本發(fā)明是在由國(guó)立衛(wèi)生研究院授予的DK080823，DK092456和GM063483下的政府支持下進(jìn)行的。政府對(duì)本發(fā)明有一定的權(quán)利。

優(yōu)先權(quán)要求

本申請(qǐng)要求于2014年5月28日提交的題為“Methods and Systems for Converting Precursor Cells into Gastric Tissues through Directed Differentiation”的Wells等人的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)No.62/003,719的優(yōu)先權(quán)和權(quán)益用于所有目的。

技術(shù)領(lǐng)域

本文中公開了涉及通過定向分化將干細(xì)胞轉(zhuǎn)化成特定組織或器官的方法和系統(tǒng)。特別地，公開了用于從人多能干細(xì)胞促進(jìn)定形內(nèi)胚層形成的方法和系統(tǒng)。還公開了用于從分化的定形內(nèi)胚層促進(jìn)胃類器官或組織形成的方法和系統(tǒng)。

發(fā)明背景

胃功能和構(gòu)造在哺乳動(dòng)物物種之間廣泛變化，以適應(yīng)極其多種棲息地和飲食。因此，非人類胃發(fā)育和疾病模型具有相當(dāng)大的局限性。例如，細(xì)菌幽門螺桿菌(Helicobacter Pylori)感染世界人口的50％，其中10％發(fā)展為消化性潰瘍病，1-2％^1-3發(fā)展為胃癌。胃疾病，包括消化性潰瘍病和胃癌，影響世界人口的10％，并且主要是由于慢性幽門螺桿菌感染。幽門螺桿菌誘導(dǎo)的疾病的當(dāng)前模型依賴于不表現(xiàn)出與人對(duì)感染的響應(yīng)相同的病理生理特征的動(dòng)物模型⁴，并且胃細(xì)胞系缺乏體內(nèi)胃上皮的細(xì)胞和構(gòu)造復(fù)雜性。因此，沒有足夠的模型來研究幽門螺桿菌感染的作用，就像它發(fā)生在人類中一樣。雖然最近使用成體胃干細(xì)胞的進(jìn)展允許體外嚙齒類胃上皮的生長(zhǎng)⁵，但是從人患者獲得這些細(xì)胞將需要手術(shù)。此外，這種方法不能用于對(duì)人胃的胚胎發(fā)育或基質(zhì)-上皮相互作用建模。胚胎發(fā)育和成體胃的構(gòu)造的物種差異使鼠模型對(duì)于器官發(fā)生和該器官的發(fā)病機(jī)理的研究變得不是最佳的。因此，需要強(qiáng)大的體外系統(tǒng)來闡明人類胃發(fā)育和疾病的根本機(jī)制，以及鑒定用于這些疾病的人類治療的新型治療。

本領(lǐng)域中需要用于精確控制前體細(xì)胞，如人多能干細(xì)胞的目的地的方法和系統(tǒng)，以便創(chuàng)建期望的特定類型的組織或生物體，特別是胃組織，其可以用于一個(gè)或多個(gè)上述目的。

發(fā)明概述

公開了誘導(dǎo)胃細(xì)胞和/或胃組織形成的方法，如以胃類器官的形式。可以通過激活和/或抑制前體細(xì)胞內(nèi)的一種或多種信號(hào)傳導(dǎo)途徑來進(jìn)行胃細(xì)胞和/或組織的形成。還公開了使用所公開的胃細(xì)胞，胃組織和/或源自前體細(xì)胞的胃類器官的方法。

附圖簡(jiǎn)述

本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，下面描述的附圖僅用于說明的目的。附圖不旨在以任何方式限制本教導(dǎo)的范圍。

專利或申請(qǐng)文件包含至少一個(gè)彩色附圖。根據(jù)請(qǐng)求并支付必要的費(fèi)用后，由官方提供具有彩色附圖的本專利或?qū)＠暾?qǐng)公開文本的副本。

圖1描繪了Sox2/Cdx2/B-連環(huán)蛋白在胃球體中的表達(dá)和RA的作用。

圖2A-2E描述了用于定向?qū)PSC分化為三維胃類器官的體外培養(yǎng)系統(tǒng)的示意圖(圖2A)，通過用Sox2，Pdx1和Cdx2對(duì)小鼠E10.5胚胎的整裝免疫熒光染色的發(fā)育中的后部前腸器官的限定標(biāo)志物(圖2B)，在存在和不存在RA的情況下的PDX1表達(dá)(圖2C)，顯示后部前腸球體生長(zhǎng)成hGO期間的形態(tài)學(xué)變化的立體顯微照片(圖2D)，在E14.5和E18.5和hGO發(fā)育的相當(dāng)階段時(shí)的發(fā)育中的小鼠竇的比較(圖2E)。

圖3A-3D描述了P12竇，E18.5竇和d34類器官中的Muc5AC，TFF2，GSII UEAI和CHGA表達(dá)(圖3A)，hGO發(fā)育期間在生長(zhǎng)，形態(tài)發(fā)生和細(xì)胞類型特化中EGF的不同作用的示意圖(圖3B)，在具有和沒有DOX的胃類器官中胃泌素，生長(zhǎng)素釋放肽，5-HT和ChrA的表達(dá)(圖3C)，以及在多種濃度的EGF下的NEUROG3的相對(duì)表達(dá)(圖3D)。

圖4A-4D描繪了在d34類器官，E18.5竇和P12竇中的SOX9Ki67表達(dá)(圖4A)，使用亮視野顯微術(shù)和免疫熒光染色顯現(xiàn)的類器官的幽門螺桿菌感染(圖4B)，癌基因c-Met的免疫沉淀(圖4C)，和通過EdU摻入測(cè)量的hGO上皮中的細(xì)胞增殖(圖4D)。

圖5A-5D描繪了在存在GSK3β抑制劑CHIR99021的情況下的Sox2和Cdx2表達(dá)和在存在和不存在頭蛋白的情況下的重組WNT3A(圖5A)，使用明視野顯微術(shù)顯現(xiàn)的CHIR誘導(dǎo)的腸管形態(tài)發(fā)生和球體產(chǎn)生(圖5B)，單層培養(yǎng)物的免疫熒光染色以評(píng)價(jià)在CHIR/FGF處理的內(nèi)胚層中的CDX2誘導(dǎo)和在頭蛋白和CHIR/FGF/頭蛋白處理的內(nèi)胚層中的SOX2誘導(dǎo)(圖5C)，BMP靶基因MSX1/2的qPCR分析(圖5D)，以及在存在和不存在BMP2的情況下的SOX2和CDX2表達(dá)。

圖6A-6G描繪了比較兩個(gè)hESC系(H1和H9)和一個(gè)iPSC系(72.3)之間的球體形成和特征的表(圖6A)，源自H1和iPSC 72.3細(xì)胞系的第34天hGO的免疫熒光染色(圖6B)，第34天hGO中的器官上皮細(xì)胞類型定量(圖6C)，誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞系iPSC 72.3的表征(圖6D-G)。

圖7A-7D描繪了顯示前腸模式化(patterning)實(shí)驗(yàn)的示意圖(圖7A)，顯示RA增加了從前腸單層培養(yǎng)物產(chǎn)生的球體數(shù)目的明場(chǎng)圖像(圖7B)，圖1d的較低功率圖像，其顯示具有位于前腸后部部分的Hnf1β蛋白的14個(gè)體節(jié)期胚胎的免疫熒光圖像(圖7C)，用RA處理的前腸球體中的基因表達(dá)的qPCR分析(圖7D)。

圖8描述了hGO分化的晚期階段的明場(chǎng)圖像和免疫染色。

圖9描述了在體內(nèi)竇發(fā)育的四個(gè)胚胎階段(E12.5，E14.5，E16.5和E18.5)和一個(gè)出生后階段(P12)期間在小鼠竇和人胃類器官發(fā)育期間的轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)。

圖10描述了E12.5竇和第13天hGO中的pHH3/E-Cad/DAPI表達(dá)和aPCC/E-CAD/DAPI表達(dá)。

圖11A-11C描述了竇間質(zhì)轉(zhuǎn)錄因子BAPX1的表達(dá)(圖11A)和間質(zhì)細(xì)胞類型標(biāo)志物的染色(圖11C)。

圖12描繪了體內(nèi)胃竇內(nèi)分泌細(xì)胞發(fā)育。

圖13A-13B描述了泛內(nèi)分泌標(biāo)志物CHGA的染色(圖13A)和內(nèi)分泌標(biāo)志物CHGA，胃泌素，生長(zhǎng)素釋放肽和促生長(zhǎng)素抑制素的表達(dá)(圖13B)。

圖14顯示了胃類器官的定向分化的方法的概述。指示分化過程中的每個(gè)步驟以及代表性的立體顯微照片。

圖15描繪了小鼠胃的示意圖和在前胃，胃底，竇和十二指腸中的已知區(qū)域標(biāo)志物的測(cè)量。

圖16描繪了在前胃，胃底，竇和十二指腸中的新的區(qū)域標(biāo)志物的測(cè)量。

圖17描繪了胃底特化方案和在對(duì)照，Wnt100，Wnt500和CHIR處理的細(xì)胞中的GAPDH，Gata4，Axin2，Sox2，Pdx1和Cdx2的測(cè)量。y軸代表相對(duì)基因表達(dá)。

圖18描繪了胃底方案中Axin2，IRX2，IRX3，Pitx1和IRX4的測(cè)量。y軸代表相對(duì)基因表達(dá)。

圖19是描述來自定形內(nèi)胚層的腸組織，胃底組織和竇組織形成的示意圖。

發(fā)明詳述

除非另有說明，術(shù)語應(yīng)根據(jù)相關(guān)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員的常規(guī)用法來理解。

如本文中使用，術(shù)語“全能干細(xì)胞”(也稱為全能干細(xì)胞)是可以分化成胚胎和胚外細(xì)胞類型的干細(xì)胞。此類細(xì)胞可以構(gòu)建完整的，活的生物體。這些細(xì)胞由卵和精細(xì)胞的融合產(chǎn)生。受精卵的前幾次分裂產(chǎn)生的細(xì)胞也是全能的。

如本文中使用，術(shù)語“多能干細(xì)胞(PSC)”包括可以分化為幾乎所有身體細(xì)胞類型的任何細(xì)胞，即源自三個(gè)胚層(生殖上皮)中的任一個(gè)的細(xì)胞，包括內(nèi)胚層(內(nèi)部胃粘膜(interior stomach lining)，胃腸道，肺)，中胚層(肌肉，骨，血液，泌尿生殖器)和外胚層(表皮組織和神經(jīng)系統(tǒng))。PSC可以是前植入囊胚(primplantation blastocyst)的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞的后代，或通過強(qiáng)制某些基因的表達(dá)通過誘導(dǎo)非多能細(xì)胞(例如成體體細(xì)胞)獲得。多能干細(xì)胞可以源自任何合適的來源，如本領(lǐng)域技術(shù)人員容易理解的。多能干細(xì)胞來源的實(shí)例包括哺乳動(dòng)物來源，包括人，嚙齒類，豬，牛，但不限于此。

如本文中使用，術(shù)語“誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPSC)”，通常也縮寫為iPS細(xì)胞，是指通過誘導(dǎo)某些基因的“強(qiáng)制”表達(dá)人工源自正常非多能細(xì)胞(如成體體細(xì)胞)的多能干細(xì)胞類型。

如本文中使用，術(shù)語“胚胎干細(xì)胞(ESC)”，通常也縮寫為ES細(xì)胞，是指多能性并源自胚泡(早期胚胎)的內(nèi)部細(xì)胞團(tuán)的細(xì)胞。為了本發(fā)明的目的，術(shù)語“ESC”有時(shí)也廣泛用于涵蓋胚胎生殖細(xì)胞。

如本文中使用，術(shù)語“前體細(xì)胞”包括可用于本文所述的方法中的任何細(xì)胞，經(jīng)由所述方法，一種或多種前體細(xì)胞獲得更新自身或分化成一種或多種特化細(xì)胞類型的能力。在一些實(shí)施方案中，前體細(xì)胞是多能的或具有變成多能性的能力。在一些實(shí)施方案中，對(duì)前體細(xì)胞進(jìn)行外部因子(例如生長(zhǎng)因子)的處理以獲得多能性。在一些實(shí)施方案中，前體細(xì)胞可以是全能(或全能)干細(xì)胞；多能干細(xì)胞(誘導(dǎo)或非誘導(dǎo))；多能干細(xì)胞；寡能干細(xì)胞和單能干細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，前體細(xì)胞可來自胚胎，嬰兒，兒童或成人。在一些實(shí)施方案中，前體細(xì)胞可以是經(jīng)受治療的體細(xì)胞，使得通過遺傳操作或蛋白質(zhì)/肽治療賦予多能性。

在發(fā)育生物學(xué)中，細(xì)胞分化是不太特化的細(xì)胞變?yōu)楦鼗募?xì)胞類型的過程。如本文中使用，術(shù)語“定向分化”描述了不太特化的細(xì)胞變?yōu)樘囟ǖ奶鼗屑?xì)胞類型的過程?？赏ㄟ^可用于定義或改變初始細(xì)胞的命運(yùn)的任何可應(yīng)用的方法來確定特化靶細(xì)胞類型的特殊性。示例性方法包括但不限于遺傳操作，化學(xué)處理，蛋白質(zhì)處理和核酸處理。

如本文中使用，術(shù)語“細(xì)胞成分”是單個(gè)基因，蛋白質(zhì)，mRNA表達(dá)基因和/或任何其它可變的細(xì)胞組分或蛋白質(zhì)活性，例如蛋白質(zhì)修飾(例如磷酸化)的程度，例如，其通常由本領(lǐng)域技術(shù)人員在生物實(shí)驗(yàn)(例如，通過微陣列或免疫組織化學(xué))中測(cè)量。與存活系統(tǒng)，常見的人類疾病，基因發(fā)現(xiàn)和結(jié)構(gòu)測(cè)定根本的生物化學(xué)過程的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)有關(guān)的重大發(fā)現(xiàn)現(xiàn)在可歸因于作為研究過程的一部分的細(xì)胞組分豐度數(shù)據(jù)的應(yīng)用。細(xì)胞組分豐度數(shù)據(jù)可以幫助鑒定生物標(biāo)志物，區(qū)分疾病亞型和鑒定毒性的機(jī)制。

在所有多細(xì)胞生物體中發(fā)現(xiàn)干細(xì)胞。它們的特征在于通過有絲分裂細(xì)胞分裂自我更新并分化成多種多樣的一批特化細(xì)胞類型的能力。兩種廣泛類型的哺乳動(dòng)物干細(xì)胞是1)從胚泡的內(nèi)部細(xì)胞團(tuán)分離的胚胎干細(xì)胞，和2)在成體組織中發(fā)現(xiàn)的成體干細(xì)胞。在發(fā)育中的胚胎中，干細(xì)胞可以分化成所有特化的胚胎組織。在成年生物體中，干細(xì)胞和祖細(xì)胞充當(dāng)身體的修復(fù)系統(tǒng)，補(bǔ)充特化的細(xì)胞，但也保持再生器官(如血液，皮膚或胃組織)的正常更新。

