骨移植物被用于促進(jìn)脊柱融合中的骨愈合，在頜面外科手術(shù)中或在創(chuàng)傷性骨缺損不愈合的情況下增加骨。從髂嵴采取的松質(zhì)骨仍然被認(rèn)為是用于脊柱融合的標(biāo)準(zhǔn)，但是與高并發(fā)癥率相關(guān)¹。同種異體移植骨是一種常用的替代方案，但可能缺乏成骨性并增加手術(shù)部位感染的風(fēng)險(xiǎn)²。合成的β-磷酸三鈣骨移植物可以單獨(dú)使用或與自體干細(xì)胞組合使用，但已報(bào)道了植入失敗³。通過自體細(xì)胞和天然或合成生物材料的組合制造的組織工程化骨可能構(gòu)成潛在的替代方案。然而，這些移植物迄今尚未進(jìn)行到臨床實(shí)踐，因?yàn)樵谌睋p部位足夠的血管形成的問題仍然未解決⁴。

另一個(gè)主要的臨床問題是骨質(zhì)疏松或創(chuàng)傷性椎骨骨折的治療：目前，新近的骨折在經(jīng)皮椎體后凸成形術(shù)或椎體成形術(shù)程序中通過灌注骨水泥治療⁵。這些程序的并發(fā)癥包括水泥外滲、相鄰椎骨骨折和感染⁶。使用骨水泥的另一個(gè)問題是有限的生物相容性：對(duì)不同PMMA水泥的體外研究證明了它們引發(fā)細(xì)胞損傷和炎癥的潛力⁷。PMMA骨水泥在聚合后沒有形狀改變的可能性，使得它們不適合用于治療處于生長(zhǎng)期的兒童和青年?？晌盏牧姿徕}水泥可以用于這個(gè)患者組，但顯示45％的泄漏率，具有不清楚的長(zhǎng)期臨床后果⁸。由于其對(duì)抗彎曲、吸引和剪切力的低抗性，存在水泥失效和矯正丟失的較高風(fēng)險(xiǎn)⁹。迄今為止還不存在將優(yōu)良的生物相容性與合適的機(jī)械穩(wěn)定性結(jié)合的合適的生物治療。

由于不良的固有愈合能力，關(guān)節(jié)軟骨的全厚度缺損仍然是未解決的臨床問題。外科治療選擇包括骨髓刺激技術(shù)，如鉆孔¹⁰或微骨折¹¹。兩種技術(shù)均建立軟骨損傷和骨髓之間的連通，從而允許來自下面的骨髓腔的間充質(zhì)干細(xì)胞遷移至缺損¹²。來自關(guān)節(jié)的非負(fù)重區(qū)域的骨軟骨柱的移植¹³代表另一種治療選擇。由于沒有獲得透明軟骨，并且纖維軟骨修復(fù)組織不能耐受隨時(shí)間的機(jī)械應(yīng)力¹⁴，這些手術(shù)程序都未導(dǎo)致恢復(fù)原狀。

已在體外分離和擴(kuò)增的自體軟骨細(xì)胞的移植(ACI)代表了針對(duì)軟骨修復(fù)的生物學(xué)方法¹⁵。ACI包括一系列程序：從受影響關(guān)節(jié)的非負(fù)重區(qū)域關(guān)節(jié)鏡獲取軟骨組織。將軟骨活檢切成小塊并酶促消化以分離關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞，然后將其在體外擴(kuò)增數(shù)周。在第二外科手術(shù)中，缺損被仔細(xì)地清創(chuàng)并被骨膜瓣(periostal flap)或生物膜覆蓋，在其下面注射軟骨細(xì)胞。在修改的該治療中，將軟骨細(xì)胞接種到膠原基質(zhì)上，然后植入¹⁶。

兩種方法都有困難：如果使用骨膜瓣封閉缺損¹⁵，需要修正手術(shù)的骨膜肥大在高達(dá)15.4％的病例中發(fā)生。在25％的經(jīng)歷基質(zhì)輔助的軟骨細(xì)胞移植的患者中也觀察到了暫時(shí)性移植物肥大¹⁶。通常為?；蜇i來源的生物膜的使用可能導(dǎo)致過敏反應(yīng)，并因此在對(duì)動(dòng)物來源的材料具有已知超敏反應(yīng)的患者中是禁忌的¹⁷。因?yàn)楫a(chǎn)品未針對(duì)可傳播的傳染病進(jìn)行常規(guī)篩選，所以它們可能對(duì)健康護(hù)理提供者¹⁸和接受者造成健康風(fēng)險(xiǎn)。

在WO 2005/018549 A2中和在2009年，Evans等人²³描述了使用用于表達(dá)BMP-2的重組腺病毒載體產(chǎn)生活化肌肉或脂肪移植物。此方法具有病毒感染的風(fēng)險(xiǎn)²³，具有高風(fēng)險(xiǎn)特征并且可能導(dǎo)致移植排斥。此外，腺病毒激活的脂肪愈合不快，在愈合骨一致性上有高變異性²³。此外，腺病毒活化的脂肪顯示用于組織修復(fù)的希望，但與肌肉組織相比愈合不快。這些差異可能是方法特異性的，最終脂肪組織對(duì)腺病毒感染的易感性較低。Orlicky和Schaak報(bào)道了前脂肪細(xì)胞系3T3-L1被腺病毒載體無效率地轉(zhuǎn)染²⁵。在綜述²⁴中，與體內(nèi)細(xì)胞活化方法相比，離體方法被認(rèn)為是累贅的、非常昂貴的和較不吸引人的。

WO 03/015803A1涉及提供間充質(zhì)細(xì)胞以治療關(guān)節(jié)中的關(guān)節(jié)缺損和骨關(guān)節(jié)病并進(jìn)一步產(chǎn)生移植物。提供合適的移植物的問題在該文獻(xiàn)中未被解決。

Wang等人²⁶描述了分化從兔分離并且接種到無細(xì)胞軟骨基質(zhì)中的脂肪來源的干細(xì)胞。

Sandor等人²⁷和WO 2006/009452 A2描述了來源于分離的自體脂肪干細(xì)胞的人工構(gòu)建體。分離細(xì)胞并離體擴(kuò)增并接種到粒狀β-磷酸三鈣支架中。

Salibian等人²⁸涉及整形外科手術(shù)中的干細(xì)胞。

Inok Kim等人²⁹和Jung等人³⁰涉及纖維蛋白膠中的MSC。

Eun Hee等人³¹綜述了分離的脂肪來源的干細(xì)胞的使用。

Stromps等人³²描述了分離的脂肪來源的干細(xì)胞的成軟骨分化。

Sujeong等人³³涉及脂肪組織來源的干細(xì)胞的神經(jīng)分化。從耳葉分離細(xì)胞并培養(yǎng)。

Halvorsen等人¹⁹描述了將基于分離的脂肪來源干細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物用于骨細(xì)胞形成。通過膠原酶從組織中除去細(xì)胞并在體外培養(yǎng)。然而，這些細(xì)胞在體外的擴(kuò)增不是高效的，并且在用于骨修復(fù)的糊劑中使用這樣的細(xì)胞的所描述的預(yù)測(cè)失敗。

因此，需要提供患者良好耐受的移植物，并提供滿足修復(fù)組織所需的強(qiáng)度和耐久性以及在血管化受體組織的情況下足夠的血管生成性質(zhì)的要求的足夠的組織替換。

