(yōu)勢(shì)?？紤]到AAD-2(v1)(參閱PCT/US2005/014737)和AAD-12(v1)的體外比較表明二者都高效降解2，4-滴，并且均享有對(duì)手性芳氧基鏈烷酸酯底物的S型特異性，這些結(jié)果是未曾預(yù)料到的。在個(gè)體T1植物中AAD-2(v1)以變化的水平表達(dá)，然而，這種表達(dá)的蛋白質(zhì)幾乎不提供對(duì)2，4-滴損傷的保護(hù)。天然和植物優(yōu)化的AAD-2基因(參閱PCT/US2005/014737)的蛋白質(zhì)表達(dá)水平(在植物中)沒(méi)有明顯的實(shí)質(zhì)性差異。這些數(shù)據(jù)證實(shí)了早前的發(fā)現(xiàn)，即在植物中產(chǎn)生AAD-12(v1)的功能性表達(dá)并得到對(duì)2，4-滴和吡啶氧乙酸類除草劑的除草劑抗性是未預(yù)料的。實(shí)施例15-種植前滅生性應(yīng)用此實(shí)施例和其后的實(shí)施例是本發(fā)明AAD-12可能帶來(lái)的新除草劑用途的具體實(shí)例。種植前滅生性除草劑應(yīng)用旨在在種植給定作物前殺死在冬天或早春出現(xiàn)的雜草。一般在種植前未完成物理除草的非耕地或減少的耕地管理系統(tǒng)中應(yīng)用。因此除草劑程序必須控制種植時(shí)存在的非常廣譜的闊葉和禾本科雜草。草甘膦、克無(wú)蹤和草銨膦是種植前滅生性除草劑應(yīng)用中廣泛使用的非選擇性無(wú)殘留除草劑的實(shí)例。然而，由于以下一種或多種原因使這個(gè)季節(jié)的一些雜草很難控制：雜草物種或生物型對(duì)除草劑的內(nèi)在不敏感性、冬季一年生雜草的相對(duì)較大的尺寸和限制除草劑攝取和活性的涼爽的天氣條件。一些除草劑選擇可以與這些除草劑罐混以提高對(duì)雜草的譜系和活性，而非選擇性除草劑對(duì)雜草不太有效。實(shí)例為2，4-滴與草甘膦罐混應(yīng)用以輔助控制小飛蓬(Conyzacanadensis)(加拿大飛蓬)。用于出現(xiàn)的多數(shù)雜草的種植前滅生控制的草甘膦用量可從420到1680gae/ha，更一般的從560到840gae/ha；然而，可以應(yīng)用280-1120gae/ha的2，4-滴以輔助控制許多闊葉雜草物種(如加拿大飛蓬)。2，4-滴是精選的除草劑，因?yàn)樗鼘?duì)范圍非常廣泛的闊葉雜草有效、甚至在低溫下也有效并且非常廉價(jià)。然而，如果其后的作物為敏感性雙子葉作物，則土壤中的2，4-滴殘留(盡管殘留很短)可能對(duì)作物產(chǎn)生負(fù)影響。大豆是敏感性作物，需要在滅生應(yīng)用和種植之間存在7天(對(duì)于280gae/ha的2，4-滴用量)到至少30天(對(duì)于1120gae/ha的2，4-滴應(yīng)用)的最小時(shí)間周期。在棉花種植前禁止用2，4-滴進(jìn)行滅生性處理(參閱聯(lián)邦說(shuō)明(federallabels)，多數(shù)通過(guò)CPR，2005提供或在cdms.net/manuf/manuf.asp在線提供)。使用AAD-12(v1)轉(zhuǎn)化的棉花或大豆，這些作物在土壤中來(lái)自之前甚至在種植后作物出苗前的滅生性應(yīng)用的2，4-滴殘留下存活。罐混(或商品預(yù)混)伴侶提高的靈活性和降低的費(fèi)用可改善雜草控制的選擇并提高在重要的非耕地和減少耕地的地點(diǎn)滅生性應(yīng)用的強(qiáng)度。此實(shí)例是可利用的多種選擇之一。通過(guò)使用聯(lián)邦除草劑說(shuō)明(CPR，2005)中所述產(chǎn)品和例如AgrilianceCropProtectionGuide(2003)所描述的用途，雜草控制領(lǐng)域的技術(shù)人員會(huì)注意到多種其他應(yīng)用，包括但不僅限于克無(wú)蹤+2，4-滴或草銨膦+2，4-滴。本領(lǐng)域技術(shù)人員還會(huì)認(rèn)識(shí)到，以上實(shí)例可應(yīng)用于任何由AAD-12(v1)基因(如果穩(wěn)定轉(zhuǎn)化)保護(hù)的2，4-滴敏感性(或其他苯氧基生長(zhǎng)素除草劑)作物。同樣，AAD-12降解綠草定和氟草煙的獨(dú)特性質(zhì)增強(qiáng)其效用，分別通過(guò)取代或罐混70-1120或35-560gae/ha的綠草定和氟草煙來(lái)增加譜系和/或提高控制多年生或藤本雜草物種的能力。實(shí)施例16-苯氧基生長(zhǎng)素除草劑在僅轉(zhuǎn)化AAD-12(v1)的大豆、棉花和其他雙子葉作物中的作物內(nèi)應(yīng)用AAD-12(v1)使得可以在通常對(duì)2，4-滴敏感的作物中使用苯氧基生長(zhǎng)素除草劑(如2，4-滴和MCPA)和吡啶氧基生長(zhǎng)素(綠草定和氟草煙)直接控制廣譜闊葉雜草。280到2240gae/ha的2，4-滴應(yīng)用可控制農(nóng)業(yè)環(huán)境中存在的多數(shù)闊葉雜草物種。更一般地使用560-1120gae/ha。對(duì)于綠草定，應(yīng)用劑量范圍一般為70-1120gae/ha，更一般140-420gae/ha。對(duì)于氟草煙，應(yīng)用劑量范圍一般為35-560gae/ha，更一般70-280gae/ha。這種額外的工具的優(yōu)勢(shì)是闊葉除草劑成分極低的費(fèi)用和以較高用量使用時(shí)較高用量的2，4-滴、綠草定和氟草煙提供的可能的短期殘留雜草控制，而非殘留除草劑如草甘膦不提供對(duì)后來(lái)萌發(fā)的雜草的控制。這種工具還提供了除草劑作用模式聯(lián)合HTC便利性的機(jī)制，作為將除草劑抗性與雜草演替有機(jī)整合在一起的管理策略。該工具提供的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是將廣譜闊葉雜草控制除草劑(如，2，4-滴、綠草定和氟草煙)和通常使用的殘留雜草控制除草劑罐混的能力。這些除草劑一般在種植前或種植期應(yīng)用，但是通常對(duì)種植前在大田中存在的已出現(xiàn)和確定的雜草低效。通過(guò)擴(kuò)展這些芳氧基生長(zhǎng)素除草劑的效用(包括種植期、出苗前或種植前應(yīng)用)，增加了殘留雜草控制程序的靈活性。本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)識(shí)到殘留除草劑程序?qū)⒁蚰康淖魑锒?，但是一般的程序包括氯乙酰?chloracetmide)除草劑和二硝基苯胺除草劑家系，還包括諸如異草松和甲磺草胺的除草劑以及多種ALS-抑制、PPO-抑制和HPPD-抑制除草劑。其他益處包括(提供)在芳氧基乙酸生長(zhǎng)素除草劑應(yīng)用之后，種植前所必須的對(duì)2，4-滴、綠草定或氟草煙的耐性(參閱前述實(shí)施例)；且由未完全清潔的含有2，4-滴、綠草定或氟草煙的大罐引起的對(duì)雙子葉作物的污染損傷問(wèn)題較小。麥草畏(和一些其他除草劑)仍可用于繼續(xù)控制轉(zhuǎn)化了AAD-12(v1)的雙子葉作物自生作物。本領(lǐng)域技術(shù)人員還會(huì)認(rèn)識(shí)到，以上實(shí)例可用于被AAD-12(v1)基因(如果穩(wěn)定轉(zhuǎn)化)保護(hù)的任何2，4-滴(或其他芳氧基生長(zhǎng)素除草劑)敏感性作物。雜草控制領(lǐng)域的技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到，AAD-12(v1)轉(zhuǎn)化使得可以使用單獨(dú)或與除草劑聯(lián)合的多種商品苯氧基或吡啶氧基生長(zhǎng)素除草劑。可以通過(guò)《作物保護(hù)參考》(CropProtectionReference，CPR)書籍中匯編的除草劑說(shuō)明或類似的匯編或任何商品或?qū)W術(shù)作物保護(hù)參考文獻(xiàn)(如來(lái)自Agriliance(2005)的《作物保護(hù)指南》(CropProtectionGuide))確定這些化學(xué)中其他代表性除草劑的具體用量。每種由于AAD-12(v1)可在HTC中使用(無(wú)論單獨(dú)、罐混或相繼使用)的可選除草劑都在本發(fā)明范圍內(nèi)。實(shí)施例17-苯氧基生長(zhǎng)素和吡啶氧基生長(zhǎng)素除草劑在僅轉(zhuǎn)化AAD-12(v1)的玉米、稻和其他單子葉物種中的作物內(nèi)用途以類似的方式用AAD-12(v1)轉(zhuǎn)化禾本科物種(例如但不僅限于玉米、稻、小麥、大麥或草坪草和牧草)將使得在通常選擇性不確定的作物中使用高效的苯氧基和吡啶氧基生長(zhǎng)素。多數(shù)禾本科物種對(duì)生長(zhǎng)素除草劑如苯氧基生長(zhǎng)素(即2，4-滴)具有天然耐性。然而，由于應(yīng)用時(shí)間窗口變短或無(wú)法接受的損傷風(fēng)險(xiǎn)，相對(duì)低水平的作物選擇性導(dǎo)致了在這些植物中應(yīng)用的減少。因此轉(zhuǎn)化了AAD-12(v1)的單子葉作物能使用已述用于雙子葉作物的相似處理組合，如應(yīng)用280到2240gae/ha的2，4-滴控制多數(shù)闊葉雜草物種。更一般地使用560-1120gae/ha。對(duì)于綠草定，一般應(yīng)用劑量范圍是70-1120gae/ha，更一般是140-420gae/ha。對(duì)于氟草煙，一般應(yīng)用劑量范圍是35-560gae/ha，更一般是70-280ae/ha。這種額外的工具的優(yōu)勢(shì)是闊葉除草劑成分極低的費(fèi)用和較高用量的2，4-滴、綠草定或氟草煙提供的可能的短期殘留雜草控制。相比之下，非殘留除草劑(如草甘膦)不提供對(duì)后來(lái)萌發(fā)的雜草的控制。這種工具還提供了將除草劑作用模式與HTC的便利性進(jìn)行輪換的機(jī)制，在草甘膦耐性作物/AAD-12(v1)HTC聯(lián)合策略中作為將除草劑抗性與雜草演替有機(jī)整合在一起的管理策略(無(wú)論是否輪作作物物種)。該工具提供的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是將廣譜闊葉雜草控制除草劑(如，2，4-滴、綠草定和氟草煙)和通常使用的殘留雜草控制除草劑罐混的能力。這些除草劑一般在種植前或種植期應(yīng)用，但是通常對(duì)種植前在大田中存在的已出現(xiàn)和確定的雜草低效。通過(guò)擴(kuò)展這些芳氧基生長(zhǎng)素除草劑的效用(包括種植期、出苗前或種植前應(yīng)用)，增加了殘留雜草控制程序的靈活性。本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)識(shí)到殘留除草劑程序?qū)⒁蚰康淖魑锒?，但是一般的程序包括氯乙酰胺除草劑和二硝基苯胺除草劑家系，還包括諸如異草松和甲磺草胺的除草劑以及多種ALS-抑制、PPO-抑制和HPPD-抑制除草劑。玉米、稻和其它單子葉植物對(duì)苯氧基或吡啶氧基生長(zhǎng)素的增加的耐性使得能作物內(nèi)使用這些除草劑，沒(méi)有生長(zhǎng)階段的限制或作物倒伏的可能性，展開的現(xiàn)象如鼠尾(“rat-tailing”)、作物倒伏、玉米中生長(zhǎng)調(diào)控因子誘導(dǎo)的莖脆性或變形的支柱根。通過(guò)AAD-12(v1)能用于HTC的每種可選的除草劑，不論是單獨(dú)、罐混或相繼使用，認(rèn)為在本發(fā)明范圍之內(nèi)。實(shí)施例18-在任意作物中與草甘膦耐性性狀疊加的AAD-12(v1)北美大田種植的絕大多數(shù)棉花、蕓苔、玉米和大豆含有草甘膦耐性(GT)性狀，并且對(duì)GT玉米的采用正在增加。