現(xiàn)在可以通過細(xì)胞培養(yǎng)使干細(xì)胞生長(zhǎng)并轉(zhuǎn)化成具有與各種組織(如肌肉或神經(jīng))的細(xì)胞一致的特征的特化細(xì)胞。來自多種來源的高度塑性成體干細(xì)胞，包括臍帶血和骨髓，常規(guī)用于醫(yī)療療法。通過治療性克隆產(chǎn)生的胚胎細(xì)胞系和自體胚胎干細(xì)胞也已被提出作為未來治療的有希望的候選者。

干細(xì)胞的經(jīng)典定義通常指示兩種性質(zhì)：自我更新，經(jīng)歷多次細(xì)胞分裂周期同時(shí)保持未分化狀態(tài)的能力，以及效力，分化成特化細(xì)胞類型的能力。在一些實(shí)施方案中，干細(xì)胞是全能的或多能的，即它們能夠產(chǎn)生任何成熟細(xì)胞類型，盡管多能或單能祖細(xì)胞有時(shí)可以稱為干細(xì)胞。

效力指定干細(xì)胞的分化潛能(分化成不同細(xì)胞類型的潛力)。全能干細(xì)胞(也稱為全能性干細(xì)胞)可以分化成胚胎和胚外細(xì)胞類型。這些細(xì)胞可以構(gòu)建完整的，活的生物體。細(xì)胞由卵和精細(xì)胞的融合產(chǎn)生。受精卵的前幾次分裂產(chǎn)生的細(xì)胞也是全能的。多能干細(xì)胞(PSC)是全能細(xì)胞的后代，并且可以分化成幾乎所有細(xì)胞，即源自三個(gè)胚層中的任一個(gè)的細(xì)胞，包括內(nèi)胚層(內(nèi)部胃粘膜，胃腸道，肺)，中胚層(肌肉，骨，血，泌尿生殖器)和外胚層(表皮組織和神經(jīng)系統(tǒng))。多能干細(xì)胞可以分化成許多細(xì)胞，但是僅分化為密切相關(guān)的細(xì)胞家族的細(xì)胞。寡能干細(xì)胞可以分化成僅少數(shù)細(xì)胞，如淋巴樣或髓樣干細(xì)胞。單能細(xì)胞只能產(chǎn)生一種它們自己的細(xì)胞類型，但具有將其與非干細(xì)胞(例如肌肉干細(xì)胞)區(qū)分開的自我更新的性質(zhì)。

胚胎和誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞對(duì)研究人類疾病和產(chǎn)生在動(dòng)物模型中治療有效的替代組織的能力已經(jīng)具有前所未有的影響。

在發(fā)育生物學(xué)中，細(xì)胞分化是不太特化的細(xì)胞變成更特化的細(xì)胞類型的過程。定向?qū)⑷薖SC分化為治療性細(xì)胞類型的最成功的努力是基于胚胎器官發(fā)育的研究。實(shí)例包括肝的肝細(xì)胞和胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞的產(chǎn)生，其在肝病和糖尿病的動(dòng)物模型中顯示出功能潛力。類似地，PSC分化為腸可以為疾病，如壞死性小腸結(jié)腸炎(necrotizing enterocolitis)，炎性腸病和短腸綜合征提供治療益處。

如上討論，多能干細(xì)胞具有分化成三種胚層中的任一種的潛能：內(nèi)胚層(內(nèi)部胃粘膜，胃腸道，肺)，中胚層(肌肉，骨，血液，泌尿生殖器)和外胚層(表皮組織和神經(jīng)系統(tǒng))。因此，多能干細(xì)胞可以產(chǎn)生任何胎兒或成人細(xì)胞類型。然而，特定多能干細(xì)胞的命運(yùn)由許多細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)途徑和許多因素控制。此外，多能干細(xì)胞單獨(dú)不能發(fā)育成胎兒或成年動(dòng)物，因?yàn)樗鼈內(nèi)狈τ兄谂咛ネ饨M織，如胎盤的潛力。

迄今為止，尚未從人多能干細(xì)胞(hPSC)產(chǎn)生胃組織。將PSC分化為肺，肝，胰腺和腸細(xì)胞的成功努力已經(jīng)取決于對(duì)這些器官的胚胎發(fā)育的良好的分子理解。^6-10不幸的是，本領(lǐng)域中的一個(gè)問題是在內(nèi)胚層形成后的胃發(fā)育的理解中的許多缺口。因此，為了指導(dǎo)hPSC分化為胃組織，申請(qǐng)人鑒定了調(diào)節(jié)早期胃發(fā)育的幾個(gè)關(guān)鍵階段的信號(hào)傳導(dǎo)途徑，包括前腸特化和模式化，胃特化，以及最后胃上皮生長(zhǎng)和分化。此外，為了產(chǎn)生更功能性的，復(fù)雜的三維組織，申請(qǐng)人旨在誘導(dǎo)在胃發(fā)育期間發(fā)生的幾種形態(tài)發(fā)生過程，包括前腸管的形態(tài)發(fā)生和胃上皮結(jié)構(gòu)(包括腺體和凹陷(pit))的形成。

如本文中所述，使用生長(zhǎng)因子操作的時(shí)間系列來建立方法和系統(tǒng)，以模擬培養(yǎng)物中的胚胎胃組織發(fā)育。特別地，建立了在體外指導(dǎo)PSC(人胚胎干細(xì)胞(hESC)和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPSC)二者)分化成胃組織的方法和系統(tǒng)。這些因素在體外在接近胎兒腸發(fā)育的階段中指導(dǎo)人類腸發(fā)育：激活蛋白誘導(dǎo)的定形內(nèi)胚層(DE)形成；FGF/Wnt/BMP誘導(dǎo)后部前腸模式化，和最后通過調(diào)節(jié)視黃酸和EFG信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)獲得的前胃培養(yǎng)系統(tǒng)，所述信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)促進(jìn)胃組織生長(zhǎng)，形態(tài)發(fā)生和細(xì)胞分化成功能性胃細(xì)胞類型和形態(tài)，包括胃腺體和凹陷，增殖區(qū)，表面和竇粘液細(xì)胞和表達(dá)胃泌素，生長(zhǎng)素釋放肽和促生長(zhǎng)素抑制素的內(nèi)分泌細(xì)胞。

申請(qǐng)人已經(jīng)鑒定了新的胚胎信號(hào)傳導(dǎo)途徑，其允許人PSC有效地逐步分化成具有復(fù)雜構(gòu)造和細(xì)胞組成的胃細(xì)胞，胃組織和/或三維胃組織(hGO)。申請(qǐng)人進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)了，發(fā)育中的hGO經(jīng)歷分子和形態(tài)學(xué)分化階段，其與小鼠發(fā)育中的竇幾乎相同，并且所得的胃類器官可含有構(gòu)成與胎兒/出生后胃相當(dāng)?shù)恼８]上皮和三維構(gòu)造的粘液，內(nèi)分泌和祖細(xì)胞的排列(array)。

所公開的人胃細(xì)胞，胃組織和/或胃類器官(hGO)可以用作體外系統(tǒng)以鑒定人胃發(fā)育，生理學(xué)的新機(jī)制，并且可以用作胃上皮對(duì)幽門螺桿菌的病理生理應(yīng)答的模型。所公開的胃細(xì)胞，胃組織和/或胃hGO和方法為藥物發(fā)現(xiàn)和胃癌的早期階段的建模呈現(xiàn)了新的機(jī)會(huì)。此外，本文中公開了人胚胎前腸的第一次三維產(chǎn)生，其是產(chǎn)生其它前腸器官組織，包括肺和胰腺的有前景的起點(diǎn)。

在一個(gè)方面，公開了誘導(dǎo)從前體細(xì)胞形成胃細(xì)胞，胃組織和/或胃hGO的方法。所述方法可以包括以下步驟：a)激活前體細(xì)胞內(nèi)的一種或多種信號(hào)傳導(dǎo)途徑，其中所述一種或多種信號(hào)傳導(dǎo)途徑選自WNT信號(hào)傳導(dǎo)途徑，WNT/FGF信號(hào)傳導(dǎo)途徑和FGF信號(hào)傳導(dǎo)途徑，以獲得從前體細(xì)胞轉(zhuǎn)變的胃細(xì)胞，胃組織和/或胃hGO。該方法可以進(jìn)一步包括抑制前體細(xì)胞內(nèi)的一種或多種信號(hào)傳導(dǎo)途徑的步驟b)。受到抑制的一種或多種信號(hào)傳導(dǎo)途徑可以包含BMP信號(hào)傳導(dǎo)途徑。

該方法還可以包括使前體細(xì)胞與視黃酸接觸的步驟。前體細(xì)胞與視黃酸的接觸可以在上述激活和抑制步驟之后發(fā)生。

該方法可以進(jìn)一步包括以足以將胃類器官的直徑增加到直徑大于約1mm或直徑大于約2mm，或直徑大于約3mm，或直徑大于約4mm的濃度和/或時(shí)間長(zhǎng)度使胃類器官與EGF接觸的步驟。

在一個(gè)方面，所述一種或多種信號(hào)傳導(dǎo)途徑可以選自Wnt信號(hào)傳導(dǎo)途徑，Wnt/β-連環(huán)蛋白信號(hào)傳導(dǎo)，Wnt/APC信號(hào)傳導(dǎo)和Wnt/PCP途徑信號(hào)傳導(dǎo)。

在一個(gè)方面，激活Wnt信號(hào)途徑的步驟可包括使前體細(xì)胞與選自Wnt1，Wnt2，Wnt2b，Wnt3，Wnt3a，Wnt4，Wnt5a，Wnt5b，Wnt6，Wnt7a，Wnt7b，Wnt8a，Wnt8b，Wnt9a，Wnt9b，Wnt10a，Wnt10b，Wnt11和Wnt16的一種或多種分子接觸。

在一個(gè)方面，激活FGF信號(hào)傳導(dǎo)途徑的步驟可包括使前體細(xì)胞與選自FGF1，F(xiàn)GF2，F(xiàn)GF3，F(xiàn)GF4，F(xiàn)GF5，F(xiàn)GF6，F(xiàn)GF7，F(xiàn)GF8，F(xiàn)GF9，F(xiàn)GF10，F(xiàn)GF11，F(xiàn)GF12，F(xiàn)GF13，F(xiàn)GF14，F(xiàn)GF16，F(xiàn)GF17，F(xiàn)GF18，F(xiàn)GF19，F(xiàn)GF20，F(xiàn)GF21，F(xiàn)GF22和FGF23的一種或多種分子接觸。

在一個(gè)方面，抑制BMP信號(hào)傳導(dǎo)途徑的步驟可以包括使前體細(xì)胞與BMP抑制劑接觸。在一個(gè)方面，BMP抑制劑可以選自Dorsomorphin，LDN189，DMH-1，頭蛋白及其組合。在一個(gè)方面，BMP抑制劑可以是頭蛋白。

在一個(gè)方面，激活步驟可以包括在稱為溫育期的規(guī)定期里使前體細(xì)胞與Wnt3a，F(xiàn)GF4和BMP抑制劑接觸。接觸步驟可以同時(shí)進(jìn)行，或者在其它方面，接觸步驟可以隨后進(jìn)行。

在一個(gè)方面，在第一溫育期可以通過信號(hào)傳導(dǎo)劑接觸可包含定形內(nèi)胚層的前體細(xì)胞，所述信號(hào)傳導(dǎo)劑可以包含1)Wnt3a或GSK-抑制劑(例如CHIRON)與2)FGF4的組合。第一溫育期可以進(jìn)一步包含BMP抑制劑。在第一溫育期后，可將前體細(xì)胞進(jìn)行第二溫育期，其中使前體細(xì)胞與視黃酸(RA)接觸。在一個(gè)方面，第一溫育期和第二溫育期重疊。在一些實(shí)施方案中，第一溫育期和第二溫育期不重疊。

在一個(gè)方面，第一和/或第二溫育期和/或第一和第二溫育期的總體可以為24至120小時(shí)，或約36至約108小時(shí)，或約48至約110小時(shí)，約96小時(shí)，或約60至約84小時(shí)。在一個(gè)方面，第一溫育期可以是至少約24小時(shí)。

一方面，第二溫育期(其中前體細(xì)胞可與RA接觸)在第一溫育期后約72小時(shí)開始。在另一方面，第二溫育期在培養(yǎng)物已經(jīng)從前體細(xì)胞形成前腸球體之后開始。然后，可將前腸球體在適于形成胃類器官的生長(zhǎng)條件下轉(zhuǎn)移至3-維基質(zhì)，例如通過將前腸球應(yīng)用于基質(zhì)膠^TM(Corning，BD Bioscience)進(jìn)行。在轉(zhuǎn)移到基質(zhì)膠后，在第三溫育期期間使前腸球體與RA接觸，在第三溫育期中可發(fā)生持續(xù)的3D生長(zhǎng)。然后，可以在第四溫育期期間使球體與EGF接觸，所述第四溫育期可與第三溫育期重疊。第三溫育期可以是約24小時(shí)。

在一個(gè)方面，前體細(xì)胞可以與50-1500ng/ml，或約100至約1200ng/ml，或約200至約1000ng/ml，或約300至約900ng/ml，或約400至約800ng/ml，或約500至約700ng/ml的濃度的Wnt3a接觸。

在一個(gè)方面，前體細(xì)胞可以選自胚胎干細(xì)胞，胚胎生殖細(xì)胞，誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞，中胚層細(xì)胞，定形內(nèi)胚層細(xì)胞，后內(nèi)胚層細(xì)胞和后腸細(xì)胞。

在一個(gè)方面，前體細(xì)胞可以是源自多能干細(xì)胞的定形內(nèi)胚層細(xì)胞。

在一個(gè)方面，前體細(xì)胞可以是多能干細(xì)胞，如胚胎干細(xì)胞，胚胎干細(xì)胞或誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞。

在一個(gè)方面，可通過使多能干細(xì)胞與選自激活蛋白，TGF-β生長(zhǎng)因子的超家族的BMP亞類；Nodal，激活蛋白A，激活蛋白B，BMP4，Wnt3a及其組合的一種或多種分子接觸衍生定形內(nèi)胚層細(xì)胞。

在一個(gè)方面，可以從一種或多種前體細(xì)胞體外產(chǎn)生胃組織。

在一個(gè)方面，一種或多種前體細(xì)胞可以選自胚胎干細(xì)胞，中胚層細(xì)胞，定形內(nèi)胚層細(xì)胞，后內(nèi)胚層細(xì)胞，前內(nèi)胚層細(xì)胞，前腸細(xì)胞和后腸細(xì)胞。

在一個(gè)方面，多能干細(xì)胞可以是哺乳動(dòng)物多能干細(xì)胞，包括但不限于人多能干細(xì)胞或小鼠多能干細(xì)胞。

在一個(gè)方面，人多能干細(xì)胞可以選自人胚胎干細(xì)胞，人胚胎生殖細(xì)胞和誘導(dǎo)的人多能干細(xì)胞。

在一個(gè)方面，提供了包含在體外從一種或多種前體細(xì)胞產(chǎn)生的胃細(xì)胞，組織或類器官的試劑盒。

在一個(gè)方面，提供了用于鑒定胃細(xì)胞或組織的吸收效應(yīng)的方法。該方法可以包括以下步驟：使源自前體細(xì)胞的胃細(xì)胞，組織或類器官與化合物接觸；并且檢測(cè)所述胃細(xì)胞或組織對(duì)化合物的吸收水平。