為了滿足這些需要，本發(fā)明提供了通過將供體結(jié)締組織(優(yōu)選脂肪組織)直接轉(zhuǎn)分化至另一種結(jié)締組織類型來產(chǎn)生生物工程化結(jié)締組織移植物的方法，包括在體外a)以至少1小時(shí)(優(yōu)選至少2天)或體內(nèi)和/或b)通過一種或多種結(jié)締組織特異性生長(zhǎng)或分化因子培養(yǎng)供體結(jié)締組織。還提供了產(chǎn)生適合用于矯正結(jié)締組織缺損(tissue defect)的結(jié)締組織移植物的方法，其包括確定組織缺損的大小和形狀，通過以任何順序的下述操作處理從患者獲得的供體結(jié)締組織(優(yōu)選脂肪組織)：塑型供體組織以適合組織缺損的大小和形狀，并使脂肪組織與一種或多種結(jié)締組織特異性生長(zhǎng)或分化因子接觸，從而起始組織移植物向另一種結(jié)締組織的分化。本發(fā)明的方法使用全組織而無需從組織分離和培養(yǎng)干細(xì)胞。供給至轉(zhuǎn)分化步驟的本發(fā)明的組織包含處于其原始細(xì)胞外基質(zhì)和細(xì)胞組構(gòu)(cellular organization)中的細(xì)胞，其在本文中還被稱為全(供體)組織。因此，與經(jīng)由分離的細(xì)胞的間接分化形成對(duì)比，本發(fā)明的方法被稱為“直接”轉(zhuǎn)分化，即“組織至組織”。分離的細(xì)胞和從其生長(zhǎng)的產(chǎn)物(無論是在培養(yǎng)基中還是在人工支架中)都不被認(rèn)為是根據(jù)本發(fā)明的組織。根據(jù)本發(fā)明，結(jié)締組織、供體組織(來自供體患者)被轉(zhuǎn)化為另一種結(jié)締組織(移植物組織，其不同于供體組織類型)。供體組織優(yōu)選為脂肪。本發(fā)明的移植物可用于治療受試者中的結(jié)締組織缺損，例如，通過將移植物插入缺損中或?qū)⒁浦参锸┘拥饺睋p上。特別地，本發(fā)明在本文所述的任何方法實(shí)施方案中提供了將脂肪組織(作為供體組織)轉(zhuǎn)分化至另一種非脂肪組織(移植物組織)的方法。還提供了用于在方法中使用的結(jié)締組織特異性生長(zhǎng)或分化因子以及將所述結(jié)締組織特異性生長(zhǎng)或分化因子用于制備用于在這樣的方法如治療方法中使用的組合物。

還提供了用于制備本發(fā)明的適合用于此組織缺損矯正治療的移植物的離體或體內(nèi)方法，以及適合用于制備和分化供體(優(yōu)選脂肪)組織成合適的移植物的試劑盒。本發(fā)明的其它方面和優(yōu)選實(shí)施方案描述于權(quán)利要求中。所有這些方法和實(shí)施方案是相互關(guān)聯(lián)的并且可以彼此組合，例如試劑盒可以用于本發(fā)明的方法中，反之亦然，試劑盒可以被調(diào)整以適合用于執(zhí)行任何一種本發(fā)明的方法；離體方法可以用作治療方法的一部分；在離體步驟中產(chǎn)生的移植物可以治療性使用或提供為用于這樣的治療用途的組合物。對(duì)于任何特定方面描述的所有優(yōu)選實(shí)施方案還應(yīng)被視為描述任何其它發(fā)明方面，如將立即設(shè)想這樣的實(shí)施方案的一般性的本領(lǐng)域技術(shù)人員所清楚的。此外，每個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案還可以與每個(gè)其它優(yōu)選實(shí)施方案組合；特別優(yōu)選的是遵循本文所述的所有優(yōu)選的建議，除非明確排除。

本發(fā)明提供了產(chǎn)生適合用于矯正結(jié)締組織缺損的結(jié)締組織移植物(其可以在使用或不使用支架的情況下應(yīng)用)，從患者獲得經(jīng)塑型以適合患者中的組織缺損的大小和形狀的供體(優(yōu)選脂肪)組織，使供體(優(yōu)選脂肪)組織與一種或多種結(jié)締組織特異性生長(zhǎng)或分化因子接觸(本文中的“孵育”)，從而起始組織移植物的分化。“接觸”是用各自的生長(zhǎng)或分化因子處理組織(或所述組織內(nèi)的細(xì)胞)，由此所述組織適應(yīng)于由這些因素引起的新條件，進(jìn)而導(dǎo)致轉(zhuǎn)分化。

先前的離體方法聚焦于分離的細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物或病毒轉(zhuǎn)染。然而，體外細(xì)胞分離、單層擴(kuò)增和在植入之前再分化是累贅的，并且可導(dǎo)致單層培養(yǎng)物中的去分化。本發(fā)明的代替分離的細(xì)胞的全組織的轉(zhuǎn)分化減少了這些缺點(diǎn)并且僅需要最小的體外或離體處理，其可以在GMP順應(yīng)性的、全自動(dòng)的組織處理裝置中進(jìn)行。例如。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，細(xì)胞培養(yǎng)基需要以諸如每周1-4次的常規(guī)間隔替換或更新。

任何類型的脂肪組織可以用于供體組織，包括但不限于來自諸如胸部、腹部和臀部、髖部和腰部的區(qū)域的皮下蓄積庫(kù)(depot)；或異位或內(nèi)臟脂肪。雖然在本發(fā)明的所有實(shí)施方案中脂肪是優(yōu)選的供體組織類型，但是可以使用其它結(jié)締組織以及供體，例如，軟骨、肌肉、腱、韌帶或神經(jīng)供體組織，用于本發(fā)明的所有實(shí)施方案替代脂肪。

可以使用本領(lǐng)域中標(biāo)準(zhǔn)的用于獲得用于移植的組織的方法從患者中提取組織。例如，可以使用標(biāo)準(zhǔn)或微創(chuàng)外科手術(shù)技術(shù)外科手術(shù)地提取這樣的組織。微創(chuàng)手術(shù)可涉及通過身體中期望的使用位置處的天然或手術(shù)創(chuàng)建的小直徑的開口提取脂肪組織，以使得外科手術(shù)介入是可能的而對(duì)患者施加的應(yīng)激顯著較小，例如，不使用全身麻醉。

在某些實(shí)施方案中，以適合用于植入特定組織缺損的大小和形狀從患者中取出組織。在其它實(shí)施方案中，從患者中取出組織，然后將其離體改變?yōu)樗璧拇笮『托螤睢?/p>

供體(優(yōu)選脂肪)組織可包含基質(zhì)細(xì)胞。其還可以包含脂肪細(xì)胞，例如白色和/或棕色脂肪細(xì)胞。通常干細(xì)胞存在于分化至特異于感興趣的結(jié)締組織(即組織缺損的組織)的細(xì)胞的脂肪組織中。這樣的細(xì)胞可以是間充質(zhì)干細(xì)胞或基質(zhì)干細(xì)胞。還令人驚訝的是，存在于本發(fā)明的脂肪組織中的脂肪細(xì)胞不需要被去除，而是可以保留并被包埋在最終的分化的組織移植物中。脂肪細(xì)胞的數(shù)目可以是組織移植物的所有細(xì)胞的至少20％，至少30％或至少40％，至少50％，至少60％，至少70％或更多。

優(yōu)選地，刺激脂肪細(xì)胞以減少或消耗其脂肪蓄積庫(kù)。這可以通過化學(xué)品或(細(xì)胞因子或激素)受體刺激或機(jī)械刺激進(jìn)行。受體刺激包括使包含脂肪細(xì)胞的供體組織與瘦素接觸。機(jī)械刺激包括揉捏或分散包含脂肪細(xì)胞的供體組織。在將組織分化至骨組織的情況下，并且還在軟骨組織的情況下，脂肪蓄積庫(kù)的減少或消耗是特別優(yōu)選的。脂肪含量可以減少到小于50％(w/w)，優(yōu)選小于30％或小于20％，例如在50％-10％的范圍內(nèi)的脂肪量。脂肪組織具有～0.9g/ml的密度。脂肪減少或消耗可導(dǎo)致密度為至少0.93g/ml、優(yōu)選至少0.95g/ml、甚至更優(yōu)選至少0.97g/ml的組織。處理可以是將要達(dá)到例如0.93g/ml至1.10g/ml的密度。