其他GT作物(如小麥、稻、甜菜和草坪草)已在開發(fā)中，但目前尚未上市。許多其他草甘膦抗性物種正處在實(shí)驗(yàn)至開發(fā)階段(如苜蓿、甘蔗、向日葵、甜菜、豌豆、胡蘿卜、黃瓜、萵苣、洋蔥、草莓、番茄和煙草；林業(yè)物種如白楊和香楓以及園藝物種如萬(wàn)壽菊、牽?；ê颓锖Ｌ?，萬(wàn)維網(wǎng)上的isb.vt.edu/cfdocs/fieldtests1.cfm，2005)。GTC是有價(jià)值的工具，在于受控雜草的范圍以及此系統(tǒng)提供的便利性和費(fèi)用效益。然而，草甘膦作為目前標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)處理的用途正在選擇草甘膦抗性雜草。此外，在實(shí)行僅用草甘膦化學(xué)品程序的大田中草甘膦固有效力較低的雜草正在演替為主要物種。通過(guò)常規(guī)育種或共同作為新轉(zhuǎn)化事件將AAD-12(v1)與GT性狀疊加可以改進(jìn)雜草控制的效力、靈活性和管理雜草演替及除草劑抗性發(fā)展的能力。如前述實(shí)施例中所提到的，通過(guò)用AAD-12(v1)轉(zhuǎn)化作物，單子葉作物將具有較高的苯氧基或吡啶氧基生長(zhǎng)素安全余地，并可以在雙子葉作物中選擇性應(yīng)用苯氧基生長(zhǎng)素。可以設(shè)想改善的雜草控制選擇的一些方案，其中在任意單子葉或雙子葉作物物種中疊加了AAD-12(v1)和GT性狀：a)可以以標(biāo)準(zhǔn)出苗后用量(420至2160gae/ha，優(yōu)選560至840gae/ha)應(yīng)用草甘膦，用于控制多數(shù)禾本科和闊葉雜草物種。為控制草甘膦抗性闊葉雜草如小飛蓬或內(nèi)在難以用草甘膦控制的雜草(如鴨跖草屬物種(Commelinaspp.)、番薯屬物種(Ipomoeaspp.)等)，可以相繼、罐混或作為預(yù)混料與草甘膦一起應(yīng)用280-2240gae/ha(優(yōu)選560-1120gae/ha)2，4-滴以提供有效控制。對(duì)于綠草定，一般用量范圍是70-1120gae/ha，更一般是140-420gae/ha。對(duì)于氟草煙，一般用量范圍是35-560gae/ha，更一般是70-280ae/ha。b)目前，應(yīng)用于GTC的草甘膦用量范圍一般為每個(gè)應(yīng)用時(shí)間560至2240gae/ha。草甘膦對(duì)于禾本科物種的效力遠(yuǎn)高于闊葉雜草物種。AAD-12(v1)+GT疊加性狀可允許禾本科有效的草甘膦用量(105-840gae/ha，更優(yōu)選210-420gae/ha)。接著可以相繼、罐混或作為預(yù)混料與禾本科有效用量的草甘膦一起應(yīng)用2，4-滴(280-2240gae/ha，更優(yōu)選560-1120gae/ha)以提供必要的闊葉雜草控制。上文提到的劑量水平上的綠草定和氟草煙是處理方案中可接受的成分。草甘膦的低用量還可為闊葉雜草控制提供一些益處；然而初期控制可來(lái)自2，4-滴、綠草定或氟草煙。雜草控制領(lǐng)域的技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到，AAD-12(v1)轉(zhuǎn)化進(jìn)作物使得可以單獨(dú)或組合(相繼或獨(dú)立地)使用一種或多種商品芳氧基生長(zhǎng)素除草劑。通過(guò)CPR《作物保護(hù)參考》書中匯編的除草劑說(shuō)明或類似的匯編、在線(如cdms.net/manuf/manuf.asp)匯編的說(shuō)明或任意商品或?qū)W術(shù)作物保護(hù)指南(如Agriliance的《作物保護(hù)指南》(2005))可以確定這些化學(xué)物質(zhì)中其他代表性除草劑的具體用量。每種由于AAD-12(v1)而可以在HTC中使用(無(wú)論單獨(dú)、罐混或相繼使用)的可選除草劑都考慮在本發(fā)明范圍內(nèi)。實(shí)施例19-在任意作物中與草銨膦耐性性狀疊加的AAD-12(v1)草銨膦耐性(PAT或bar)目前作為輸入性狀(如昆蟲抗性蛋白)的選擇標(biāo)記或具體作為HTC性狀存在于北美種植的大量作物中。作物包括但不僅限于草銨膦耐性蕓苔、玉米和棉花。其他的草銨膦耐性作物(如稻、甜菜、大豆和草坪草)已在開發(fā)中，但目前尚未準(zhǔn)予上市。與草甘膦相似，草銨膦是相對(duì)非選擇性廣譜禾本科和闊葉除草劑。草銨膦的作用方式與草甘膦不同。其作用較快，在除草劑應(yīng)用24-48小時(shí)后導(dǎo)致受到處理的葉的脫水和“燒傷”。這對(duì)于表觀快速雜草控制是有利的。然而，這也限制了草銨膦向靶植物分生組織區(qū)的轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致較弱的雜草控制，這被兩種化合物在許多物種中的相對(duì)雜草控制性能評(píng)定所證明(Agriliance，2005)。通過(guò)常規(guī)育種或共同作為新轉(zhuǎn)化事件將AAD-12(v1)與草銨膦耐性性狀疊加可以改進(jìn)雜草控制的效力、靈活性和管理雜草演替及除草劑抗性發(fā)展的能力?？梢栽O(shè)想改善的雜草控制選擇的一些方案，其中在任意單子葉或雙子葉作物物種中疊加了AAD-12(v1)和草銨膦耐性性狀：a)可以以標(biāo)準(zhǔn)出苗后用量(200至1700gae/ha，優(yōu)選350至500gae/ha)應(yīng)用草銨膦，用于控制多種禾本科和闊葉雜草物種。目前尚未確認(rèn)草銨膦抗性雜草；然而固有對(duì)草銨膦更有耐性的雜草數(shù)目多于草甘膦。i)內(nèi)在耐性闊葉雜草物種(如田薊(Cirsiumarvensis)、加拿大麻(Apocynumcannabinum)和小飛蓬)的控制可通過(guò)罐混280-2240gae/ha(更優(yōu)選560-2240gae/ha)的2，4-滴以有效控制這些更難以控制的多年生物種并改進(jìn)對(duì)一年生闊葉雜草物種的控制強(qiáng)度。在雜草控制方案中，認(rèn)為綠草定和氟草煙是可接受的成分。對(duì)于綠草定，一般用量范圍是70-1120gae/ha，更一般是140-420gae/ha。對(duì)于氟草煙，一般用量范圍是35-560gae/ha，更一般是70-280ae/ha。b)多重組合(如草銨膦(200-500gae/ha)+/-2，4-滴(280-1120gae/ha)+/-綠草定或氟草煙(以上文所列用量))可提供更強(qiáng)的重疊雜草控制譜。另外，重疊譜提供管理或延緩除草劑抗性雜草的另一種機(jī)制。雜草控制領(lǐng)域的技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到，AAD-12(v1)轉(zhuǎn)化進(jìn)作物使得可以單獨(dú)或組合(相繼或獨(dú)立地)使用一種或多種商品芳氧基乙酸生長(zhǎng)素除草劑。通過(guò)CPR《作物保護(hù)參考》書中匯編的除草劑說(shuō)明或類似的匯編、在線(如cdms.net/manuf/manuf.asp)匯編的說(shuō)明或任意商品或?qū)W術(shù)作物保護(hù)指南(如Agriliance的《作物保護(hù)指南》(2005))可以確定這些化學(xué)物質(zhì)中其他代表性除草劑的具體用量。每種由于AAD-12(v1)而可以在HTC中使用(無(wú)論單獨(dú)、罐混或相繼使用)的可選除草劑都考慮在本發(fā)明的范圍內(nèi)。實(shí)施例20-在任意作物中與AHAS性狀疊加的AAD-12(v1)咪唑啉酮除草劑耐性(AHAS等)目前存在于北美種植的大量作物中，包括但不僅限于玉米、稻和小麥。其他的咪唑啉酮耐性作物(如棉花和甜菜)已在開發(fā)中，但目前尚未上市。目前將許多咪唑啉酮類除草劑(如甲氧咪草煙、咪草煙、滅草喹和甲咪唑煙酸)選擇性用于多種常規(guī)作物中。通過(guò)咪唑啉酮耐性性狀如AHAS等使得可以使用咪草煙、甲氧咪草煙和非選擇性的咪唑煙酸。這類化學(xué)品還具有顯著的土壤殘留活性，因此與基于草甘膦或草銨膦的系統(tǒng)不同，它能提供超過(guò)應(yīng)用時(shí)間的延長(zhǎng)的雜草控制。然而，咪唑啉酮類除草劑控制的雜草譜不如草甘膦廣泛(Agriliance，2005)。另外，針對(duì)咪唑啉酮類除草劑具有的作用模式(抑制乙酰乳酸合酶，ALS)，許多雜草已經(jīng)發(fā)展出抗性(Heap，2005)。通過(guò)常規(guī)育種或共同作為新轉(zhuǎn)化事件將AAD-12(v1)與咪唑啉酮耐性性狀疊加可以改進(jìn)雜草控制的效力、靈活性和管理雜草演替及除草劑抗性發(fā)展的能力。如前述實(shí)施例中所提到的，通過(guò)用AAD-12(v1)轉(zhuǎn)化作物，單子葉作物將具有較高的苯氧基或吡啶氧基生長(zhǎng)素安全余地，并可以在雙子葉作物中選擇性應(yīng)用這些生長(zhǎng)素?？梢栽O(shè)想改善的雜草控制選擇的一些方案，其中在任意單子葉或雙子葉作物物種中疊加了AAD-12(v1)和咪唑啉酮耐性性狀：a)可以以標(biāo)準(zhǔn)出苗后用量(35至280gae/ha，優(yōu)選70-140gae/ha)應(yīng)用咪唑啉酮，用于控制許多禾本科和闊葉雜草物種。i)可以通過(guò)罐混280-2240gae/ha(更優(yōu)選560-2240gae/ha)的2，4-滴來(lái)控制ALS抑制劑抗性闊葉雜草(如Amaranihusrudis、三裂葉豚草(Ambrosiatrifida)、藜(Chenopodiumalbum)(等等，Heap，2005))。對(duì)于綠草定，一般用量范圍是70-1120gae/ha，更一般是140-420gae/ha。對(duì)于氟草煙，一般用量范圍是35-560gae/ha，更一般是70-280ae/ha。ii)也可以通過(guò)罐混280-2240gae/ha(更優(yōu)選560-2240gae/ha)的2，4-滴來(lái)控制固有對(duì)咪唑啉酮類除草劑更具耐性的闊葉物種(如番薯屬物種)。參閱上文綠草定或氟草煙的用量。b)多重組合(如咪草煙(35至280gae/ha，優(yōu)選70-140gae/ha)+/-2，4-滴(280-1120gae/ha)+/-綠草定或氟草煙(以上文所列用量))可提供更強(qiáng)的重疊雜草控制譜。另外，重疊譜提供管理或延緩除草劑抗性雜草的另一種機(jī)制。雜草控制領(lǐng)域的技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到，通過(guò)AAD-12(v1)轉(zhuǎn)化并通過(guò)常規(guī)育種或遺傳工程與任意咪唑啉酮耐性性狀疊加使得可以單獨(dú)或以多種組合使用多種商品咪唑啉酮類除草劑、苯氧乙酸或吡啶氧乙酸生長(zhǎng)素除草劑的任意一種。通過(guò)CPR《作物保護(hù)參考》書中匯編的除草劑說(shuō)明或類似的匯編、在線(如cdms.net/manuf/manuf.asp)匯編的說(shuō)明或任意商品或?qū)W術(shù)作物保護(hù)指南(如Agriliance的《作物保護(hù)指南》(2005))可以確定這些化學(xué)品中其他代表性除草劑的具體用量。每種由于AAD-12(v1)而可以在HTC中使用(無(wú)論單獨(dú)、罐混或相繼使用)的可選除草劑都考慮在本發(fā)明的范圍內(nèi)。實(shí)施例21-稻中的AAD-12(v1)21.1-培養(yǎng)基說(shuō)明。用1MKOH將使用的培養(yǎng)基調(diào)整至pH5.8，并用2.5g/L植物凝膠(希格瑪，Sigma)固化。在含有40ml半固體培養(yǎng)基的100×20mm皮氏培養(yǎng)皿中培養(yǎng)胚性愈傷組織。