本發(fā)明涉及一種落葉松胚性細(xì)胞的遺傳轉(zhuǎn)化方法。

背景技術(shù)：

落葉松(LarixLeptolepis)是我國北方及亞熱帶中高山地區(qū)的針葉速生造林用材樹種，具有分布廣泛、適應(yīng)性強(qiáng)、病蟲害少、材質(zhì)優(yōu)良等特點(diǎn)，且早期速生性在所有的針葉樹中位居前列，是國營林場和農(nóng)民都非常重視的造林樹種，人工造林面積目益擴(kuò)大。因此，開展落葉松育種研究工作是我國針葉樹改良的一個(gè)重要領(lǐng)域。目前，我國主要通過人工引種、良種選育、種間雜交等傳統(tǒng)育種方式對落葉松進(jìn)行遺傳改良。雖然在此領(lǐng)域已取得了令人矚目的進(jìn)展，然而從技術(shù)層面上來說，由于這些傳統(tǒng)的育種方式存在人力、物力耗費(fèi)較大、受自然條件影響、育種周期長、遺傳操作難度大等問題，落葉松育種進(jìn)程不能滿足現(xiàn)代林木遺傳育種的需求。近年來，基因工程育種的迅速發(fā)展，為林木遺傳改良開辟了一條新途徑，利用基因工程手段，可突破物種界限，將控制優(yōu)良性狀的外源基因?qū)胧荏w，對植物進(jìn)行快速定向的遺傳改良，從而達(dá)到常規(guī)育種手段無法實(shí)現(xiàn)的目標(biāo)?；蚬こ淌侄我呀?jīng)成功應(yīng)用于很多的農(nóng)林植物育種技術(shù)，并獲得了很有應(yīng)用價(jià)值的新品系(種)。

目前針葉樹遺傳轉(zhuǎn)化主要利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法和基因槍法，同時(shí)也嘗試了電擊法和PEG誘導(dǎo)法。在諸多遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)中，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化(Agrobacterium-mediated transformation)占主導(dǎo)地位，其中根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化是目前研究最多、機(jī)理最清楚、技術(shù)最成熟的基因轉(zhuǎn)化方法。農(nóng)桿菌介導(dǎo)法與其它轉(zhuǎn)化方法(如基因槍法、電擊法、PEG介導(dǎo)法)相比具有操作簡單、成本低、可導(dǎo)入大片段基因、基因整合拷貝數(shù)低、發(fā)生基因沉默率低等優(yōu)點(diǎn)而被較多植物生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室使用，也是應(yīng)用于針葉樹遺傳轉(zhuǎn)化最廣泛的方法。早在1934年,研究者們就已知道根癌農(nóng)桿菌能侵染針葉樹。后來進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，針葉樹確實(shí)是農(nóng)桿菌的天然宿主，此發(fā)現(xiàn)為開展以農(nóng)桿菌介導(dǎo)的針葉樹遺傳轉(zhuǎn)化研究并取得成功奠定了基礎(chǔ)。Sederoff等利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將外源基因?qū)牖鹁嫠?，這是首次成功轉(zhuǎn)化針葉樹的報(bào)道，但未獲得轉(zhuǎn)基因植株。Huang等用發(fā)根農(nóng)桿菌對歐洲落葉松無菌苗進(jìn)行侵染，獲得了穩(wěn)定表達(dá)外源基因的轉(zhuǎn)化植株，這是利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化針葉樹獲得的第一例轉(zhuǎn)基因植株。目前國際上已有大量利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)針葉樹遺傳轉(zhuǎn)化成功獲得穩(wěn)定表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株的報(bào)道。

據(jù)統(tǒng)計(jì)，近年來松科(松屬、冷杉屬、云杉屬、黃杉屬、落葉松屬)、柏科、杉科等幾十種針葉樹通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化已經(jīng)成功獲得了轉(zhuǎn)化體。其中火炬松、挪 威云杉、輻射松具有良好的再生受體系統(tǒng)，其遺傳轉(zhuǎn)化研究進(jìn)展較快，轉(zhuǎn)化技術(shù)比較成熟。其它針葉樹種遺傳轉(zhuǎn)化研究工作進(jìn)展緩慢，體系不太穩(wěn)定，轉(zhuǎn)化率普遍較低。綜合大量針葉樹遺傳轉(zhuǎn)化研究的報(bào)道得出，農(nóng)桿菌侵染轉(zhuǎn)化針葉樹受多因素影響，主要包括：針葉樹不同樹種及基因型；受體材料及生理狀態(tài)；農(nóng)桿菌菌株及載體的類型；侵染及共培養(yǎng)條件；篩選機(jī)制等，各種影響因素的綜合和優(yōu)化有助于提高遺傳轉(zhuǎn)化效率。由于針葉樹種大多缺乏優(yōu)良的再生系統(tǒng)，遺傳轉(zhuǎn)化研究進(jìn)展緩慢，缺乏系統(tǒng)性。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種落葉松胚性細(xì)胞的遺傳轉(zhuǎn)化方法。