可以任意選擇使大小和形狀適合于組織缺損的步驟和接觸供體組織并從而起始供體組織的分化的步驟的順序，例如醫(yī)生可以首先調(diào)整形狀，然后分化細(xì)胞，或者可以首先分化細(xì)胞，然后使移植物成形以適合組織缺損。當(dāng)然，成形也可以在分化之前和之后進(jìn)行，例如，在分化之前提供粗略形狀，然后在分化后微調(diào)形狀。同樣，確定缺損的大小可以在分化之前或之后。優(yōu)選的是在分化之前，以選擇足夠大小的供體組織，其當(dāng)然也可以隨后在插入缺損后微調(diào)至缺損的大小。

分化導(dǎo)致產(chǎn)生增加數(shù)量的移植結(jié)締組織(包括骨、軟骨、肌肉(生肌組織)、腱(生腱組織(tenogenic tissue))、韌帶或神經(jīng)細(xì)胞(神經(jīng)源性組織))的細(xì)胞，和優(yōu)選還產(chǎn)生特異于移植結(jié)締組織的細(xì)胞外基質(zhì)。然而，供體組織(特別是脂肪組織)的細(xì)胞外基質(zhì)還可以至少部分地保留在最終的移植物組織中。通過選擇本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的合適的結(jié)締組織特異性生長(zhǎng)或分化因子和/或適合用于所述分化的孵育時(shí)間，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以將分化引導(dǎo)至特定類型的移植物組織。特別地，移植結(jié)締組織類型可以是骨或軟骨。

“起始組織移植物的分化”是指不一定完全分化供體結(jié)締組織(優(yōu)選脂肪組織)的所有應(yīng)答性細(xì)胞(例如干細(xì)胞)，但通常足以起始分化反應(yīng)，以使得細(xì)胞即使在(離體)孵育之后(特別是在插入組織缺損后)也將繼續(xù)分化。優(yōu)選(離體)分化發(fā)生至少直到移植物達(dá)到缺損組織的至少5％、優(yōu)選至少50％的拉伸強(qiáng)度。在骨移植物的情況下，移植物組織具有比骨更低的拉伸強(qiáng)度，以允許容易地處理移植物組織，從而保持移植物組織的柔性。在骨的情況下，優(yōu)選的拉伸強(qiáng)度為缺損組織的約5％至15％。特別地，但不限于，在軟骨、肌肉、腱、韌帶或神經(jīng)移植物靶的情況下，優(yōu)選地，移植物達(dá)到缺損組織的至少25％，優(yōu)選至少50％的拉伸強(qiáng)度。或者或另外，優(yōu)選差異發(fā)生至少直到移植物達(dá)到至少20％，優(yōu)選至少40％，例如至少20％的密度。20％至60％的缺損組織。本文給出的拉伸強(qiáng)度和密度是指如從原始供體組織到靶移植物組織比較的拉伸強(qiáng)度或密度的變化。百分比將參數(shù)(拉伸強(qiáng)度或密度)的變化定義為以所述百分比值至靶組織方向的逐漸變化。移植參數(shù)可以通過A+(B-A)*P計(jì)算，其中A是供體組織的參數(shù)，B是缺損的靶組織的參數(shù)，P是給定的百分比值。在用于骨缺損的骨移植物的情況下，優(yōu)選分化發(fā)生至少直到移植物達(dá)到缺損組織的至少20％，優(yōu)選至少40％，例如20％至60％的礦化含量。礦化含量可以通過組織學(xué)和確定2D切片中礦化區(qū)域的含量來確定。

對(duì)于椎骨骨折的治療，優(yōu)選(離體)分化發(fā)生至少直到移植物達(dá)到缺損組織的至少10％，優(yōu)選至少20％，例如10％至30％的礦化含量。通常，在通過小通道配合移植物組織的情況下(例如在椎骨骨折的情況下)，優(yōu)選的是，移植物組織具有足夠的彈性以用于通過通道例如以折疊狀態(tài)輸送并且上述較低的礦化是優(yōu)選的。

本發(fā)明的方法還可以包括將分化的移植物組織置于患者的組織缺損中。優(yōu)選地，患者和/或供體是人或非人動(dòng)物。非人動(dòng)物包括哺乳動(dòng)物，例如包括馬，牛，狗，貓，豬，羊，鳥類如鴕鳥或鸚鵡，爬行動(dòng)物如鱷魚。優(yōu)選地，具有組織缺損的患者和提供供體組織的患者是相同的患者(自體組織)。

在一個(gè)實(shí)施方案中，將移植物離體孵育足以允許供體組織中的至少一部分細(xì)胞分化或起始分化為用于組織移植物的所需細(xì)胞類型的一段時(shí)間。接觸步驟(孵育)的示例時(shí)間為1小時(shí)(h)至10周(w)，優(yōu)選1小時(shí)至6周。優(yōu)選的時(shí)間是至少1小時(shí)，至少2小時(shí)，至少3小時(shí)，至少5小時(shí)，至少8小時(shí)，至少12小時(shí)，至少18小時(shí)，至少24小時(shí)(1天；1d)，至少30小時(shí)，至少36小時(shí)，至少2d，至少3d，至少4d，至少5d，至少6d，至少7d，至少8d，至少9d，至少10d，至少11d，至少12d，至少14d。可選擇地或與這些最小時(shí)期中的任一個(gè)組合地，接觸步驟(孵育)為至多10w，至多8w、6w，至多5w，至多4w，至多3w，至多2w，至多10d，至多8d，至多6d，至多4d，至多3d，至多2d，至多1d，至多18h。優(yōu)選的范圍是2d至4w。

在替代離體分化或與其組合的實(shí)施方案中，本發(fā)明的移植物在體內(nèi)分化。因此，沒有離體分化的供體移植物或部分離體分化的移植物被放置或植入到組織缺損中，并被刺激以分化為缺損組織的組織類型。這可以通過對(duì)植入的移植物施用(例如通過局部注射)結(jié)締組織特異性生長(zhǎng)或分化因子(特異于缺損組織)來完成?？梢愿鶕?jù)組織類型和移植物大小來選擇施用的劑量和間隔。結(jié)締組織特異性生長(zhǎng)或分化因子可以與下文對(duì)于離體方法所進(jìn)一步描述的相同，其是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案。

根據(jù)本發(fā)明，供體組織的細(xì)胞優(yōu)選不經(jīng)分離和擴(kuò)增，而是僅經(jīng)轉(zhuǎn)分化。

在優(yōu)選的實(shí)施方案中，移植的結(jié)締組織是軟骨(成軟骨分化組織)。分化可以包括將脂肪組織的細(xì)胞分化至軟骨細(xì)胞和/或成軟骨細(xì)胞，優(yōu)選以及它們的特異性細(xì)胞外基質(zhì)。例如，移植物組織可以包含軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的標(biāo)記物，例如如圖2a-c所示的。分化因子隨后是軟骨細(xì)胞分化因子。這樣的因子或因子的混合物優(yōu)選包含TGF-β。TGF-β可以包括TGFβ-1、TGFβ-2或TGFβ-3中的任一種或其混合物，例如TGFβ-1和TGFβ-2。此外，優(yōu)選的是胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF)。其它成軟骨生長(zhǎng)和分化因子包括BMP-2，BMP-4，BMP-6，BMP-7，BMP-9，地塞米松，α-FGF，F(xiàn)GF-2，IGF-1，IGF-2，其全都可以任選地附加使用(例如附加于TGF-β)或作為替代物使用。在軟骨靶移植物組織的情況下，優(yōu)選在不存在血清的情況下培養(yǎng)組織。軟骨組織質(zhì)量可以通過在轉(zhuǎn)分化期間或之后加入BMP-14(GDF-5)來進(jìn)一步改善。