在Magenta盒中的50ml培養(yǎng)基中培養(yǎng)稻小植株。在含有35ml液體培養(yǎng)基的125ml錐形瓶中維持細(xì)胞懸液并以125rpm旋轉(zhuǎn)。在25-26℃在黑暗中誘導(dǎo)和維持胚胎發(fā)生培養(yǎng)物，在16小時(shí)光周期下進(jìn)行植物再生和全植物培養(yǎng)(Zhang等1996)。如前述在NB基礎(chǔ)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)和維持胚性愈傷組織(Li等1993)，但調(diào)整為含有500mg/L谷氨酰胺。在SZ液體培養(yǎng)基(Zhang等1998)中起始和維持懸浮培養(yǎng)物，其中含有代替麥芽糖的30g/L蔗糖。滲透培養(yǎng)基(NBO)由加入各0.256M的甘露醇和山梨醇的NB培養(yǎng)基組成。在補(bǔ)充了50mg/L潮霉素B的NB培養(yǎng)基上選擇潮霉素B抗性愈傷組織3-4周。在由NB培養(yǎng)基組成的培養(yǎng)基(PRH50)上預(yù)再生一周，其中NB培養(yǎng)基無(wú)2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-滴)，但加入了2mg/L6-芐氨基嘌呤(BAP)、1mg/Lα-萘乙酸(NAA)、5mg/L脫落酸(ABA)和50mg/L潮霉素B。接著通過(guò)在再生培養(yǎng)基(RNH50)上培養(yǎng)至芽再生來(lái)再生小植株，所述再生培養(yǎng)基含有無(wú)2，4-滴并補(bǔ)充了3mg/LBAP、0.5mg/LNAA和50mg/L潮霉素B的NB培養(yǎng)基。將芽轉(zhuǎn)移到含有半濃度Murashige和Skoog基礎(chǔ)鹽和GamborgB5維生素、補(bǔ)充了1％蔗糖和50mg/L潮霉素B(1/2MSH50)的生根培養(yǎng)基中。21.2-組織培養(yǎng)發(fā)育。如Zhang等1996所述將粳稻栽培種臺(tái)北309(OryzasativaL.japonicacv.Taipei309)的成熟干燥種子滅菌。通過(guò)在黑暗中在NB培養(yǎng)基上培養(yǎng)無(wú)菌成熟稻種誘導(dǎo)胚胎發(fā)生組織。將直徑約1mm的初級(jí)愈傷組織從盾片中移出，并用于在SZ液體培養(yǎng)基中起始細(xì)胞懸液。接著如Zhang1995所述維持懸液。前述繼代培養(yǎng)后3-5天將懸液來(lái)源的胚胎發(fā)生組織從液體培養(yǎng)基中移出，并置于NBO滲透培養(yǎng)基上以在皮氏培養(yǎng)皿中形成約2.5cm的圓圈，在轟擊前培養(yǎng)4小時(shí)。轟擊后16到20小時(shí)，將組織從NBO培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到NBH50潮霉素B選擇培養(yǎng)基上(保證轟擊表面向上)，并在黑暗中孵育14-17天。然后從原始轟擊外植體分離新形成的愈傷組織，并置于旁邊相同的培養(yǎng)基上。再過(guò)8-12天后，目測(cè)鑒定相對(duì)致密、不透明的愈傷組織，并轉(zhuǎn)移到PRH50預(yù)再生培養(yǎng)基在黑暗中經(jīng)過(guò)7天。接著將變得更加致密和不透光的生長(zhǎng)的愈傷組織在RNH50再生培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)，在16小時(shí)光周期下經(jīng)過(guò)14-21天的時(shí)間。將再生的芽轉(zhuǎn)移到含有1/2MSH50培養(yǎng)基的Magenta盒中。認(rèn)為從單個(gè)外植體再生的多個(gè)植物是同胞，并作為一個(gè)獨(dú)立的植物株系進(jìn)行處理。如果植物產(chǎn)生白色粗根并在1/2MSH50培養(yǎng)基上旺盛生長(zhǎng)，則將其評(píng)定為hph基因陽(yáng)性。一旦小植株達(dá)到Magenta盒的頂部時(shí)，將其轉(zhuǎn)移到100％濕度下6cm盆里的土壤中一周，接著移至14小時(shí)30℃的光照期和21℃黑暗的培養(yǎng)箱中2-3周，之后移植到溫室中的13cm盆。收集種子，于儲(chǔ)藏前在37℃干燥一周。21.3-微粒轟擊。用BiolisticPDS-1000/HeTM系統(tǒng)(Bio-Rad，Laboratories，Inc.)實(shí)施所有轟擊。將3mg、直徑1.0μm的金顆粒用100％乙醇洗滌一次，用無(wú)菌蒸餾水洗滌兩次并重懸于經(jīng)硅化處理的Eppendorf管中的50μl水中。在金懸液中加入5μg質(zhì)粒DNA(1∶6摩爾比的pDOW3303(含有Hpt的載體)和pDAB4101(AAD-12(v1)+AHAS))、20μl亞精胺(0.1M)和50μl氯化鈣(2.5M)。在室溫孵育混合物10分鐘，以10000rpm沉淀10秒，重懸于60μl冷的100％乙醇并給每個(gè)巨載體分配8-9μl。如Zhang等(1996)所述，以1100psi和27英寸Hg真空轟擊組織樣品。21.4-AAD-12(v1)轉(zhuǎn)化的T0稻中的出苗后除草劑耐性使用履帶式噴霧器(刻度為187L/ha)用含有1％SunitII(體積/體積)和1.25％UAN(體積/體積)的致死劑量為0.16％(體積/體積)的Pursuit溶液(為證實(shí)存在AHAS基因)噴灑3-5葉期的稻小植株。在處理后36天(DAT)，進(jìn)行敏感或抗性的評(píng)估。送到溫室中33個(gè)事件中的10個(gè)對(duì)Pursuit強(qiáng)耐性；其它的遭受多種水平的除草劑損傷。植物取樣(按照下文21.7節(jié))并進(jìn)行如前面實(shí)施例8所述的分子表征，確定這10個(gè)事件中的7個(gè)包含AAD-12(v1)PTU和全部AHAS編碼區(qū)。21.5-AAD-12(v1)在T1稻中的遺傳力包含AAD-12(v1)PTU和AHAS編碼區(qū)的AAD-12(v1)株系里的5個(gè)T1株系進(jìn)行100個(gè)植物子代測(cè)試。按照上文方法種植種子并如前所述使用履帶式噴霧機(jī)噴灑140gae/ha咪草煙。14DAT之后，對(duì)抗性和敏感植物計(jì)數(shù)。5個(gè)測(cè)試株系中的2個(gè)作為單個(gè)基因座分離，用卡方分析確定顯性孟德爾性狀(3R：1S)。AAD-12與AHAS選擇標(biāo)記物共分離，這由下文2，4-滴耐性測(cè)試確定。21.6-T1稻中高2，4-滴耐性的驗(yàn)證。將以下T1AAD-12(v1)單個(gè)分離基因座株系，即pDAB4101(20)003和pDAB4101(27)002種植到含有MetroMix培養(yǎng)基的3英寸盆中。在2-3葉期用140gae/ha咪草煙噴灑。消除無(wú)效事件，在V3-V4期用設(shè)置為187L/ha的履帶式噴霧器向個(gè)體噴灑1120、2240或4480gae/ha2，4-滴二甲胺鹽(分別2、4和8倍于一般商業(yè)用量)。在7和14DAT對(duì)植物分級(jí)，并與作為陰性對(duì)照植物的未轉(zhuǎn)化商業(yè)稻品種‘Lamont’作比較。損傷數(shù)據(jù)(表27)顯示AAD-12(v1)轉(zhuǎn)化株系對(duì)高劑量2，4-滴二甲胺鹽的耐性比未轉(zhuǎn)化對(duì)照強(qiáng)。pDAB4101(20)003株系對(duì)高水平2，4-滴的耐性比pDAB4101(27)002株系強(qiáng)。數(shù)據(jù)還表明2，4-滴耐性對(duì)至少兩代穩(wěn)定。21.7-組織收獲、DNA分離和定量。將新鮮組織置于管中并在4℃凍干兩天。組織完全干燥后，將鎢珠(Valenite)放進(jìn)管中并使用Kelco玻珠研磨機(jī)將樣品干磨1分鐘。其后遵循標(biāo)準(zhǔn)DNeasyDNA分離方案(Qiagen，DNeasy69109)。將提取的DNA的等分試樣用PicoGreen(MolecularProbesP7589)染色并與已知標(biāo)準(zhǔn)品一起在熒光計(jì)(BioTek)中掃描，以得到以ng/μl計(jì)的濃度。21.8-AAD-12(v1)表達(dá)。樣本準(zhǔn)備和分析條件如前述。使用ELISA印跡對(duì)所有33個(gè)T0轉(zhuǎn)基因稻株系和1個(gè)非轉(zhuǎn)基因?qū)φ辗治鯝AD-12表達(dá)。在20個(gè)株系克隆中檢測(cè)到AAD-12，但是在株系臺(tái)北309對(duì)照植物中沒(méi)有檢測(cè)到。具有一些對(duì)咪草煙耐性克隆的20個(gè)株系中的12個(gè)表達(dá)AAD-12蛋白，AAD-12PCRPTU陽(yáng)性和AHAS編碼區(qū)陽(yáng)性。表達(dá)水平的范圍是總可溶性蛋白質(zhì)的2.3至1092.4ppm。21.9-pDAB4101稻植物對(duì)2，4-滴和綠草定除草劑的大田耐性。在密西西比州的Wayside，用AAD-12(v1)事件pDAB4101[20]和一個(gè)野生型稻(Clearfield131)(非轉(zhuǎn)基因咪唑啉酮抗性品種)進(jìn)行大田水平耐性試驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)是單個(gè)重復(fù)的隨機(jī)完全區(qū)組設(shè)計(jì)。除草劑處理是以2240gae/ha使用的2倍劑量的2，4-滴(二甲胺鹽)和以560gae/ha使用的綠草定加上未處理的對(duì)照。在每個(gè)除草劑處理中，使用小區(qū)播種機(jī)以8英寸行間距種植兩行T1代pDAB4101[20]和兩行Clearfield稻。pDAB4101[20]稻包含AHAS基因作為AAD-12(v1)基因的選擇標(biāo)記物。在1葉期使用咪草煙作為選擇劑以去除區(qū)中任一AAD-12(v1)無(wú)效植物。當(dāng)?shù)具_(dá)到2葉期，使用以130-200kpa壓力遞送187L/ha載體體積的壓縮空氣背包式噴霧器進(jìn)行除草劑處理。在應(yīng)用后7、14和21天進(jìn)行目測(cè)損傷評(píng)估。表28顯示AAD-12(v1)事件對(duì)2，4-滴和綠草定的應(yīng)答。以2240gae/ha使用(被認(rèn)為4倍于商業(yè)用量)的2，4-滴嚴(yán)重?fù)p傷非轉(zhuǎn)化稻株系(Clearfield)(30％在7DAT和35％在15DAT)。AAD-12(v1)事件在7或15DAT沒(méi)有觀察到損傷，證明對(duì)2，4-滴的優(yōu)良耐性。2倍劑量的綠草定(560gae/ha)顯著損傷非轉(zhuǎn)化稻(15％在7DAT和25％在15DAT)。AAD-12(v1)事件在7或15DAT沒(méi)有觀察到損傷，證明對(duì)2倍劑量綠草定的優(yōu)良耐性。這些結(jié)果表明AAD-12(v1)轉(zhuǎn)化稻表現(xiàn)出對(duì)2，4-滴和綠草定(在引起Clearfield稻嚴(yán)重目測(cè)損傷時(shí)的劑量)高水平的抗性。還證明在多種物種中AAD-12疊加多種除草劑耐性基因的能力以提供對(duì)廣譜有效化學(xué)品的抗性。實(shí)施例22-蕓苔中的AAD-12(v1)22.1-蕓苔轉(zhuǎn)化。用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化和質(zhì)粒pDAB3759，將賦予對(duì)2，4-滴抗性的AAD-12(v1)基因轉(zhuǎn)化歐洲油菜Nexera＊710變種(Brassicanapusvar.Nexera＊710)。