本發(fā)明涉及用于產(chǎn)生目的蛋白質(zhì)的單一載體中的雙獨立順反子表達系統(tǒng)，所述目的蛋白質(zhì)包含表達為在細菌大腸桿菌(E.coli.)中形成的不溶性包涵體的抗體的重組Fab片段或其它抗體片段、肽和蛋白質(zhì)。

背景技術(shù)：

重組DNA技術(shù)(rDNA)已經(jīng)徹底改變了治療劑的制備方式。所需蛋白質(zhì)現(xiàn)在在外源細胞內(nèi)制備并純化。

具有翻譯后修飾(PTM)的蛋白質(zhì)通常在哺乳動物或酵母系統(tǒng)中表達為重組分子。酵母表達系統(tǒng)如畢赤酵母屬(Pichia)和酵母屬(Saccharomyces)在PTM方面更接近哺乳動物系統(tǒng)，但是在糖基化類型中依然不同，如在畢赤酵母屬情況下的高甘露糖聚糖，使得其不適合用于人使用的重組蛋白質(zhì)的表達。

單克隆抗體(mAb)、抗體、融合蛋白、mAb的Fab片段被用作治療劑。rDNA技術(shù)使用專門的載體和表達系統(tǒng)來產(chǎn)生治療性蛋白質(zhì)。表達系統(tǒng)主要由細菌、酵母、昆蟲或哺乳動物表達系統(tǒng)組成。最初，大多數(shù)重組蛋白質(zhì)在使用大腸桿菌作為宿主的細菌表達系統(tǒng)中表達。使用大腸桿菌作為表達宿主具有多個優(yōu)點，例如容易克隆、容易表達、更短的時間表、更短的孵育期和非常高的產(chǎn)量。因此，可以在大腸桿菌中安全地表達不需要任何PTM的蛋白質(zhì)。

作為mAb的抗原結(jié)合片段部分的Fab不需要在哺乳動物系統(tǒng)中表達，因為其不包含存在于抗體Fc部分中的糖基化位點。因此，F(xiàn)ab通常在大腸桿菌系統(tǒng)中表達。在1980-1990期間，數(shù)位研究人員嘗試了在大腸桿菌中表達Fab。PlückthunA等人,1990Behring Inst.Mitt.(87):48-55是報道了從大腸桿菌中分泌Fab抗體的一些早期工作人員。Williamson R.A.等人,1991Biochem J.277(Pt 2):561-3報道了使用噬菌體λ載體在大腸桿菌中表達Fab分子。用于在大腸桿菌中生產(chǎn)Fab、二價抗體或嵌合抗體片段的噬菌體展示系統(tǒng)。此外，F(xiàn)ab也在大腸桿菌中作為錯誤折疊的包涵體產(chǎn)生，然后將其重折疊以獲得功能分子，從而獲得抗體產(chǎn)率40％的提高。

上述大多數(shù)研究使用單啟動子(即phoA)來驅(qū)動重鏈和輕鏈兩者的表達。存在于重鏈和輕鏈之間的核糖體結(jié)合位點(rbs)驅(qū)動第二基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯。

US5648237也采用類似的單啟動子(phoA)策略來在大腸桿菌中表達Fab基因，以獲得分泌產(chǎn)物。上述策略的主要缺點是第二基因的表達水平通常低于第一基因，因此限制功能性Fab的產(chǎn)量。

專利No.WO03018771公開了通過兩個分開的翻譯單元產(chǎn)生抗體的方法，所述翻譯單元分別編碼所述抗體或片段的輕鏈和重鏈，其中兩條鏈以順序方式表達，從而特異性地分離輕鏈和重鏈的產(chǎn)生，并允許輕鏈和重鏈組裝。

專利No.EP1356052B1公開了在原核細胞中產(chǎn)生全抗體的方法。存在第一啟動子和第一順反子以產(chǎn)生免疫球蛋白輕鏈，以及第二啟動子和第二順反子以產(chǎn)生免疫球蛋白重鏈，其中兩條鏈折疊并組裝以形成生物活性免疫球蛋白。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