在一個(gè)方面，提供了用于鑒定化合物對(duì)胃細(xì)胞或組織的毒性的方法。該方法可以包括以下步驟：使源自前體細(xì)胞的胃細(xì)胞，組織或類器官與化合物接觸；并且檢測(cè)所述胃細(xì)胞或組織對(duì)化合物的吸收水平。

在一個(gè)方面，公開了包含從頭產(chǎn)生的三維人胃類組織(hGO)的組合物，以及通過人多能干細(xì)胞(hPSC)的定向分化來制備它們的方法。此類hGO可用于對(duì)胃發(fā)育以及幽門螺桿菌感染期間發(fā)生的早期事件建模。

在一個(gè)方面，公開了通過人多能干細(xì)胞(hPSC)的定向分化體外產(chǎn)生hGO的方法。該人胃組織可用于對(duì)人胃發(fā)育和疾病建模。還公開了誘導(dǎo)定形內(nèi)胚層(DE)以形成3維腸管結(jié)構(gòu)的方法。在一個(gè)方面，這可以通過激活FGF和WNT信號(hào)傳導(dǎo)來進(jìn)行，而前腸命運(yùn)可以通過同時(shí)抑制BMP信號(hào)傳導(dǎo)來促進(jìn)。然后，可以通過操縱視黃酸和EGF信號(hào)傳導(dǎo)將前腸球體定向?yàn)楹蟛壳澳c和胃命運(yùn)，產(chǎn)生hGO。

形成中的hGO可以經(jīng)歷與發(fā)育中的小鼠竇幾乎相同的分子和形態(tài)發(fā)生變化，形成胃腺和凹陷，增殖區(qū)，表面和竇粘液細(xì)胞和表達(dá)胃泌素，生長(zhǎng)素釋放肽和促生長(zhǎng)素抑制素的內(nèi)分泌細(xì)胞。使用hGO對(duì)人胃發(fā)育建模，已經(jīng)確定EGF信號(hào)傳導(dǎo)抑制轉(zhuǎn)錄因子NEUROGENIN 3上游的內(nèi)分泌細(xì)胞發(fā)育。申請(qǐng)人進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)hGO忠實(shí)地重演由幽門螺桿菌引發(fā)的胃疾病的早期階段，包括快速激活c-Met信號(hào)傳導(dǎo)和上皮增殖。這些研究一起描述一個(gè)新穎和強(qiáng)力的體外系統(tǒng)以闡明人類胃發(fā)育和疾病的根本機(jī)制。

源自胚胎細(xì)胞的多能干細(xì)胞

在一個(gè)方面，方法可包括獲得多能性或可被誘導(dǎo)變成多能性的干細(xì)胞的步驟。在一些實(shí)施方案中，多能干細(xì)胞源自胚胎干細(xì)胞，其又源自早期哺乳動(dòng)物胚胎的全能細(xì)胞，并且能夠在體外具有無限的未分化增殖。胚胎干細(xì)胞是源自胚泡(早期胚胎)的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的多能干細(xì)胞。用于從胚細(xì)胞衍生胚胎干細(xì)胞的方法是本領(lǐng)域熟知的。例如，雖然本文中舉例說明了某些細(xì)胞類型，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，本文中所述的方法和系統(tǒng)適用于任何干細(xì)胞。

可以在根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案中使用的另外的干細(xì)胞包括但不限于以下提供的或由以下主辦的數(shù)據(jù)庫；和由普林斯頓大學(xué)和賓夕法尼亞大學(xué)主辦的干細(xì)胞數(shù)據(jù)庫中描述的那些干細(xì)胞：國(guó)家干細(xì)胞庫(National Stem Cell Bank,NSCB)，人類胚胎干細(xì)胞研究中心(NSCB)，在加利福尼亞大學(xué)舊金山分校(UCSF)；WISC細(xì)胞庫，在Wi細(xì)胞研究所；威斯康星大學(xué)干細(xì)胞和再生醫(yī)學(xué)中心(UW-SCRMC)；Novocell,Inc.(San Diego,Calif.)；Cellartis AB(Goteborg,Sweden)；ES Cell International Pte Ltd(新加坡)；Technion，以色列理工學(xué)院(以色列海法)?？捎糜诟鶕?jù)本發(fā)明的實(shí)施方案中的示例性胚胎干細(xì)胞包括但不限于SA01(SA001)；SA02(SA002)；ES01(HES-1)；ES02(HES-2)；ES03(HES-3)；ES04(HES-4)；ES05(HES-5)；ES06(HES-6)；BG01(BGN-01)；BG02(BGN-02)；BG03(BGN-03)；TE03(13)；TE04(14)；TE06(16)；UC01(HSF1)；UC06(HSF6)；WA01(H1)；WA07(H7)；WA09(H9)；WA13(H13)；WA14(H14)。

在一些實(shí)施方案中，干細(xì)胞可以進(jìn)一步修飾以摻入另外的性質(zhì)。示例性修飾的細(xì)胞系包括但不限于H1 OCT4-EGFP；H9 Cre-LoxP；H9 hNanog-pGZ；H9 hOct4-pGZ；GFPhES中的H9；以及H9 Syn-GFP。

關(guān)于胚胎干細(xì)胞的更多細(xì)節(jié)可以參見例如Thomson et al.,1998,“Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts,”Science 282(5391):1145-1147；Andrews et al.,2005,“Embryonic stem(ES)cells and embryonal carcinoma(EC)cells:opposite sides of the same coin,”Biochem Soc Trans 33:1526-1530；Martin 1980,“Teratocarcinomas and mammalian embryogenesis,”.Science 209(4458):768-776；Evans and Kaufman,1981,“Establishment in culture of pluripotent cells from小鼠embryos,”Nature 292(5819):154-156；Klimanskaya et al.,2005,“Human embryonic stem cells derived without feeder cells,”Lancet 365(9471):1636-1641；每篇在此以其整體并入本文。

或者，多能干細(xì)胞可源自胚胎生殖細(xì)胞(EGC)，其是產(chǎn)生有性繁殖的生物體的配子的細(xì)胞。EGC源自在晚期胚胎的性腺脊中發(fā)現(xiàn)的原始生殖細(xì)胞，具有胚胎干細(xì)胞的許多性質(zhì)。胚胎中的原始生殖細(xì)胞發(fā)育成干細(xì)胞，其在成年人中產(chǎn)生繁殖配子(精子或卵)。在小鼠和人中，可以在合適的條件下在組織培養(yǎng)物中培養(yǎng)胚胎生殖細(xì)胞。EGC和ESC二者都是多能的。為了本發(fā)明的目的，術(shù)語“ESC”有時(shí)廣泛地用于涵蓋EGC。

誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞(iPSC)

在一些實(shí)施方案中，通過將某些干細(xì)胞相關(guān)基因轉(zhuǎn)染到非多能細(xì)胞(如成體成纖維細(xì)胞)中衍生iPSC。轉(zhuǎn)染通常通過病毒載體，如逆轉(zhuǎn)錄病毒實(shí)現(xiàn)。轉(zhuǎn)染的基因包括主轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子Oct-3/4(Pouf51)和Sox2，雖然提示了其它基因增強(qiáng)誘導(dǎo)的效率。3-4周后，少量轉(zhuǎn)染的細(xì)胞開始在形態(tài)和生物化學(xué)上類似于多能干細(xì)胞，并且通常通過形態(tài)選擇，倍增時(shí)間或通過報(bào)告基因和抗生素選擇來分離。如本文中使用，iPSC可包括但不限于第一代iPSC，小鼠中的第二代iPSC和人誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，逆轉(zhuǎn)錄病毒系統(tǒng)可用于使用四種關(guān)鍵基因：Oct3/4，Sox2，Klf4和c-Myc將人成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為多能干細(xì)胞。在備選實(shí)施方案中，慢病毒系統(tǒng)用于用OCT4，SOX2，NANOG和LIN28轉(zhuǎn)化體細(xì)胞。其表達(dá)可在iPSC中誘導(dǎo)的基因包括但不限于Oct-3/4(例如Pou5fl)；Sox基因家族的某些成員(例如Sox1，Sox2，Sox3和Sox15)；Klf家族的某些成員(例如Klf1，Klf2，Klf4和Klf5)，Myc家族的某些成員(例如C-myc，L-myc和N-myc)，Nanog和LIN28。

在一些實(shí)施方案中，可以采用基于非病毒的技術(shù)來產(chǎn)生iPSC。在一些實(shí)施方案中，腺病毒可用于將必需的四種基因轉(zhuǎn)運(yùn)到小鼠的皮膚和肝細(xì)胞的DNA中，產(chǎn)生與胚胎干細(xì)胞相同的細(xì)胞。由于腺病毒不將其自身基因中的任一種與靶向宿主組合，消除了創(chuàng)建腫瘤的危險(xiǎn)。在一些實(shí)施方案中，重編程可以通過根本沒有任何病毒轉(zhuǎn)染系統(tǒng)的質(zhì)粒完成，盡管效率非常低。在其它實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)的直接遞送用于產(chǎn)生iPSC，因此消除對(duì)病毒或遺傳修飾的需要。在一些實(shí)施方案中，使用類似的方法可以產(chǎn)生小鼠iPSC：用通過聚精氨酸錨定物引導(dǎo)入細(xì)胞中的某些蛋白質(zhì)重復(fù)處理細(xì)胞足以誘導(dǎo)多能性。在一些實(shí)施方案中，多能性誘導(dǎo)基因的表達(dá)也可以通過在低氧條件下用FGF2處理體細(xì)胞來增加。

關(guān)于胚胎干細(xì)胞的更多細(xì)節(jié)可以參見例如Kaji et al.,2009,“Virus free induction of pluripotency and subsequent excision of reprogramming factors,”Nature 458:771-775；Woltjen et al.,2009,“piggyBac transposition reprograms fibroblasts to induced pluripotent stem cells,”Nature 458:766-770；Okita et al.,2008,“Generation of小鼠Induced Pluripotent Stem Cells Without Viral Vectors,”Science 322(5903):949-953；Stadtfeld et al.,2008,“Induced Pluripotent Stem Cells Generated without Viral Integration,”Science 322(5903):945-949；and Zhou et al.,2009,“Generation of Induced Pluripotent Stem Cells Using Recombinant Proteins,”Cell Stem Cell 4(5):381-384；每篇在此以其整體并入本文。

在一些實(shí)施方案中，示例性iPS細(xì)胞系包括但不限于iPS-DF19-9；iPS-DF19-9；iPS-DF4-3；iPS-DF6-9；iPS(包皮)；iPS(IMR90)；和iPS(IMR90)。

已經(jīng)顯示iPSC能夠以類似于ESC的方式分化成完全分化的組織。例如，將iPSC分化成表達(dá)βIII-微管蛋白，酪氨酸羥化酶，AADC，DAT，ChAT，LMX1B和MAP2的神經(jīng)元。兒茶酚胺相關(guān)酶的存在可能表明iPSCs，像hESC一樣，可以是可分化成多巴胺能神經(jīng)元。顯示干細(xì)胞相關(guān)基因在分化后下調(diào)。還已經(jīng)顯示iPSC可以分化成自發(fā)開始跳動(dòng)的心肌細(xì)胞。心肌細(xì)胞表達(dá)TnTc，MEF2C，MYL2A，MYHCβ和NKX2.5。干細(xì)胞相關(guān)基因在分化后下調(diào)。

胃器官和發(fā)育

在申請(qǐng)人的發(fā)明之前，沒有系統(tǒng)可用于將前體細(xì)胞，如胚胎干細(xì)胞和/或iPSC轉(zhuǎn)化為胃組織。

在一些實(shí)施方案中，PSC，如ESC和iPSC以逐步方式首先進(jìn)行定向分化成內(nèi)胚層(DE)，然后分化成三維腸管結(jié)構(gòu)(前腸球體)，然后通過后部前腸/胃組織的形成分化成三維胃類器官組織(hGO)。

在一些實(shí)施方案中，PSC，如ESC和iPSC以非步進(jìn)方式進(jìn)行定向分化，其中用于促進(jìn)DE形成的分子(例如生長(zhǎng)因子，配體)和用于隨后組織形成的分子在相同的時(shí)間添加。

定形內(nèi)胚層

胃的上皮源自稱為定形內(nèi)胚層(DE)的簡(jiǎn)單的細(xì)胞片層。前部DE形成前腸及其相關(guān)器官，包括肺，食道，胃，肝和胰腺，并且后部DE形成中腸和后腸，其形成小腸和大腸以及泌尿生殖系統(tǒng)的部分。DE在體內(nèi)產(chǎn)生胃腸道和呼吸道的上皮。使用小鼠，雞和青蛙胚胎的研究表明在原腸胚階段在DE中建立前部-后部模式是隨后的前腸和后腸發(fā)育的先決條件。在一些實(shí)施方案中，PSC，如ESC和iPSC以逐步的方式首先定向分化成定形內(nèi)胚層(DE)，然后分化成前部/前腸上皮(例如，前腸球)，然后分化成胃組織。認(rèn)為BMP，Wnt和FGF信號(hào)傳導(dǎo)途徑對(duì)于該過程是關(guān)鍵的。WNT和FGF的激活作用為促進(jìn)腸管形態(tài)發(fā)生，并且抑制BMP信號(hào)傳導(dǎo)促進(jìn)前腸命運(yùn)。前腸的簡(jiǎn)單立方上皮首先發(fā)育成假復(fù)層柱狀上皮，然后發(fā)育成腺體和凹陷，它們含有胃上皮和在絨毛基部的增殖區(qū)，其對(duì)應(yīng)于假定的祖先域。

建立了強(qiáng)力和有效的過程，以在體外指導(dǎo)DE分化成胃組織。在一些實(shí)施方案中，通過選擇性激活iPSC和/或DE細(xì)胞中的某些信號(hào)傳導(dǎo)途徑來實(shí)現(xiàn)定向分化。在一些實(shí)施方案中，信號(hào)傳導(dǎo)途徑是在胃組織發(fā)育中有活性的那些，包括但不限于Wnt信號(hào)傳導(dǎo)途徑，Wnt/APC信號(hào)傳導(dǎo)途徑，F(xiàn)GF信號(hào)傳導(dǎo)途徑，TGF-β信號(hào)傳導(dǎo)途徑，BMP信號(hào)傳導(dǎo)途徑；EGF信號(hào)途徑和視黃酸信號(hào)途徑。