構(gòu)建體含有CsVMV啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的AAD-12(v1)基因和AtUbi10啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的PAT基因，以及AtUbi10啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的EPSPS草甘膦抗性性狀(參閱2.4節(jié))。用10％商品漂白劑對(duì)種子進(jìn)行10分鐘表面滅菌并用無(wú)菌蒸餾水洗滌3次。然后將種子置于半濃度MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基(Murashige和Skoog，1962)上并在設(shè)置為25℃和16小時(shí)光照/8小時(shí)黑暗的光周期的生長(zhǎng)方案下維持。從5-7天齡的幼苗上切下下胚軸段(3-5mm)并置于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基K1D1(含1mg/L激動(dòng)素和1mg/L2，4-滴的MS培養(yǎng)基)上3天作為預(yù)處理。接著將下胚軸段轉(zhuǎn)移進(jìn)皮氏平板，用含有pDAB3759的農(nóng)桿菌Z707S或LBA4404菌株處理。農(nóng)桿菌在28℃黑暗中150rpm的振蕩器上過(guò)夜培養(yǎng)，并接著重懸于培養(yǎng)基中。用農(nóng)桿菌處理下胚軸段30分鐘后，將其放回愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基3天。共培養(yǎng)之后將片段置于K1D1TC(含有250mg/L羧芐青霉素和300mg/L特美汀的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基)恢復(fù)1周或2周?；蛘?，直接將下胚軸段置于選擇培養(yǎng)基K1D1H1(帶有1mg/L好必思(Herbiace)的上文培養(yǎng)基)。羧芐青霉素和特美汀是用于殺死農(nóng)桿菌的抗生素。選擇劑好必思允許轉(zhuǎn)化細(xì)胞生長(zhǎng)。接著將形成愈傷組織的下胚軸段置于B3Z1H1(MS培養(yǎng)基、3mg/L芐氨基嘌呤、1mg/L玉米醇溶蛋白、0.5mg/LMES[2-(N-嗎啉代)乙磺酸]，5mg/L硝酸銀、1mg/L好必思、羧芐青霉素和特美汀)芽再生培養(yǎng)基。2-3周后芽開始再生。將下胚軸片段與芽一起轉(zhuǎn)移到B3Z1H3培養(yǎng)基(MS培養(yǎng)基、3mg/L芐氨基嘌呤、1mg/L玉米醇溶蛋白、0.5mg/LMES[2-(N-嗎啉代)乙磺酸]、5mg/L硝酸銀、3mg/L好必思、羧芐青霉素和特美汀)再過(guò)三周。從下胚軸片段上剪下芽并轉(zhuǎn)移到芽伸長(zhǎng)培養(yǎng)基MESH5或MESH10(MS、0.5mg/LMES、5或10mg/L好必思、羧芐青霉素、特美汀)上2-4周。將伸長(zhǎng)的芽在MSI.1(含0.1mg/L吲哚丁酸的MS)上進(jìn)行根誘導(dǎo)培養(yǎng)。待植物具有良好建立的根系時(shí)將其移植到土壤中。轉(zhuǎn)移到溫室之前，植物在Conviron中受控環(huán)境條件下適應(yīng)1-2周。22.2-分子分析：蕓苔材料和方法22.2.1-組織收獲的DNA的分離和定量。將新鮮組織置于管中并在4℃凍干兩天。組織完全干燥后，將鎢珠(Valenite)放進(jìn)管中并使用Kelco玻珠研磨機(jī)將樣品干磨1分鐘。其后遵循標(biāo)準(zhǔn)DNeasyDNA分離方案(Qiagen，DNeasy69109)。將提取的DNA的等分試樣用PicoGreen(MolecularProbesP7589)染色并與已知標(biāo)準(zhǔn)品一起在熒光計(jì)(BioTek)中讀數(shù)，以得到以ng/μl計(jì)的濃度。22.2.2-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。用總計(jì)100ng的總DNA作為模板。使用20mM每種引物和TakaraExTaqPCR聚合酶試劑盒(MirusTAKRR001A)。用于AAD-12(v1)編碼區(qū)PCR的引物為(SEQIDNO：10)(正向)和(SEQIDNO：11)(反向)。在9700Geneamp熱循環(huán)儀(AppliedBiosystems)中進(jìn)行PCR反應(yīng)：將樣品置于94℃3分鐘，94℃30秒、65℃30秒、72℃2分鐘的35個(gè)循環(huán)和其后72℃10分鐘。通過(guò)在1％瓊脂糖凝膠上電泳、溴化乙啶染色來(lái)分析PCR產(chǎn)物。來(lái)自35株含AAD-12(v1)事件植物的35個(gè)樣品測(cè)試為陽(yáng)性。三個(gè)陰性對(duì)照樣品測(cè)試為陰性。22.2.3-ELISA。使用先前章節(jié)所述已建立的ELISA在5個(gè)不同蕓苔轉(zhuǎn)化植物事件中檢測(cè)AAD-12蛋白。表達(dá)水平范圍從總可溶蛋白(TSP)的14到超過(guò)700ppm。平行測(cè)試的三個(gè)不同的未轉(zhuǎn)化植物樣品未檢測(cè)到信號(hào)，表明該測(cè)定中使用的抗體與蕓苔細(xì)胞基質(zhì)具有最小的交叉反應(yīng)性。通過(guò)Western分析這些樣品也證實(shí)為陽(yáng)性。結(jié)果概括于表29。22.4-AAD-12(v1)轉(zhuǎn)化T0蕓苔的出苗后除草劑耐性。將來(lái)自于構(gòu)建體pDAB3759轉(zhuǎn)化事件中的45個(gè)T0事件送到溫室并允許其在溫室中適應(yīng)一段時(shí)間。植物生長(zhǎng)直到出現(xiàn)2-4個(gè)新的、有正常外觀的葉子(即植物從組織培養(yǎng)轉(zhuǎn)換到溫室生長(zhǎng)條件)。然后用致死劑量的2，4-滴胺4商業(yè)制劑(560gae/ha劑量)處理植物。使用履帶式噴霧器以187L/ha噴霧體積、50-cm噴霧高度應(yīng)用除草劑。將引起未轉(zhuǎn)化對(duì)照＞95％損傷時(shí)的劑量定義為致死劑量。24個(gè)事件對(duì)應(yīng)用2，4-D二甲胺鹽除草劑耐性。一些事件確實(shí)遭受小損傷但是在14DAT恢復(fù)。在可控制的袋栽條件下，事件通過(guò)自花授粉進(jìn)行到T1(和T2代)。22.5-蕓苔中的AAD-12(V1)遺傳性。還對(duì)11個(gè)AAD-12(v1)T1株系進(jìn)行100個(gè)植物子代測(cè)試。播種種子并移植到充滿MetroMix培養(yǎng)基的3英寸盆中。接著如前述用560gae/ha2，4-滴二甲胺鹽噴灑所有的植物。14DAT之后，對(duì)抗性和敏感植物進(jìn)行計(jì)數(shù)。測(cè)試的11個(gè)株系中的7個(gè)作為單基因座分離，用卡方分析確定顯性孟德爾性狀(3R：1S)。AAD-12作為強(qiáng)芳氧基鏈烷酸酯生長(zhǎng)素抗性基因在多種物種中遺傳并能與一種或多種其他除草劑抗性基因疊加。22.6-T1蕓苔中高2，4-滴耐性的驗(yàn)證。對(duì)于T1AAD-12(v1)，將5-6mg的種子層積、播種并且加入一薄層SunshineMix#5培養(yǎng)基作為土壤的頂層。在種植后7和13天，用560gae/ha2，4-滴選擇冒出的植物。存活的植物移植到含有MetroMix培養(yǎng)基的3英寸盆中。用560gae/ha2，4-滴選擇的來(lái)自于T1子代的存活植物還移植到充滿MetroMix土壤的3英寸盆中。在2-4葉期，用280、560、1120或2240gae/ha2，4-滴二甲胺鹽噴灑植物。在3和14DAT對(duì)植物分級(jí)并與未轉(zhuǎn)化對(duì)照植物進(jìn)行比較。表30可見14DATT1事件抽樣的損傷數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)表明多種事件對(duì)2240gae/ha2，4-滴強(qiáng)抗性，而其它事件表明對(duì)1120gae/ha2，4-滴的次強(qiáng)耐性。存活的植物移植到包含MetroMix培養(yǎng)基的51/4”盆中并置于與以前相同的生長(zhǎng)條件下，且自花授粉只產(chǎn)生純合種子。表30.T1AAD-12(v1)和未轉(zhuǎn)化對(duì)照對(duì)出苗后應(yīng)用不同劑量2，4-滴二甲胺鹽的應(yīng)答。22.7-pDAB3759蕓苔植物對(duì)2，4-滴、2，4-滴丙酸、綠草定和氟草煙除草劑的大田耐性。在印地安納州的Fowler，對(duì)兩個(gè)AAD-12(v1)事件3759(20)018.001和3759(18)030.001以及一個(gè)野生型蕓苔(Nex710)進(jìn)行大田水平耐性試驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)是3次重復(fù)的隨機(jī)完全區(qū)組設(shè)計(jì)。除草劑處理包括以280、560、1120、2240和4480gae/ha使用的2，4-滴(二甲胺鹽)、以840gae/ha使用的綠草定、以280gae/ha使用的氟草煙和未處理對(duì)照。在每個(gè)除草劑處理中，在8英寸行間距上以四行播種機(jī)種植單20ft行/事件的事件3759(18)030.0011、3759(18)018.001和野生型株系(Nex710)。當(dāng)蕓苔達(dá)到4-6葉期，使用以130-200kpa壓力遞送187L/ha載體體積的壓縮空氣背包式噴霧器進(jìn)行除草劑處理。在應(yīng)用后7、14和21天進(jìn)行目測(cè)損傷評(píng)估。表31顯示蕓苔對(duì)2，4-滴、綠草定和氟草煙的應(yīng)答。以2240gae/ha使用(被認(rèn)為4倍劑量)的2，4-滴嚴(yán)重?fù)p傷野生型蕓苔(Nex710)(72％在14DAT)。AAD-12(v1)事件在14DAT分別在1、2和4倍劑量的2，4-滴應(yīng)用中觀察到平均2、3和2％的損傷，均證明其對(duì)2，4-滴的優(yōu)良耐性。2倍劑量的綠草定(840gae/ha)嚴(yán)重?fù)p傷野生型蕓苔(25％在14DAT)。AAD-12(v1)事件證明在兩個(gè)事件中在14DAT對(duì)2倍劑量綠草定(平均6％損傷)的耐性。在14DAT以280gae/ha使用的氟草煙引起非轉(zhuǎn)化株系嚴(yán)重的損傷(37％)。AAD-12(v1)事件證明在5DAT其對(duì)氟草煙(平均8％損傷)增加的耐性。這些結(jié)果表明AAD-12(v1)轉(zhuǎn)化事件表現(xiàn)出對(duì)2，4-滴、綠草定和氟草煙(在致死或引起非轉(zhuǎn)化蕓苔嚴(yán)重偏上性畸形時(shí)的用量)高水平的抗性。顯示AAD-12具有2，4-滴＞綠草定＞氟草煙的相對(duì)功效。每一列帶有不同字母的平均值，由LSD定義為顯著性差異(p＝0.05)。實(shí)施例23-在任意作物中AAD-12(v1)與昆蟲抗性(IR)或其他輸入性狀疊加作物中由轉(zhuǎn)基因性狀提供的昆蟲抗性在北美及全球的玉米和棉花產(chǎn)品中是普遍的。多家種子公司已開發(fā)具有聯(lián)合IR和HT性狀的商業(yè)產(chǎn)品。這些包括BtIR性狀(如在網(wǎng)址lifesci.sussex.ac.uk列出的Bt毒素，2006)和任一或所有上文提到的HTC性狀。這種性狀提供帶來(lái)的價(jià)值是通過(guò)單次性狀提供的遺傳方法控制多種害蟲問(wèn)題的能力。