在一個實施方案中，本發(fā)明涉及單一載體中的雙獨立順反子表達系統(tǒng)，其用于在細菌細胞中產(chǎn)生表達為不溶性包涵體的重組蛋白質(zhì)和肽。

在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及制備具有兩個不同啟動子的單一載體中的雙獨立順反子表達系統(tǒng)的方法，其用于在細菌細胞中產(chǎn)生表達為不溶性包涵體的重組蛋白質(zhì)和肽。

在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及具有兩個不同啟動子的單一載體中的雙獨立順反子表達系統(tǒng)，其用于在細菌細胞中產(chǎn)生表達為不溶性包涵體的抗體片段。

在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及具有兩個不同啟動子的單一載體中的雙獨立順反子表達系統(tǒng)，其用于在細菌細胞中產(chǎn)生表達為不溶性包涵體的抗體的重組Fab片段。

在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及具有兩個不同啟動子的單一載體中的雙獨立順反子表達系統(tǒng)，其用于在細菌細胞中產(chǎn)生表達為不溶性包涵體的重組肽。

在另一個實施方案中，該雙順反子表達系統(tǒng)包含：

a)第一順反子，其包含與編碼目的蛋白質(zhì)的多核苷酸序列可操作地連接的啟動子；

b)第二順反子，其包含與編碼目的蛋白質(zhì)的多核苷酸序列可操作地連接的啟動子；

其中所述第一順反子和所述第二順反子位于單一載體中，并在細菌細胞中表達編碼作為包涵體的目的蛋白質(zhì)的多核苷酸序列。

在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及雙順反子載體，其包含可操作地連接到含有目的基因的多克隆位點的啟動子、核糖體結(jié)合位點和終止子。

在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及使用雙順反子表達系統(tǒng)產(chǎn)生目的蛋白質(zhì)的方法。

下面闡述的本發(fā)明的一個或多個實施方案的細節(jié)在本質(zhì)上僅僅是說明性的，并且不旨在限制本發(fā)明的范圍。通過該描述，本發(fā)明的其它特征、目的和優(yōu)點將變得明顯。

附圖簡述

圖1；示出了雙順反子載體的公式。

圖2；示出了克隆pET21a-HC-LC的載體圖譜。

圖3；示出了大腸桿菌BL21A1克隆的不溶性沉淀部分以及對照和參考產(chǎn)品的SDS PAGE分析。

圖4；示出了溶解的IB樣品的RP-HPLC分析，與還原的Fab分子相比，在克隆中看到了LC和HC峰。

圖5；示出了將重鏈峰與其它蛋白質(zhì)分離而運行的HPLC。

圖6；示出了與在大腸桿菌BL21A1細胞系中的單順反子克隆相比，雙順反子構(gòu)建體中SAK-Lira克隆的表達顯著增加。

圖7；示出了載體圖譜pBAD24M-LC。

發(fā)明詳述

定義：

如本文所用，術(shù)語“目的蛋白質(zhì)”在本文中是指用于生物治療行業(yè)或用于診斷或研究目的的任何多肽，包括蛋白質(zhì)和肽。

如本文所用，本文所用的術(shù)語“編碼目的蛋白質(zhì)的多核苷酸序列”包括編碼表達多肽的基因(優(yōu)選異源基因)的DNA。

如本文所用，術(shù)語“重組蛋白質(zhì)和肽”是指在活細胞內(nèi)通過重組DNA的表達產(chǎn)生的蛋白或肽。

如本文所用，術(shù)語“Fab”和“抗體”可互換使用，因為抗體包含兩個部分，即Fab和Fc區(qū)。

如本文所用，術(shù)語“載體(vector)”是指用作人工攜帶外源遺傳物質(zhì)進入細菌細胞的媒介物(vehicle)的DNA分子，其可以在細菌細胞中復制和表達。