本發(fā)明提供了一種落葉松胚性細(xì)胞的遺傳轉(zhuǎn)化方法，依次包括如下步驟：

(a1)取落葉松胚性細(xì)胞，懸浮于重組農(nóng)桿菌侵染液進(jìn)行侵染；

(a2)完成步驟(a1)后，收集落葉松胚性細(xì)胞，進(jìn)行恢復(fù)培養(yǎng)；

(a3)完成步驟(a2)后，取落葉松胚性細(xì)胞，采用抽濾脫菌裝置進(jìn)行脫菌；

所述抽濾脫菌裝置包括分離裝置1、液體收集裝置2和抽氣裝置3；

所述分離裝置的上部為頂端開口內(nèi)部中空的加樣部1-1，下部為底端開口內(nèi)部中空的漏斗部1-2，加樣部和漏斗部外部相接、內(nèi)部連通，加樣部和漏斗部的內(nèi)部連接處設(shè)有孔徑為200-500目的不銹鋼網(wǎng)1-3；

所述液體收集裝置為密閉的中空容器，具有上開口和側(cè)開口；

所述分離裝置的漏斗部的底端開口與所述液體收集裝置的上開口氣密連通；

所述液體收集裝置的側(cè)開口與抽氣裝置氣密連通。

所述步驟(a3)中，所述脫菌的過程為：先用蒸餾水洗滌3-5次、每次2-5min，再用300-500mg/L抗生素溶液洗滌3-5次、每次5-10min。

所述步驟(a3)中，所述脫菌的過程具體可為：先用蒸餾水洗滌4次、每次3min，再用400mg/L抗生素溶液洗滌4次、每次8min。

所述抗生素溶液具體可為頭孢霉素水溶液。

所述步驟(a1)中，所述重組農(nóng)桿菌侵染液為用侵染液懸浮重組農(nóng)桿菌得到的液相；所述重組農(nóng)桿菌為含有目的DNA的農(nóng)桿菌。所述侵染液為：乙酰丁香酮2-40mg/L，余量為水；pH5.75-5.85。所述侵染液具體可為：乙酰丁香酮20mg/L，余量為水；pH5.8。

所述步驟(a1)中，所述侵染的條件為：室溫靜置5-20分鐘。

所述步驟(a1)中，所述侵染的條件具體可為：室溫靜置10分鐘。

所述步驟(a2)中，所述恢復(fù)培養(yǎng)在S₁培養(yǎng)基上進(jìn)行；

所述S₁培養(yǎng)基如下：KNO₃1836-2836mg/L、NH₄NO₃243-360mg/L、KH₂PO₄70-130mg/L、CaCl₂·2H₂O300-450mg/L、MgSO₄·7H₂O130-250mg/L、H₃BO₃2-11mg/L、ZnSO₄·7H₂O3-7mg/L、MnSO₄·H₂O6.5-10.5mg/L、Na₂MoO₄·2H₂O0.11-0.21mg/L、KI0.28-0.63mg/L、 CuSO₄·5H₂O0.01-0.035mg/L、CoCl₂0.01-0.035mg/L、FeSO₄·7H₂O13-21mg/L、Na₂·EDTA·H₂O15-27mg/L、肌醇50-1500mg/L、維生素B₁0.4-0.6mg/L、谷氨酰胺400-700mg/L、蔗糖20000-55000mg/L、2,4-二氯苯氧乙酸0.3-2.7mg/L、酸水解酪蛋白350-1050mg/L、6-芐氨基嘌呤0.05-3.1mg/L、瓊脂2500-7000mg/L、乙酰丁香酮2-40mg/L，余量為水；pH5.75-5.85。