在進(jìn)一步的優(yōu)選實(shí)施方案中，移植的結(jié)締組織是骨(成骨分化組織)。分化可以包括脂肪組織的細(xì)胞分化至骨細(xì)胞和/或成骨細(xì)胞，優(yōu)選以及其特異性細(xì)胞外基質(zhì)，例如礦化。分化因子隨后是成骨分化因子。這樣的因子或因子的混合物優(yōu)選包含β-甘油磷酸酯。其它成骨生長(zhǎng)和分化因子包括地塞米松，bFGF，BMP-2，PGF，成骨蛋白，GDF-5，CTFG，其全都可以任選地附加使用(例如附加于β-甘油磷酸酯)或作為替代物使用。特別優(yōu)選的是如下文進(jìn)一步詳細(xì)描述的作為添加劑的血清。特別優(yōu)選的是β-甘油磷酸酯、地塞米松和抗壞血酸的組合，優(yōu)選進(jìn)一步與血清組合。

在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，移植結(jié)締組織是腱(生腱分化組織)。分化可以包括將供體組織(優(yōu)選脂肪組織)的細(xì)胞分化至腱細(xì)胞。分化因子隨后是生腱分化因子。這樣的因子或因子的混合物優(yōu)選包括在具有或不具有BMP-2、PGE₂、BMP-12、BMP-14、TGFβ₃和富含血小板的血漿釋放物、優(yōu)選以及血清中的任何一種或多種的情況下的機(jī)械體外拉伸。示例性生腱分化培養(yǎng)基包含補(bǔ)充有1％FCS和BMP-12(優(yōu)選約10ng/ml BMP-12)的DMEM-F12。

在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，移植結(jié)締組織是肌肉(肌原性分化組織)。分化可以包括將供體組織(優(yōu)選脂肪組織)的細(xì)胞分化至肌細(xì)胞。分化因子隨后是生肌分化因子。這樣的因子或因子的混合物優(yōu)選包括5-氮雜胞苷、兩性霉素B、bFGF和優(yōu)選以及血清中的任何一種或多種。

在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，移植結(jié)締組織是神經(jīng)(神經(jīng)源性分化組織)。分化可以包括將供體組織(優(yōu)選脂肪組織)的細(xì)胞分化至神經(jīng)細(xì)胞。分化因子隨后是神經(jīng)源性分化因子。這樣的因子或因子的混合物優(yōu)選包括FGF-2、視黃酸、2-巰基乙醇、氫化可的松、cAMP、aFGF、Shh、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(brain derived neurotropic factor)、神經(jīng)生長(zhǎng)因子、玻連蛋白、AsA、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、毛喉素和佛波醇肉豆蔻酸乙酸酯(優(yōu)選其20nM)以及優(yōu)選血清中的任何一種或多種。

在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，移植結(jié)締組織是韌帶。分化可以包括將供體組織(優(yōu)選脂肪組織)的細(xì)胞分化至韌帶細(xì)胞。分化因子隨后是成纖維細(xì)胞分化因子。這樣的因子或因子的混合物優(yōu)選包括TGF-β1、IGF-1、PDGF、BMP-12、bFGF和胰島素以及優(yōu)選血清中的任何一種或多種。

對(duì)于軟骨分化，生長(zhǎng)和分化因子可以包括地塞米松、抗壞血酸-2-磷酸鹽、胰島素、亞硒酸、轉(zhuǎn)鐵蛋白、丙酮酸鈉和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β)、BMP-14和/或胰島素樣生長(zhǎng)因子(例如IGF-1)中的一種或多種。特別優(yōu)選的是TGF-β和/或IGF-1。可以用所有這些組分實(shí)現(xiàn)特別有效的分化。

還可以包括的另外的營(yíng)養(yǎng)物包括Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基和Ham營(yíng)養(yǎng)混合物F12、任何蛋白質(zhì)性氨基酸(proteinogenic amino acid)，例如L-谷氨酰胺。

對(duì)于成骨(骨)分化，考慮到軟骨發(fā)育是骨發(fā)育的前兆，軟骨生長(zhǎng)和分化因子可以與另外的骨生長(zhǎng)和分化因子一起使用。

成骨分化因子是例如描述于參考文獻(xiàn)21中的，并且可以包括1-1000nM的地塞米松(Dex)、0.01-4mM L-抗壞血酸-2-磷酸酯(AsAP)或0.25mM抗壞血酸和1-10mMβ-甘油磷酸酯(βGP)。其可以包括DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基加上100nM Dex、0.05mM AsAP和10mMβGP。

優(yōu)選地，骨分化和生長(zhǎng)因子包括選自以下的一種或多種：抗壞血酸，任何蛋白質(zhì)性氨基酸，例如L-谷氨酰胺，地塞米松，β-甘油磷酸酯和瘦素。特別優(yōu)選的是β-甘油磷酸酯和/或瘦素?？梢杂盟羞@些組分實(shí)現(xiàn)特別有效的分化。

還優(yōu)選在骨分化期間使用如在Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基(DMEM)和/或血清中的營(yíng)養(yǎng)物。DMEM提供了可在本發(fā)明的任何方法中用于在分化期間和之后培養(yǎng)任何預(yù)分化的脂肪組織的基本營(yíng)養(yǎng)物，包括氨基酸。

優(yōu)選地，在分化步驟期間將血清，特別是來自轉(zhuǎn)分化的組織移植物的接受者的自體血清添加至供體(優(yōu)選脂肪)組織，優(yōu)選在離體培養(yǎng)物中進(jìn)行。血清可以是哺乳動(dòng)物血清，例如牛血清，特別優(yōu)選的是胎小牛血清或胎牛血清，但在人患者的情況下優(yōu)選人血清。血清可以以1％至80％(v/v)，優(yōu)選2％至60％，3％至50％，4％至40％，5％至30％，特別優(yōu)選6％至20％的濃度提供。血清通常僅用于維持某些細(xì)胞存活或增殖-甚至是軟骨細(xì)胞，然而其在存在或血清存在下去分化至其它細(xì)胞和/或減少其膠原和糖胺聚糖合成。血清優(yōu)選不用于軟骨移植物。轉(zhuǎn)分化通常不依賴于血清。根據(jù)本發(fā)明的方法，可以在骨、肌肉、腱、韌帶或神經(jīng)產(chǎn)生期間使用血清?？梢允褂闷渌襟E來促進(jìn)向這些組織的細(xì)胞的分化。

優(yōu)選地，IGF(特別是IGF-1)用于骨分化。

優(yōu)選地，結(jié)締組織特異性生長(zhǎng)和/或分化因子外在地提供至組織，例如，組織與這些因子接觸，并且因子不在供體或移植物組織的細(xì)胞中重組表達(dá)。

令人驚訝的是，發(fā)現(xiàn)可以促進(jìn)骨分化，而不需要骨形態(tài)發(fā)生蛋白，例如BMP-2。因此，在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，BMP或編碼BMP的核酸不加入到用于軟骨和/或骨分化的脂肪組織中。在其它實(shí)施方案中，可以使用BMP，例如BMP-5或BMP-7。BMP是BMP1，BMP2，BMP3，BMP4，BMP5，BMP6，BMP7，BMP8a，BMP8b，BMP10，BMP15。

優(yōu)選地，核酸(例如轉(zhuǎn)基因)不用作生長(zhǎng)或分化因子。本發(fā)明的分化或生長(zhǎng)因子是蛋白質(zhì)或肽。另外或可選地，可以使用具有至多10kDa，優(yōu)選至多5kDa，特別優(yōu)選至多2kDa的大小的小有機(jī)分子。