關(guān)于與DE發(fā)育和/或腸發(fā)育相關(guān)的信號(hào)傳導(dǎo)途徑的功能的更多細(xì)節(jié)一般可以參見例如Zorn and Wells,2009,“Vertebrate endoderm development and organ formation,”Annu Rev Cell Dev Biol 25:221-251；Dessimoz et al.,2006,“FGF signaling is necessary for establishing gut tube domains along the anterior-posterior axis in vivo,”Mech Dev 123:42-55；McLin et al.,2007,“Repression of Wnt/{beta}-catenin signaling in the anterior endoderm is essential for liver and pancreas development.Development,”134:2207-2217；Wells and Melton,2000,Development 127:1563-1572；de Santa Barbara et al.,2003,“Development and differentiation of the intestinal epithelium,”Cell Mol Life Sci 60(7):1322-1332；Sancho et al.,2004,“Signaling Pathways in Intestinal Development and Cancer,”Annual Review of Cell and Developmental Biology 20:695-723；Logan and Nusse,2004,“The Wnt Signaling Pathway in Development and Disease,”Annual Review of Cell and Developmental Biology 20:781-810；Taipalel and Beachyl,2001,“The Hedgehog and Wnt signalling pathways in cancer,”Nature 411:349-354；Gregorieff and Clevers,2005,“Wnt signaling in the intestinal epithelium:from endoderm to cancer,”Genes&Dev.19:877-890；每篇在此以其整體并入本文。

用于從多能細(xì)胞(例如iPSC或ESC)產(chǎn)生定形內(nèi)胚層的任何方法適用于本文所述的方法。在一些實(shí)施方案中，多能細(xì)胞源自桑椹胚。在一些實(shí)施方案中，多能干細(xì)胞是干細(xì)胞。在這些方法中使用的干細(xì)胞可以包括但不限于胚胎干細(xì)胞。胚胎干細(xì)胞可以源自胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)或胚胎性腺脊。胚胎干細(xì)胞或生殖細(xì)胞可以源自多種動(dòng)物物種，包括但不限于各種哺乳動(dòng)物物種，包括人。在一些實(shí)施方案中，人胚胎干細(xì)胞用于產(chǎn)生定形內(nèi)胚層。在一些實(shí)施方案中，人胚胎生殖細(xì)胞用于產(chǎn)生定形內(nèi)胚層。在一些實(shí)施方案中，iPSC用于產(chǎn)生定形內(nèi)胚層。

在一些實(shí)施方案中，在從多能干細(xì)胞到DE細(xì)胞的分化過程中使用一種或多種生長(zhǎng)因子。在分化過程中使用的一種或多種生長(zhǎng)因子可以包括來自TGF-β超家族的生長(zhǎng)因子。在此類實(shí)施方案中，一種或多種生長(zhǎng)因子包含TGF-β生長(zhǎng)因子超家族的Nodal/激活蛋白和/或BMP亞群。在一些實(shí)施方案中，所述一種或多種生長(zhǎng)因子選自Nodal，激活蛋白A，激活蛋白B，BMP4，Wnt3a或任何這些生長(zhǎng)因子的組合。

在一些實(shí)施方案中，用一種或多種生長(zhǎng)因子將胚胎干細(xì)胞或誘導(dǎo)的多能細(xì)胞和iPSC處理6小時(shí)以上；12小時(shí)以上；18小時(shí)以上；24小時(shí)以上；36小時(shí)以上；48小時(shí)以上；60小時(shí)以上；72小時(shí)以上；84小時(shí)以上；96小時(shí)以上；120小時(shí)以上；150小時(shí)以上；180小時(shí)以上；或240小時(shí)以上。

在一些實(shí)施方案中，用濃度為10ng/ml或更高；20ng/ml或更高；50ng/ml或更高；75ng/ml或更高；100ng/ml或更高；120ng/ml或更高；150ng/ml或更高；200ng/ml或更高；500ng/ml或更高；1,000ng/ml或更高；1,200ng/ml或更高；1,500ng/ml或更高；2,000ng/ml或更高；5,000ng/ml或更高；7,000ng/ml或更高；10,000ng/ml或更高；或15,000ng/ml或更高的一種或多種生長(zhǎng)因子處理胚胎干細(xì)胞或生殖細(xì)胞和iPSC。在一些實(shí)施方案中，在整個(gè)治療中生長(zhǎng)因子的濃度維持在恒定水平。在其它實(shí)施方案中，生長(zhǎng)因子的濃度在治療過程中變化。在一些實(shí)施方案中，生長(zhǎng)因子懸浮在包括具有不同HyClone濃度的胎牛絲氨酸(FBS)的培養(yǎng)基中。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，本文所述的方案適用于單獨(dú)或組合的任何已知的生長(zhǎng)因子。當(dāng)使用兩種或更多種生長(zhǎng)因子時(shí)，每種生長(zhǎng)因子的濃度可以獨(dú)立地變化。

在一些實(shí)施方案中，使用富含定形內(nèi)胚層細(xì)胞的細(xì)胞群體。在一些實(shí)施方案中，定形內(nèi)胚層細(xì)胞是分離的或基本純化的。在一些實(shí)施方案中，分離的或基本上純化的定形內(nèi)胚層細(xì)胞以比OCT4，AFP，TM，SPARC和/或SOX7標(biāo)志物更大的程度表達(dá)SOX17，F(xiàn)OXA2和/或CXRC4標(biāo)志物。

也涵蓋了用定形內(nèi)胚層富集細(xì)胞群體的方法。在一些實(shí)施方案中，可以如下從混合的細(xì)胞群體分離或基本上純化定形內(nèi)胚層細(xì)胞：使細(xì)胞與結(jié)合存在于定形內(nèi)胚層細(xì)胞表面上但不存在于混合細(xì)胞群體中的其它細(xì)胞表面上的分子的試劑接觸，然后分離與試劑結(jié)合的細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，存在于定形內(nèi)胚層細(xì)胞表面上的細(xì)胞成分是CXCR4。

本發(fā)明的其它實(shí)施方案涉及CXCR4抗體，SDF-1配體或CXCR4的其它配體可用于獲得富集，分離或基本純化形式的定形內(nèi)胚層細(xì)胞。例如，CXCR4抗體，SDF-1配體或CXCR4的另一種配體可以在諸如基于親和力的分離或基于磁性的分離的方法中用作試劑，以富集，分離或基本上純化結(jié)合試劑的定形內(nèi)胚層的制備物。

在一些實(shí)施方案中，用一種或多種生長(zhǎng)因子處理定形內(nèi)胚層細(xì)胞和hESC。此類生長(zhǎng)因子可以包括來自TGF-β超家族的生長(zhǎng)因子。在此類實(shí)施方案中，一種或多種生長(zhǎng)因子包含TGF-β生長(zhǎng)因子超家族的Nodal/激活蛋白和/或BMP亞組。在一些實(shí)施方案中，所述一種或多種生長(zhǎng)因子選自Nodal，激活蛋白A，激活蛋白B，BMP4，Wnt3a或任何這些生長(zhǎng)因子的組合。

用于獲得或創(chuàng)建可用于本發(fā)明的DE細(xì)胞的其它方法包括但不限于描述于D'Amour等人的美國(guó)專利號(hào)7,510,876；Fisk等人的美國(guó)專利號(hào)7,326,572；Kubol et al.,2004,“Development of definitive endoderm from embryonic stem cells in culture,”Development 131:1651-1662；D'Amour et al.,2005,“Efficient differentiation of human embryonic stem cells to definitive endoderm,”Nature Biotechnology 23:1534-1541；and Ang et al.,1993,“The formation and maintenance of the definitive endoderm lineage in the小鼠:involvement of HNF3/forkhead proteins,”Development 119:1301-1315；其各自通過引用整體并入本文。

后化DE(posteriorized DE)的定向分化

在一些實(shí)施方案中，激活蛋白誘導(dǎo)的定形內(nèi)胚層(DE)可進(jìn)一步經(jīng)歷FGF/Wnt/頭蛋白誘導(dǎo)的前內(nèi)胚層模式化，前腸特化和形態(tài)發(fā)生，以及最后前胃培養(yǎng)系統(tǒng)，以促進(jìn)胃組織生長(zhǎng)，形態(tài)發(fā)生和細(xì)胞分化成功能性胃細(xì)胞類型，包括表面粘液細(xì)胞，粘液腺細(xì)胞，內(nèi)分泌和祖細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，人PSC被有效地導(dǎo)向在體外分化成包括粘液，內(nèi)分泌和祖細(xì)胞類型的胃上皮。應(yīng)當(dāng)理解，諸如生長(zhǎng)因子等分子可以添加到發(fā)育的任何階段以促進(jìn)特定類型的胃組織形成。

在一些實(shí)施方案中，DE的前化(anteriorized)內(nèi)胚層細(xì)胞進(jìn)一步發(fā)育成一種或多種特化的細(xì)胞類型。

在一些實(shí)施方案中，可溶性FGF和Wnt配體和BMP拮抗劑用于模擬培養(yǎng)物中的早期前腸規(guī)定，以通過定向分化將從iPSC或ESC發(fā)育的DE轉(zhuǎn)化成前腸上皮，其有效地產(chǎn)生所有主要胃竇胃細(xì)胞類型。在人類中，通過選擇性激活對(duì)胃發(fā)育重要的某些信號(hào)傳導(dǎo)途徑來實(shí)現(xiàn)DE的定向分化。

人胃/胃發(fā)育在體外發(fā)生在近似胎兒腸發(fā)育的階段；內(nèi)胚層形成，前內(nèi)胚層模式化，前腸形態(tài)發(fā)生，胎兒胃，竇和胃底發(fā)育，上皮形態(tài)發(fā)生，推定的祖先域的形成和分化為胃的功能性細(xì)胞類型。

本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，根據(jù)本發(fā)明改變?nèi)魏蜽nt信號(hào)傳導(dǎo)蛋白與任何FGF配體的組合的表達(dá)可以產(chǎn)生定向分化。在一些實(shí)施方案中，所述改變是Wnt3，特別是Wnt3a的過表達(dá)。在一些實(shí)施方案中，所述改變是Wnt1或其它Wnt配體的過表達(dá)。

本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，根據(jù)本發(fā)明，改變Wnt信號(hào)傳導(dǎo)途徑的信號(hào)傳導(dǎo)活性與改變FGF信號(hào)傳導(dǎo)途徑的信號(hào)傳導(dǎo)活性相組合可以產(chǎn)生定向分化。在一些實(shí)施方案中，所述改變是通過使用激活上述途徑的小分子調(diào)節(jié)劑。例如，Wnt途徑的小分子調(diào)節(jié)劑包括但不限于氯化鋰；2-氨基-4,6-二取代的嘧啶(雜)芳基嘧啶；IQ1；QS11；NSC668036；DCAβ-連環(huán)蛋白；2-氨基-4-[3,4-(亞甲基二氧基)-芐基-氨基]-6-(3-甲氧基苯基)嘧啶。

在可選的實(shí)施方案中，可以抑制與Wnt和/或FGF信號(hào)傳導(dǎo)途徑相關(guān)的細(xì)胞成分，例如，途徑的天然抑制劑或拮抗劑，導(dǎo)致Wnt和/或FGF信號(hào)傳導(dǎo)途徑的激活。

在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞成分被其它細(xì)胞成分或外在分子抑制。Wnt信號(hào)傳導(dǎo)的示例性天然抑制劑包括但不限于Dkk1，SFRP蛋白和FrzB。在一些實(shí)施方案中，外在分子可以包括但不限于小分子，例如WAY-316606；SB-216763；或BIO(6-溴靛玉紅-3'-肟(6-bromoindirubin-3′-oxime))。

更多細(xì)節(jié)參見例如Liu et al.,“A small-molecule agonist of the Wnt signaling pathway,”Angew Chem Int Ed Engl.44(13):1987-1990(2005)；Miyabayashi et al.,“Wnt/beta-catenin/CBP signaling maintains long-term murine embryonic stem cell pluripotency,”Proc Natl Acad Sci USA.104(13):5668-5673(2007)；Zhang et al.,“Small-molecule synergist of the Wnt/beta-catenin signaling pathway,”Proc Natl Acad Sci U S A.104(18):7444-7448(2007)；Neiiendam et al.,“An NCAM-derived FGF-receptor agonist,the FGL-peptide,induces neurite outgrowth and neuronal survival in primary rat neurons,”J.Neurochem.91(4):920-935(2004)；Shan et al.,“Identification of a specific inhibitor of the dishevelled PDZ domain,”Biochemistry 44(47):15495-15503(2005)；Coghlan et al.,“Selective small molecule inhibitors of glycogen synthase kinase-3 modulate glycogen metabolism and gene transcription,”Chem.Biol.7(10):793-803(2000)；Coghlan et al.,“Selective small molecule inhibitors of glycogen synthase kinase-3 modulate glycogen metabolism and gene transcription,”Chemistry&Biology 7(10):793-803；和Pai et al.,“Deoxycholic acid activates beta-catenin signaling pathway and increases colon cell cancer growth and invasiveness,”Mol Biol Cell.15(5):2156-2163(2004)；每篇通過引用整體并入本文。

在一些實(shí)施方案中，使用靶向與Wnt和/或FGF信號(hào)傳導(dǎo)途徑相關(guān)的細(xì)胞成分的siRNA和/或shRNA來激活這些途徑。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，靶細(xì)胞組分可以包括但不限于SFRP蛋白；GSK3，Dkk1和FrzB。

關(guān)于基于RNAi的技術(shù)的更多細(xì)節(jié)可以參見例如Couzin,2002,Science 298:2296-2297；McManus et al.,2002,Nat.Rev.Genet.3,737-747；Hannon,G.J.,2002,Nature 418,244-251；Paddison et al.,2002,Cancer Cell 2,17-23；Elbashir et al.,2001.EMBO J.20:6877-6888；Tuschl et al.,1999,Genes Dev.13:3191-3197；Hutvagner et al.,Sciencexpress 297:2056-2060；每篇通過引用整體并入本文。

成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)是涉及血管生成，傷口愈合和胚胎發(fā)育的生長(zhǎng)因子家族。FGF是肝素結(jié)合蛋白，并且已經(jīng)顯示與細(xì)胞表面相關(guān)的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的相互作用對(duì)于FGF信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)是必需的。FGF是極其多種細(xì)胞和組織的增殖和分化過程中的關(guān)鍵參與者。在人類中，已鑒定了FGF家族的22個(gè)成員，所有這些都是結(jié)構(gòu)相關(guān)的信號(hào)傳導(dǎo)分子。成員FGF1至FGF10都結(jié)合成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體(FGFR)。FGF1也稱為酸性，并且FGF2也稱為堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子。成員FGF11，F(xiàn)GF12，F(xiàn)GF13和FGF14，也稱為FGF同源因子1-4(FHF1-FHF4)，已顯示與FGF相比具有獨(dú)特的功能差異。雖然這些因子具有顯著相似的序列同源性，但它們不結(jié)合FGFR并且參與與FGF無關(guān)的胞內(nèi)過程。該組也稱為“iFGF”。成員FGF16至FGF23是較新的，并且沒有被良好表征。FGF15是人FGF19的小鼠直向同源物(因此不存在人FGF15)。人FGF20基于其與蟾蜍(Xenopus)FGF-20(XFGF-20)的同源性鑒定。與其它FGF的局部活性相反，F(xiàn)GF15/FGF19，F(xiàn)GF21和FGF23具有更多的全身作用。

在一些實(shí)施方案中，本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，任何FGF可以與來自Wnt信號(hào)傳導(dǎo)途徑的蛋白質(zhì)聯(lián)合使用。在一些實(shí)施方案中，可溶性FGF可包括但不限于FGF4，F(xiàn)GF2和FGF3。