所述S₁培養(yǎng)基具體如下：KNO₃2803mg/L、NH₄NO₃331mg/L、KH₂PO₄103mg/L、CaCl₂·2H₂O326mg/L、MgSO₄·7H₂O206mg/L、H₃BO₃9.5mg/L、ZnSO₄·7H₂O5.2mg/L、MnSO₄·H₂O10.2mg/L、Na₂MoO₄·2H₂O0.15mg/L、KI0.51mg/L、CuSO₄·5H₂O0.0125mg/L、CoCl₂0.0125mg/L、FeSO₄·7H₂O13.93mg/L、Na₂·EDTA·H₂O18.65mg/L、肌醇1000mg/L、維生素B₁0.5mg/L、谷氨酰胺450mg/L、蔗糖30000mg/L、2,4-二氯苯氧乙酸0.4mg/L、酸水解酪蛋白500mg/L、6-芐氨基嘌呤0.4mg/L、瓊脂3000mg/L、乙酰丁香酮20mg/L，余量為水；pH5.8。

所述步驟(a2)中，所述恢復(fù)培養(yǎng)的條件為：20-25℃、黑暗條件下靜置46-50小時(shí)。

所述步驟(a2)中，所述恢復(fù)培養(yǎng)的條件具體可為：23℃、黑暗條件下靜置48小時(shí)。

所述方法還可包括如下步驟(a4)：完成步驟(a3)后，取落葉松胚性細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至S₂培養(yǎng)基上，20-25℃、黑暗條件下靜置培養(yǎng)7-10天。

所述S₂培養(yǎng)基如下：KNO₃1836-2836mg/L、NH₄NO₃243-360mg/L、KH₂PO₄70-130mg/L、CaCl₂·2H₂O300-450mg/L、MgSO₄·7H₂O130-250mg/L、H₃BO₃2-11mg/L、ZnSO₄·7H₂O3-7mg/L、MnSO₄·H₂O6.5-10.5mg/L、Na₂MoO₄·2H₂O0.11-0.21mg/L、KI0.28-0.63mg/L、CuSO₄·5H₂O0.01-0.035mg/L、CoCl₂0.01-0.035mg/L、FeSO₄·7H₂O13-21mg/L、Na₂·EDTA·H₂O15-27mg/L、肌醇50-1500mg/L、維生素B₁0.4-0.6mg/L、谷氨酰胺400-700mg/L、蔗糖20000-55000mg/L、2,4-二氯苯氧乙酸0.3-2.7mg/L、酸水解酪蛋白350-1050mg/L、6-芐氨基嘌呤0.05-3.1mg/L、瓊脂2500-7000mg/L、頭孢霉素200-700mg/L，余量為水；pH5.75-5.85。

所述S₂培養(yǎng)基具體如下：KNO₃2803mg/L、NH₄NO₃331mg/L、KH₂PO₄103mg/L、CaCl₂·2H₂O326mg/L、MgSO₄·7H₂O206mg/L、H₃BO₃9.5mg/L、ZnSO₄·7H₂O5.2mg/L、MnSO₄·H₂O10.2mg/L、Na₂MoO₄·2H₂O0.15mg/L、KI0.51mg/L、CuSO₄·5H₂O0.0125mg/L、CoCl₂0.0125mg/L、FeSO₄·7H₂O13.93mg/L、Na₂·EDTA·H₂O18.65mg/L、肌醇1000mg/L、維生素B₁0.5mg/L、谷氨酰胺450mg/L、蔗糖30000mg/L、2,4-二氯苯氧乙酸0.4mg/L、酸水解酪蛋白500mg/L、6-芐氨基嘌呤0.4mg/L、瓊脂3000mg/L、頭孢霉素400mg/L，余量為水；pH5.8。

所述步驟(a4)具體可為：完成步驟(a3)后，取落葉松胚性細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至S₂培養(yǎng)基上，23℃、黑暗條件下靜置培養(yǎng)7天。

所述方法還可包括如下步驟(a5)：完成步驟(a4)后，取落葉松胚性細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至S₃培養(yǎng)基上，20-25℃、黑暗條件下靜置培養(yǎng)15-25天。

所述S₃培養(yǎng)基如下：KNO₃1836-2836mg/L、NH₄NO₃243-360mg/L、KH₂PO₄70-130mg/L、CaCl₂·2H₂O300-450mg/L、MgSO₄·7H₂O130-250mg/L、H₃BO₃2-11mg/L、ZnSO₄·7H₂O3-7mg/L、MnSO₄·H₂O6.5-10.5mg/L、Na₂MoO₄·2H₂O0.11-0.21mg/L、KI0.28-0.63mg/L、CuSO₄·5H₂O0.01-0.035mg/L、CoCl₂0.01-0.035mg/L、FeSO₄·7H₂O13-21mg/L、Na₂·EDTA·H₂O15-27mg/L、肌醇50-1500mg/L、維生素B₁0.4-0.6mg/L、谷氨酰胺400-700mg/L、蔗糖20000-55000mg/L、2,4-二氯苯氧乙酸0.3-2.7mg/L、酸水解酪蛋白350-1050mg/L、6-芐氨基嘌呤0.05-3.1mg/L、瓊脂2500-7000mg/L、頭孢霉素200-700mg/L、潮霉素的濃度為3-20mg/L，余量為水；pH5.75-5.85。