優(yōu)選地，結(jié)締組織特異性生長(zhǎng)或分化因子包括抗壞血酸或抗壞血酸酯，優(yōu)選抗壞血酸-2-磷酸酯，或其任何藥學(xué)上可接受的鹽?？箟难峒捌漉?例如L-抗壞血酸2-磷酸酯)刺激膠原累積、細(xì)胞增殖以及通過皮膚成纖維細(xì)胞形成三維結(jié)構(gòu)。因此，在本發(fā)明的任何方法及其任何實(shí)施方案(包括軟骨或骨分化)中，抗壞血酸及其衍生物是作為結(jié)締組織特異性生長(zhǎng)或分化因子的優(yōu)選組分或作為這樣的因子的混合物中的添加劑。

優(yōu)選地，分化(孵育)在30至40℃的溫度下進(jìn)行。還優(yōu)選地，分化(孵育)在包含0.01％至10％(w/v)CO₂的氣氛下進(jìn)行。還優(yōu)選地，分化(孵育)在包含70％-98％濕度的氣氛下進(jìn)行。優(yōu)選地，但不是必須地，使用這些參數(shù)的組合。

在本發(fā)明的方法中，供體和移植物組織的細(xì)胞(至少組織內(nèi)經(jīng)轉(zhuǎn)分化的細(xì)胞)保持存活。

在特定方面，本發(fā)明提供了用于將供體(優(yōu)選脂肪)組織制備成適合用于結(jié)締組織修復(fù)的分化的移植物的離體方法，其包括使供體(優(yōu)選脂肪)組織與一種或多種結(jié)締組織特異性生長(zhǎng)或分化因子接觸，從而起始組織移植物的分化，其中所述接觸在30至40℃的溫度、0.01％至10％(w/v)CO₂和70％至98％的濕度下持續(xù)1小時(shí)至4周的時(shí)間，優(yōu)選其中所述方法進(jìn)一步通過如上或如下所述的其它步驟來限定。特別地，結(jié)締組織特異性生長(zhǎng)或分化因子由大小為至多10kDa的蛋白質(zhì)、肽和小分子組成，例如不使用在脂肪組織的細(xì)胞中的重組表達(dá)。

如果需要，可將供體或移植物組織切成所需大小的切片以促進(jìn)微創(chuàng)插入。所需的大小長(zhǎng)度可以為0.3mm至10mm。優(yōu)選地，移植物組織或轉(zhuǎn)分化之前或期間的本發(fā)明的供體具有0.001mm³至1000cm³的大小，優(yōu)選0.01mm³至100cm³的大小，或0.1mm³至10cm³的大小，1mm³至1cm³或10mm³至100mm³的大小。

將分化的組織移植物插入組織缺損中或組織缺損上，并且進(jìn)一步優(yōu)選地其中插入通過組織密封劑(優(yōu)選纖維蛋白膠)固定。

將任何一種上述分化步驟即孵育作為本發(fā)明的另一方面提供于包括所述孵育步驟的用于將脂肪組織轉(zhuǎn)化為結(jié)締組織的組織移植物的離體或體內(nèi)方法中。

優(yōu)選地，本發(fā)明的任何一種方法進(jìn)一步包括使組織與組織密封劑接觸，優(yōu)選在用所述結(jié)締組織特異性生長(zhǎng)或分化因子處理后和/或在將組織移植物的大小和形狀調(diào)節(jié)至適合患者的結(jié)締組織缺損的任選步驟之后。調(diào)整形狀和大小意味著組織移植物將裝配到缺損空間中或其上，以允許缺損愈合，即移植物附著至相鄰結(jié)締組織。使用組織密封劑的處理允許移植物牢固地附著至周圍的結(jié)締組織并且增強(qiáng)結(jié)締組織的細(xì)胞的生長(zhǎng)。組織密封劑還可以涂覆到組織缺損中。在任何方式下，組織密封劑用于將移植物與周圍的結(jié)締組織連接。

通常，組織缺損的治療可以包括將本發(fā)明的移植物植入例如由于損傷或由于手術(shù)天然缺失的一定體積的缺失組織(組織缺損)中。移植物還可以用于治療表面組織缺損(在其上固定移植物，并且從其發(fā)生增強(qiáng)效應(yīng)至下面的缺損)，例如通過活化或分化的干細(xì)胞從移植物組織遷移到缺損中。

特別優(yōu)選地，移植物組織包含血管。來自供體移植物組織的血管得到維持并且不需要再生長(zhǎng)。移植物中的這樣的血管可以在移植后與組織缺損附近的血管連接，并且允許移植物與具有原始缺損的周圍或鄰近組織的良好結(jié)合。

缺損可以在可能需要例如矯形外科手術(shù)、頜面外科手術(shù)、牙科或整形和重建手術(shù)的許多組織中。

使用本發(fā)明的組織移植物的缺損和療法實(shí)例包括(通過移植物或缺損組織分類)：

軟骨移植物組織可用于治療軟骨缺損。待治療的軟骨類型的缺損包括局灶性軟骨損傷，例如剝脫性骨軟骨炎或創(chuàng)傷性軟骨損傷，例如在膝關(guān)節(jié)或距骨中；骨關(guān)節(jié)炎，特別是由于骨關(guān)節(jié)炎引起的軟骨磨損；椎間盤再生；半月板再生；髓核突出和隨后的微椎間盤切除術(shù)引起的椎間盤損傷。轉(zhuǎn)分化組織移植物可用作生物髓核替代物。它可以用于通過植入成軟骨轉(zhuǎn)分化移植物作為髓核替代物來治療退行性椎間盤疾病。軟骨移植物組織可以進(jìn)一步用于治療創(chuàng)傷性或退行性半月板撕裂。在撕裂的半月板的部分切除后，轉(zhuǎn)分化的移植物可以縫合到半月板缺損中。

韌帶移植物組織可以用于治療韌帶缺損，包括治療膝關(guān)節(jié)中的創(chuàng)傷性十字韌帶撕裂；治療外側(cè)踝韌帶的創(chuàng)傷性撕裂。

腱移植物組織可用于治療腱缺損，包括治療創(chuàng)傷性或退化性肩袖撕裂；治療跟腱撕裂。

骨移植物組織可用于治療骨缺損，包括骨外科手術(shù)，例如在脊柱畸形或退行性椎間盤疾病的情況下的脊柱融合術(shù)中：成骨轉(zhuǎn)分化移植物可用于移除椎間盤和制備椎間隙后的籠和椎間隙填充。移植物還可以單獨(dú)使用或與BMP組合使用，以通過移植附著到脊柱上來實(shí)現(xiàn)脊柱融合。移植物可用于治療骨折后的不愈合，或者移植物可以移植到損傷區(qū)域以促進(jìn)骨愈合。它可以用于治療骨質(zhì)疏松缺損或用于骨增加，包括預(yù)防性治療，例如在椎體后凸成形術(shù)或椎體成形術(shù)中作為椎體骨折的治療或用于預(yù)防性骨增加。成骨轉(zhuǎn)分化移植物可以插入椎體并促成生物骨折愈合。其可用于治療通常需要骨移植的骨缺損，例如動(dòng)脈瘤和幼年骨囊腫，或用于骨增強(qiáng)，例如在插入牙種植體之前。例如，其可以用于牙科中的竇提升。待根據(jù)本發(fā)明治療的具有缺損的骨可以是根據(jù)骨類型的常見分類的長(zhǎng)骨、短骨、扁平骨、籽骨或不規(guī)則骨。