如果雜草控制和昆蟲控制彼此獨(dú)立完成，這種性狀提供的便利性將受到限制。單獨(dú)或與一個(gè)或多個(gè)其他HTC性狀疊加的AAD-12(v1)，通過(guò)常規(guī)育種或共同作為新的轉(zhuǎn)化事件，能與一個(gè)或多個(gè)其他輸入性狀(如昆蟲抗性、真菌抗性或脅迫耐受性等)(isb.vt.edu/cfdocs/fieldtests1.cfm，2005)疊加。除了由AAD-12提供的改良的雜草控制和相關(guān)的除草劑耐性之外，益處包括上文實(shí)施例15-20所述的便利性和靈活性，以及控制昆蟲害蟲和/或其他農(nóng)事脅迫的能力。因此，本發(fā)明可用于提供完整的改良作物品質(zhì)的農(nóng)事工具包，其具有靈活和低本高效控制許多農(nóng)事問(wèn)題的能力。IR和HT的聯(lián)合性狀應(yīng)用于大部分的農(nóng)事和園藝/觀賞性作物以及林業(yè)。AAD-12和它相稱的除草劑耐性的聯(lián)合以及任意數(shù)量的Bt或非BtIR基因給予的昆蟲抗性可應(yīng)用到實(shí)施例13列出的作物種類(但不局限于此)。雜草控制領(lǐng)域的技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到AAD-12(v1)轉(zhuǎn)化和通過(guò)常規(guī)育種或基因工程與相應(yīng)的HT性狀或IR性狀疊加，使之能夠利用單獨(dú)或多種組合的任何在實(shí)施例18-20中描述的多種商業(yè)除草劑、苯氧乙酸或吡啶氧乙酸類植物生長(zhǎng)素除草劑。這些化學(xué)品的其他除草劑代表的具體用量由CPR《作物保護(hù)參考》書或相似的編輯物匯編的除草劑說(shuō)明、在線匯編的說(shuō)明(如cdms.net/manuf/manuf.asp)或任何商業(yè)或?qū)W術(shù)作物保護(hù)指南(如Agriliance的《作物保護(hù)指南》(2005))確定。通過(guò)AAD-12(v1)，能在HTC中使用(不管單獨(dú)使用、罐混還是相繼使用)的每種可選的除草劑，被認(rèn)為在本發(fā)明范圍內(nèi)。實(shí)施例24-AAD-12(v1)作為體外雙子葉植物的選擇標(biāo)記物使用合適的遞送方法將目的基因插入植物細(xì)胞的過(guò)程起始植物細(xì)胞、組織、器官和植物或細(xì)胞器(如質(zhì)粒)的遺傳改造。然而，當(dāng)基因遞送進(jìn)入植物細(xì)胞中，只有極少百分比的細(xì)胞將異源基因整合到其基因組中。為了選擇這些已整合了目的基因的少數(shù)細(xì)胞，研究人員將可選擇或篩選的“標(biāo)記基因”與載體中的目的基因(GOI)連接。含有這些標(biāo)記的細(xì)胞可從遞入DNA質(zhì)粒載體的全體細(xì)胞群/組織中鑒定出來(lái)。通過(guò)選擇那些表達(dá)標(biāo)記基因的細(xì)胞，研究人員能鑒定可能將GOI整合進(jìn)其基因組的少數(shù)細(xì)胞。有多種選擇標(biāo)記用于對(duì)得到轉(zhuǎn)基因的細(xì)胞、愈傷組織、胚胎、芽和苗進(jìn)行選擇。農(nóng)業(yè)上優(yōu)選的選擇標(biāo)記是除草劑標(biāo)記，在大田位置進(jìn)行分選事件的過(guò)程中，其允許在大田中易于噴灑化合物來(lái)選擇正確的轉(zhuǎn)基因子代。已表明AAD-12(v1)可有效作為選擇標(biāo)記物(以2，4-滴作為選擇試劑)用于溫室和培養(yǎng)箱(實(shí)施例7)中被該基因轉(zhuǎn)化的整株植物。使用2，4-滴聯(lián)合AAD-12(v1)基因進(jìn)行大田選擇也是有可能的(實(shí)施例11、22)，但是事實(shí)上由于2，4-滴作為植物生長(zhǎng)調(diào)控因子，在植物組織培養(yǎng)系統(tǒng)中被幾乎廣泛使用，因此在體外使用2，4-滴用于細(xì)胞水平的選擇是復(fù)雜的。AAD-12(v1)對(duì)這種重要激素的降解能影響利用該基因作為體外選擇標(biāo)記物的能力。發(fā)展2，4-滴作為標(biāo)記物基因的成功依賴于確定正確的替代的植物生長(zhǎng)調(diào)控因子，其能模擬2，4-滴在相應(yīng)培養(yǎng)系統(tǒng)中的作用，并同時(shí)具有穩(wěn)定的能力且不被在轉(zhuǎn)基因細(xì)胞中表達(dá)的AAD-12酶降解。R-2，4-滴丙酸是與2，4-滴接近的類似物，其不是AAD-12(v1)的底物，并且在煙草細(xì)胞培養(yǎng)物中用作非代謝植物生長(zhǎng)素的替代物，允許2，4-滴作為選擇試劑大量使用。此事實(shí)用于示例AAD-12(v1)能作為體外選擇標(biāo)記物使用。24.1-細(xì)胞培養(yǎng)-備選的植物生長(zhǎng)素。AAD-12(v1)降解2，4-滴，卻不降解R-2，4-二氯苯氧基丙酸(R-2，4-滴丙酸)，其同時(shí)具有植物生長(zhǎng)素生長(zhǎng)調(diào)控因子必需的結(jié)構(gòu)?？捎糜诩?xì)胞培養(yǎng)的其他非代謝植物生長(zhǎng)素模擬物包括NAA(萘乙酸)、IAA(吲哚乙酸)、麥草畏、毒莠定和R-2-甲-4-氯丙酸。研究是否可能替代R-2，4-滴丙酸并成功維持兩種不同的煙草細(xì)胞培養(yǎng)物PHL(PetiteHavanna)和BY2懸液。相反，對(duì)于棉花外植體，R-2，4-滴丙酸、麥草畏和毒莠定作為備選的植物生長(zhǎng)素進(jìn)行測(cè)試，并且相比于標(biāo)準(zhǔn)生長(zhǎng)調(diào)控因子2，4-滴，評(píng)測(cè)胚性愈傷組織誘導(dǎo)應(yīng)答。在這些實(shí)驗(yàn)中使用PetiteHavana煙草(PHL)和Coker棉花子葉。24.1.1-煙草細(xì)胞懸液-2，4-滴作為選擇試劑。用R-2，4-滴丙酸馴化的PHL細(xì)胞和R-2，4-滴丙酸馴化的BY2細(xì)胞進(jìn)行劑量應(yīng)答研究，其中R-2，4-滴丙酸直接代替培養(yǎng)基中的2，4-滴。盡管焦點(diǎn)在PHL，也對(duì)BY2進(jìn)行了劑量應(yīng)答應(yīng)答，以備將來(lái)研究之用，并輔助預(yù)測(cè)PHL的劑量應(yīng)答。對(duì)于2，4-滴丙酸馴化的PHL劑量應(yīng)答，2，4-滴使用水平(在有R-2，4-滴丙酸的LSBY2C培養(yǎng)基上)是0(對(duì)照)、1、2、3、5、8、10、12、15、18、20、40、60、80、100、110、120mg/L2，4-滴。每個(gè)濃度有4個(gè)重復(fù)。對(duì)于2，4-滴丙酸馴化的BY2劑量應(yīng)答，2，4-滴使用水平(在LSBY2C培養(yǎng)基上)是0(對(duì)照)、1、2、3、5、8、10、20、30、40mg/L2，4-滴。進(jìn)行的劑量應(yīng)答表明2，4-滴測(cè)試的10mg/L濃度之上的所有濃度是致死的。然而，在至高達(dá)10mg/L2，4-滴的所有濃度中有生長(zhǎng)，其中觀察到PHL懸液輕微的生長(zhǎng)。來(lái)自1-8mg/L2，4-滴濃度的懸液集落的生長(zhǎng)可比得上對(duì)照處理中的生長(zhǎng)。除了發(fā)現(xiàn)10mg/L濃度是致死的和亞致死濃度是8mg/L濃度，BY2懸液細(xì)胞進(jìn)行的觀察是相似的。24.1.2-用AAD-12(v1)轉(zhuǎn)化煙草細(xì)胞和2，4-滴選擇。對(duì)于煙草轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，總共有11個(gè)處理：對(duì)照組涂平板于LS-BY2C+2，4-滴丙酸培養(yǎng)基和10組LSBY2C+2，4-滴丙酸+2，4-滴(在不同的濃度水平(1、2、3、5、8、10、12、15、18、20mg/L))。每次處理有4個(gè)重復(fù)。使用的質(zhì)粒DNA載體pDAB724，用于轉(zhuǎn)化的載體是根癌農(nóng)桿菌EHA101S菌株。4mlOD660為0.6的PHL懸液與100μlOD660為1.0的農(nóng)桿菌(EHA101或LBA4404菌株)懸液在無(wú)菌皮氏板中混合并徹底混合，在黑培養(yǎng)箱中非振蕩條件下25℃共培養(yǎng)3天。共培養(yǎng)期之后，將1.5ml農(nóng)桿菌-煙草懸液混合物涂布到上述11組平板中。用13種處理重復(fù)實(shí)驗(yàn)：LS-BY2C+2，4-滴丙酸培養(yǎng)基(無(wú)2，4-滴)的對(duì)照和LS-BY2C+2，4-滴丙酸+2，4-滴(1、2、3、5、8、10、12、15、18、20mg/L)；LSBY2C+1mg/L2，4-滴+B10(Bialophos)；LSBY2C+102，4-滴+B10+R-2，4-滴丙酸。此外，每次處理有4個(gè)重復(fù)，以及陽(yáng)性和陰性對(duì)照。所有的培養(yǎng)基包含500mg/L羧芐青霉素(C)以控制選擇培養(yǎng)基中含有的農(nóng)桿菌生長(zhǎng)。這些實(shí)驗(yàn)中使用的質(zhì)粒是pDAB724并且它還有PAT選擇標(biāo)記。因此，遵循上文所述的標(biāo)準(zhǔn)方法，存在10mg/Lbialophos的條件下，使用R-2，4-滴丙酸馴化的PHL起始對(duì)照轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。4個(gè)重復(fù)平行進(jìn)行處理來(lái)看在這些懸液中bialophos選擇是否正常。在所有10mg/L之上的2，4-滴測(cè)試選擇濃度中，觀察到很少的生長(zhǎng)；然而在2、5和8mg/L2，4-滴濃度中發(fā)現(xiàn)許多快速生長(zhǎng)的集落，并將代表性樣品轉(zhuǎn)移到新鮮的選擇(10mg/L選擇濃度)平板中使愈傷組織膨大。同樣，從12、15、18和20mg/L2，4-滴中挑選一些推斷的菌落，但是當(dāng)與10mg/L相比，在這些選擇平板上僅有很少的菌落。用bialophos選擇進(jìn)行的對(duì)照處理顯示正常集落發(fā)展。發(fā)現(xiàn)10mg/L2，4-滴是亞致死并且超過(guò)這個(gè)濃度，2，4-滴表現(xiàn)出對(duì)非轉(zhuǎn)化細(xì)胞致死。將所有鑒定的集落轉(zhuǎn)移至含10mg/L選擇劑的新鮮培養(yǎng)基中，并用實(shí)施例10所述的PCR探測(cè)轉(zhuǎn)基因的存在。選擇的和膨大的集落具有用PCR確定的轉(zhuǎn)基因，并且Western分析(如實(shí)施例10所述)確定基因的表達(dá)。將鑒定為活躍生長(zhǎng)的一些集落轉(zhuǎn)移到含10mg/L2，4-滴的新鮮選擇培養(yǎng)基中膨大愈傷組織。然后將膨大的愈傷組織轉(zhuǎn)移到更高水平的2，4-滴中以測(cè)試體外的耐性水平。使用的2，4-滴水平是20、40、60、80、100和120mg/L2，4-滴。然而超過(guò)20mg/L2，4-滴的濃度愈傷組織不生長(zhǎng)，表明可能存在高于20mg/L的閾值濃度。24.2.1-棉花外植體-植物生長(zhǎng)素備選起始劑量應(yīng)答研究來(lái)測(cè)試作為2，4-滴(作為生長(zhǎng)調(diào)控因子)在棉花中用途的替代的多個(gè)植物生長(zhǎng)素代替物。測(cè)試的替代植物生長(zhǎng)素是2，4-滴丙酸、麥草畏和毒莠定。這些化合物分別在0.2、2.0和20.0μM濃度進(jìn)行測(cè)試。0.02μM濃度的2，4-滴用于對(duì)照處理。