所述S₃培養(yǎng)基具體如下：KNO₃2803mg/L、NH₄NO₃331mg/L、KH₂PO₄103mg/L、CaCl₂·2H₂O326mg/L、MgSO₄·7H₂O206mg/L、H₃BO₃9.5mg/L、ZnSO₄·7H₂O5.2mg/L、MnSO₄·H₂O10.2mg/L、Na₂MoO₄·2H₂O0.15mg/L、KI0.51mg/L、CuSO₄·5H₂O0.0125mg/L、CoCl₂0.0125mg/L、FeSO₄·7H₂O13.93mg/L、Na₂·EDTA·H₂O18.65mg/L、肌醇1000mg/L、維生素B₁0.5mg/L、谷氨酰胺450mg/L、蔗糖30000mg/L、2,4-二氯苯氧乙酸0.4mg/L、酸水解酪蛋白500mg/L、6-芐氨基嘌呤0.4mg/L、瓊脂3000mg/L、頭孢霉素400mg/L、潮霉素的濃度為5mg/L，余量為水；pH5.8。

所述步驟(a5)具體可為：完成步驟(a4)后，取落葉松胚性細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至S₃培養(yǎng)基上，23℃、黑暗條件下靜置培養(yǎng)20天。

所述方法還可包括如下步驟(a6)：完成步驟(a5)后，進(jìn)行兩次以上如下操作：取存活的胚性細(xì)胞團(tuán)，轉(zhuǎn)移到所述S₃培養(yǎng)基上，20-25℃、黑暗條件下靜置培養(yǎng)15-25天。

所述步驟(a6)具體可為：完成步驟(a5)后，進(jìn)行兩次如下操作：取存活的胚性細(xì)胞團(tuán)，轉(zhuǎn)移到所述S₃培養(yǎng)基上，25℃、黑暗條件下靜置培養(yǎng)20天。

以上任一所述方法中，進(jìn)行所述步驟(a1)以前，落葉松胚性細(xì)胞先進(jìn)行如下操作：

(b1)將落葉松胚性細(xì)胞接種至S₀培養(yǎng)基上，20-25℃、黑暗條件下靜置培養(yǎng)15-20天；

(b2)完成步驟(b1)后，挑取落葉松胚性細(xì)胞，加入Y₀培養(yǎng)基中，20-25℃、黑暗條件下振蕩培養(yǎng)，每7-10天繼代一次，繼代培養(yǎng)5-7天時(shí)加入乙酰丁香酮，加入乙酰丁香酮12-24小時(shí)后取落葉松胚性細(xì)胞進(jìn)行所述步驟(a1)；

乙酰丁香酮的加入量為：每92毫升Y₀培養(yǎng)基加入0.5-2mg乙酰丁香酮。

所述S₀培養(yǎng)基如下：KNO₃1836-2836mg/L、NH₄NO₃243-360mg/L、KH₂PO₄70-130mg/L、CaCl₂·2H₂O300-450mg/L、MgSO₄·7H₂O130-250mg/L、H₃BO₃2-11mg/L、ZnSO₄·7H₂O3-7mg/L、MnSO₄·H₂O6.5-10.5mg/L、Na₂MoO₄·2H₂O0.11-0.21mg/L、KI0.28-0.63mg/L、CuSO₄·5H₂O0.01-0.035mg/L、CoCl₂0.01-0.035mg/L、FeSO₄·7H₂O13-21mg/L、Na₂·EDTA·H₂O15-27mg/L、肌醇50-1500mg/L、維生素B₁0.4-0.6mg/L、谷氨酰胺400-700mg/L、蔗糖20000-55000mg/L、2,4-二氯苯氧乙酸0.3-2.7mg/L、酸水解酪蛋白350-1050mg/L、6-芐氨基嘌呤0.05-3.1mg/L、瓊脂2500-7000mg/L，余量為水；pH5.4-6.2。