可以提供通過本發(fā)明的方法制備的移植物用于任何治療性組織缺損治療。

在另一方面還提供了試劑盒，其適合用于實(shí)施本發(fā)明的方法，特別是將脂肪組織的細(xì)胞分化至具有分化細(xì)胞的合適的結(jié)締組織移植物的方法，并任選進(jìn)一步適合用于將移植物附著至組織缺損。試劑盒可以包含結(jié)締組織特異性生長(zhǎng)或分化因子(優(yōu)選如上所述的)和組織密封劑，優(yōu)選纖維蛋白膠。可以包括如上所述的任何其它組分。還可以提供孵育容器，例如燒瓶或盤。還提供的可以是調(diào)節(jié)合適的氣氛的組件，例如CO₂燒瓶。

所述試劑盒可以進(jìn)一步包含軟骨或骨組織標(biāo)簽或標(biāo)記物，其適合用于監(jiān)測(cè)分化的進(jìn)展并且評(píng)估轉(zhuǎn)化到結(jié)締組織移植物中的脂肪組織的給定分化階段是否足以插入到缺損中。分化的階段可以如上所述。

本發(fā)明的進(jìn)一步特征在于以下附圖和實(shí)施例，而不限于本發(fā)明的這些實(shí)施方案。

附圖：

圖1：與顯示不規(guī)則、不均勻的表面形成的相應(yīng)對(duì)照(b)相比，成軟骨轉(zhuǎn)分化脂肪移植物(a)的平滑表面轉(zhuǎn)化。

圖2：成軟骨轉(zhuǎn)分化脂肪移植物(a)和相應(yīng)的對(duì)照(d)的阿爾新藍(lán)糖胺聚糖染色；脂肪移植物(b)和對(duì)照(e)的俾斯麥棕染色；脂肪移植物(c)和對(duì)照(f)的番紅O染色。

圖3：成軟骨轉(zhuǎn)分化脂肪移植物的糖胺聚糖含量。

圖4：通過陽(yáng)性von Kossa染色(a)和茜素紅染色(b)指示的成骨轉(zhuǎn)分化脂肪移植物的礦化。相應(yīng)的對(duì)照(d，e)沒有顯示礦化的跡象。與未分化的對(duì)照(f)相比，偶氮卡紅(Azan)染色顯示轉(zhuǎn)分化脂肪移植物(c)中的膠原組織增加。

圖5：成骨轉(zhuǎn)分化移植物的5μm切片中礦化的定量

圖6：使用HET-CAM血管生成測(cè)定評(píng)價(jià)成骨轉(zhuǎn)分化移植物的血管生成和組織整合。在體內(nèi)5天后，移植物顯示良好的組織整合并連接至接受者的容器系統(tǒng)(a，b)。許多血管在移植物內(nèi)可見(c；箭頭)。如通過陽(yáng)性von Kossa染色所顯示的，成骨分化得到維持(d)。

圖7：在成軟骨轉(zhuǎn)分化脂肪組織移植物的植入后14天的膝關(guān)節(jié)的透明軟骨。移植物很好地整合到接受者組織中。

圖8：分離的神經(jīng)源性分化間充質(zhì)干細(xì)胞顯示典型的神經(jīng)元和軸突形成(圖8a，箭頭)。在對(duì)照組中未觀察到軸突和神經(jīng)元形成(圖8b)。神經(jīng)源性轉(zhuǎn)分化脂肪移植物顯示陽(yáng)性尼氏體染色(圖8c，箭頭)，其在對(duì)照組(8d)中未觀察到。

圖9：a)對(duì)照脂肪組織，其顯示典型的脂肪組織表型。b)6周后神經(jīng)源性轉(zhuǎn)分化脂肪墊：脂泡已被指示陽(yáng)性甲酚紫染色的神經(jīng)源性組織代替。c)可以觀察到周圍神經(jīng)組織的區(qū)帶分化，包括神經(jīng)束膜(黑色箭頭)和神經(jīng)外膜(灰色箭頭)以及伴隨的血管(黃色箭頭)。d)神經(jīng)束膜內(nèi)的尼氏體在神經(jīng)源性轉(zhuǎn)分化樣品中可見(箭頭)。

圖10：a)在分化起始后兩周，朝向腱細(xì)胞表型(tenocytic phenotype)的分離的間充質(zhì)干細(xì)胞的分化。b)對(duì)照組的未改變的表型。c)顯示圓形取向的腱細(xì)胞分化細(xì)胞島存在于轉(zhuǎn)分化脂肪墊中，但不存在于對(duì)照組織中(d)。

圖11：生肌分化：a)朝向定向肌細(xì)胞的早期分化；b)對(duì)照組中無分化。c)脂泡部分地被顯示縱向取向和陽(yáng)性Goldner染色的肌肉組織替代；d)對(duì)照樣品中不存在肌肉組織形成。

實(shí)施例：

實(shí)施例1：脂肪組織轉(zhuǎn)分化至透明軟骨移植物

脂肪移植物制備：

在脊柱減壓手術(shù)期間獲得的小脂肪活檢被放置在無菌容器中用于運(yùn)輸?shù)浇M織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室。將樣品在無菌鹽水溶液中洗滌以除去污染性紅細(xì)胞。在通過污染檢查后，將樣品分成兩部分。將A部分(轉(zhuǎn)分化樣品)在旨在用于間充質(zhì)干細(xì)胞分化的市售成軟骨分化培養(yǎng)基(Promocell，Heidelberg/Germany)中孵育。為了獲得間充質(zhì)干細(xì)胞分化，通常將細(xì)胞置于含有地塞米松、抗壞血酸-2-磷酸酯、胰島素、亞硒酸、轉(zhuǎn)鐵蛋白、丙酮酸鈉和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β)的確定培養(yǎng)基¹⁵中的聚集體或沉淀培養(yǎng)物中。將B部分(對(duì)照)在補(bǔ)充有10％胎小牛血清和2mM L-谷氨酰胺的Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基與Ham營(yíng)養(yǎng)混合物F12的1:1混合物中孵育。為了防止細(xì)菌污染，向該兩種培養(yǎng)基中加入50μg/ml慶大霉素。在37℃、5％CO₂和90％濕度下進(jìn)行孵育2-3周。每周更換培養(yǎng)基兩次。

組織學(xué)評(píng)價(jià)：

在孵育期結(jié)束時(shí)，將樣品在4％甲醛中固定，在磷酸緩沖鹽水中洗滌，并在升高的濃度的乙醇中排干。將組織包埋在塑化石蠟中，制備5μm切片。通過阿爾新藍(lán)、俾斯麥棕和番紅O染色評(píng)價(jià)成軟骨分化。

糖胺聚糖合成的評(píng)價(jià)：

在2周的轉(zhuǎn)分化后，將樣品在溶解于含有1mM EDTA的50mM Tris中的1mg/ml蛋白酶K中消化過夜。使用二甲基-亞甲基藍(lán)測(cè)定法測(cè)量糖胺聚糖含量，并在525nm處讀取吸光度。使用鯊魚硫酸軟骨素產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)曲線。

形態(tài)學(xué)結(jié)果：

在體外3周的轉(zhuǎn)分化后，脂肪組織顯示具有平滑表面重塑的緊湊的球形形態(tài)(圖1)。

組織學(xué)結(jié)果：

成軟骨分化的組織學(xué)染色在轉(zhuǎn)分化脂肪組織中是陽(yáng)性的：糖胺聚糖合成可以通過阿爾新藍(lán)染色檢測(cè)。通過陽(yáng)性番紅O染色進(jìn)一步顯現(xiàn)蛋白聚糖，并且陽(yáng)性俾斯麥棕染色表明存在軟骨組織典型的細(xì)胞外基質(zhì)(圖2)。

糖胺聚糖合成的評(píng)價(jià)：

在轉(zhuǎn)分化過程起始的兩個(gè)星期后，轉(zhuǎn)分化脂肪移植物含有16.56μg糖胺聚糖/mg組織，而對(duì)照僅顯示1.92μg/mg的平均糖胺聚糖含量(p<0.0001；圖3)。