使用的培養(yǎng)基是用于棉花愈傷組織誘導(dǎo)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基(實(shí)施例12)。培養(yǎng)初期之后，植物生長(zhǎng)素從培養(yǎng)基中去除來(lái)促使組織轉(zhuǎn)向再生過(guò)程。R-2，4-滴丙酸在子葉節(jié)段的愈傷組織誘導(dǎo)中無(wú)效，并且在最低測(cè)試濃度(0.02μM)表現(xiàn)出對(duì)棉花細(xì)胞的毒性。麥草畏在所有測(cè)試濃度(0.02-20μM)有效誘導(dǎo)愈傷組織生長(zhǎng)并且在這個(gè)濃度范圍內(nèi)沒(méi)有明顯的毒性作用。用0.2μM至20μM的毒莠定處理外植體時(shí)，增至最大濃度的毒莠定誘導(dǎo)愈傷組織。在2μM毒莠定濃度的愈傷組織質(zhì)量和標(biāo)準(zhǔn)2，4-滴處理一致。在最高濃度(20μM)2，4-滴也抑制棉花愈傷組織產(chǎn)生和生長(zhǎng)。棉花已顯示有效應(yīng)答培養(yǎng)物中(2，4-滴)備選植物生長(zhǎng)素的最初能力。在足夠高的濃度，2，4-滴對(duì)棉花子葉外植體有毒性。R-2，4-滴丙酸比2，4-滴或其他植物生長(zhǎng)素對(duì)棉花有令人驚奇地更顯著的毒性。2，4-滴可作為選擇劑與作為選擇標(biāo)記物基因的AAD-12(v1)聯(lián)合使用。其他的非代謝植物生長(zhǎng)素代替品(如麥草畏、毒莠定、R-2-甲-4-氯丙酸、NAA或IAA)允許AAD-12作為選擇標(biāo)記物和作為選擇試劑的2，4-滴在雙子葉植物中使用。參考文獻(xiàn)Adang，M.J.，M.J.Staver，T.A.Rocheleau，J.Leighton，R.E.Barker和D.V.Thompson.1985.Characterizedfull-lengthandtruncatedplasmidclonesofthecrystalproteinofBacillusthuringiensissubspkurstakiHD-73andtheirtoxicitytoManducasexta.Gene36：289-300.AgrilianceCropProtectionGuide.2005.Agriliance，LLC.StPaul，MN.614頁(yè)Altschul，S.F.，W.Gish，W.Miller，E.W.Myers和D.J.Lipman.1990.Basiclocalalighmentsearchtool.J.Mol.Biol.215：403-410.Altschul，S.F.，T.L.Madden，A.A.Schaffer，J.Zhang，Z，Zhang，W.Miller和D.J.Lipman.1997.GappedBLASTandPSIBLAST：anewgenerationofproteindatabasesearchprograms.Nucl.AcidsRes.25：3389-3402.An，G.，B.D.Watson，S.Stachel，M.P.Gordon，E.W.Nester.1985.Newcloningvehiclesfortransformationofhigherplants.EMBOJ.4：277-284.ArmstrongC.L.，C.E.Green，R.L.Phillips.1991.DevelopmentandavailabilityofgermplasmwithhighTypeIIcultureformationresponse.MaizeGenetCoopNewsLett65：92-93.Beltz，G.A.，K.A.Jacobs，T.H.Eickbush，P.T.Cherbas和F.C.Kafatos.1983MethodsofEnzymology，R.Wu，L.GrossmanandK.Moldave[eds.]AcademicPress，NewYork100：266-285BirchR.G.和T.Franks.1991.Developmentandoptimizationofmicroprojectilesystemsforplantgenetictransformation.Aust.J.PlantPhysiol.18：453-469.CDMS.CropDataManagementSystemsLabelsandMSDS.Online.Internet.March13，2004.Availableatnet/manuf/manuf.asp.CheeP.P.，K.A.Fober，J.L.Slightom.1989.Transformationofsoybean(Glycinemax)byinfectinggerminatingseedswithAgrobacteriumtumefaciens.PlantPhysiol.91：1212-1218.ChengM.，J.E.Fry，S.Pang，H.Zhou，C.M.Hironaka，D.R.Duncan，T.W.Conner和Y.Wan.1997.GenetictransformationofwheatmediatedbyAgrobacteriumtumefaciens.PlantPhysiol115：971-980.ChuC.C.，C.C.Wang，C.S.Sun，C.Hsu，K.C.Yin，C.Y.Chu，F(xiàn).Y.Bi.1975.Establishmentofanefficientmediumforanthercultureofricethroughcomparativeexperimentsonthenitrogensources.Sci.Sinica18：659-668.ClementeT.E.，B.J.LaVallee，A.R.Howe，D.Conner-Ward，R.J.Rozman，P.E.Hunter，D.L.Broyles，D.S.Kasten，M.A.Hinchee.2000.ProgenyanalysisofglyphosateselectedtransgenicsoybeansderivedfromAgrobacterium-mediatedtransformation.CropSci40：797-803.CPR：CropProtectionReference.2005ChemicalandPharmaceuticalPress，NewYork，NY.2647頁(yè)Devine，M.D.2005.Whyaretherenotmoreherbicide-tolerantcrops？PestManag.Sci.61：312-317.Dietrich，GabrieleElfriede(1998)ImidazolinoneresistantAHASmutants.U.S.Patent5，731，180.DidierjeanL，L.Gondet，R.Perkins，S.M.Lau，H.Schaller，D.P.O′Keefe，D.Werck-Reichhart.2002.EngineeringHerbicideMetabolisminTobaccoandArabidopsiswithCYP76B1，aCytochromeP450EnzymefromJerusalemArtichoke.PlantPhysiol2002，130：179-189.Ditta，G.S.Stranfield，D.Corbin和D.R.Helinski.1980.BroadhostrangeDNAcloningsystemforGram-negativebacteria：ConstructionofagenebankofRhizobiumleliloti.PNAS77：7347-7351.Edwards，R.A.，L.H.Keller和D.M.Schifferli.1998.Improvedallelicexchangevectorsandtheirusetoanalyze987Pfimbriageneexpression.Gene207：149-157.El-ShemyA，M.Teraishi，M.Khalafalla，T.Katsube-Tanaka，S.Utsumi，M.Ishimoto.2004.IsolationofsoybeanplantswithstabletransgeneexpressionbyvisualselectionbasedongreenfluorescentproteinMolecularBreeding14：227-238.El-ShemyA，M.Khalafalla，K.Fujita，M.Ishimoto.2006.Molecularcontrolofgeneco-suppressionoftransgenicsoybean.J.Biochem.andMole.Biol.39：61-67.FalcoS.C.，T.Guida，M.Locke，J.Mauvais，C.Sanders，R.T.Ward，P.Webber.1995.Transgeniccanolaandsoybeanseedswithincreasedlysine.Bio/Technology13：577-582.FinerJ.和M.McMullen.1991.Transformationofsoybeanviaparticlebombardmentofembryogenicsuspensionculturetissue.InVitroCell.Dev.Biol.27P：175-182.Fraley，R.T.，D.G.Rogers和R.B.Horsch.1986.Genetictransformationinhigherplants.Crit.Rev.PlantSci.4：1-46.FrameB.R.，P.R.Drayton，S.V.Bagnall，C.J.Lewnau，W.P.Bullock，H.M.Wilson，J.M.Dunwell，J.A.Thompson和K.Wang.1994.Productionoffertilemaizeplantsbysiliconcarbidewhisker-mediatedtransformation.PlantJ.6：941-948.Fukumori，F(xiàn).和R.P.Hausinger.1993.Purificationandcharacterizationof2，4-dichlorophenoxyacetate/α-ketoglutaratedioxygenase.J.Biol.Chem.268：24311-24317.Gamborg，O.L.，R.A.Miller和K.Ojima.1968.Nutirentrequirementsofsuspensionsofculturesofsoybeanrootcells.Exp.CellRes.50：151-158.Gay，P.，D.LeCoq，M.Steinmetz，E.Ferrari和J.A.Hoch.1983.CloningstmcturalgenesacB，whichcodesforexoenzymelevansucraseofBacillussubtilis：expressionofthegeneinEschericiacoli.J.Bacteriol.153：1424-1431.Gianessi，L.R.2005EconomicandherbicideuseimpactsofglyPhosate-resistantcrops.Pest.Manag.Sci.61：241-245.Heap，I.TheInternationalSurveyofHerbicideResistantWeeds.Online.Internet.March18，2005.Availableatweedscience.com.HieiY.，T.Komari和T.Kubo.1997.TranformationofricemediatedbyAgrobacteriumtumefaciens，PlantMol.Biol.35：205-218.Hiei，Y.，T.Komari(1997)MethodforTransformingMonocotyledons.U.S.Patent5，591，616.HincheeM.A.W.