所述S₀培養(yǎng)基具體如下：KNO₃2803mg/L、NH₄NO₃331mg/L、KH₂PO₄103mg/L、CaCl₂·2H₂O326mg/L、MgSO₄·7H₂O206mg/L、H₃BO₃9.5mg/L、ZnSO₄·7H₂O5.2mg/L、MnSO₄·H₂O10.2mg/L、Na₂MoO₄·2H₂O0.15mg/L、KI0.51mg/L、CuSO₄·5H₂O0.0125mg/L、CoCl₂0.0125mg/L、FeSO₄·7H₂O13.93mg/L、Na₂·EDTA·H₂O18.65mg/L、肌醇1000mg/L、維生素B₁0.5mg/L、谷氨酰胺450mg/L、蔗糖30000mg/L、2,4-二氯苯氧乙酸0.4mg/L、酸水解酪蛋白500mg/L、6-芐氨基嘌呤0.4mg/L、瓊脂3000mg/L，余量為水；pH5.8。

所述Y₀培養(yǎng)基如下：KNO₃1836-2836mg/L、NH₄NO₃243-360mg/L、KH₂PO₄70-130mg/L、CaCl₂·2H₂O300-450mg/L、MgSO₄·7H₂O130-250mg/L、H₃BO₃2-11mg/L、ZnSO₄·7H₂O3-7mg/L、MnSO₄·H₂O6.5-10.5mg/L、Na₂MoO₄·2H₂O0.11-0.21mg/L、KI0.28-0.63mg/L、CuSO₄·5H₂O0.01-0.035mg/L、CoCl₂0.01-0.035mg/L、FeSO₄·7H₂O13-21mg/L、Na₂·EDTA·H₂O15-27mg/L、肌醇50-1500mg/L、維生素B₁0.4-0.6mg/L、谷氨酰胺400-700mg/L、蔗糖20000-55000mg/L、2,4-二氯苯氧乙酸0.3-2.7mg/L、酸水解酪蛋白350-1050mg/L、6-芐氨基嘌呤0.05-3.1mg/L，余量為水；pH5.4-6.2；

所述Y₀培養(yǎng)基具體如下：KNO₃2803mg/L、NH₄NO₃331mg/L、KH₂PO₄103mg/L、CaCl₂·2H₂O326mg/L、MgSO₄·7H₂O206mg/L、H₃BO₃9.5mg/L、ZnSO₄·7H₂O5.2mg/L、MnSO₄·H₂O10.2mg/L、Na₂MoO₄·2H₂O0.15mg/L、KI0.51mg/L、CuSO₄·5H₂O0.0125mg/L、CoCl₂0.0125mg/L、FeSO₄·7H₂O13.93mg/L、Na₂·EDTA·H₂O18.65mg/L、肌醇1000mg/L、維生素B₁0.5mg/L、谷氨酰胺450mg/L、蔗糖30000mg/L、2,4-二氯苯氧乙酸0.4mg/L、酸水解酪蛋白500mg/L、6-芐氨基嘌呤0.4mg/L，余量為水；pH5.8。

所述步驟(b1)具體可為：將落葉松胚性細(xì)胞接種至所述S₀培養(yǎng)基上，23℃、黑暗條件下靜置培養(yǎng)15天。

所述(b2)具體可為：完成步驟(b1)后，挑取落葉松胚性細(xì)胞，加入Y₀培養(yǎng)基中，23℃、黑暗條件下振蕩培養(yǎng)，每7天繼代一次，繼代培養(yǎng)7天時(shí)加入乙酰丁香酮，加入乙酰丁香酮12小時(shí)后取落葉松胚性細(xì)胞進(jìn)行所述步驟(a1)；

乙酰丁香酮的加入量為：每92毫升Y₀培養(yǎng)基加入1mg乙酰丁香酮。

所述重組農(nóng)桿菌侵染液的OD_600nm＝0.05-0.2，具體可為0.1。

以上任一所述抽濾脫菌裝置中，所述分離裝置由布氏漏斗和不銹鋼網(wǎng)1-3組成；所述不銹鋼網(wǎng)的孔徑為200-500目，置于所述布氏漏斗的空心圓柱部的下底面上，與其大小形狀匹配。

以上任一所述抽濾脫菌裝置中，所述布氏漏斗的上部為只有下底面沒有上底面的空心圓柱部，所述布氏漏斗的下部為漏斗部，空心圓柱部與漏斗部在外部相接、在內(nèi)部通過空心圓柱部下底面上的若干通孔連通。