在一些實(shí)施方案中，F(xiàn)GF信號(hào)傳導(dǎo)途徑的細(xì)胞組分受其它細(xì)胞成分或外在分子抑制。FGF信號(hào)傳導(dǎo)的示例性天然抑制劑可以包括但不限于Sprouty蛋白家族和Spred蛋白家族。如上所討論，蛋白質(zhì)，小分子，核酸可用于激活FGF信號(hào)傳導(dǎo)途徑。

本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，通過實(shí)例提供了本文所述的與Wnt和FGF信號(hào)傳導(dǎo)途徑有關(guān)的方法和組合物。類似的方法和組合物適用于本文中公開的其它信號(hào)傳導(dǎo)途徑。

在一些實(shí)施方案中，可用本文所述的信號(hào)傳導(dǎo)途徑的一個(gè)或多個(gè)分子處理DE培養(yǎng)物達(dá)6小時(shí)以上；12小時(shí)以上；18小時(shí)以上；24小時(shí)以上；36小時(shí)以上；48小時(shí)以上；60小時(shí)以上；72小時(shí)以上；84小時(shí)以上；96小時(shí)以上；120小時(shí)以上；150小時(shí)以上；180小時(shí)以上；200小時(shí)或更多小時(shí)，240小時(shí)或更多小時(shí)；270小時(shí)以上；300小時(shí)以上；350小時(shí)以上；400小時(shí)以上；500小時(shí)以上；600小時(shí)以上；700小時(shí)以上；800小時(shí)以上；900小時(shí)以上；1,000小時(shí)以上；1,200小時(shí)以上；或1,500小時(shí)以上。

在一些實(shí)施方案中，以10ng/ml或更高；20ng/ml或更高；50ng/ml或更高；75ng/ml或更高；100ng/ml或更高；120ng/ml或更高；150ng/ml或更高；200ng/ml或更高；500ng/ml或更高；1,000ng/ml或更高；1,200ng/ml或更高；1,500ng/ml或更高；2,000ng/ml或更高；5,000ng/ml或更高；7,000ng/ml或更高；10,000ng/ml或更高；或15,000ng/ml或更高的濃度用本文所述的一種或多種信號(hào)傳導(dǎo)途徑分子處理DE培養(yǎng)物。在一些實(shí)施方案中，信號(hào)傳導(dǎo)分子的濃度在整個(gè)治療中保持恒定。在其它實(shí)施方案中，信號(hào)傳導(dǎo)途徑分子的濃度在治療過程中變化。在一些實(shí)施方案中，將根據(jù)本發(fā)明的信號(hào)傳導(dǎo)分子懸浮在包含DMEM和胎牛絲氨酸(FBS)的培養(yǎng)基中。FBS可以為2％以上；5％以上；10％以上；15％以上；20％以上；30％以上；或50％以上的濃度。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，本文所述的方案可單獨(dú)或組合地應(yīng)用于本文所述的信號(hào)傳導(dǎo)途徑的任何已知分子，包括但不限于Wnt和FGF信號(hào)傳導(dǎo)途徑中的任何分子。

在兩種或更多的信號(hào)分子用于處理DE培養(yǎng)物的實(shí)施方案中，可以同時(shí)或分別添加信號(hào)傳導(dǎo)分子。當(dāng)使用兩種或更多種分子時(shí)，每種分子的濃度可以獨(dú)立地變化。

PSC分化成DE培養(yǎng)物并隨后分化成各種中間成熟胃細(xì)胞類型可以通過階段特異性細(xì)胞標(biāo)志物的存在來確定。在一些實(shí)施方案中，代表性細(xì)胞成分的表達(dá)用于測(cè)定DE形成。代表性的細(xì)胞成分可包括但不限于，CMKOR1，CXCR4，GPR37，RTN4RL1，SLC5A9，SLC40A1，TRPA1，AGPAT3，APOA2，C20orf56，C21orf129，CALCR，CCL2，CER1，CMKOR1，CRIP1，CXCR4，CXorf1，DIO3，DIO30S，EB-1，EHHADH，ELOVL2，EPSTI1，F(xiàn)GF17，F(xiàn)LJ10970，F(xiàn)LJ21195，F(xiàn)LJ22471，F(xiàn)LJ23514，F(xiàn)OXA2，F(xiàn)OXQ1，GATA4，GPR37，GSC，LOC283537，MYL7，NPPB，NTN4，PRSS2，RTN4RL1，SEMA3E，SIAT8D，SLC5A9，SLC40A1，SOX17，SPOCK3，TMOD1，TRPA1，TTN，AW166727，AI821586，BF941609，AI916532，BC034407，N63706和AW772192。

適合于檢測(cè)DE形成的另外的細(xì)胞組分可以參見例如2005年6月23日提交的美國(guó)專利申請(qǐng)流水號(hào)11/165,305；2005年12月22日提交的美國(guó)專利申請(qǐng)流水號(hào)11/317,387；2004年12月23日提交的美國(guó)專利申請(qǐng)流水號(hào)11/021,618；2005年4月26日提交的美國(guó)專利申請(qǐng)流水號(hào)11/021,618,11/115,868；2005年12月22日提交的美國(guó)專利申請(qǐng)流水號(hào)11/317,387；2006年6月23日提交的美國(guó)專利申請(qǐng)流水號(hào)11/474,211；2005年6月23日提交的美國(guó)專利申請(qǐng)流水號(hào)11/165,305；2008年8月29日提交的美國(guó)專利申請(qǐng)流水號(hào)11/587,735；2008年2月28日提交的美國(guó)專利申請(qǐng)流水號(hào)12/039,701；2009年3月30日提交的美國(guó)專利申請(qǐng)流水號(hào)12/414,482；2009年6月2日提交的美國(guó)專利申請(qǐng)流水號(hào)12/476,570；2008年7月21日提交的美國(guó)專利申請(qǐng)流水號(hào)12/093,590；2009年10月20日提交的美國(guó)專利申請(qǐng)流水號(hào)12/582,600；其各自通過引用整體并入本文。

在一些實(shí)施方案中，使用SOX2的表達(dá)揭示在DE已經(jīng)與FGF4和Wnt3a加頭蛋白溫育一段時(shí)間，例如12小時(shí)以上；18小時(shí)以上；24小時(shí)以上；36小時(shí)以上；48小時(shí)以上；60小時(shí)以上；或90小時(shí)以上后的前腸形成傾向。在一些實(shí)施方案中，需要較長(zhǎng)的溫育期以實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定前內(nèi)胚層表型，如通過長(zhǎng)期表達(dá)CDX2測(cè)量。在此類實(shí)施方案中，溫育時(shí)段可以是60小時(shí)以上；72小時(shí)以上；84小時(shí)以上；96小時(shí)以上；108小時(shí)或更長(zhǎng)；120小時(shí)以上；140小時(shí)以上；160小時(shí)以上；180小時(shí)以上；200小時(shí)以上；240小時(shí)或更長(zhǎng)；或300小時(shí)以上。

或者，在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞組分(如后腸標(biāo)志物例如CDX2)的不存在可用于揭示定向前腸形成。在一些實(shí)施方案中，胃轉(zhuǎn)錄因子PDX1，KLF5和SOX9可用于代表胃發(fā)育。在一些實(shí)施方案中，GATA4和/或GATA6蛋白表達(dá)可用于代表胃發(fā)育。在這些實(shí)施方案中，溫育時(shí)段可以持續(xù)12小時(shí)以上；18小時(shí)以上；24小時(shí)以上；36小時(shí)以上；48小時(shí)以上；60小時(shí)以上；或90小時(shí)以上。或者，溫育時(shí)段可以持續(xù)60小時(shí)以上；72小時(shí)以上；84小時(shí)以上；96小時(shí)以上；108小時(shí)以上；120小時(shí)以上；140小時(shí)以上；160小時(shí)或更長(zhǎng)；180小時(shí)以上；200小時(shí)以上；240小時(shí)以上；或300小時(shí)以上。

在一些實(shí)施方案中，通過使用靶向相關(guān)信號(hào)傳導(dǎo)途徑中的分子的一抗和/或二抗的免疫組織化學(xué)測(cè)定細(xì)胞組分的豐度數(shù)據(jù)，例如蛋白質(zhì)和/或基因表達(dá)水平。在其它實(shí)施方案中，通過微陣列分析測(cè)定細(xì)胞組分的豐度數(shù)據(jù)，例如蛋白質(zhì)和/或基因表達(dá)水平。

或者，形態(tài)學(xué)變化可用于表示定向分化的進(jìn)展。在一些實(shí)施方案中，前腸球體可以進(jìn)一步經(jīng)受用于進(jìn)一步成熟的3維培養(yǎng)條件。此外，可以在6天以上；7天以上；9天以上；10天以上；12天以上；15天以上；20天以上；25天以上；28天以上；32天以上；36天以上；40天以上；45天以上；50天以上；或60天以上中觀察胃類器官。

多能干細(xì)胞的定向分化

在一些實(shí)施方案中，通過“一步”方法將多能干細(xì)胞轉(zhuǎn)化為胃細(xì)胞類型。例如，可以將多能干細(xì)胞分化為DE培養(yǎng)物的一種或多種分子(例如，激活蛋白A)與可以促進(jìn)DE培養(yǎng)物的定向分化的另外的分子(例如Wnt3a/FGF4激活劑和BMP抑制劑)組合，以直接處理多能干細(xì)胞。

效用和試劑盒實(shí)施方案

在一些實(shí)施方案中，本文所述的胃組織或相關(guān)細(xì)胞類型可用于對(duì)藥物篩選胃攝取和/或運(yùn)輸機(jī)制和/或幽門螺桿菌的治療。例如，這可以以高通量方式進(jìn)行，以篩選最容易吸收或有效的藥物，并且可以增加為了研究藥物胃吸收和胃毒性進(jìn)行的1期臨床試驗(yàn)。這可以包括小分子，肽，代謝物，鹽的胞周和胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制。本文中公開的胃組織可以進(jìn)一步用于評(píng)估與旨在與胃組織接觸以評(píng)價(jià)生物相容性的任何藥劑和/或裝置的相容性。

在一些實(shí)施方案中，本文所述的胃細(xì)胞，胃組織和/或胃hGO可用于鑒定正常人胃發(fā)育的分子基礎(chǔ)。

在一些實(shí)施方案中，本文所述的胃細(xì)胞，胃組織和/或胃hGO可用于鑒定影響人胃發(fā)育的先天缺陷的分子基礎(chǔ)。

在一些實(shí)施方案中，本文所述的胃細(xì)胞，胃組織和/或胃hGO可用于校正由遺傳突變引起的先天性胃遺傳缺陷。特別地，影響人胃發(fā)育的突變可以使用本文所述的iPSC技術(shù)和遺傳正常的胃組織或相關(guān)細(xì)胞類型來校正。在一些實(shí)施方案中，本文所述的胃組織或相關(guān)細(xì)胞類型可用于產(chǎn)生替換組織。遺傳性疾病的實(shí)例包括但不限于Neurog3突變和腸道內(nèi)分泌腺病，PTF1a突變和新生兒糖尿病，實(shí)現(xiàn)胃的腸內(nèi)分泌細(xì)胞的PDX1突變。

在一些實(shí)施方案中，本文所述的胃細(xì)胞，胃組織和/或胃hGO可用于產(chǎn)生用于疾病或病癥(如消化性潰瘍病，梅內(nèi)特里耶病(Ménétrier's disease))或胃癌患者的替換胃組織。

在一些實(shí)施方案中，本文所述的胃細(xì)胞，胃組織和/或胃hGO可用于研究與人宿主上皮和宿主免疫的微生物相互作用。

在一些實(shí)施方案中，本文所述的胃組織或相關(guān)細(xì)胞類型，特別是腸內(nèi)分泌細(xì)胞可用于研究由胃內(nèi)分泌介導(dǎo)的攝食行為，代謝的激素調(diào)節(jié)。

在一些實(shí)施方案中，本文所述的胃細(xì)胞，胃組織和/或胃hGO，特別是產(chǎn)生激素胃泌素或生長(zhǎng)素釋放肽的腸內(nèi)分泌細(xì)胞，可用于研究和改善例如具有肥胖，代謝綜合征或2型糖尿病的患者中的代謝控制。

在一些實(shí)施方案中，本文所述的胃細(xì)胞，胃組織和/或胃hGO可用于代替有需要的受試者中的任何損傷或移除的胃組織。

在一些實(shí)施方案中，本文所述的胃細(xì)胞，胃組織和/或胃hGO可用于篩選作用于胃組織的任何藥物的毒性和功效。

在其中本文所述的胃細(xì)胞，胃組織和/或胃hGO用于測(cè)定化合物的吸收水平的一些實(shí)施方案中，化合物將與胃細(xì)胞，胃組織和/或胃hGO接觸；并且可以量化由胃細(xì)胞，胃組織和/或胃hGO對(duì)化合物的吸收水平。在一些實(shí)施方案中，化合物可以用放射性同位素，熒光標(biāo)記物和/或初級(jí)或次級(jí)可見標(biāo)志物標(biāo)記。

在一些實(shí)施方案中，開發(fā)診斷試劑盒或包裝以包括本文所述并且基于一種或多種上述效用的胃細(xì)胞，胃組織和/或胃hGO。

已經(jīng)詳細(xì)描述了本發(fā)明，顯而易見的是，在不脫離所附權(quán)利要求書中限定的本發(fā)明的范圍的情況下，修改，變化和等同實(shí)施方案是可能的。此外，應(yīng)當(dāng)理解，本公開中的所有示例都作為非限制性示例提供。

實(shí)施例

提供以下非限制性實(shí)施例以進(jìn)一步說明本文公開的本發(fā)明的實(shí)施方案。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，以下實(shí)施例中公開的技術(shù)代表已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在本發(fā)明的實(shí)踐中良好地起作用的方法，因此可以被認(rèn)為構(gòu)成其實(shí)踐的模式的實(shí)例。然而，根據(jù)本公開內(nèi)容，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍的情況下，可以對(duì)所公開的具體實(shí)施方案進(jìn)行許多改變，并且仍然獲得相同或相似的結(jié)果。

多能干細(xì)胞培養(yǎng)物

從WiCell獲得人胚胎干細(xì)胞系WA01(H1)和WA09(H9)。ESC和iPSC系在無滋養(yǎng)層條件下在mTesR1培養(yǎng)基(Stem Cell Technologies)中的HESC量化基質(zhì)膠(BD Biosciences)上維持為集落。每四天用分散酶(Invitrogen)常規(guī)傳代細(xì)胞。

DE誘導(dǎo)。

(圖14中總結(jié))在經(jīng)基質(zhì)膠(BD Biosciences)包被的24孔板中以每孔150,000個(gè)細(xì)胞將人ES和iPS細(xì)胞作為單細(xì)胞鋪在加有ROCK抑制劑Y27632(10μM；Stemgent)的mTesR1培養(yǎng)基中。ROCK抑制劑在用于分化的鋪板后增強(qiáng)干細(xì)胞的存活。從第二天開始，在含有漸增濃度的0％，0.2％和2.0％的限定胎牛血清(dFBS；Invitrogen)的RPMI 1640(Invitrogen)中用激活蛋白A(100ng ml-1；Cell Guidance Systems)處理細(xì)胞三天。