實(shí)施例2：脂肪組織轉(zhuǎn)分化至骨移植物

脂肪移植物制備：

在脊柱減壓手術(shù)期間獲得的小脂肪活檢被放置在無菌容器中用于運(yùn)輸?shù)浇M織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室。將樣品在無菌鹽水溶液中洗滌以除去污染性紅細(xì)胞。在通過污染檢查后，將樣品分成兩部分。使A部分(轉(zhuǎn)分化樣品)經(jīng)受反復(fù)的機(jī)械刺激，隨后在成骨分化培養(yǎng)基中孵育。成骨分化培養(yǎng)基由補(bǔ)充有10％胎小牛血清、0.05mg/ml抗壞血酸、2mM L-谷氨酰胺、1μM地塞米松、10mMβ-甘油磷酸鈉和1μg/ml瘦素的Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基(DMEM)組成。將B部分(對(duì)照)在補(bǔ)充有10％胎小牛血清和2mM L-谷氨酰胺的Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基與Ham營(yíng)養(yǎng)混合物F12的1:1混合物中孵育。為了防止細(xì)菌污染，向該兩種培養(yǎng)基中加入50μg/ml慶大霉素。在37℃、5％CO₂和95％濕度下進(jìn)行孵育3周。每周更換培養(yǎng)基兩次。

組織學(xué)評(píng)價(jià)：

在孵育期結(jié)束時(shí)，將樣品在4％甲醛中固定，在磷酸緩沖鹽水中洗滌，并在升高的濃度的乙醇中排干。將組織包埋在塑化石蠟中，制備5μm切片。樣品用偶氮卡紅、von Kossa和茜素紅染色。

組織學(xué)結(jié)果：

如由陽(yáng)性von Kossa和茜素紅染色所示的，轉(zhuǎn)分化脂肪移植物顯示出膠原含量的增加和礦化的跡象(圖4)。

礦化的定量：

通過測(cè)定成骨轉(zhuǎn)分化3周后茜素紅染色的光密度(OD)，從5μm切片定量礦化程度。

茜素紅染色結(jié)果：

成骨轉(zhuǎn)分化移植物的平均OD為0.25/5μm切片。相應(yīng)對(duì)照切片的OD為0.12(p<0.005；圖5)

血管生成和組織整合的評(píng)價(jià)：

使用HET-CAM(Hen Egg Test-Chorionallantoic Membrane)測(cè)定法評(píng)價(jià)血管生成和組織整合。將成骨轉(zhuǎn)分化移植物異位植入到受精的、無特異性病原體的雞蛋的暴露的絨毛膜尿囊膜上。植入后5天，切除CAM的移植物負(fù)載區(qū)域并經(jīng)加工用于組織學(xué)分析。

HET-CAM測(cè)試結(jié)果：

在體內(nèi)5天后，植入物被良好整合并連接至接受者的血管系統(tǒng)(圖6a，b)。在移植物內(nèi)可見許多小血管(圖6c；箭頭)。盡管剝奪了分化因子，但是成骨分化得到維持(圖6d)。

實(shí)施例3：軟骨損傷的治療

移植物收獲和制備：

在局部麻醉下收獲皮下脂肪活檢。這可以在計(jì)劃的外科手術(shù)之前大約14天在門診環(huán)境中完成。將脂肪組織無菌地置于含有組織培養(yǎng)基的無菌容器中，并且例如如上所述進(jìn)行處理，即移植物在37℃、5％CO₂和90％濕度下進(jìn)行成軟骨轉(zhuǎn)分化2周。在計(jì)劃的手術(shù)當(dāng)天，將移植物送至手術(shù)室。體外轉(zhuǎn)分化的軟骨移植植入物顯示在圖7中。

缺損制備：

執(zhí)行小關(guān)節(jié)切開術(shù)，并對(duì)缺損仔細(xì)清創(chuàng)。通過使用模板(例如無菌錫箔)，制造缺損的精確模具。

移植物制備和植入：

通過使用模板，使移植物適合于缺損的大小。然后使用纖維蛋白膠將移植物植入缺損中。在5分鐘的硬化時(shí)間后，用手術(shù)刀除去過量的膠，并且使關(guān)節(jié)彎曲和完全伸展10次。在關(guān)節(jié)運(yùn)動(dòng)期間檢查移植物的穩(wěn)定性和位置。隨后，閉合傷口。

手術(shù)后程序：

患者經(jīng)歷關(guān)節(jié)的部分負(fù)重(10kg)治療14天，之后進(jìn)行取決于腫脹的漸進(jìn)負(fù)重。移植物在約8周后完全負(fù)重。

實(shí)施例4：椎骨骨折的治療：

移植物收獲和準(zhǔn)備：

在局部麻醉下收獲皮下脂肪活檢。這可以在計(jì)劃的外科手術(shù)之前約1-2周在門診環(huán)境中完成。將脂肪無菌地切成具有2mm²長(zhǎng)度的邊緣的切片，置于含有組織培養(yǎng)基的無菌容器中，并且例如如上所述進(jìn)行處理，即移植物在37℃、5％CO₂和90％濕度下進(jìn)行成骨轉(zhuǎn)分化1-2周。在計(jì)劃的手術(shù)當(dāng)天，將移植物送至手術(shù)室。

手術(shù)程序：

患者以俯臥位置被放置在射線可透射的臺(tái)上。在熒光鏡檢查下確定切口的位置之后，制作穿刺切口。將接入器械插入并向前移動(dòng)，直到達(dá)到蒂部接觸。確認(rèn)恰當(dāng)?shù)能壽E后，使器械前進(jìn)到椎體內(nèi)?？梢酝ㄟ^導(dǎo)絲或套針獲得椎體的接近。如果需要，可以恢復(fù)椎體高度，從而執(zhí)行椎體后凸成形術(shù)程序。

移植物制備和植入：

移植物在無菌施用裝置中遞送。將施用裝置連接至接入裝置。移植物和纖維蛋白在熒光鏡引導(dǎo)下同時(shí)注射到椎體中。在已將所需量的移植物插入椎體后，取出接入器械并閉合傷口。

手術(shù)后程序：

松動(dòng)(mobilisation)可以在手術(shù)的當(dāng)天開始。推薦支撐直到?jīng)]有疼痛，應(yīng)開具足夠的止痛藥。聚焦于腰椎穩(wěn)定的鍛煉計(jì)劃應(yīng)在疼痛情況允許的情況下盡快開始。

實(shí)施例5：神經(jīng)源性轉(zhuǎn)分化的起始

概念驗(yàn)證：

通過膠原酶消化從脂肪組織活檢中分離間充質(zhì)干細(xì)胞。細(xì)胞在單層培養(yǎng)中擴(kuò)增。在獲得足夠量的細(xì)胞后，將細(xì)胞以3×10⁴個(gè)細(xì)胞的密度接種到48孔板的兩個(gè)孔中。通過加入市售的神經(jīng)源性分化培養(yǎng)基在一個(gè)孔中起始神經(jīng)源性分化。將剩余的細(xì)胞在對(duì)照培養(yǎng)基中培養(yǎng)，所述對(duì)照培養(yǎng)基由補(bǔ)充有10％胎小牛血清和2mM L-谷氨酰胺的Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基與Ham營(yíng)養(yǎng)混合物F12的1:1混合物組成。為了防止細(xì)菌污染，向該兩種培養(yǎng)基中加入50μg/ml慶大霉素。在37℃、5％CO₂和90％濕度下進(jìn)行孵育。每周更換培養(yǎng)基兩次。3天后，觀察到對(duì)神經(jīng)元樣細(xì)胞典型的樹突和軸突的形成(圖8a)。在對(duì)照培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)胞保持其對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞典型的多邊形形狀(圖8b)。