以上任一所述抽濾脫菌裝置中，所述液體收集裝置為布氏燒瓶。

以上任一所述抽濾脫菌裝置中，所述抽氣裝置為手動(dòng)抽氣泵或微型真空泵。

以上任一所述抽濾脫菌裝置中，所述抽氣裝置為在工作狀態(tài)下的抽氣速率為20mL/s的抽氣裝置。

以上任一所述抽濾脫菌裝置中，所述抽氣裝置為功率為6W以下的抽氣裝置。

本發(fā)明還保護(hù)一種用于落葉松胚性細(xì)胞的遺傳轉(zhuǎn)化的試劑盒，包括以上任一所述侵染液、以上任一所述S₁培養(yǎng)基、以上任一所述S₂培養(yǎng)基和以上任一所述S₃培養(yǎng)基。

所述試劑盒還可包括以上任一所述抽濾脫菌裝置。

所述試劑盒還可包括以上任一所述S₀培養(yǎng)基和以上任一所述Y₀培養(yǎng)基。

以上任一所述落葉松具體可為日本落葉松。

本發(fā)明提供的遺傳轉(zhuǎn)化方法的優(yōu)點(diǎn)如下：

①操作簡易：現(xiàn)有的落葉松遺傳轉(zhuǎn)化體系中所有用到的液體均為培養(yǎng)基，其中脫菌洗滌一次就要用2-3L左右，用量較大；本發(fā)明提供的方法中，用蒸餾水代替培養(yǎng)基進(jìn)行菌重懸以及脫菌洗滌，免去了培養(yǎng)基配置、分裝、滅菌的繁瑣步驟；本發(fā)明的發(fā)明人打破了遺傳轉(zhuǎn)化操作的常規(guī)思路，極大的改進(jìn)并簡化了遺傳轉(zhuǎn)化操作的復(fù)雜性，經(jīng)恢復(fù)培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，簡化操作后對后期胚性細(xì)胞的恢復(fù)增殖沒有影響；

②脫菌徹底、染菌率低：在對胚性愈傷組織或胚性細(xì)胞進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化的過程中，需要將胚性愈傷組織或胚性細(xì)胞懸浮于侵染液進(jìn)行侵染，如何對侵染后的胚性愈傷組織或胚性細(xì)胞進(jìn)行脫菌成為首要困難，為解決這個(gè)難題，本發(fā)明的發(fā)明人設(shè)計(jì)了抽濾脫菌裝置，洗滌徹底、染菌率低且對愈傷組織造成的傷害很小，有利于胚性細(xì)胞的恢復(fù)培養(yǎng)；

③高轉(zhuǎn)化效率：在侵染前用乙酰丁香酮分別處理受體材料和重組農(nóng)桿菌，有助于外源基因的導(dǎo)入，現(xiàn)有落葉松遺傳轉(zhuǎn)化體系的遺傳轉(zhuǎn)化效率為0.94個(gè)/g，而本發(fā)明提供的方法的遺傳轉(zhuǎn)化效率提高至2.5個(gè)/g。

本發(fā)明提供的方法，可用于利用基因工程手段對落葉松進(jìn)行快速定向遺傳改良， 為研究外源基因在落葉松體內(nèi)表達(dá)調(diào)控及其功能驗(yàn)證和胚胎發(fā)育研究提供技術(shù)平臺(tái)。

附圖說明

圖1為遺傳轉(zhuǎn)化的流程圖。

圖2為抽濾脫菌裝置的結(jié)構(gòu)示意圖。

圖3為實(shí)施例2中的照片。

圖4為實(shí)施例2中的瓊脂糖凝膠電泳圖。

具體實(shí)施方式

以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。

Y₀培養(yǎng)基(液體)(pH5.8)：KNO₃2803mg/L、NH₄NO₃331mg/L、KH₂PO₄103mg/L、CaCl₂·2H₂O326mg/L、MgSO₄·7H₂O206mg/L、H₃BO₃9.5mg/L、ZnSO₄·7H₂O5.2mg/L、MnSO₄·H₂O10.2mg/L、Na₂MoO₄·2H₂O0.15mg/L、KI0.51mg/L、CuSO₄·5H₂O0.0125mg/L、CoCl₂0.0125mg/L、FeSO₄·7H₂O13.93mg/L、Na₂·EDTA·H₂O18.65mg/L、肌醇1000mg/L、維生素B₁0.5mg/L、谷氨酰胺450mg/L、蔗糖30000mg/L、2,4-二氯苯氧乙酸0.4mg/L、酸水解酪蛋白500mg/L、6-芐氨基嘌呤0.4mg/L，余量為水。