定形內(nèi)胚層(DE)的分化

為了分化，使用accutase(Stem Cell Technologies)，在具有ROCK抑制劑Y-27632(10μM；Stemgent)的mTesR1中以150,000個(gè)細(xì)胞/孔的密度將PSC作為單細(xì)胞鋪板在基質(zhì)膠包被的24孔板。次日，如前所述^11,35，將PSC分化為DE。在RPMI 1640培養(yǎng)基(Invitrogen)中將細(xì)胞暴露于激活蛋白A(100ng ml-1；Cell Guidance Systems)三天，所述培養(yǎng)基含有漸增濃度的0％0.2％和2.0％限定胎牛血清(dFBS；Invitrogen)。此外，在DE誘導(dǎo)的第一天添加BMP4(50ngml-1；R&D Systems)。

內(nèi)胚層模式化和腸管形態(tài)發(fā)生。

在DE誘導(dǎo)后，在具有2.0％dFBS的RPMI 1640中用生長(zhǎng)因子/拮抗劑處理細(xì)胞三天。為了產(chǎn)生后部前腸球體，用頭蛋白(200ng ml-1；R&D Systems)，F(xiàn)GF4(500ng ml-1；R&D Systems)和WNT3A(500ng ml-1；R&D Systems)或CHIR99021(2μM；Stemgent)處理DE三天。CHIR99021是刺激Wnt信號(hào)傳導(dǎo)途徑的小分子。在最后一天添加RA(2μM；Sigma Aldrich)。三維生長(zhǎng)和竇特化。如前所述^10,12，將后部前腸球體包埋入的基質(zhì)膠(BD Biosciences)中，隨后在補(bǔ)充有N2(Invitrogen)，B27(Invitrogen)，L-谷氨酰胺，10μM HEPES，青霉素/鏈霉素，和EGF(100ng ml-1；R&D Systems)的Advanced DMEM/F12(Invitrogen)中培養(yǎng)。對(duì)于竇特化，在三維生長(zhǎng)的前三天添加RA和頭蛋白。對(duì)于內(nèi)分泌細(xì)胞特化，在第30天將EGF濃度降低至10ng ml^-1。

內(nèi)胚層模式化和前腸球體產(chǎn)生

DE誘導(dǎo)后，將細(xì)胞在含有2.0％dFBS和生長(zhǎng)因子：WNT3A(500ng ml-1；R&D Systems)，CHIR99021(2μM；Stemgent)；FGF4(500ng ml-1；R&D Systems)和頭蛋白(200ng ml-1；R&D Systems)的RPMI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。每天更換培養(yǎng)基。三天后，WNT3A(或CHIR99021)，F(xiàn)GF4和頭蛋白的組合在培養(yǎng)孔中導(dǎo)致浮動(dòng)的前腸球體。為了前化前腸內(nèi)胚層，在WNT/FGF/頭蛋白處理的第三天加入RA(2μM；Sigma Aldrich)。

胃類器官的三維培養(yǎng)

將球體轉(zhuǎn)移到三維體外培養(yǎng)系統(tǒng)，如先前所述的5，10，12。簡(jiǎn)言之，收集球體，重懸于50μl基質(zhì)膠(BD Biosciences)中，并鋪板在三維液滴中。在允許基質(zhì)膠在組織培養(yǎng)溫育箱中固化10-15分鐘后，用腸培養(yǎng)基覆蓋球形體：具有N2(Invitrogen)，B27(Invitrogen)，L-谷氨酰胺，10μM HEPES，青霉素/鏈霉素，和EGF(100ng ml-1；R&D Systems)的Advanced DMEM/F12。對(duì)于前三天，將RA和頭蛋白加入到腸培養(yǎng)基中。在必要時(shí)，每3-4天更換培養(yǎng)基。在第20天，收集類器官，并在約1:12的稀釋度的新鮮基質(zhì)膠中重新鋪板。

dox誘導(dǎo)型hNEUROG3hESC系的產(chǎn)生

為了產(chǎn)生過表達(dá)構(gòu)建體，使用Gateway Cloning(Invitrogen)方法將hNEUROG3 cDNA(Dana-Farber/Harvard Cancer Center DNA Resource Core；克隆HsCD00345898)克隆到pInducer20慢病毒載體(來自T.Westbrook36的贈(zèng)品)中。高滴度慢病毒顆粒由CCHMC Viral Vector Core產(chǎn)生。將H1hESC用Accutase解離，作為單細(xì)胞懸液在具有10μMY-27632的mTesR1中鋪板，并暴露于慢病毒4小時(shí)。每天更換mTesR1，兩天后，向培養(yǎng)基中加入G418(200μg ml-1)以選擇整合的克隆。G418抗性細(xì)胞無限期地保持在抗生素中，但是以其它方式培養(yǎng)并正常傳代。

iPSC系的產(chǎn)生和表征

原代人包皮成纖維細(xì)胞(HFF)從新生兒人包皮組織培養(yǎng)并通過辛迪納大學(xué)皮膚病學(xué)系(Department of Dermatology,University of Cincinnati)從2個(gè)供體獲得，并且是來自Susanne Wells博士的贈(zèng)品。將HFF在由補(bǔ)充有10％FCS(Hyclone)的DMEM(Invitrogen)組成的成纖維細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并用于在第5代和第8代之間重編程。先前描述了用于此研究的基于EBNA1/OriP的附加型質(zhì)粒pCLXE-hOct3/4-shp53，pCLXE-hSox2-Klf4，pCLXE-hLmyc-Lin28，和pCLXE-GFP³⁷，并從Addgene(分別為ID#：27077，27078，27080和27082)獲得。優(yōu)化的人真皮成纖維細(xì)胞Nucleofector試劑盒(VPD-1001；Lonza)用于用附加體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HFF。簡(jiǎn)言之，對(duì)于每次轉(zhuǎn)染，通過在室溫下以200×g離心10分鐘使1×10 6個(gè)HFF沉淀，重懸于100μl室溫Nucleofector溶液中，并用1.25μg每種附加體質(zhì)粒(程序U20)核轉(zhuǎn)染。將來自2次轉(zhuǎn)染(2x10 6總細(xì)胞)的細(xì)胞在成纖維細(xì)胞培養(yǎng)基中的10cm組織培養(yǎng)板中重新鋪板，并在37℃/5％CO2下培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染后6天，將4.5×10 5個(gè)HFF在成纖維細(xì)胞培養(yǎng)基中在明膠包被的含有1.07x10⁶個(gè)照射的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF)的10cm皿中重新鋪板。從轉(zhuǎn)染后第7天開始，每天用補(bǔ)充有20％敲除血清替換，1mM L-谷氨酰胺，0.1mMβ-巰基乙醇，0.1mM非必需氨基酸和4ng ml-1堿性FGF(均來自Invitrogen)的DMEM/F12培養(yǎng)基中喂養(yǎng)細(xì)胞。大約2周后，手動(dòng)切出具有hESC樣形態(tài)的離散集落，并在用hESC量化的基質(zhì)膠(Becton Dickinson)包被的組織培養(yǎng)皿中在mTeSR1培養(yǎng)基(Stem Cell Technologies)中重新鋪板。在適應(yīng)于mTeSR1/基質(zhì)膠培養(yǎng)后，擴(kuò)增保持強(qiáng)力增殖和具有最小自發(fā)分化的hESC樣形態(tài)的iPSC，用于冷凍保存和表征。

通過CCHMC細(xì)胞遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)室測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)中期擴(kuò)展和G帶化核型。對(duì)于畸胎瘤形成，將來自6孔皿的3個(gè)孔的iPSC組合，并輕輕地重懸浮于冰冷的DMEM/F12中。在即將注射之前，加入基質(zhì)膠至終濃度約33％，并將細(xì)胞皮下注射到免疫受損的NOD/SCID GAMMA C-/-小鼠中。腫瘤在6-12周內(nèi)形成。固定切出的畸胎瘤，包埋在石蠟中，用蘇木精和曙紅染色切片用于組織學(xué)檢查。

用于胃類器官的示例性方案

下表說明了用于從前體細(xì)胞形成胃類器官的示例性處理方案。**基礎(chǔ)腸培養(yǎng)基＝Advanced DMEM/F12+B27+N2+1-谷氨酰胺+HEPES；mTesR1可獲自StemCell Technologies。

胃底特化方案

申請(qǐng)人首先尋求在胚胎階段鑒定在胃底中但不在竇中特異性表達(dá)的基因。顯微切割E14.5小鼠胚胎的消化道，并分成四個(gè)區(qū)域：前胃(包括食管)，胃底，竇和十二指腸。參見圖15。然后，通過qPCR對(duì)這些區(qū)域分析區(qū)域化的標(biāo)志物。圖15顯示了已知在不同區(qū)域中表達(dá)的對(duì)照基因的表達(dá)?？梢酝ㄟ^Sox2和Gata4的其高表達(dá)，以及不存在P63和Cdx2，將胃底和竇與前胃和十二指腸區(qū)分開。重要的是，Pdx1(竇的標(biāo)志物)以在竇組織中比在胃底中高得多的水平表示，表明準(zhǔn)確的解剖。

使用來自胚胎小鼠內(nèi)胚層和成年人胃組織的公開的微陣列數(shù)據(jù)集的生物信息學(xué)分析來產(chǎn)生可以優(yōu)先在胃底而不是竇中表達(dá)的候選基因的列表。通過qPCR檢測(cè)這些推定的標(biāo)志物在E14.5小鼠節(jié)段中的表達(dá)。Irx1，Irx2，Irx3，Irx5和Pitx1確實(shí)在胃底中比在竇中以更高的水平表達(dá)。因此，這些標(biāo)志物可以用作hPSC衍生的前腸培養(yǎng)物中的胃底特化的指標(biāo)。參見圖16。

接下來，測(cè)試Wnt信號(hào)傳導(dǎo)在胃類器官分化方案的6-9天的胃底-竇模式化的調(diào)節(jié)中的功能。添加Wnt3a(在100ng/mL和500ng/mL)對(duì)球體基因表達(dá)沒有影響，但它也的確誘導(dǎo)Wnt靶基因Axin2的表達(dá)。因此，測(cè)試了小分子CHIR99021(CHIR；2uM)的作用。CHIR99021以受體非依賴性方式刺激Wnt信號(hào)傳導(dǎo)。暴露于CHIR導(dǎo)致Pdx1表達(dá)水平的強(qiáng)力抑制，與胃底特化一致。CHIR不誘導(dǎo)腸標(biāo)志物Cdx2的表達(dá)。參見圖17。圖18顯示，與Pdx1的阻抑一致，暴露于CHIR誘導(dǎo)了胃底特異性標(biāo)志物IRX3和IRX5的高水平表達(dá)。

幽門螺桿菌感染

在由Columbia Agar Base(Fisher Scientific)，5％馬血液(Colorado Serum Company)，5μg ml-1，萬古霉素和10μgml-1甲氧芐啶組成的血液瓊脂板上培養(yǎng)幽門螺桿菌菌株G2738和缺少CagA(ΔCagA)39的突變體G27菌株，如先前描述⁴⁰。對(duì)于類組織注射，將幽門螺桿菌以1x10 9細(xì)菌ml-1的濃度重懸于布魯氏肉湯(brucella broth)中，并裝載到Nanoject II(Drummond)微量注射器裝置上。將大約200nl(含有2x10 5個(gè)細(xì)菌)直接注射到每種類器官的內(nèi)腔中，并將注射的類器官培養(yǎng)24小時(shí)。注射布魯氏菌肉湯作為陰性對(duì)照。

材料和方法

免疫熒光染色

將所有組織在4％多聚甲醛中在室溫下固定1小時(shí)用于冷凍處理或在4℃下過夜用于石蠟處理。對(duì)于冷凍切片，將組織在30％蔗糖中在4℃下保護(hù)過夜，然后包埋在OCT(Tissue-Tek)中，并切成10μm。對(duì)于石蠟切片，通過分級(jí)乙醇系列，然后二甲苯處理組織，然后包埋在石蠟中并在7μm處切割。將組織培養(yǎng)細(xì)胞在室溫下固定15分鐘并直接染色。為了染色，將凍結(jié)的載玻片解凍至室溫并在PBS中再水合，而石蠟載玻片脫蠟并進(jìn)行抗原修復(fù)。將載玻片在室溫下在含有0.5％Triton-X的PBS中的5％正常驢血清(Jackson Immuno Research)中封閉30分鐘。將一抗(在方法表1中列出)在封閉緩沖液中稀釋，并在4℃溫育過夜。將載玻片在PBS中洗滌，并在室溫下與二抗溫育1小時(shí)，并使用Fluoromount-G(Southern Biotech)安裝蓋玻片。在Nikon A1Rsi倒置共焦顯微鏡上捕獲共焦圖像。

RNA分離和qPCR

使用Nucleospin RNA II試劑盒(Machery-Nagel)從組織中分離總RNA。使用Superscript VILO cDNA Synthesis Kit(Invitrogen)根據(jù)制造商的方案從100ng RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。使用Quantitect SybrGreen Master Mix(Qiagen)在CFX-96實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)系統(tǒng)(BioRad)上進(jìn)行qPCR。使用ΔΔCT方法進(jìn)行分析。使用來自qPrimerDepot(http://primerdepot.nci.nih.gov)的序列設(shè)計(jì)PCR引物，并列于表2中。

免疫沉淀和Western印跡分析

在冰冷的PBS中從基質(zhì)膠收獲幽門螺桿菌感染的類器官，并在150g下離心5分鐘。將組織在補(bǔ)充有蛋白酶抑制劑(Roche)的M-PER哺乳動(dòng)物蛋白提取試劑(Thermo Scientific)中裂解。來自細(xì)胞裂解物的10μg總蛋白用抗c-Met抗體(2μg；Cell Signaling 4560)在4℃下免疫沉淀16小時(shí)。然后加入蛋白A/G瓊脂糖珠(20μl；Santa Cruz Biotechnology)，將樣品在4℃下溫育16小時(shí)。將免疫沉淀物在PBS中洗滌3次，然后重懸于含有β-巰基乙醇(40μl；BioRad)的Laemmli上樣緩沖液中。樣品在4-20％Tris-甘氨酸梯度凝膠(Invitrogen)上運(yùn)行并在80V下運(yùn)行3.5小時(shí)。將凝膠在105V下轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜(Whatman Protran，0.45μm)上1.5小時(shí)。將膜在KPL檢測(cè)器封閉溶液(Kirkeaard&Perry Laboratories)中在室溫下封閉1小時(shí)，然后在4℃與一抗溫育過夜。使用的一抗：抗磷酸酪氨酸(Santa Cruz，sc-7020；1:100)，抗c-Met(Abcam，ab59884；1:100)和抗幽門螺桿菌CagA(Abcam，ab90490；1:100)。將膜洗滌并在Alexa Fluor抗小鼠680(Invitrogen；1:100)二抗中溫育。使用Odyssey紅外成像軟件系統(tǒng)(Licor)對(duì)印跡進(jìn)行成像。