如本文所用，術(shù)語“順反子”是指含有單個多肽的遺傳密碼并用作遺傳單位的DNA區(qū)段。

如本文所用，術(shù)語“雙獨立順反子表達”是指兩個分開的順反子，其用于獨立地表達兩種相同或不同的蛋白質(zhì)。

如本文所用，術(shù)語“相同(same)”與同一(identical)或相似(similar)可互換。

如本文所用，術(shù)語“雙順反子表達系統(tǒng)”包含編碼待表達的多肽的多核苷酸序列和控制其表達的序列，例如啟動子和任選的增強子序列。本發(fā)明的啟動子可操作地連接到待表達的基因(即轉(zhuǎn)錄單位)，或通過插入DNA(例如通過異源基因的5'非翻譯區(qū))與其分開。優(yōu)選地，表達系統(tǒng)的側(cè)翼是一個或多個合適的限制性位點，以便能夠?qū)⒈磉_盒插入載體和/或?qū)⑵鋸妮d體中刪除。因此，根據(jù)本發(fā)明的表達系統(tǒng)可用于構(gòu)建表達載體，特別是細菌表達載體。

如本文所用，術(shù)語“啟動子”是指通常位于基因上游的DNA調(diào)節(jié)區(qū)，提供用于調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄的控制點。

如本文所用，術(shù)語“可操作地連接”是指兩個或更多個DNA區(qū)段，特別是待表達的基因序列和控制其表達的那些序列之間的功能關(guān)系。

如本文所用，術(shù)語“小肽”或“肽”是指用于生物治療行業(yè)以及診斷和研究目的的2至10kDa的肽，如利拉魯肽、exanetide、PTH等。

本發(fā)明提供了用于產(chǎn)生多種目的重組蛋白質(zhì)的雙順反子表達系統(tǒng)。在某些實施方案中，雙順反子表達系統(tǒng)包含兩個順反子，其具有與編碼目的蛋白質(zhì)的多核苷酸序列可操作地連接的啟動子和終止子。

在某些實施方案中，雙順反子表達系統(tǒng)包含位于單一載體中的兩個順反子，其表達編碼目的蛋白質(zhì)的多核苷酸序列。

在一個實施方案中，雙順反子表達系統(tǒng)包含：

a)第一順反子，其包含與編碼目的蛋白質(zhì)的多核苷酸序列可操作地連接的啟動子；

b)第二順反子，其包含與編碼目的蛋白質(zhì)的多核苷酸序列可操作地連接的啟動子；

其中所述第一順反子和所述第二順反子位于單一載體中，并表達編碼作為宿主細胞中形成的包涵體的目的蛋白質(zhì)的多核苷酸序列。

在一個實施方案中，啟動子可以選自T7啟動子、阿拉伯糖啟動子phoA、tac、lpp、lac-lpp、lac、trp、trc，優(yōu)選T7啟動子和阿拉伯糖啟動子。在某些實施方案中，雙順反子表達系統(tǒng)包含兩個順反子，其在兩個啟動子的控制下表達編碼目的蛋白質(zhì)的多核苷酸序列。在一個實施方案中，兩個啟動子控制編碼相同目的蛋白質(zhì)的多核苷酸序列的表達。在另一個實施方案中，兩個啟動子控制編碼氨基酸長度或物理化學性質(zhì)不同的目的蛋白質(zhì)的多核苷酸序列的表達。

在某些實施方案中，目的蛋白質(zhì)可以選自肽和蛋白質(zhì)。

在一些實施方案中，蛋白質(zhì)可以在雙順反子載體中表達。所述蛋白質(zhì)包括抗體或其片段?？贵w片段可以在雙順反子表達系統(tǒng)中表達。抗體片段可以選自抗體的Fab重鏈和輕鏈或其它抗體片段，例如scFv、雙抗體、三抗體、四抗體、雙-scFv、微抗體Fab₂(雙特異性)、Fab3(三特異性)。在優(yōu)選的實施方案中，雙順反子表達系統(tǒng)表達編碼形成Fab抗體的抗體重鏈和輕鏈的多核苷酸序列。在這樣的實施方案中，F(xiàn)ab抗體顯示對VEGF受體的親和力，并且所述Fab抗體是雷珠單抗(Ranibizumab)。