S₀培養(yǎng)基(固體)(pH5.8)：與Y₀培養(yǎng)基的差別僅在于加入了瓊脂并使其濃度為3000mg/L。

S₁培養(yǎng)基(固體)(pH5.8)：與S₀培養(yǎng)基的差別僅在于加入了乙酰丁香酮并使其濃度為20mg/L。

S₂培養(yǎng)基(固體)(pH5.8)：與S₀培養(yǎng)基的差別僅在于加入了頭孢霉素并使其濃度為400mg/L。

S₃培養(yǎng)基(固體)(pH5.8)：與S₀培養(yǎng)基的差別僅在于加入了頭孢霉素和潮霉素，頭孢霉素的濃度為400mg/L，潮霉素的濃度為5mg/L。

侵染液(pH5.8)：乙酰丁香酮20mg/L，余量為水。

日本落葉松胚性細(xì)胞：朱彩虹,李水根，齊力旺，韓素英；農(nóng)桿菌介導(dǎo)的日本落葉松胚性細(xì)胞遺傳轉(zhuǎn)化研究，《中國生物工程雜志》2013年05期。

Super1300載體：上海北諾生物科技有限公司。

農(nóng)桿菌GV3101：北京華越洋生物科技有限公司。

抗性率(個(gè)/g)＝抗性細(xì)胞系數(shù)量/遺傳轉(zhuǎn)化的受體材料鮮重。

遺傳轉(zhuǎn)化率(個(gè)/g)＝轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系數(shù)量/遺傳轉(zhuǎn)化的受體材料鮮重。

抽濾脫菌裝置的結(jié)構(gòu)示意圖見圖2，包括分離裝置1、液體收集裝置2和抽氣裝置 3；分離裝置由布氏漏斗和不銹鋼網(wǎng)組成。布氏漏斗的上部為只有下底面沒有上底面的空心圓柱部，布氏漏斗的下部為漏斗部，空心圓柱部與漏斗部在外部相接、在內(nèi)部通過空心圓柱部下底面上的若干通孔連通。不銹鋼網(wǎng)的孔徑為200-500目，置于所述布氏漏斗的空心圓柱部的下底面上，與其大小形狀匹配。液體收集裝置為布氏燒瓶。抽氣裝置為手動(dòng)抽氣泵(工作狀態(tài)下的抽氣速率為20mL/s)。

實(shí)施例1、重組質(zhì)粒pSuper::MIR156的構(gòu)建和重組農(nóng)桿菌GV3101/MIR156的制備

一、重組質(zhì)粒pSuper::MIR156的構(gòu)建

1、設(shè)計(jì)引物對

miR156前體的編碼序列如序列表的序列1所示，在其莖環(huán)結(jié)構(gòu)序列的兩端大于90bp處設(shè)計(jì)引物對(由M156F和M156R組成)。

M156F：5’-CCCAAGCTTTTGTACTCAGCCGACAGAA-3’；

M156R：5’-GGACTAGTCCTCTAGCGGTAAATCTCAA-3’。

2、提取日本落葉松的基因組DNA作為模板，采用M156F和M156R組成進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。

3、用限制性內(nèi)切酶Hind III和Spe I雙酶切步驟2得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，回收酶切產(chǎn)物。

4、限制性內(nèi)切酶Hind III和Spe I雙酶切Super1300載體，回收約10kb的載體骨架。

5、將步驟3的酶切產(chǎn)物和步驟4的載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒pSuper::MIR156。根據(jù)測序結(jié)果，對重組質(zhì)粒pSuper::MIR156進(jìn)行結(jié)構(gòu)描述如下：在Super1300載體的Hind III和Spe I酶切位點(diǎn)之間插入了序列表的序列1自5’末端第84至469位核苷酸所示的雙鏈DNA分子。重組質(zhì)粒pSuper::MIR156中，由Super啟動(dòng)子啟動(dòng)外源插入片段的轉(zhuǎn)錄。

二、重組農(nóng)桿菌GV3101/MIR156的制備

將重組質(zhì)粒pSuper::MIR156導(dǎo)入農(nóng)桿菌GV3101，得到重組農(nóng)桿菌，將其命名為GV3101/MIR156。

實(shí)施例2、落葉松的遺傳轉(zhuǎn)化

遺傳轉(zhuǎn)化的流程圖見圖1。

一、受體材料的準(zhǔn)備及預(yù)培養(yǎng)