，D.V.Conner-Ward，C.A.Newell，R.E.McDonnell，S.J.Sato，C.S.Gasser，D.A.Fischhoff，D.B.Re，R.T.Fraley，R.B.Horsch.1988.ProductionoftransgenicsoybeanplantsusingAgrobacterium-mediatedDNAtransfer.Bio/Technology6：915-922.H.和H.R.Whiteley.1989.InsecticidalcristalproteinsofBacillusthuringiensis.1989.Microbiol.Rev.53：242-255.Hoekema，A.1985.In：TheBinaryPlantVectorSystem，Offset-durkkerijKantersB.V.，Alblasserdam，Chapter5.Hogan，D.A.；S.R.Smith，E.A.Saari，J.McCracken，R.P.Hausinger.2000.Site-directedmutagenesisof2，4-dichlorophenoxyaceticacid/a-ketoglutaratedioxygenase.Identificationofresiduesinvolvedinmetallocenterformationandsubstratebinding.J.Biol.Chem.275：12400-12409.Holsters，M.，D.DeWaele，A.Depicker，E.Messens，M.VanMontagu和J.Schell.1978.TransfectionandtransformationofAgrobacteriumtumefaciens.MolGen.Genet.163：181-187.Horsch，R.，J.Fry，N.Hoffman，J.Neidermeyer，S.Rogers和R.Fraley.1988.InPlantMolecularBiologyManual，S.Gelvinetal.，eds.，KluwerAcademicPublishers，BostonHorvath，M.，G.Ditzelmüller，M.Lodl和F.Streichsbier.1990.Isolationandcharacterizationofa2-(2，4-dichlorophenoxy)propionicacid-degradingsoilbacterium.Appl.MicrobiolBiotechnol.33：213-216.Jefferson，R.A.M.Bevan和T.Kavanagh.1987.TheuseofEscherichiacoliβ-glucuronidasegeneasagenefustionmarkerforstudiesofgeneexpressioninhigherplants.Biochem.Soc.Trans.15：17-19.Karlin，S.和S.F.Altschul.1990.Methodsforassessingthestatisticalsignificanceofmolecularsequencefeaturesbyusinggeneralscoringschemes.PNAS87：2264-2268.Karlin，S.和S.F.Altschul.1993.Applicationsandstatisticsformultiplehigh-scoringsegmentsinmolecularsequences.PNAS90：5873-5877Keller，G.H.和M.M.Manak.1987.DNAProbes.StocktonPress，NewYork，NY，169-170頁(yè)KhalafallaM，S.Rahman，H.El-Shemy，Y.Nakamoto，K.Wakasa，M.Ishimoto.2005.OptimizationofparticlebombardmentconditionsbymonitoringoftransientsGFP(S65T)expressionintransformedsoybean.BreedingSci.55：257-263.KhanM，L.Table，L.Heath，D.Speneer，T.Higgins.1994.Agrobacterium-mediatedtransformationofsubterraneanclover(TrifoliumsubterraneumL.).PlantPhysiol105：81-88.Kohler，H.P.E.1999.DelftiaacidovoransMH：aversatilephenoxyalkanoicacidherbicidedegrader.J.IndMicrobiolandBiotech.23：336-340.LiL，QuR，KochkoAde，F(xiàn)auquetCM，BeachyRN(1993)Animprovedricetransformationsystemusingthebiolisticmethod.PlantCellRep12：250-255Linsmaier，E.M.和F.Skoog(1965)Organicgrowthfactorrequirementsoftobaccotissuecultures.Physiol.Plant.18：100-127.Lorraine-Colwill，D.F.，S.B.Powles，T.R.Hoawkes，P.H.Hollingshead，S.A.J.Arner和C.Preston.2003.InvestigationsintothemechanismofglyPhosateresistanceinLoliumrigidum.Pestic.Biochem.Physiol.74：62-73.Luo，H.，Q.Hu，K.Nelson，C.Longo，A.P.Kausch，J.M.Chandlee，J.K.Wipff和C.R.Fricker.2004.Agrobacteriumtumefaciens-mediatedcreepingbentgrass(AgrostisstoloniferaL.)transformationusingphosphinothricinselectionresultsinahighfrequencyofsingle-copytransgeneintegration.PlantCellReports22：645-652.Lyon，B.R.，D.J.Llewellyn，J.L.Huppatz，E.S.Dennis和W.J.Peacock.1989.Expressionofabacterialgeneintransgenictobaccoconfersresistancetotheherbicide2，4-dichlorophenoxyaceticacid.PlantMol.Bio.13：533-540.Lyon，B.R.，Y.L.Cousins，D.J.Llewellyn和E.S.Dennis.1993.Cottonplantstransformedwithabacterialdegradationgeneareprotectedfromaccidentalspraydriftdamagebytheherbicide2，4-dichlorophenoxyaceticacid.TransgenicRes.2：166-169.Maniatis，T.，E.F.Fritsch，J.Sambrook.1982.MolecularCloning：ALaboratoryManual，ColdSpringHarborLaboratory，ColdSpringHarbor，NYMartin，J.R.和W.W.Witt.2002.Responseofglyphosatetolerantandsusceptiblebiotypesofhorseweed(Conyzacanadensis)tofoliarappliedherbicides.Proc.NorthCent.WeedSci.Soc.57：185.MartinellB.J.，L.S.Julson，C.A.Emler，H.Yong，D.E.McCabe，E.J.Williams.2002.SoybeanAgrobacteriumtransformationmethod.U.S.PatentApplicationNo.6384301McCabeD.E.，W.F.Swain，B.J.Martinell，P.Christou.1988.Stabletransformationofsoybean(Glycinemax)byparticleacceleration.Bio/Technology6：923-926.MillerS.D.，P.W.Stahlman，P.Westra，G.W.Wicks，R.G.Wilson，J.M.Tichota.2003.Risksofweedspectrumshiftsandherbicideresistanceinglyphosate-resistantcroppingsystems.Proc.West.Soc.WeedSci.56：61-62.MullerR，S.Jorks，S.Kleinsteuber，W.Babel.1999.ComamonasacidovoransstrainMCl：anewisolatecapableofdegradingthechiralherbicidesdichlorpropandmecopropandtheherbicides2，4-DandMCPA.Microbiol.Res.154：241-246.MullerT，S.Byrde，C.Werlen，J.RoelofvanderMeer，H-P.Kohler.2004.GeneticAnalysisofPhenoxyalkanoicAcidDegradationinSphingomonasherbicidovoransMH.Appl.Environ.Microbiol.70(10)：6066-6075.MullerT，T.Fleischmann，J.RoelofvanderMeer，H-P.Kohler.2006.PurificationandCharacterizationofTwoEnantioselectiveα-Ketoglutarate-DependentDioxygenases，RdpAandSpdAfromSphingomonasherbicidovoransMH.Appl.Environ.Microbiol.72(7)：4853-4861.MullerT，M.Zavodszky，M.Feig，L.Kuhn，R.Hausinger.2006.StructuralbasisfortheenantiospecificitiesofR-andS-specificphenoxyproprionate/α-ketoglutaratedioxygenases.ProteinSci.15：1356-1368.MurashigeT.和F.Skoog.1962.Arevisedmediumforrapidgrowthandbioassayswithtobaccotissuecultures.Physiol.Plant.15：473-497.MurphyG.P.，T.E.Dutt，R.F.Montgomery，T.S.Willard，G.A.Elmore.2002.ControlofhorseweedwithglyPhosate.Proc.NorthCent.WeedSci.Soc.57：194.Ng，C.H.，R.Wickneswari，S.Salmigah，Y.T.Teng和B.S.Ismail.2003.GenepolymorphismsinglyPhosate-resistantand-susceptiblebiotypesofEleusineindicafromMalaysia.WeedRes.43：108-115.OlhoftP.M.