在另一個實施方案中，蛋白質(zhì)可以選自但不限于G-CSF、IFN、促紅細胞生成素、胰島素及其變體、PTH(1-84aa)、FSH、LH、GH和蛋白質(zhì)二硫化物異構(gòu)酶(PDI)。

在一些實施方案中，所述肽可以在雙順反子載體中表達。所述肽包含選自至少小于40個氨基酸或優(yōu)選小于31個氨基酸或更優(yōu)選小于10個氨基酸的氨基酸序列。在某些實施方案中，肽分子量選自約2至約10kDa。所述肽可以選自但不限于GLP-1肽類似物如利拉魯肽或Exendinor GLP-2肽如替度魯肽和PTH(1-34aa)和胰島素。在另一個優(yōu)選的實施方案中，雙順反子表達系統(tǒng)表達編碼GLP-1激動劑肽的多核苷酸序列。在這樣的實施方案中，GLP-1肽是利拉魯肽。

在另一個實施方案中，兩個啟動子獨立地控制氨基酸長度和物理化學性質(zhì)不同的不同目的蛋白質(zhì)(例如抗體的重鏈或輕鏈)的表達。

在一個實施方案中，雙順反子表達系統(tǒng)包含：

a)第一順反子，其包含與編碼抗體重鏈的多核苷酸序列可操作地連接的T7啟動子；

b)第二順反子，其包含與編碼抗體輕鏈的多核苷酸序列可操作地連接的阿拉伯糖啟動子；

其中所述第一順反子和所述第二順反子位于單一載體中，并表達作為宿主細胞中形成的包涵體的抗體的重鏈和輕鏈。

在這樣的實施方案中，抗體的抗體重鏈和輕鏈包含核苷酸序列序列ID no.1和序列ID no.2或氨基酸序列序列ID no.3和序列ID no.4。在一些實施方案中，第一順反子和第二順反子的位置可互換，其中第二順反子可以克隆在載體中第一順反子的位置，第一順反子可以位于第二順反子處。抗體的重鏈和輕鏈獨立地表達為包涵體，并且可以進一步處理以獲得對VEGF受體顯示親和力的Fab抗體，并且所述Fab抗體是雷珠單抗。

在某些實施方案中，抗體的重鏈和輕鏈任選地與信號肽(優(yōu)選pelB)組合表達。信號肽指導蛋白在宿主細胞的周質(zhì)空間中的表達。

在實施方案中，在具有分別調(diào)節(jié)重組Fab片段的重鏈和輕鏈的產(chǎn)生的阿拉伯糖啟動子和T7啟動子的兩個不同啟動子且均具有pelB標簽的單一載體中的雙順反子表達系統(tǒng)在大腸桿菌的周質(zhì)空間中產(chǎn)生為不溶性包涵體。

在某些實施方案中，抗體的重鏈或輕鏈任選地與調(diào)節(jié)子(優(yōu)選AraC基因)組合表達，以進一步增加蛋白質(zhì)的表達。

雙順反子表達系統(tǒng)提供目的蛋白質(zhì)的等摩爾表達。為了以合適的質(zhì)量和數(shù)量獲得目的蛋白質(zhì)，非常需要等摩爾表達。其取決于重鏈與輕鏈的比例或克隆到載體中的多肽亞基的比例。在某些實施方案中，重鏈和輕鏈以合適的比率克隆，包括重鏈至少等于或高于輕鏈，以獲得重鏈和輕鏈的等摩爾表達。以選自1:5:0.7至1:1，包括1:3:0.8、1:2:0.9、1:2:1 1:1的比例克隆重鏈和輕鏈。

在實施方案中，雙順反子表達系統(tǒng)包含序列ID no 19所示的核苷酸序列。

在另一個實施方案中，雙順反子表達系統(tǒng)包含：

a)第一順反子，其包含與編碼肽的多核苷酸序列可操作地連接的T7啟動子；

b)第二順反子，其包含與編碼肽的多核苷酸序列可操作地連接的阿拉伯糖啟動子；

其中所述第一順反子和所述第二順反子位于單一載體中，并表達作為宿主細胞中形成的包涵體的所述肽。

在這樣的實施方案中，所述肽是GLP-1類似物，包含序列ID no 6所示的核苷酸序列，其編碼為具有序列ID No 7的氨基酸序列的利拉魯肽的GLP-1激動劑肽。

在某些實施方案中，肽可以任選地與本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的信號肽或調(diào)節(jié)子/增強子一起表達。