1、將日本落葉松胚性細(xì)胞接種至S₀培養(yǎng)基上，23℃、黑暗條件下靜置培養(yǎng)15天。

2、完成步驟1后，挑取表面生長旺盛的胚性細(xì)胞約1g，加入裝有92mlY₀培養(yǎng)基 的250ml三角瓶中，23℃、黑暗條件下100rpm振蕩培養(yǎng)。每7天繼代一次(每次繼代的方法均如下：取胚性細(xì)胞約1g，加入裝有92ml Y₀培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，23℃、黑暗條件下100rpm振蕩培養(yǎng))。繼代培養(yǎng)7天時(shí)，每個(gè)三角瓶中加入1mg乙酰丁香酮，從加入乙酰丁香酮開始計(jì)時(shí)，12小時(shí)后取胚性細(xì)胞，作為遺傳轉(zhuǎn)化的受體材料。

二、農(nóng)桿菌侵染液制備

用侵染液懸浮重組農(nóng)桿菌GV3101/MIR156，得到OD_600nm＝0.1的菌懸液，即為農(nóng)桿菌侵染液。

三、侵染、共培養(yǎng)及抗性篩選

1、取6g步驟一得到胚性細(xì)胞(遺傳轉(zhuǎn)化的受體材料)，懸浮于步驟二制備的農(nóng)桿菌侵染液中，充分混勻后室溫靜置10分鐘。

2、完成步驟1后，收集胚性細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至S₁培養(yǎng)基上，23℃、黑暗條件下靜置培養(yǎng)48小時(shí)。

3、完成步驟2后，取胚性細(xì)胞，采用抽濾脫菌裝置進(jìn)行脫菌，具體步驟如下：將胚性細(xì)胞倒進(jìn)分離裝置，打開手動(dòng)抽氣泵，先用蒸餾水洗滌4次(每次3min)，再用400mg/L頭孢霉素水溶液洗滌4次(每次8min)。

4、完成步驟3后，取胚性細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至鋪設(shè)有無菌濾紙的S₂培養(yǎng)基上，23℃、黑暗條件下靜置培養(yǎng)7天。

5、完成步驟4后，取胚性細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至S₃培養(yǎng)基上，23℃、黑暗條件下靜置培養(yǎng)20天，存活22個(gè)胚性細(xì)胞團(tuán)(照片見圖3，圖3中每3g胚性細(xì)胞轉(zhuǎn)移至1個(gè)S₃培養(yǎng)基，共轉(zhuǎn)移了6g胚性細(xì)胞，每個(gè)S₃培養(yǎng)基上獲得了11個(gè)存活的胚性細(xì)胞團(tuán)，共獲得了22個(gè)存活的胚性細(xì)胞團(tuán))。

6、完成步驟5后，取存活的胚性細(xì)胞團(tuán)，轉(zhuǎn)移到新的S₃培養(yǎng)基上，25℃、黑暗條件下靜置培養(yǎng)20天。

7、完成步驟6后，取存活的胚性細(xì)胞團(tuán)，轉(zhuǎn)移到新的S₃培養(yǎng)基上，25℃、黑暗條件下靜置培養(yǎng)20天，存活15個(gè)胚性細(xì)胞團(tuán)(每個(gè)胚性細(xì)胞團(tuán)定義為一個(gè)抗性細(xì)胞系)?？剐月蕿?.5個(gè)/g受體材料。

上述步驟4至步驟7中，沒有發(fā)生任何染菌現(xiàn)象。

四、PCR鑒定

分別將步驟三得到的15個(gè)抗性細(xì)胞系進(jìn)行如下鑒定：

提取抗性細(xì)胞系的基因組DNA，采用F1和R1組成的引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后進(jìn)行1.0％瓊脂糖凝膠電泳。以日本落葉松胚性細(xì)胞的基因組DNA作為陰性對照。以重組質(zhì)粒pSuper::MIR156作為陽性對照。

F1：5’-ACAGCAAGAACGGAATGC-3’；

R1：5’-GATAATCATCGCAAGACCG-3’。

F1和R1對應(yīng)Super1300載體上的核苷酸序列，跨越外源插入片段，如果得到657bp的擴(kuò)增產(chǎn)物，PCR鑒定結(jié)果為陽性，該抗性細(xì)胞系為遺傳轉(zhuǎn)化成功的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。

瓊脂糖凝膠電泳圖見圖4。圖4中，Marker自下往上依次為300bp、500bp、800bp、1000bp、1500bp、2000bp、3000bp、5000bp，質(zhì)粒代表陽性對照，非轉(zhuǎn)基因代表陰性對照，1號(hào)至15號(hào)代表15個(gè)抗性細(xì)胞系。

遺傳轉(zhuǎn)化率為2.5個(gè)/g受體材料。