討論

將hPSC分化成定形內(nèi)胚層(DE)¹¹，其在體內(nèi)產(chǎn)生胃腸道和呼吸道的上皮。所有內(nèi)胚層器官的發(fā)育中的下兩個(gè)基本事件是沿著前部-至-后部(A-P)軸和腸管形態(tài)發(fā)生的DE模式化，導(dǎo)致在前部中的Sox2+前腸和在后部中的Cdx2+中-后腸的形成(如在E8.5,14體節(jié)階段小鼠胚胎中突出顯示的，圖1A)。這種形態(tài)發(fā)生和內(nèi)胚層和中胚層之間的組織相互作用似乎對(duì)于體內(nèi)和體外二者的正確器官發(fā)生是關(guān)鍵的。WNT3A和FGF4先前已經(jīng)證明協(xié)同作用做三件事：后化hPSC衍生的DE，促進(jìn)間質(zhì)的擴(kuò)張，并且誘導(dǎo)表達(dá)中后腸標(biāo)志物CDX2的腸管樣結(jié)構(gòu)的組裝^10,12。圖1A顯示Sox2蛋白標(biāo)記前腸內(nèi)胚層，并且Cdx2蛋白標(biāo)記e8.5(14體節(jié)期)小鼠胚胎中的中/后腸內(nèi)胚層。圖1B顯示抑制BMP抑制中/后腸的命運(yùn)并促進(jìn)前腸標(biāo)志物SOX2的表達(dá)。在單獨(dú)(對(duì)照)或具有指定的生長(zhǎng)因子/拮抗劑的培養(yǎng)基中暴露于三天的hPSC-DE培養(yǎng)物中的模式化標(biāo)志物的PCR分析。如先前報(bào)道的¹⁰，WNT和FGF的組合活性誘導(dǎo)CDX2表達(dá)，而BMP拮抗劑頭蛋白抑制CDX2表達(dá)，并且足以誘導(dǎo)高水平的前腸標(biāo)志物SOX2。*，與對(duì)照相比p<0.05。**，與WNT/FGF相比p<0.005。圖1C描述了與單獨(dú)用Wnt和FGF產(chǎn)生的具有高水平CDX2的球體相比，根據(jù)整裝免疫熒光染色和mRNA，用Wnt/FGF/頭蛋白產(chǎn)生的前腸球體具有高水平的SOX2蛋白。*，p<1.0×10-6。圖1D描述了e8.5，14-體細(xì)胞階段小鼠胚胎中的后部前腸產(chǎn)生胃和胰腺并且具有高水平的Hnf1β蛋白。圖1E描述了在球體產(chǎn)生步驟的最后一天將培養(yǎng)物暴露于RA誘導(dǎo)在SOX2表達(dá)上皮中HNF1β的表達(dá)，導(dǎo)致后部前腸球體的形成。*，p<0.005。圖1F描繪了總結(jié)在前部和后部前腸內(nèi)胚層兩者的形成中頭蛋白和RA的模式化效應(yīng)的譜系圖。比例尺，100μm。誤差棒表示標(biāo)偏差。

表1：一抗。

表2：qPCR引物序列

為了促進(jìn)hPSC衍生的DE中前腸結(jié)構(gòu)的形成，申請(qǐng)人試圖分離WNT/FGF刺激腸管形態(tài)發(fā)生的能力與其在促進(jìn)后部?jī)?nèi)胚層命運(yùn)中的作用。基于來自發(fā)育模型生物的體內(nèi)研究^13,14，測(cè)試BMP信號(hào)傳導(dǎo)在調(diào)節(jié)A-P模式化中的功能，申請(qǐng)人確定WNT/FGF需要BMP活性來啟動(dòng)后腸程序。具體地，即使在存在WNT/FGF的情況下，用拮抗劑頭蛋白抑制BMP信號(hào)傳導(dǎo)抑制CDX2并在三天后在DE培養(yǎng)物中誘導(dǎo)前腸標(biāo)志物SOX2(圖1B-C和圖5)。重要的是，對(duì)BMP信號(hào)傳導(dǎo)的抑制對(duì)WNT/FGF促進(jìn)間質(zhì)擴(kuò)展和腸管結(jié)構(gòu)的裝配的能力沒有影響，因此導(dǎo)致SOX2⁺前腸球體的形成。

圖5顯示與WNT和FGF的激活平行地需要BMP信號(hào)傳導(dǎo)以促進(jìn)后部命運(yùn)。圖5A顯示GSK3β抑制劑CHIR99021(CHIR；2μM)誘導(dǎo)與重組WNT3A相同的后化作用，并且這些可以被BMP抑制阻斷。圖5B顯示CHIR誘導(dǎo)的腸管形態(tài)發(fā)生和球體產(chǎn)生以與WNT3A類似的方式發(fā)生。圖5C描繪了單層培養(yǎng)物的免疫熒光染色，其證實(shí)了在CHIR/FGF處理的內(nèi)胚層中的CDX2誘導(dǎo)和頭蛋白和CHIR/FGF/頭蛋白處理的內(nèi)胚層中的SOX2誘導(dǎo)的高效率。圖5D顯示BMP靶基因MSX1/2的qPCR分析，其指示BMP活性不響應(yīng)于Wnt/FGF而增加，但是靶基因響應(yīng)頭蛋白而抑制，表明存在內(nèi)源性BMP信號(hào)傳導(dǎo)。圖5E顯示加入BMP2(100ng mL-1)不代替或提升Wnt/FGF使內(nèi)胚層后化的能力。這些數(shù)據(jù)指示W(wǎng)nt/FGF的后化作用不是由BMP信號(hào)傳導(dǎo)的上調(diào)介導(dǎo)的，但是確實(shí)需要內(nèi)源性BMP活性。比例尺，圖5B中的1mm；圖5C中的100μm。誤差棒表示標(biāo)準(zhǔn)偏差。

球體形態(tài)發(fā)生在hESC和hiPSC系二者中是強(qiáng)力的過程(圖6A)，并且>90％的球體細(xì)胞表達(dá)SOX2(圖1C)，指示有效規(guī)定成前腸譜系。因此，申請(qǐng)人已經(jīng)鑒定了WNT，F(xiàn)GF和BMP之間的新的上位關(guān)系，其中所有三種途徑協(xié)作以促進(jìn)中后腸命運(yùn)，而WNT和FGF與BMP分開作用以驅(qū)動(dòng)內(nèi)胚層和中胚層組裝成腸管結(jié)構(gòu)。

圖2A-2G描繪了胃類器官分化是有效的和細(xì)胞系非依賴性過程。圖2A，比較兩個(gè)hESC系(H1和H9)和一個(gè)iPSC系(72.3)之間的球體形成和特征的表。圖2B，源自H1和iPSC 72.3細(xì)胞系的第34天hGO的免疫熒光染色。iPSC衍生的類器官表現(xiàn)出與源自hESC的那些相同的形態(tài)和分子特征。圖2C。在第34天hGO中的器官上皮細(xì)胞類型定量。大于90％的上皮是竇性的，由PDX1表達(dá)和缺乏PTF1A表達(dá)指示，而小于5％表達(dá)與源自內(nèi)胚層的其它器官相關(guān)的標(biāo)志物，包括CDX2(腸)，白蛋白(肝)和p63(鱗狀上皮)。d-g，誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞系iPSC 72.3的表征。圖2D，iPSC 72.3表現(xiàn)出與H1hESC系相比的多能干細(xì)胞集落的正常形態(tài)學(xué)特征，并且圖2E具有正常的46；XY核型。圖2F，iPSC 72.3表達(dá)多能標(biāo)志物OCT3/4和NANOG，并且圖2G，通過在體內(nèi)畸胎瘤測(cè)定法中分化成內(nèi)胚層，中胚層和外胚層譜系來證明多能性。比例尺，100μm。誤差棒表示標(biāo)準(zhǔn)偏差。

在體內(nèi)，胃的基底和竇域與胰腺，肝和十二指腸一起都源自Sox2⁺前腸內(nèi)胚層的后段。為了將SOX2⁺前腸球體定向成胃譜系，申請(qǐng)人試圖鑒定促進(jìn)后部前腸命運(yùn)的信號(hào)傳導(dǎo)途徑。申請(qǐng)人聚焦于視黃酸(RA)信號(hào)傳導(dǎo)，鑒于其在后部前腸衍生的器官的發(fā)育中的作用。^15-17在體內(nèi)，后部前腸由Hnf1β的表達(dá)標(biāo)記(圖1D)。申請(qǐng)人鑒定了在模式化/球體生成階段(FGF4/WNT3A/頭蛋白)的最后一天(第5-6天)的24小時(shí)暴露于RA導(dǎo)致后部前腸標(biāo)志物的強(qiáng)烈激活和SOX2/HNF1β⁺后部前腸球體的形成(圖1E和圖7)。因此，RA，WNT，F(xiàn)GF和BMP信號(hào)傳導(dǎo)途徑的精確時(shí)間和組合操作允許產(chǎn)生三維后部前腸球體。

圖7A-7D顯示視黃酸使前腸內(nèi)胚層后化。圖7A描述了前腸模式化實(shí)驗(yàn)的示意圖。DE培養(yǎng)物用Wnt(CHIR)/FGF/頭蛋白處理三天以產(chǎn)生Sox2陽性前腸球體，并且在模式化的第三天添加RA達(dá)24小時(shí)。圖7B描述了顯示RA增加從前腸單層培養(yǎng)物產(chǎn)生的球體數(shù)目的明視野圖像。圖7C描繪了圖1D的低倍圖像，顯示了具有位于前腸后部的Hnf1β蛋白的14個(gè)體節(jié)期胚胎的免疫熒光圖像。胚胎的框示區(qū)域顯示在圖1D中。圖7D顯示用RA處理的前腸球體中基因表達(dá)的qPCR分析。后部前腸標(biāo)志物HNF1β和HNF6通過24小時(shí)暴露于RA而被強(qiáng)烈誘導(dǎo)。*，p<0.05。比例尺，圖7B中的1mm；圖7C中的100μm。誤差棒表示標(biāo)準(zhǔn)偏差。

將后部前腸定向?yàn)椴煌鞴僮V系的分子機(jī)制了解甚少。在發(fā)育早期，推定的器官域由不同的基因表達(dá)模式標(biāo)記：Sox2⁺基底，Sox2/Pdx1⁺竇，Pdx1/Ptf1α⁺胰腺和Pdx1/Cdx2⁺十二指腸(圖2B)。申請(qǐng)人使用這些分子標(biāo)志物來鑒定將后部前腸球體培養(yǎng)物定向?yàn)槲缸V系的信號(hào)傳導(dǎo)途徑。在將球體轉(zhuǎn)移到三維培養(yǎng)條件后，用RA進(jìn)一步處理72小時(shí)(6-9天)導(dǎo)致PDX1mRNA水平>100倍的增加，同時(shí)保持高SOX2表達(dá)(圖2C)。重要的是，RA處理不促進(jìn)其它人⁹觀察到的胰腺命運(yùn)，因?yàn)闆]有誘導(dǎo)胰腺特異性標(biāo)志物PTF1α的表達(dá)。這些數(shù)據(jù)證明RA信號(hào)傳導(dǎo)與三維生長(zhǎng)的組合有效地將后部前腸球體定向成指示早期竇性命運(yùn)的SOX2/PDX1⁺上皮。

圖2一般地描述了人竇胃類器官的特化和生長(zhǎng)。誤差棒表示標(biāo)準(zhǔn)偏差。圖2A描繪了用于指導(dǎo)hPSC分化為三維胃類器官的體外培養(yǎng)系統(tǒng)的示意圖，圖2B描述了通過用Sox2，Pdx1和Cdx2對(duì)小鼠E10.5胚胎進(jìn)行整裝疫熒光染色來限定發(fā)育中的后部前腸器官的標(biāo)志物。Sox2和Pdx1的共表達(dá)是對(duì)于胃上皮的遠(yuǎn)端部分是獨(dú)特的，推定的竇(a)，Sox2表達(dá)標(biāo)記胃底(f)，Pdx1(和Ptf1a)表達(dá)標(biāo)記背側(cè)(dp)和腹側(cè)(vp)胰腺，并且Pdx1/Cdx2共表達(dá)標(biāo)記十二指腸(d)。圖2C顯示在RA(2μM)存在下在三維基質(zhì)中培養(yǎng)三天的后部前腸球體共表達(dá)高水平的PDX1和SOX2，并且不表達(dá)胰腺標(biāo)志物PTF1α，類似于發(fā)展中的竇*p<0.05。圖2D描繪了顯示后部前腸球體生長(zhǎng)成胃類器官期間形態(tài)學(xué)變化的立體顯微照片。到四周，hGO的上皮展現(xiàn)出復(fù)雜的腺體構(gòu)造，比例尺，500μm。圖2E描述了E14.5和E18.5和相當(dāng)?shù)膆GO發(fā)育階段時(shí)的發(fā)育中的小鼠竇的比較。Sox2和Pdx1在小鼠竇和hGO二者中的早期假復(fù)層上皮中共表達(dá)。在后期階段，Sox2被下調(diào)，因?yàn)樯掀まD(zhuǎn)變成更成熟的腺體結(jié)構(gòu)。Pdx1在體內(nèi)貫穿成人期和在hGO中檢查的所有階段保持在竇中，圖2E中的比例尺100μm。

申請(qǐng)人使用SOX2/PDX1⁺球體來鑒定促進(jìn)早期胃上皮的生長(zhǎng)和形態(tài)發(fā)生的途徑，并且發(fā)現(xiàn)高濃度的EGF(100ng mL^-1)足以促進(jìn)人竇胃類器官(hGO)的強(qiáng)力生長(zhǎng)。在3-4周的過程中，直徑<100μm的球體生長(zhǎng)成直徑為2-4mm的類器官。在培養(yǎng)的后期(約第27天)，hGO上皮經(jīng)歷了一系列形態(tài)發(fā)生變化，使人想起胚胎胃發(fā)育的晚期，在此期間，簡(jiǎn)單的平坦的假復(fù)層上皮轉(zhuǎn)變成精細(xì)的，旋繞的腺上皮(圖2D)。前腸球體的初始生長(zhǎng)依賴于EGF(數(shù)據(jù)未顯示)；此外，當(dāng)在第27天從培養(yǎng)基中除去EGF時(shí)，不發(fā)生上皮擴(kuò)張和形態(tài)發(fā)生成腺體(圖8)。這些結(jié)果支持已公布的發(fā)現(xiàn)，其指示EGF在促進(jìn)胃粘膜的適當(dāng)生長(zhǎng)中的重要作用^19,20。

圖8顯示EGF是胃類器官中腺體形態(tài)發(fā)生所需的。明視野圖像和免疫染色證明了在hGO分化的晚期階段上皮形態(tài)發(fā)生和腺形成需要EGF。當(dāng)在第27天從生長(zhǎng)培養(yǎng)基中除去EGF時(shí)，在腺形態(tài)發(fā)生之前，hGO上皮保持了不能形成腺體的簡(jiǎn)單的立方結(jié)構(gòu)。比例尺，100μm。

hGO生長(zhǎng)與胚胎小鼠胃發(fā)育的比較揭示了hGO發(fā)育與體內(nèi)胃器官發(fā)生驚人地相似。在早期階段(小鼠中的E12-14和13天hGO)，這兩種上皮都是假復(fù)層的，并且包含集中朝向腔面的有絲分裂細(xì)胞(圖9和圖10)，指示相互動(dòng)力核遷移過程(interkinetic nuclear migration process)²¹。早期hGO是適當(dāng)?shù)貥O化的，并且包含由頂端標(biāo)志物aPKC22的表達(dá)描繪輪廓的次級(jí)腔(secondary lumina)(圖10)。