在某些實施方案中，所述肽可任選地與融合伴侶或融合標簽一起表達，以防止肽的降解。融合伴侶包含30個氨基酸至300個氨基酸的氨基酸序列。融合伴侶包含選自約50個氨基酸、100個氨基酸、約136個氨基酸、約175個氨基酸、約250個氨基酸、300個氨基酸，優(yōu)選約136個氨基酸的氨基酸序列。融合標簽可以選自但不限于組氨酸標簽、谷胱甘肽-s-轉(zhuǎn)移酶(GST)、麥芽糖結(jié)合蛋白、NusA、硫氧還蛋白(TRX)、多組氨酸(HIS)、小泛素樣修飾劑(SUMO)和泛素(Ub)和葡萄球菌激酶(SAK)基因。在優(yōu)選的實施方案中，融合標簽是SAK基因。SAK基因作為目的蛋白質(zhì)的融合標簽的詳細用途公開于US8853380中，其通過引用并入本文。

在一些實施方案中，雙順反子表達系統(tǒng)還包含選擇標記，其選自氨芐青霉素、卡那霉素，優(yōu)選氨芐青霉素。

在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了產(chǎn)生目的蛋白質(zhì)的方法，其包括以下步驟：

(i)用基本上由雙順反子表達系統(tǒng)組成的單一載體轉(zhuǎn)化宿主細胞；

(ii)在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的細胞以表達目的蛋白質(zhì)，其中第一順反子和第二順反子表達在包涵體中的目的蛋白質(zhì)；

(iii)進行包涵體的溶解；

(iv)進行目的蛋白質(zhì)的重折疊。

在實施方案中，將雙順反子表達系統(tǒng)轉(zhuǎn)染到合適的細菌宿主細胞中以表達目的蛋白質(zhì)。合適的細菌宿主細胞是大腸桿菌，其中目的蛋白質(zhì)以包涵體的形式表達。包涵體是在大腸桿菌的周質(zhì)或細胞質(zhì)中形成的不溶性物質(zhì)?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域熟知的技術(shù)分離、溶解包涵體，并且以活性形式回收目的蛋白質(zhì)。

在一個實施方案中，通過在具有兩個不同啟動子(阿拉伯糖啟動子和T7啟動子)的單一載體中構(gòu)建兩個獨立的順反子，將抗體的Fab重鏈和輕鏈或其它抗體片段，例如scFv、雙抗體、三抗體、四抗體、雙-scFv、微抗體Fab₂(雙特異性)、Fab3(三特異性)表達為大腸桿菌的周質(zhì)空間中的不溶性包涵體。兩個不同的啟動子，即T7啟動子和阿拉伯糖啟動子分別有助于Fab分子的重鏈和輕鏈的表達?？贵w重鏈和輕鏈在細菌細胞即大腸桿菌中作為非功能性包涵體產(chǎn)生，隨后對其進行提取、重折疊和純化。

在本發(fā)明的一個實施方案中，順反子包含這樣的結(jié)構(gòu)，即，每個基因(重鏈和輕鏈)在單個載體中具有其自身的啟動子和終止子。在T7啟動子的控制下克隆重鏈，而在阿拉伯糖啟動子的控制下克隆輕鏈。兩條鏈之前是信號序列pelB標簽，用于在細菌膜的周質(zhì)空間中獲得的產(chǎn)物。

雙順反子表達系統(tǒng)的優(yōu)點是，阿拉伯糖和T7兩者都是強啟動子，從單次發(fā)酵運行獲得輕鏈和重鏈兩者的高表達，而不是用輕鏈和重鏈克隆分開發(fā)酵。雙順反子表達系統(tǒng)使得更容易表征和維持單細胞庫，而不是用于輕鏈和重鏈克隆的分離的細胞庫。此外，當從細菌細胞的周質(zhì)空間提取時，由此獲得的包涵體是相對純的。作為包涵體獲得的高水平的表達和更純形式的輕鏈和重鏈相對更容易在離體折疊成功能性Fab，從而顯著地增加產(chǎn)物的產(chǎn)量。