和D.A.Somers.2001.L-CysteineincreasesAgrobacterium-mediatedT-DNAdeliveryintosoybeancotyledonary-nodecells.PlantCellRep20：706-711Olhoft，P.M.，L.E.Flagel，C.M.Donovan和D.A.Somers.2003.EfficientsoybeantransformationusinghygromycinBselectioninthecotyledonary-nodemethod.Planta216：723-735PadgetteS.R.，K.H.Kolacz，X.Delannay，D.B.Re，B.J.LaVallee，C.N.Tinius，W.K.Rhodes，Y.I.Otero，G.F.Barry，D.A.Eichholtz，V.M.Peschke，D.L.Nida，N.B.Taylor和G.M.Kishore.1995.Development，identification，andcharacterizationofaglyphosate-tolerantsoybeanline.CropSci.1995；35：1451-1461.ParrottW.A.，J.N.All，M.J.Adang，M.A.Bailey，H.R.Boerma和C.N.Stewart，Jr.1994.RecoveryandevaluationofsoybeanplantstransgenicforaBacillusthuringiensisvar.kurstakiinsecticidalgene.InVitroCell.Dev.Biol.30P：144-149.Popelka，J.C.和F.Altpeter2003.Agrobacteriumtumefaciens-mediatedgenetictransformationofrye(SecalecerealeL)Mol.Breed11：203-211Powles，S.B.和C.Preston.2006.EvolvedglyPhosateresistanceinplants：biochemicalandgeneticbasisofresistance.WeedTech20：282-289.Saari，R.E.，D.A.Hogan和R.P.Hausinger.1999.Stereospecificdegradationofthepheonxypropionateherbicidedichlorprop.J.Mol.Catal.B：Enz.6：421-428.Saiki，R.K.，S.Scharf，F(xiàn).Faloona，K.B.Mullis，G.T.Horn，H.A.Erlich和N.Arnheim.1985.EnzymaticAmplificationofβ-GlobinGenomicSequencesandRestrictionSiteAnalysisforDiagnosisofSickleCellAnemia.Science230：1350-1354.Sambrook，J.，E.F.Fritsch和T.Maniatis.1989.MolecularCloning，ALaboratoryManual，ColdSpringHarborPress.Sambrook，J.和D.W.Russell.2000.MolecularCloning.ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，NY.Schenk，R.U.和A.C.Hildebrandt(1972)Methodsandtechniquesforinductionandgrowthofmonocotyledenousanddicotyledenousplantcellcultures.Can.J.Bot.50：199-204.Sfiligoj，E.2004.Spreadingresistance.CropLife.Marchissue.Simarmata，M.，J.E.Kaufmann和D.Penner.2003.PotentialbasisofglyphosateresistanceinCaliforniarigidryegrass(Loliumrigidum).WeedSci.51：678-682.SinghR.J.，T.M.Klein，C.J.Mauvais，S.Knowlton，T.Hymowitz，C.M.Kostow.Cytologicalcharacterizationoftransgenicsoybean.Theor.Appl.Genet.1998；96：319-324.Smejkal，C.W.，T.Vallaeys，S.K.Burton和H.M.Lappin-Scott.2001.Substratespecificityofchlorophenoxyalkanoicacid-degradingbacteriaisnotdependentuponphylogeneticallyrelatedtfdAgenetypes.Biol.Fertil.Sols33：507-513.Streber，W.和L.Willmitzer.1989.Transgenictobaccoplantsexpressingabacterialdetoxifyingenzymeareresistantto2，4-D.Bio/Technology7：811-816.Streber，W.R.，K.N.Timmis和M.H.Zenk.2000.Microorganismsandplasmidsfor2，4-dichlorophenoxyaceticacid(2，4-D)monooxygenaseformationandprocessfortheproductionoftheseplasmidsandstrains.USPat.6,153,401.Streber，W.R.，K.N.Timmis和M.H.Zenk.1987.Analysis，cloning，andhigh-levelexpressionof2，4-dichlorophenixyaceticmonooxygenasegenetfdAofAlcaligeneseutrophusJMP134.J.Bacteriol.169：2950-2955.Suggs，S.V.，T.Miyake，E.H.Kawashime，M.J.Johnson，K.Itakura和R.B.Wallace.1981.ICN-UCLASymp.Dev.Biol.UsingPurifiedGenes，D.D.Brown[ed.]，AcademicPress，NewYork，23：683-693.TerakawaT，H.Hisakazu，Y.Masanori.2005.Efficientwhiskermediatedgenetransformationinacombinationwithsupersonictreatment.Breedingscience55：456-358.Tingay，S.，D.McElroy，R.Kalla，S.Fieg，W.Mingbo，S.Thornton和R.Bretell.1997.Agrobacteriumtumefaciens-mediatedbarleytransformation.PlantJ.11：1369-1376.Weigel，D.和J.Glazebrook.2002.Arabidopsis：ALaboratoryManual.ColdSpringHarborLabPress，ColdSpringHarbor，N.Y.358頁(yè)Weising，K.，J.Schell和G.Kahl.1988.Foreigngenesinplants：transfer，structure，expressionandapplications.Ann.Rev.Genet.22：421-477.Welter，M.E.，D.S.Clayton，M.A.miler和J.F.Petolino.1995.Morphotypesoffriableembryogenicmaizecallus.PlantCellRep.14：725-729.WestendorfA.，D.Benndorf，R.Muller，W.Babel.2002.Thetwoenantiospecificdichlorprop/α-ketoglutarate-dioxygenasesfromDelftiaacidovoransMC1-proteinandsequencedataofRdpaandSdpA.Microbiol.Res.157：317-22.Westendorf，A.，R.H.Muller和W.Babel.2003.PurificationandcharacterizationoftheenantiospecificdioxygenasesfromDelftiaacidovoransMC1initiatingthedegradationofphenoxypropionatesandphenoxyacetateherbicides.ActaBiotechnol.23：3-17.WSSA.2002.HerbicideHandbook(第8版).WeedScienceSocietyofAmerica.Lawrence，KS492頁(yè).ZengP，D.Vadnais，Z.Zhang和J.Polacco.2004.RefinedglufosinateselectioninAgrobacterium-mediatedtransformationofsoybean[Glycinemax(L.)Merr.].PlantCellRep.22：478-482.ZhangS(1995)Efficientplantregenerationfromindica(group1)riceprotoplastsofoneadvancedbreedinglineandthreevarieties.PlantCellRep15：68-71ZhangS，ChenL，QuR，MarmeyP，BeachyRN，F(xiàn)auquetCM(1996)Efficientplantregenerationfromindica(group1)riceprotoplastsofoneadvancedbreedinglineandthreevarieties.PlantCellRep15：465-469.ZhangS，SongW，ChenL，RuanD，TaylorN，RonaldP，BeachyRN，F(xiàn)auquetCM(1998)TransgeniceliteIndicaricevarieties，resistanttoXanthomonasoryzaepv.oryzae.MolBreed4：551-558.Zhang，Z.，A.Xing，P.E.Staswick和T.E.Clemente.1999.TheuseofglufosinateasaselectiveagentinAgrobacterium-mediatedtransformationofsoybean.PlantCell，Tissue，andOrganCulture56：37-46.Zhao，Z.Y.，T.Cai，L.Tagliani，M.Miller，N.Wang，H.Pang，M.Rudert，S.Schroeder，D.Hondred，J.Seltzer和D.Pierce.2000.Agrobacterium-mediatedsorghumtransformation，PlantMol.Biol.44：789-798.Zipper，C.，M.Bunk，A.Zehnder，H.Kohler.1998.Enantioselectiveuptakeanddegradationofthechiralherbicidedichlorprop[(RS)-2-(2，4-dichlorophenoxy)propanoicacid]byDelftiaacidovoransMH.J.Bact.13：3368-3374當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3