在E16.5和產(chǎn)后早期階段之間，竇轉(zhuǎn)化成表現(xiàn)出由腺體和凹陷組成的高度結(jié)構(gòu)化構(gòu)造的簡(jiǎn)單柱狀上皮(圖2E和圖9)。在體外13和34天之間，hGO上皮經(jīng)歷類似的轉(zhuǎn)變以形成具有類似于晚期胎兒竇的腺狀結(jié)構(gòu)的高柱狀上皮(圖2E)。對(duì)轉(zhuǎn)錄因子Sox2，Pdx1，Gata4和Klf5的表達(dá)的分析揭示在體內(nèi)和體外伴隨這些形態(tài)發(fā)生過程的定型(stereotypic)時(shí)空表達(dá)模式(圖9)。在早期階段，這些因子都在未成熟的假復(fù)層上皮中共表達(dá)。然而，在后期階段，Sox2表達(dá)下調(diào)，因?yàn)樯掀ば纬稍缙谙袤w和凹陷，而其它因素的表達(dá)無限期地維持?；谶@些數(shù)據(jù)，估計(jì)13天hGO代表類似于E12-14小鼠竇的發(fā)育階段，而34天hGO更相當(dāng)于晚期胎兒早期產(chǎn)后竇。此外，推斷hGO重演正常胚胎發(fā)育，并且發(fā)生在竇發(fā)育期間的分子和形態(tài)發(fā)生過程在嚙齒類和人類之間是保守的。

圖9顯示在小鼠竇和人胃類器官發(fā)育期間轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)的比較。分析了體內(nèi)竇發(fā)育的四個(gè)胚胎期(E12.5，E14.5，E16.5和E18.5)和一個(gè)出生后階段(P12)的轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)：Sox2，Pdx1，Gata4，Klf5和FoxF1。在體外hGO發(fā)育的兩個(gè)階段(第13天和第34天)分析相同的標(biāo)志物，并且揭示類器官發(fā)育與在體內(nèi)發(fā)生的事情平行。在竇發(fā)育的早期階段，上皮標(biāo)志物Sox2遍在表達(dá)，但在后期階段時(shí)下調(diào)，而其它上皮轉(zhuǎn)錄因子Pdx1，Gata4和Klf5在整個(gè)發(fā)育中表現(xiàn)出持續(xù)表達(dá)。早期和晚期hGO二者都包含圍繞上皮的FoxF1陽性間質(zhì)細(xì)胞。比例尺，100μm。圖10顯示早期階段人胃類器官表現(xiàn)出定型結(jié)構(gòu)和核行為。在13天，hGO含有顯示由頂端標(biāo)志物aPKC和基底外側(cè)標(biāo)志物E-鈣粘蛋白標(biāo)記的頂基部(apicobasal)極性的假復(fù)層上皮細(xì)胞，類似于E12.5小鼠竇。此外，在類器官上皮內(nèi)看到襯里為頂膜的次級(jí)腔(白色箭頭)。E12.5小鼠竇和第7天hGO兩者似乎僅在細(xì)胞的頂端部分中經(jīng)歷相互動(dòng)力學(xué)核遷移，其由有絲分裂核，pHH3的存在指示。比例尺，50μm。

前腸球體含有類似于先前描述¹⁰的中后腸球體的間質(zhì)組分。在分化為胃類器官組織期間，間質(zhì)擴(kuò)展并表達(dá)與竇間質(zhì)發(fā)育相關(guān)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，包括FOXF1和BAPX1(圖10和圖11)。在后期階段，hGO間質(zhì)主要由VIMENTIN⁺粘膜下成纖維細(xì)胞和較少數(shù)量的ACTA2⁺上皮下肌纖維母細(xì)胞(指示未成熟的胃間質(zhì))組成(圖11)。hGO不形成如在體內(nèi)發(fā)生的平滑肌的分化層。鑒于在除了EGF之外沒有任何外源因子的情況下存在這種強(qiáng)力的上皮形態(tài)發(fā)生，似乎可能的是間質(zhì)在上皮發(fā)育中起作用。因此，令人驚訝的是，上皮不表現(xiàn)出促進(jìn)間質(zhì)的強(qiáng)力分化。這提示其它刺激物(可能是機(jī)械的)在胃間質(zhì)分化中發(fā)揮作用。

圖11顯示胃類器官中的間質(zhì)分化。圖11A顯示竇間質(zhì)轉(zhuǎn)錄因子BAPX1的時(shí)間表達(dá)分析。類似于其已知的胚胎表達(dá)模式，BAPX1是在hGO分化的早期階段期間上調(diào)，然后下調(diào)，與功能細(xì)胞類型標(biāo)志物表達(dá)一致。圖11B顯示間質(zhì)細(xì)胞類型標(biāo)志物的染色揭示第34天hGO含有FOXF1/波形蛋白陽性粘膜下成纖維細(xì)胞和少量表達(dá)波形蛋白/ALPHA-SM-ACTIN(SMA)的上皮下成纖維細(xì)胞。hGO缺乏穩(wěn)定的平滑肌層，其由體內(nèi)竇中的SMA/結(jié)蛋白陽性細(xì)胞表示。比例尺，100μm。誤差棒表示標(biāo)準(zhǔn)偏差。

在竇中發(fā)現(xiàn)的主要功能細(xì)胞類型是粘液細(xì)胞，其分泌作為胃上皮襯里的保護(hù)性粘液層和分泌激素以調(diào)節(jié)胃腸生理學(xué)和代謝穩(wěn)態(tài)的內(nèi)分泌細(xì)胞²⁴。到第34天，hGO含有將粘液分泌到管腔中并具有與其體內(nèi)對(duì)應(yīng)物相同的高柱狀形態(tài)的表面粘液細(xì)胞(MUC5AC/UEAI⁺)。hGO還含有TFF2/GSII⁺竇腺細(xì)胞，指示在竇粘液譜系中的適當(dāng)分化(圖3A)。此外，hGO形成由基本定位的增殖和SOX9表達(dá)區(qū)域指示的祖細(xì)胞小生境(圖4A)，盡管上皮的增殖指數(shù)是可變的并且在1-10％之間變化。因此，體外hGO含有包含祖細(xì)胞和分化細(xì)胞類型二者的生理性胃上皮。

圖4顯示人胃類器官表現(xiàn)出對(duì)幽門螺桿菌感染的急性響應(yīng)。圖4A顯示第28天hGO含有以Ki67標(biāo)記的增殖細(xì)胞和限制到早期腺體底部的SOX9+祖細(xì)胞，類似于晚期胚胎和出生后小鼠竇。圖4B顯示hGO用于對(duì)幽門螺桿菌感染的人特異性疾病過程建模。將細(xì)菌顯微注射到hGO的腔中，并且通過明視野顯微術(shù)(黑色箭頭)和免疫熒光染色在注射后24小時(shí)在腔中顯現(xiàn)細(xì)菌。圖4C描述了癌基因c-Met的免疫沉淀，并且證明幽門螺桿菌誘導(dǎo)c-Met的強(qiáng)力激活(酪氨酸磷酸化)，并且這是CagA依賴性過程。此外，CagA直接與人類胃上皮細(xì)胞中的c-Met相互作用。圖4D顯示在24小時(shí)內(nèi)，幽門螺桿菌感染導(dǎo)致hGO上皮中的增殖細(xì)胞數(shù)量增加兩倍，其通過EdU摻入測(cè)量。*，p<0.05。比例尺，a中100μm；b中25μm。誤差棒表示。

圖3證明人胃類器官組織含有正常分化的竇細(xì)胞類型，并且可用于對(duì)人胃發(fā)育建模。圖3A證明hGO含有所有主要的竇細(xì)胞譜系。34天hGO具有表面粘液細(xì)胞(Muc5AC)和粘液腺細(xì)胞(TFF2)，以及凝集素染色區(qū)分表面粘液，UEAI和粘液腺細(xì)胞GSII。hGO還包含如由染色顆粒素(Chromogranin)A(CHGA)標(biāo)記的內(nèi)分泌細(xì)胞。圖3B是在hGO發(fā)育期間EGF在生長(zhǎng)，形態(tài)發(fā)生和細(xì)胞類型特化中的不同作用的示意圖。在早期發(fā)育階段需要高水平的EGF以形成腺體，然而其在發(fā)育的晚期抑制內(nèi)分泌分化；因此，到第30天，EGF濃度降低以允許內(nèi)分泌細(xì)胞發(fā)育。圖3C顯示，在撤去包括胃泌素，生長(zhǎng)素釋放肽和血清素(5-HT)的EGF時(shí)，所有主要內(nèi)分泌激素在hGO中表達(dá)。圖3D顯示高水平的EGF抑制NEUROG3表達(dá)。在第30天EGF濃度的降低導(dǎo)致在第34天通過qPCR測(cè)量的NEUROG3表達(dá)的顯著增加，指示EGF在內(nèi)分泌特化中作用于NEUROG3的上游。*，p<0.05。圖3E顯示NEUROG3在EGF下游作用以誘導(dǎo)內(nèi)分泌細(xì)胞命運(yùn)。使用dox誘導(dǎo)性系統(tǒng)的NEUROG3的強(qiáng)制表達(dá)足以超越高EGF(100ng mL-1)的內(nèi)分泌抑制作用。hGO在第30天暴露于dox(1μg/mL)24小時(shí)，并在第34天進(jìn)行分析。經(jīng)Dox處理的類器官表現(xiàn)出對(duì)表達(dá)ChrA的內(nèi)分泌細(xì)胞的強(qiáng)烈誘導(dǎo)。比例尺，100μm。誤差棒表示標(biāo)準(zhǔn)偏差。

在34天hGO中還存在豐富的染色顆粒素-A(CHGA)⁺內(nèi)分泌細(xì)胞，包括表達(dá)胃泌素，生長(zhǎng)素釋放肽，生長(zhǎng)抑素和血清素的竇中的四種主要內(nèi)分泌細(xì)胞類型(圖3C和圖12)。有趣的是，我們觀察到高水平的EGF抑制內(nèi)分泌細(xì)胞形成，使得100ng ml^-1導(dǎo)致每個(gè)類器官的<1個(gè)內(nèi)分泌細(xì)胞。相反，從第30-34天在較低水平的EGF(10ng ml^-1)中培養(yǎng)的hGO產(chǎn)生大量的內(nèi)分泌細(xì)胞(圖13)。此外，高EGF還抑制促內(nèi)分泌轉(zhuǎn)錄因子NEUROG3的表達(dá)(圖3D)，其在胰腺和腸中廣泛研究^25-28并且是大多數(shù)胃內(nèi)分泌譜系的形成中所需要的^29,30。這些數(shù)據(jù)提示EGFR信號(hào)傳導(dǎo)在NEUROG3上游的胃內(nèi)分泌細(xì)胞特化中的新的抑制作用。為了測(cè)試該模型，申請(qǐng)人使用多西環(huán)素誘導(dǎo)型hNEUROG3過表達(dá)hESC系，并且發(fā)現(xiàn)NEUROG3表達(dá)足以克服高EGF(100ng ml^-1)的內(nèi)分泌抑制作用，導(dǎo)致CHGA⁺內(nèi)分泌細(xì)胞的強(qiáng)力形成(圖3E和圖13)。從這些發(fā)現(xiàn)，我們得出結(jié)論，EGF通過抑制NEUROG3抑制內(nèi)分泌祖細(xì)胞的形成，并且NEUROG3足以用于人胃內(nèi)分泌細(xì)胞的特化。

圖12顯示了體內(nèi)胃竇內(nèi)分泌細(xì)胞發(fā)育。竇中的內(nèi)分泌細(xì)胞分化首先在E18.5明顯，但在出生后階段更明確(顯示的P12)。在早期階段，所有預(yù)期的胃內(nèi)分泌亞型是明顯的，包括胃泌素，生長(zhǎng)素釋放肽，生長(zhǎng)抑素和血清素(5-HT)。比例尺，100μm。圖13顯示EGF信號(hào)傳導(dǎo)抑制NEUROG3依賴性胃內(nèi)分泌特化程序。圖13A顯示維持在高濃度的EGF(100ng mL-1)中的hGO在第34天具有非常少的內(nèi)分泌細(xì)胞，其通過泛內(nèi)分泌標(biāo)志物CHGA的染色顯示。在第24天EGF濃度(10ng mL-1)的減少導(dǎo)致胃上皮中內(nèi)分泌細(xì)胞的更多生理數(shù)目。圖13B顯示從用dox誘導(dǎo)型NEUROG3過表達(dá)轉(zhuǎn)基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的hESC系產(chǎn)生hGO，以測(cè)試NEUROG3上游是否發(fā)生內(nèi)分泌分化的EGF阻遏。hGO維持在高EGF(100ng mL-1)中，然后在第30天用多西環(huán)素(1μg/mL-1)處理24小時(shí)，然后在第34天進(jìn)行分析。經(jīng)Dox處理的hGO顯示內(nèi)分泌標(biāo)志物CHGA，胃泌素，生長(zhǎng)素釋放肽和促生長(zhǎng)素抑制素，并且它們含有具有內(nèi)分泌形態(tài)的CHGA-(圖3A)，生長(zhǎng)素釋放肽-和促生長(zhǎng)素抑制素陽性細(xì)胞。*，p<0.05。比例尺，100μm。誤差棒表示標(biāo)準(zhǔn)偏差。

臨床證據(jù)指示竇的主要定植在幽門螺桿菌介導(dǎo)的疾病中具有重要作用^31,32。因此，申請(qǐng)人測(cè)試了hGO是否可用于對(duì)人胃對(duì)病原體幽門螺桿菌的病理生理響應(yīng)建模。為了模擬正常的宿主-病原體界面，我們通過顯微注射到類器官的腔中直接將幽門螺桿菌引入上皮的腔表面并測(cè)量上皮信號(hào)傳導(dǎo)和增殖(圖4)。通過免疫熒光觀察細(xì)菌與hGO上皮緊密結(jié)合(圖4B)。在24小時(shí)內(nèi)，申請(qǐng)人觀察到對(duì)幽門螺桿菌的顯著上皮應(yīng)答，包括胃癌基因c-Met³³的強(qiáng)力激活和上皮細(xì)胞增殖的2倍增加。幽門螺桿菌毒力因子CagA在疾病的病因中起關(guān)鍵作用。與已發(fā)表的研究³⁴一致，申請(qǐng)人證明CagA移位到類器官上皮細(xì)胞中并與c-Met形成復(fù)合物(圖4C)。此外，當(dāng)用缺乏CagA的幽門螺桿菌的非致病性菌株注射hGO時(shí)，上皮應(yīng)答被消除，增強(qiáng)了該因子在幽門螺桿菌介導(dǎo)的人類發(fā)病機(jī)理中的重要性。因此，hGO對(duì)幽門螺桿菌的病理生理應(yīng)答使它們成為闡明由幽門螺桿菌介導(dǎo)的人胃疾病的起始事件的前所未有的模型。

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