脂肪移植物制備：

將小脂肪活檢置于無菌容器中用于運(yùn)輸?shù)浇M織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室。將樣品在無菌鹽水溶液中洗滌以除去污染性紅細(xì)胞。在通過污染檢查后，將樣品分成兩部分。將A部分(轉(zhuǎn)分化樣品)在旨在用于間充質(zhì)干細(xì)胞分化的市售神經(jīng)源性分化培養(yǎng)基(Promocell，Heidelberg/Germany)中孵育。將B部分(對(duì)照)在補(bǔ)充有10％胎小牛血清和2mM L-谷氨酰胺的Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基與Ham營(yíng)養(yǎng)混合物F12的1:1混合物中孵育。為了防止細(xì)菌污染，向該兩種培養(yǎng)基中加入50μg/ml慶大霉素。在37℃、5％CO₂和90％濕度下進(jìn)行孵育6周。每周更換培養(yǎng)基兩次。

組織學(xué)評(píng)價(jià)：

在孵育期結(jié)束時(shí)，將樣品在4％甲醛中固定，在磷酸緩沖鹽水中洗滌，并在升高的濃度的乙醇中排干。將組織包埋在塑化石蠟中，制備5μm切片。通過使用甲酚紫的尼氏體組織化學(xué)染色評(píng)估神經(jīng)源性分化。

結(jié)果：

在對(duì)照組織中沒有觀察到形態(tài)學(xué)變化(圖9a)。神經(jīng)源性轉(zhuǎn)分化移植物顯示出陽(yáng)性甲酚紫染色，由細(xì)胞質(zhì)內(nèi)黑-紫色尼氏體的存在指示的(圖8c，箭頭)。在神經(jīng)源性轉(zhuǎn)分化樣品中，脂泡逐漸被表現(xiàn)出對(duì)于神經(jīng)細(xì)胞典型的陽(yáng)性甲酚紫染色的含有具有大的核周體的圓形細(xì)胞的神經(jīng)源性組織替代(圖9b)。在轉(zhuǎn)分化樣品中可以觀察到周圍神經(jīng)組織的區(qū)帶分化，其包含圍繞神經(jīng)細(xì)胞的清晰可辨的神經(jīng)束膜和神經(jīng)外膜以及伴隨的血管(圖9c)。在對(duì)照樣品中未觀察到尼氏體的形成(圖8d)。

實(shí)施例6：生腱分化的誘導(dǎo)

概念的初步驗(yàn)證：

作為生腱分化培養(yǎng)基的初始評(píng)價(jià)，通過膠原酶消化從脂肪組織活檢中分離間充質(zhì)干細(xì)胞。細(xì)胞在單層培養(yǎng)中擴(kuò)增。在獲得足夠量的細(xì)胞后，將細(xì)胞以5×10⁴個(gè)細(xì)胞的密度接種到48孔板的兩個(gè)孔中。通過加入由補(bǔ)充有1％FCS和10ng/ml BMP-12的DMEM-F12組成的生腱分化培養(yǎng)基在一個(gè)孔中起始生腱分化。將剩余的細(xì)胞在對(duì)照培養(yǎng)基中培養(yǎng)，所述對(duì)照培養(yǎng)基由補(bǔ)充有10％胎小牛血清和2mM L-谷氨酰胺的Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基與Ham營(yíng)養(yǎng)混合物F12的1:1混合物組成。為了防止細(xì)菌污染，向該兩種培養(yǎng)基中加入50μg/ml慶大霉素。在37℃、5％CO₂和90％濕度下進(jìn)行孵育。每周更換培養(yǎng)基兩次。在兩周后在分化組中可以看到朝向紡錘形腱細(xì)胞的分化(圖10a)。在對(duì)照組中未觀察到形態(tài)學(xué)變化(圖10b)。

脂肪移植物制備：

將小脂肪活檢置于無菌容器中用于運(yùn)輸?shù)浇M織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室。將樣品在無菌鹽水溶液中洗滌以除去污染性紅細(xì)胞。在通過污染檢查后，將樣品分成兩部分。將A部分(轉(zhuǎn)分化樣品)在生腱分化培養(yǎng)基中孵育。將B部分(對(duì)照)在補(bǔ)充有10％胎小牛血清和2mM L-谷氨酰胺的Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基與Ham營(yíng)養(yǎng)混合物F12的1:1混合物中孵育。為了防止細(xì)菌污染，向該兩種培養(yǎng)基中加入50μg/ml慶大霉素。在37℃、5％CO₂和90％濕度下進(jìn)行孵育6周。每周更換培養(yǎng)基兩次。

組織學(xué)評(píng)價(jià)：

在孵育期結(jié)束時(shí)，將樣品在4％甲醛中固定，在磷酸緩沖鹽水中洗滌，并在升高的濃度的乙醇中排干。將組織包埋在塑化石蠟中，制備5μm切片。使用H/E染色評(píng)價(jià)生腱分化。

結(jié)果：

在轉(zhuǎn)分化脂肪墊中存在顯示圓形取向的腱細(xì)胞分化組織的島(圖10c)，但其不存在于對(duì)照組(d)中。

實(shí)施例7：生肌分化的誘導(dǎo)

概念的初步驗(yàn)證：

作為概念的初步驗(yàn)證，通過膠原酶消化從脂肪組織活檢中分離間充質(zhì)干細(xì)胞。細(xì)胞在單層培養(yǎng)中擴(kuò)增。在獲得足夠量的細(xì)胞后，將細(xì)胞以5×10⁴個(gè)細(xì)胞的密度接種到48孔板的兩個(gè)孔中。通過加入市售的生肌分化培養(yǎng)基在一個(gè)孔中起始生肌分化。將剩余的細(xì)胞在對(duì)照培養(yǎng)基中培養(yǎng)，所述對(duì)照培養(yǎng)基由補(bǔ)充有10％胎小牛血清和2mM L-谷氨酰胺的Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基與Ham營(yíng)養(yǎng)混合物F12的1:1混合物組成。為了防止細(xì)菌污染，向該兩種培養(yǎng)基中加入50μg/ml慶大霉素。在37℃、5％CO₂和90％濕度下進(jìn)行孵育。每周更換培養(yǎng)基兩次。兩周后在分化組中可以看到朝向定向肌細(xì)胞的分化(圖11a)，但在對(duì)照組中未觀察到(圖11b)。

脂肪移植物制備：

將小脂肪活檢置于無菌容器中用于運(yùn)輸?shù)浇M織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室。將樣品在無菌鹽水溶液中洗滌以除去污染性紅細(xì)胞。在通過污染檢查后，將樣品分成兩部分。將A部分(轉(zhuǎn)分化樣品)在生肌分化培養(yǎng)基中孵育。將B部分(對(duì)照)在補(bǔ)充有10％胎小牛血清和2mM L-谷氨酰胺的Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基與Ham營(yíng)養(yǎng)混合物F12的1:1混合物中孵育。為了防止細(xì)菌污染，向該兩種培養(yǎng)基中加入50μg/ml慶大霉素。在37℃、5％CO₂和90％濕度下進(jìn)行孵育6周。每周更換培養(yǎng)基兩次。

組織學(xué)評(píng)價(jià)：

在孵育期結(jié)束時(shí)，將樣品在4％甲醛中固定，在磷酸緩沖鹽水中洗滌，并在升高的濃度的乙醇中排干。將組織包埋在塑化石蠟中，制備5μm切片。使用Masson Goldner染色評(píng)價(jià)生肌分化。

結(jié)果：

在分化6周后，脂泡被顯示縱向取向和陽(yáng)性Goldner染色的肌肉組織部分地替代(圖11c)。在對(duì)照樣品中不存在肌肉組織形成(圖11d)。

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