該系統(tǒng)的另一個優(yōu)點是可以在阿拉伯糖啟動子和T7啟動子下克隆和表達目的蛋白質(zhì)，并且可以顯著提高蛋白質(zhì)的表達水平。

下面公開的實施例僅用于說明本發(fā)明的目的，而不是限制性的。

實施例1：在pET21a載體中克隆重鏈

用于克隆Fab片段的重鏈和輕鏈的DNA序列分別在序列ID no 1和2中給出。使用基因特異性引物從合成DNA來擴增重鏈插入物。根據(jù)本領(lǐng)域熟知的方法設(shè)計引物。然后將重鏈PCR產(chǎn)物用NdeI-HindIII酶消化，并連接到用相同酶消化的pET21a載體。通過菌落PCR篩選克隆體并通過限制性分析證實。將所得克隆體命名為pET21a-HC。將重組載體導入BL21A1細胞系并檢查重鏈的表達。

實施例2：在pBAD24M載體中克隆輕鏈

使用基因特異性引物從合成DNA來擴增輕鏈插入物。根據(jù)本領(lǐng)域熟知的方法設(shè)計引物。將擴增的輕鏈用NdeI-HindIII酶消化，并在相同位點連接到消化的pBAD24M載體(實驗室中可獲得)。通過菌落PCR篩選克隆體并通過限制性分析證實。將所得克隆體命名為pBAD24M-LC。將重組載體導入BL21A1細胞系并檢查輕鏈的表達。

實施例3：在同一載體中構(gòu)建兩個獨立的順反子

設(shè)計引物以與阿拉伯糖啟動子、終止子和araC基因一起擴增輕鏈。根據(jù)本領(lǐng)域熟知的方法設(shè)計引物。引物將BglII接頭加入擴增產(chǎn)物。pET21a載體具有在T7啟動子上游的單個BglII位點。使用載體特異性引物從模板pBAD24M來擴增輕鏈表達盒，并在BglII位點克隆到pET21a-HC克隆體中。通過限制性消化和測序確認所述克隆體。最終的克隆體命名為pET21a-HC-LC，并基于表達列出合適的克隆體。pET21a-HC-LC的克隆圖譜示于圖2中。

這樣產(chǎn)生的克隆體含有重鏈和輕鏈兩者的獨立調(diào)節(jié)和表達所需的所有區(qū)段。

實施例4：表達分析

使用大腸桿菌BL21A1細胞系作為表達宿主。除了BL21A1之外，使用BL21DE3或基因組中含有T7啟動子的任何其它細胞系。使用上述選擇的克隆體連同作為對照的pET21a-HC和pBAD24M-LC轉(zhuǎn)化BL21A1細胞。通過IPTG誘導重鏈，通過阿拉伯糖誘導輕鏈。誘導物濃度為13mM阿拉伯糖和1mM IPTG，當培養(yǎng)物OD 600為～1時完成誘導。誘導后4小時收獲細胞。在搖瓶中進行研究。將獲得的收獲物用珠裂解并離心以分離可溶性級分和不溶性級分。將樣品裝載在12％SDS PAGE凝膠上以檢查表達。SDS PAGE凝膠分析示于圖3中。將還原的雷珠單抗加載到圖3的泳道5中以證實還原的輕鏈和重鏈的表達。

SDS PAGE分析顯示不溶性沉淀級分中兩條鏈的表達，并且也通過RP-HPLC分析得以證實，其中參考產(chǎn)品的輕鏈和重鏈的保留時間對應(yīng)于內(nèi)部產(chǎn)物的保留時間。使用的對照是還原的Fab分子(參考產(chǎn)品)，以及pET21a-HC克隆體和pBAD24M克隆體的產(chǎn)物。因此，證實了來自單個克隆體的重鏈和輕鏈的表達。RP-HPLC分析示于圖4和5中。在RP-HPLC中，將雙順反子克隆體的溶解和還原的IB與還原的雷珠單抗(RMP)以及分別表達重鏈和輕鏈的克隆體(即，pET21-HC和pBAD24MLC)相比較。

僅表達輕鏈的pBAD24MLC的溶解的IB的主峰保留時間(RT)與還原的RMP的輕鏈的RT匹配。在RT 13分鐘的雜質(zhì)峰與重鏈的保留時間匹配，這表明相似的疏水性。因此，通過LC-MS/MS表征雜質(zhì)，并且最終注釋為在RT 17分鐘的宿主細胞蛋白質(zhì)OMP C和具有未裂解的前導序列的輕鏈。由pET21a-HC表達的重鏈與參考標準重鏈匹配。該圖譜還表明在RT 19分鐘的后峰，其表征為具有未裂解的前導序列的重鏈。表達LC和HC兩者的雙順反子克隆體pET21a_HC_LC具有2個主峰，其具有與參考標準品的LC和HC相當?shù)谋Ａ魰r間。但是，由于OMP C與重鏈共洗脫，反相測試方法需要更好地解析，這在圖4中給出。

將Zorbax C8RP柱上的現(xiàn)有方法修改為Aeriswidepore C8，并解析共洗脫物質(zhì)。在Aeriswidepore C8上，pET21a_HC_LC的溶解的IB顯示出不同的LC、HC和OMP C峰，使得能夠鑒定和精確定量IB中的各個亞基，如圖5所示。

雖然上面已經(jīng)詳細描述了某些實施方案和實施例，但是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將清楚地理解，在不脫離其教導的情況下，可以對實施方案和實施進行許多修改。

實施例no.5：在pET24a載體中克隆具有葡萄球菌激酶(SAK)融合標簽的小肽(利拉魯肽)

使用基因特異性引物由合成DNA擴增SAK和利拉魯肽基因。根據(jù)本領(lǐng)域中熟知的方法設(shè)計引物，將PCR產(chǎn)物用NdeI-BamHI和BamHI-HindIII酶消化并且在NdeI-HindIII位點連接到消化的pET24a載體。通過菌落PCR篩選克隆體并通過限制性分析證實。將所得的克隆體命名為pET24a-SAK-Lira。

實施例6：在pBAD24M載體中克隆具有葡萄球菌激酶融合標簽的小肽(利拉魯肽)

如實施例no 6中所給出的，將具有SAK標簽的利拉魯肽克隆到pBAD24M載體中。將該克隆體命名為pBAD24M-SAK-Lira。

實施例no.7：在同一載體中構(gòu)建兩個獨立的順反子，兩個順反子均表達SAK-Lira融合肽。

使用實施例no.3中使用的克隆設(shè)計策略構(gòu)建利拉魯肽的雙順反子克隆體，其中從pBAD24M-SAK-Lira克隆體擴增SAK-Lira融合基因以及阿拉伯糖表達盒，并克隆到pET24a-SAK-Lira克隆體中以構(gòu)建雙順反子構(gòu)建體。將該克隆體標記為pET-ara-SAK-Lira。

實施例no.8：具有SAK-Lira融合蛋白的雙順反子克隆體的表達分析。

使用大腸桿菌BL21A1細胞系作為表達宿主。除了BL21A1之外，使用BL21DE3或基因組中含有T7啟動子的任何其它細胞系。使用上述單和雙順反子構(gòu)建體轉(zhuǎn)化BL21A1細胞。通過IPTG和阿拉伯糖誘導克隆體。誘導物濃度為13mM阿拉伯糖和1mM的IPTG，當培養(yǎng)物OD 600為～1時完成誘導。誘導后4小時收獲細胞。在搖瓶中進行研究。將獲得的收獲物用珠裂解并離心以分離可溶性級分和不溶性級分。將樣品裝載在12％SDS PAGE凝膠上以檢查表達。

SDS PAGE凝膠分析清楚地顯示，與單順反子pET24a-SAK-Lira克隆體(圖6泳道3)相比，在雙順反子克隆體(圖6泳道2)中SAK-Lira融合蛋白的表達增加。